JP6567824B2 - Human papillomavirus vaccine and method of use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の改良型ワクチン、ＨＰＶに対する免疫反応を誘導するための改良法、ならびにＨＰＶに対して予防的および／または治療的に個体を免疫化するための改良法に関する。 The present invention relates to an improved human papillomavirus (HPV) vaccine, an improved method for inducing an immune response against HPV, and an improved method for immunizing an individual prophylactically and / or therapeutically against HPV.
パピローマウイルスは、最高で７つの初期遺伝子および２つの後期遺伝子を含む小さいＤＮＡウイルスである。一般に、パピローマウイルスの初期遺伝子はＥ１〜Ｅ７と命名され、パピローマウイルスの後期遺伝子はＬ１およびＬ２と命名される。いくつかの動物の種類に、パピローマウイルスファミリーの一員は感染することができる。 Papillomaviruses are small DNA viruses that contain up to seven early genes and two late genes. In general, the early genes of papillomavirus are named E1-E7, and the late genes of papillomavirus are named L1 and L2. Several animal types can be infected by members of the papillomavirus family.
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染は日常的であり、性的接触によって伝染され得る。ＨＰＶは、ＤＮＡ配列相同性に基づいて５６種類以上に分類された。上皮異形成および他の損傷を引き起こすＨＰＶの１６型および１８型は、多くの場合、癌、特に、子宮頸部、膣、外陰部および肛門管の上皮内癌および湿潤性癌のリスクの増加と関連する。世界的に、子宮頸癌のほぼ８８％が、ＨＰＶサブタイプ１６、１８、４５、３１、３３、５２および５８によるものである。さらに、様々な研究により、再発性呼吸器乳頭腫症のほとんどの発生においてＨＰＶ６およびＨＰＶ１１の存在が明らかになった。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、性器疣贅との関係が知られ、子宮頸癌の場合ではわずかな比率でのみ見られるが、軽度頸部病変の全ての場合の２．６〜５．２％に見られる。さらに、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、今日、グレード２およびグレード３の子宮頸部上皮内腫瘍ならびに軽度の子宮頸部異形成を含む、現在では子宮頸癌の前兆と考えられている軽度扁平上皮内病変の約２０％と関連している。研究が進むにつれ、これら２つの血清型が、性器疣贅、再発性呼吸器乳頭腫症、肺癌、扁桃癌、喉頭癌、および他の点では良性の腫瘍の他の悪性転換ならびに頭頸部の異形成を含む耳鼻科疾患の様々な形態と関連することが明らかになった。この研究の発見が、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１に対するコンセンサス配列ＤＮＡワクチンの使用を明らかにし、その将来の有望性を期待させる。 Human papillomavirus (HPV) infection is routine and can be transmitted by sexual contact. HPV was classified into more than 56 types based on DNA sequence homology. HPV types 16 and 18 that cause epithelial dysplasia and other injuries are often associated with an increased risk of cancer, particularly in situ and wet cancer of the cervix, vagina, vulva and anal canal. Related. Worldwide, approximately 88% of cervical cancers are due to HPV subtypes 16, 18, 45, 31, 33, 52 and 58. In addition, various studies have revealed the presence of HPV6 and HPV11 in most occurrences of recurrent respiratory papillomatosis. HPV6 and HPV11 are known to be associated with genital warts and are found only in a small proportion in the case of cervical cancer, but in 2.6-5.2% of all cases of mild cervical lesions . In addition, HPV6 and HPV11 are present in mild squamous intraepithelial lesions that are now considered precursors of cervical cancer, including grade 2 and grade 3 cervical intraepithelial neoplasia and mild cervical dysplasia. Associated with about 20%. As research progresses, these two serotypes will become more genital warts, recurrent respiratory papillomatosis, lung cancer, tonsil cancer, laryngeal cancer, and other malignant transformations of benign tumors and head and neck differences. It has been found to be associated with various forms of otolaryngological disease, including formation. The discovery of this study reveals the use of consensus sequence DNA vaccines for HPV6 and HPV11 and promises its future promise.
ＤＮＡワクチンは、弱毒化生ウイルスワクチンおよび組み換えタンパク質に基づくワクチンなどの、より伝統的なワクチン接種法を上回る多くの概念的な利点を有する。ＤＮＡワクチンは、安全であり、安定であり、容易に産生され、かつヒトにおいて十分に耐容性を示し、前臨床試験はプラスミド組み込みの証拠を示さない（Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１９９９．１０（５）：ｐ．７５９−６８：Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｅ．Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９５．７７２：ｐ．３０−９）。さらに、ＤＮＡワクチンの有効性が、ベクターに対する、以前から存在する抗体力価によって影響されないという事実により、ＤＮＡワクチンは反復投与に十分に適する（Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｏｙｅｒ，ａｎｄ Ｄ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ，１９９７．１１（１０）：ｐ．７５３−６３）。しかし、大型動物に移行した時、ＤＮＡワクチンの臨床導入に対する１つの重大な障害は、プラットフォームとなる免疫原性の減少であった（Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ，２００５．５５：ｐ．２５−４０）。コドン最適化、ＲＮＡ最適化および免疫グロブリンリーダー配列の付加などの、ＤＮＡワクチン免疫原の遺伝子工学処理における最近の技術的進歩により、ＤＮＡワクチンの発現および免疫原性が改良され（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｐ１２０ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（２）：ｐ．１４９７−５０３；Ｄｅｍｌ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ Ｇａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（２２）：ｐ．１０９９１−１００１；Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７．２５（１６）：ｐ．２９８４−９；Ｆｒｅｌｉｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ３／４Ａ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４．１１（６）：ｐ．５２２−３３）、かつ、近年、電気穿孔法などのプラスミド送達システムの技術が開発された（Ｈｉｒａｏ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ／ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｌａｓｍｉｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８．２６（３）：ｐ．４４０−８；Ｌｕｃｋａｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１０）：ｐ．５２５７−６９；Ａｈｌｅｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ３／４Ａ ＤＮＡ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｏｃａｌ ＤＮＡ ｕｐｔａｋｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１７９（７）：ｐ．４７４１−５３）。さらに、コンセンサス免疫原を使用することで、天然の抗原のみと比較して、細胞性免疫反応の幅を拡大させることができる可能性があることを複数の研究が示唆した（Ｙａｎ．，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ−１ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．４１１−２１；Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｃｅｎｔｅｒ−ｏｆ−ｔｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１６）：ｐ．８５０７−１４）。 DNA vaccines have many conceptual advantages over more traditional vaccination methods, such as live attenuated virus vaccines and recombinant protein-based vaccines. DNA vaccines are safe, stable, easily produced, and well tolerated in humans, preclinical studies show no evidence of plasmid integration (Martin, T., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection.Hum Gene Ther, 1999.10 (5): p.759-68: Nichols, W., ent. N Y Acad Sci, 1995.772: p.30-9). Furthermore, due to the fact that the efficacy of the DNA vaccine is not affected by the preexisting antibody titer against the vector, the DNA vaccine is well suited for repeated administration (Chattergon, M., J. Boyer, and DB). Weiner, Genetic Immunization: a new era in vaccines and immunotherapeutics. FASEB J, 1997.11 (10): pp. 753-63). However, when moving to large animals, one significant obstacle to clinical introduction of DNA vaccines has been a reduction in platform immunogenicity (Liu, MA and JB Ulmer, Human clinical trials). of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005.55: p.25-40). Recent technological advances in genetic engineering of DNA vaccine immunogens, such as codon optimization, RNA optimization and the addition of immunoglobulin leader sequences, have improved the expression and immunogenicity of DNA vaccines (Andre, S., et al., Increased immune response eliminated by DNA vacuation with a synthetic gp120 sequence with optimized cousage. J. Viol, 1998. 72 (2): p. 97. 72 (2): p. usage optimization on expression and immunogenici y of DNA candidates encoding the human immunofidelity virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75 (22): p. 1091, 1001; Laddy, D. o. et al. against avian influenza. Vaccine, 2007.25 (16): p.2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification efficiency enhancement. of the hepatitis C virus nonstructural 3 / 4A gene. Gene Ther, 2004.11 (6): p. 522-33), and in recent years, technologies for plasmid delivery systems such as electroporation have been developed (Hirao, L.). A., et al., Intradermal / subcutaneous immobilization by electroporation impulses, positive vaccine delivery and potency in pigs and rhesus. Vaccine, 2008.26 (3): p. 440-8; Luckay, A .; , Et al. , Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the re- sulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007.81 (10): p. 5257-69; Ahlen, G .; , Et al. , In vivo electrophoresis enhancement the immunology of hepatitis C virus nonstructural 3 / 4A DNA by incremental local DNA uptake, protein J Immunol, 2007.179 (7): p. 4741-53). Furthermore, several studies have suggested that the use of consensus immunogens may expand the range of cellular immune responses compared to natural antigens alone (Yan., J. et al. , Et al., Enhanced cellular responses responded by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine.Mol Ther, 2007.15.21.Mol Ther. Reconstruction and function of ancillary center-of-tree human immunofidelity virus type proteins.J Virol, 2007.81 (16): p.8507-14).
ＨＰＶ感染、特に、子宮頸癌ならびに／または肺癌、扁桃癌、および咽頭癌を引き起こす感染を予防および治療するための改良型ワクチンならびに方法に対するニーズが依然としてある。 There remains a need for improved vaccines and methods for preventing and treating HPV infections, particularly infections that cause cervical cancer and / or lung cancer, tonsil cancer, and pharyngeal cancer.
本発明の態様には、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７；９０％の相同性を有するそれらの断片；およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＰＶ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が含まれる。一部の態様において、これらの核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８をコードするヌクレオチド配列；配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸断片をコードするヌクレオチド配列；配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８をコードするヌクレオチド配列の断片；および配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８と少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸断片をコードするヌクレオチド配列の断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。 Embodiments of the invention encode an HPV antigen selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7; fragments thereof having 90% homology; and combinations thereof Nucleic acid molecules comprising nucleotide sequences are included. In some embodiments, these nucleic acid molecules comprise at least a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 A nucleotide sequence encoding an amino acid fragment having 90% homology; a fragment of a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8; and SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 Or a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments of nucleotide sequences encoding amino acid fragments having at least 90% homology with SEQ ID NO: 8.
一部の態様において、本明細書に記載の核酸分子を含む医薬組成物を提供する。 In some embodiments, pharmaceutical compositions comprising the nucleic acid molecules described herein are provided.
他の態様において、ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、本明細書に記載の核酸分子を含む組成物を当該個体に投与することを含む方法を提供する。 In another aspect, there is provided a method of inducing an immune response against HPV in an individual comprising administering to the individual a composition comprising a nucleic acid molecule described herein.
本発明には、本明細書に記載の核酸分子を含む組換えワクチンも含まれる。これらの組換えワクチンには、組換えワクシニアワクチン、弱毒化生ワクチン、およびＤＮＡプラスミドが含まれる。 The invention also includes recombinant vaccines comprising the nucleic acid molecules described herein. These recombinant vaccines include recombinant vaccinia vaccines, live attenuated vaccines, and DNA plasmids.
本発明の一部の態様には、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８；および配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８と少なくとも９０％の相同性を有する配列の断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質が含まれる。 Some embodiments of the invention include at least 90% homology with SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8; and SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8. Proteins comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments of the sequences having are included.
ＨＰＶに対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、本明細書に提供する組換えワクチンを当該個体に投与することを含む方法も提供する。 Also provided is a method of inducing an immune response against HPV in an individual comprising administering to the individual a recombinant vaccine provided herein.
一部の態様において、配列番号１および配列番号３のＨＰＶ抗原をコードするヌクレオチド配列；もしくはそれらの断片；またはそれらと９０％の相同性を有する断片を含む医薬組成物を提供する。ＨＰＶサブタイプ６または１１に対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、前述の医薬組成物を当該個体に投与することを含む方法も提供する。 In some embodiments, a pharmaceutical composition is provided comprising a nucleotide sequence encoding the HPV antigens of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3; or a fragment thereof; or a fragment having 90% homology with them. Also provided is a method of inducing an immune response against HPV subtype 6 or 11 in an individual, comprising administering the aforementioned pharmaceutical composition to the individual.
一部の態様において、配列番号５および配列番号７のＨＰＶ抗原をコードするヌクレオチド配列；もしくはそれらの断片；またはそれらと９０％の相同性を有する断片を含む医薬組成物を提供する。ＨＰＶサブタイプ３３または５８に対する免疫反応を個体において誘導する方法であって、前述の医薬組成物を当該個体に投与することを含む方法も提供する。 In some embodiments, a pharmaceutical composition comprising a nucleotide sequence encoding the HPV antigen of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7; or a fragment thereof; or a fragment having 90% homology with them is provided. Also provided is a method of inducing an immune response in an individual against HPV subtype 33 or 58, comprising administering the aforementioned pharmaceutical composition to the individual.
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という語句は、１つの核酸分子が別の核酸分子とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境において様々である。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が、平衡状態でこの標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）温度である。一般に、これらの標的配列はＴｍにおいて過剰に存在するので、これらのプローブの５０％が平衡状態で占有する。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的に約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃であり、長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である条件であろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定剤の付加によっても達成され得る。 As used herein, the phrase “stringent hybridization conditions” or “stringent conditions” refers to conditions under which one nucleic acid molecule hybridizes with another nucleic acid molecule but does not hybridize with another sequence. Represents. Stringent conditions are sequence-dependent and will vary in different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures. Generally, stringent conditions are selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting point (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. Tm is the temperature (under a defined ionic strength, pH and nucleic acid concentration) at which 50% of the probe complementary to the target sequence hybridizes with this target sequence in equilibrium. In general, these target sequences are present in excess at Tm, so 50% of these probes occupy in equilibrium. Typically, stringent conditions are such that at pH 7.0-8.3, sodium ions with a salt concentration of less than about 1.0M, typically about 0.01-1.0M sodium ions (or other Salt) and the temperature is at least about 30 ° C. for short probes, primers or oligonucleotides (eg, 10-50 nucleotides) and at least about 60 ° C. for long probes, primers or oligonucleotides Will. Stringent conditions may also be achieved with the addition of destabilizing agents such as formamide.
ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列相同性を、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）ならびにＰＡＵＰ*４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて測定してもよい。「類似度のパーセンテージ」を、ＰＡＵＰ*４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて計算する。コンセンサス配列の平均類似度を、系統樹の全配列と比較して計算する。 Nucleotide and amino acid sequence homology was determined by FASTA, BLAST and Gapped BLAST (Altschul et al., Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3389, which is hereby incorporated by reference in its entirety) and PAUP * Measurements may be made using 4.0b10 software (DL Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts). “Percentage of similarity” is calculated using PAUP * 4.0b10 software (DL Swoffford, Sinauer Associates, Massachusetts). The average similarity of the consensus sequence is calculated relative to the entire sequence of the phylogenetic tree.
簡潔に述べると、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似度の決定に適している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０，これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードと整列させた時に、ある正の値の域値スコア（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）Ｔと一致するかまたはそれを満足させる問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコアな配列の対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア域値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見出す検索を開始するための種として機能する。このワードヒットは、累積のアラインメントスコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に拡大される。各方向のワードヒットの拡大は、以下の場合に停止される：１）累積のアラインメントスコアが、その最大達成値からＸ量低下する場合；２）１つ以上の負のスコア残基アラインメント（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）の蓄積により、累積スコアが０以下になる場合；または３）いずれかの配列の末端に到達する場合。ＢｌａｓｔアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。このＢｌａｓｔプログラムでは、初期設定として、ワード長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１０９１５−１０９１９参照、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）アラインメント（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較が使用される。このＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３−５７８７、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似度の統計解析を行う。このＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似度の１つの測定は、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に生じる確立の指標を与える最小合計確立（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と他の核酸の比較における最小合計確立が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は別の核酸と類似するとみなされる。 Briefly, the BLAST algorithm representing the Basic Local Alignment Search Tool is suitable for determining sequence similarity (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410, see reference). Which is incorporated herein in its entirety). Software for performing BLAST analyzes is published through the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The algorithm uses a length in the query sequence that matches or satisfies a certain positive-valued threshold score T when aligned with words of the same length in the database sequence. Identifying high-scoring sequence pairs (HSPs) first by identifying short words of length W. T is referred to as the neighborhood word score threshold (Altschul et al., Supra). These initial neighborhood word hits act as seeds for initiating searches to find HSPs containing them. This word hit is expanded in both directions along each sequence as long as the cumulative alignment score can be increased. Word hit expansion in each direction is stopped when: 1) the cumulative alignment score is reduced by X amounts from its maximum achieved value; 2) one or more negative score residue alignments (negative) -Accumulating scoring residue alignments) results in a cumulative score of 0 or less; or 3) reaching the end of any sequence. Blast algorithm parameters W, T and X determine the sensitivity and speed of the alignment. In this Blast program, as an initial setting, the word length (W) is 11, BLOSUM62 scoring matrix (see Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10915-10919, refer to (Which is incorporated herein in its entirety) uses an alignment (B) of 50, an expected value (E) of 10, M = 5, N = 4, and a comparison of both strands. The BLAST algorithm (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5787, which is hereby incorporated by reference in its entirety) and Gapped BLAST are two sequences. Statistical analysis of the similarity between them. One measure of similarity provided by this BLAST algorithm is the smallest sum probability (P (N)) that gives an indication of the probability that a match between two nucleotide sequences will occur by chance. If the minimum total probability of comparing a nucleic acid with other nucleic acids is less than about 1, preferably less than about 0.1, more preferably less than about 0.01, and most preferably less than about 0.001, Considered similar to nucleic acid.
本明細書で使用される「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を表す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞において発現を指示することができる、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素と作動可能に連結される開始シグナルおよび終止シグナルを含む。 As used herein, the term “genetic construct” refers to a DNA or RNA molecule comprising a nucleotide sequence encoding a protein. A coding sequence includes initiation and termination signals operably linked to regulatory elements, including promoters and polyadenylation signals, that can direct expression in the cells of the individual to which the nucleic acid molecule is administered.
本明細書で使用される「発現できる形態」という用語は、個体の細胞に存在する時に、コード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列と作動可能に連結される必須の調節配列を含む遺伝子構築物を表す。 As used herein, the term “expressible form” refers to an essential regulatory sequence that is operably linked to a coding sequence that encodes a protein such that the coding sequence is expressed when present in a cell of an individual. Represents a genetic construct containing.
免疫原によって誘導される細胞性免疫反応を高めるための多面的戦略から生じる改良型ワクチンを開示する。改変したコンセンサス配列を作製した。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および高効率な免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子改変も開示する。この新規の構築物を、対応するコドン最適化免疫原よりも強力で、広範な細胞性免疫反応を引き起こすように設計した。 Disclosed is an improved vaccine resulting from a multifaceted strategy to enhance the cellular immune response induced by the immunogen. A modified consensus sequence was generated. Also disclosed are genetic modifications including codon optimization, RNA optimization, and the addition of highly efficient immunoglobulin leader sequences. This new construct was designed to be more potent than the corresponding codon-optimized immunogen and elicit a broad cellular immune response.
改良型ＨＰＶワクチンは、抗ＨＰＶを誘導することができる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびそのようなエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物に基づく。したがって、ワクチンは治療的または予防的に免疫反応を誘導し得る。一部の実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。一部の実施形態において、このワクチンは、１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチンおよび１つ以上の不活化ワクチンからなる群から選択される組み合わせを含む。 Improved HPV vaccines are based on proteins having epitopes that make the improved vaccines particularly effective as immunogens capable of inducing anti-HPV, and genetic constructs that encode proteins having such epitopes. Thus, a vaccine can induce an immune response therapeutically or prophylactically. In some embodiments, means for delivering the immunogen include a DNA vaccine, a recombinant vaccine, a protein subunit vaccine, a composition comprising the immunogen, an attenuated vaccine, or an inactivated vaccine. In some embodiments, the vaccine comprises one or more DNA vaccines, one or more recombinant vaccines, one or more protein subunit vaccines, one or more compositions comprising the immunogen, one or more A combination selected from the group consisting of an attenuated vaccine and one or more inactivated vaccines.
一部の実施形態によると、ワクチンが個体に送達され、この個体の免疫システムの活性を調節し、それによって、ＨＰＶに対する免疫反応が高まる。このタンパク質をコードする核酸分子がこの個体の細胞に取り込まれると、このヌクレオチド配列がこれらの細胞において発現し、それによって、このタンパク質がこの個体に送達される。プラスミドなどの核酸分子上のこのタンパク質のコード配列を、組み換えワクチンの一部としておよび弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として送達する方法を提供する。 According to some embodiments, the vaccine is delivered to an individual and modulates the activity of the individual's immune system, thereby increasing the immune response to HPV. When the nucleic acid molecule encoding the protein is taken up by the cells of the individual, the nucleotide sequence is expressed in these cells, thereby delivering the protein to the individual. Methods are provided for delivering the coding sequence of this protein on a nucleic acid molecule, such as a plasmid, as part of a recombinant vaccine and as part of an attenuated vaccine, either as an isolated protein or as a protein part of a vector.
ＨＰＶに対して予防的および／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法を提供する。 Compositions and methods for immunizing an individual prophylactically and / or therapeutically against HPV are provided.
この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を送達するための組成物を、調節要素と作動可能に連結する。組成物には、この免疫原をコードするプラスミド、この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えワクチン、本発明のタンパク質をコードするおよび／もしくは本発明のタンパク質を含む弱毒化生病原体；本発明のタンパク質を含む不活化病原体；または本発明のタンパク質を含むリポソームもしくはサブユニットワクチンなどの組成物が含まれてもよい。本発明は、さらに、組成物を含む注射可能な医薬組成物に関する。 A composition for delivering a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the immunogen is operably linked to a regulatory element. The composition includes a plasmid encoding the immunogen, a recombinant vaccine comprising a nucleotide sequence encoding the immunogen, an attenuated live pathogen encoding the protein of the invention and / or comprising the protein of the invention; Compositions such as inactivated pathogens comprising proteins; or liposomes or subunit vaccines comprising proteins of the invention may be included. The invention further relates to an injectable pharmaceutical composition comprising the composition.
配列番号１は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号１は、配列番号１の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号２は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。 SEQ ID NO: 1 comprises the nucleotide sequence encoding the consensus immunogen of HPV6 E6 and E7 proteins. SEQ ID NO: 1 comprises the IgE leader sequence of SEQ ID NO: 9 linked to this nucleotide sequence at the 5 'end of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2 comprises the amino acid sequence of the consensus immunogen of HPV6 E6 and E7 proteins. SEQ ID NO: 2 comprises the IgE leader sequence of SEQ ID NO: 10 at the N-terminus of the consensus immunogen sequence. This IgE leader sequence is SEQ ID NO: 10 and can be encoded by SEQ ID NO: 9.
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号２または配列番号２をコードする核酸分子を含む。 In some embodiments, the vaccine comprises SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid molecule that encodes SEQ ID NO: 2.
一部の実施形態において、配列番号１の断片は、７８６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８３０以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８５６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８６５以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。 In some embodiments, a fragment of SEQ ID NO: 1 comprises 786 or more nucleotides, in some embodiments, 830 or more nucleotides, in some embodiments, 856 or more nucleotides, In form, it may comprise 865 or more nucleotides. In some embodiments, a fragment of SEQ ID NO: 1, such as a fragment described herein, may further comprise a coding sequence for an IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 1 does not include a coding sequence for an IgE leader sequence.
一部の実施形態において、配列番号２の断片は、２５２以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２６６以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２７５以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２７８以上のアミノ酸を含んでもよい。 In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 2 has 252 amino acids or more, in some embodiments 266 amino acids or more, in some embodiments 275 amino acids or more, some implementations. In form, it may contain 278 or more amino acids.
配列番号３は、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号３は、配列番号３の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号４は、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号４は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。 SEQ ID NO: 3 comprises the nucleotide sequence encoding the consensus immunogen of HPV11 E6 and E7 proteins. SEQ ID NO: 3 comprises the IgE leader sequence of SEQ ID NO: 9 linked to this nucleotide sequence at the 5 'end of SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 4 comprises the amino acid sequence of the consensus immunogen of HPV11 E6 and E7 proteins. SEQ ID NO: 4 contains the IgE leader sequence of SEQ ID NO: 10 at the N-terminus of the consensus immunogen sequence. This IgE leader sequence is SEQ ID NO: 10 and can be encoded by SEQ ID NO: 9.
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号４または配列番号４をコードする核酸分子を含む。 In some embodiments, the vaccine comprises SEQ ID NO: 4 or a nucleic acid molecule that encodes SEQ ID NO: 4.
一部の実施形態において、配列番号３の断片は、７８６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８３０以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８５６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８６５以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号３の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号３の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。 In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 3 comprises 786 or more nucleotides, in some embodiments, 830 or more nucleotides, in some embodiments, 856 or more nucleotides, In form, it may comprise 865 or more nucleotides. In some embodiments, a fragment of SEQ ID NO: 3, such as a fragment described herein, may further comprise a coding sequence for an IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 3 does not include the coding sequence for the IgE leader sequence.
一部の実施形態において、配列番号４の断片は、２５２以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２６６以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２７５以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２７８以上のアミノ酸を含んでもよい。 In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 4 comprises 252 amino acids or more, in some embodiments 266 amino acids or more, in some embodiments 275 amino acids or more, some implementations. In form, it may contain 278 or more amino acids.
配列番号５は、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号５は、配列番号５の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号６は、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号６は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。 SEQ ID NO: 5 comprises the nucleotide sequence encoding the consensus immunogen of the HPV33 E6 and E7 proteins. SEQ ID NO: 5 comprises the IgE leader sequence of SEQ ID NO: 9 linked to this nucleotide sequence at the 5 'end of SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 6 comprises the amino acid sequence of the consensus immunogen of HPV33 E6 and E7 proteins. SEQ ID NO: 6 comprises the IgE leader sequence of SEQ ID NO: 10 at the N-terminus of the consensus immunogen sequence. This IgE leader sequence is SEQ ID NO: 10 and can be encoded by SEQ ID NO: 9.
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号６または配列番号６をコードする核酸分子を含む。 In some embodiments, the vaccine comprises SEQ ID NO: 6 or a nucleic acid molecule that encodes SEQ ID NO: 6.
一部の実施形態において、配列番号５の断片は、７４６以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７８７以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８１２以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８２０以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号５の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号５の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。 In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 5 comprises 746 or more nucleotides, in some embodiments 787 or more nucleotides, in some embodiments 812 or more nucleotides, some implementations. In form, it may contain 820 or more nucleotides. In some embodiments, a fragment of SEQ ID NO: 5, such as those described herein, may further comprise a coding sequence for an IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 5 does not include the coding sequence for the IgE leader sequence.
一部の実施形態において、配列番号６の断片は、２３５以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２４８以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５６以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５９以上のアミノ酸を含んでもよい。 In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 6 comprises 235 or more amino acids, in some embodiments 248 or more amino acids, in some embodiments 256 or more amino acids, some implementations. In a form, it may contain 259 or more amino acids.
配列番号７は、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号７は、配列番号７の５’末端にこのヌクレオチド配列と連結される配列番号９のＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号８は、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７タンパク質のコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号８は、コンセンサス免疫原配列のＮ末端に配列番号１０のＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は配列番号１０であり、配列番号９によってコードされ得る。 SEQ ID NO: 7 comprises the nucleotide sequence encoding the consensus immunogen of the E6 and E7 proteins of HPV58. SEQ ID NO: 7 comprises the IgE leader sequence of SEQ ID NO: 9 linked to this nucleotide sequence at the 5 'end of SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 8 comprises the amino acid sequence of the consensus immunogen of HPV58 E6 and E7 proteins. SEQ ID NO: 8 comprises the IgE leader sequence of SEQ ID NO: 10 at the N-terminus of the consensus immunogen sequence. This IgE leader sequence is SEQ ID NO: 10 and can be encoded by SEQ ID NO: 9.
一部の実施形態において、ワクチンは、配列番号８または配列番号８をコードする核酸分子を含む。 In some embodiments, the vaccine comprises SEQ ID NO: 8 or a nucleic acid molecule that encodes SEQ ID NO: 8.
一部の実施形態において、配列番号７の断片は、７５２以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、７９４以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８１９以上のヌクレオチドを、一部の実施形態において、８２７以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態において、本明細書で説明される断片などの配列番号７の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列をさらに含んでもよい。一部の実施形態において、配列番号７の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。 In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 7 comprises 752 or more nucleotides, in some embodiments 794 or more nucleotides, in some embodiments 819 or more nucleotides, some implementations. In form, it may comprise 827 or more nucleotides. In some embodiments, a fragment of SEQ ID NO: 7, such as a fragment described herein, may further comprise a coding sequence for an IgE leader sequence. In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 7 does not include the coding sequence for the IgE leader sequence.
一部の実施形態において、配列番号８の断片は、２３５以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２４９以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２５７以上のアミノ酸を、一部の実施形態において、２６０以上のアミノ酸を含んでもよい。 In some embodiments, the fragment of SEQ ID NO: 8 comprises 235 amino acids or more, in some embodiments 249 amino acids or more, in some embodiments 257 amino acids or more, some implementations. In form, it may contain 260 or more amino acids.
一部の実施形態によると、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、それらの機能的断片、ならびにそれらの発現できるコード配列をこの個体に投与することを含む。一部の実施形態は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、ならびにそれらの断片をコードする単離した核酸分子を含む。一部の実施形態は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、ならびにそれらの断片をコードする組み換えワクチンを含む。一部の実施形態は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、ならびにそれらの断片を含むサブユニットワクチンを含む。一部の実施形態は、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７、ＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７からなる群から選択されるコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、ならびにそれらの断片を含む弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンを含む。 According to some embodiments, the method of inducing an immune response against an immunogen in an individual is selected from the group consisting of HPV6 E6 and E7, HPV11 E6 and E7, HPV33 E6 and E7, HPV58 E6 and E7 Administration to the individual of the amino acid sequence of the consensus immunogen, the functional fragment thereof, and the coding sequence that can be expressed thereof. Some embodiments encode amino acid sequences of consensus immunogens selected from the group consisting of HPV6 E6 and E7, HPV11 E6 and E7, HPV33 E6 and E7, HPV58 E6 and E7, and fragments thereof An isolated nucleic acid molecule. Some embodiments encode amino acid sequences of consensus immunogens selected from the group consisting of HPV6 E6 and E7, HPV11 E6 and E7, HPV33 E6 and E7, HPV58 E6 and E7, and fragments thereof Including recombinant vaccines. Some embodiments include amino acid sequences of consensus immunogens selected from the group consisting of E6 and E7 of HPV6, E6 and E7 of HPV11, E6 and E7 of HPV33, E6 and E7 of HPV58, and fragments thereof Includes subunit vaccines. Some embodiments include amino acid sequences of consensus immunogens selected from the group consisting of E6 and E7 of HPV6, E6 and E7 of HPV11, E6 and E7 of HPV33, E6 and E7 of HPV58, and fragments thereof Includes live attenuated vaccines and / or inactivated vaccines.
一態様において、本明細書のワクチンは、頭頸部癌の形態、および耳鼻咽喉科疾患の他の形態と主に関連することが見出された、ＨＰＶサブタイプに対する免疫反応を引き起こすワクチンであり、特に、これらのワクチンには、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７ならびにＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７、好ましくはその両方が含まれる。 In one aspect, the vaccine herein is a vaccine that elicits an immune response against the HPV subtype that has been found to be primarily associated with forms of head and neck cancer, and other forms of otolaryngology diseases, In particular, these vaccines include HPV6 E6 and E7 and HPV11 E6 and E7, preferably both.
別の態様において、本明細書のワクチンは、例えば、米国外の患者、より具体的には、アジアの患者の子宮頚癌の形態と主に関連することが見出された、ＨＰＶサブタイプに対する免疫反応を引き起こすワクチンであり、特に、これらのワクチンには、ＨＰＶ３３のＥ６およびＥ７ならびにＨＰＶ５８のＥ６およびＥ７、好ましくはその両方が含まれる。 In another aspect, the vaccines herein are directed against HPV subtypes that have been found to be primarily associated with, for example, cervical cancer morphology in non-US patients, more specifically in Asian patients. Vaccines that cause an immune response, in particular these vaccines include HPV33 E6 and E7 and HPV58 E6 and E7, preferably both.
改良型ワクチンは、抗ＨＰＶ免疫反応を誘導することができる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびそのようなエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物を含む。したがって、治療的または予防的に免疫反応を誘導するために、ワクチンを提供することができる。一部の実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。一部の実施形態において、このワクチンは、以下からなる群から選択される組み合わせを含む：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチン、１つ以上の不活化ワクチン。 Improved vaccines include proteins having epitopes that make the improved vaccines particularly effective as immunogens capable of inducing an anti-HPV immune response, and genetic constructs encoding proteins having such epitopes. Thus, vaccines can be provided to induce an immune response therapeutically or prophylactically. In some embodiments, means for delivering the immunogen include a DNA vaccine, a recombinant vaccine, a protein subunit vaccine, a composition comprising the immunogen, an attenuated vaccine, or an inactivated vaccine. In some embodiments, the vaccine comprises a combination selected from the group consisting of: one or more DNA vaccines, one or more recombinant vaccines, one or more protein subunit vaccines, the immunogen One or more compositions comprising, one or more attenuated vaccines, one or more inactivated vaccines.
本発明の態様は、プラスミドなどの核酸分子上のタンパク質コード配列を、組み換えワクチンの一部として、弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として送達する方法を提供する。 Aspects of the invention provide methods for delivering a protein coding sequence on a nucleic acid molecule such as a plasmid, as part of a recombinant vaccine, as part of an attenuated vaccine, or as the protein part of an isolated protein or vector.
本発明の一部の態様によると、予防的におよび／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法が提供される。 According to some aspects of the invention, compositions and methods are provided for immunizing an individual prophylactically and / or therapeutically.
ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、同第５，６７６，５９４号、および本明細書で引用する優先出願に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。それらの出願に記載される送達プロトコールに加えて、ＤＮＡを送達する代替方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。 DNA vaccines are disclosed in U.S. Patent Nos. 5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, No. 5,981,505, No. 5,580,859, No. 5,703,055, No. 5,676,594, and priority applications cited in this specification. Each of which is incorporated herein by reference. In addition to the delivery protocols described in those applications, alternative methods of delivering DNA are described in US Pat. Nos. 4,945,050 and 5,036,006, both of which are referenced. Is incorporated herein by reference.
本発明は、改良型弱毒化生ワクチン、改良型不活化ワクチン、および抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを使用する改良型ワクチン、さらにサブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンに関する。弱毒化生ワクチン、組み換えベクターを使用して外来抗原を送達するワクチン、サブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンの例は、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号および同第６，５８９，５２９号に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。 The present invention relates to improved live attenuated vaccines, improved inactivated vaccines, and improved vaccines that use recombinant vectors to deliver foreign genes encoding antigens, as well as subunit vaccines and glycoprotein vaccines. Examples of live attenuated vaccines, vaccines that deliver foreign antigens using recombinant vectors, subunit vaccines and glycoprotein vaccines are described in US Pat. Nos. 4,510,245, 4,797,368, 4,722,848, 4,790,987, 4,920,209, 5,017,487, 5,077,044, 5,110,587 No. 5,112,749, No. 5,174,993, No. 5,223,424, No. 5,225,336, No. 5,240,703, No. 5 No. 5,242,829, No. 5,294,441, No. 5,294,548, No. 5,310,668, No. 5,387,744, No. 5,389,368. No. 5,424,065, No. 5,451 No. 499, No. 5,453,364, No. 5,462,734, No. 5,470,734, No. 5,474,935, No. 5,482,713, No. 5,591,439, 5,643,579, 5,650,309, 5,698,202, 5,955,088, 6,034,298 No. 6,042,836, 6,156,319 and 6,589,529, each of which is incorporated herein by reference.
細胞に取り込まれると、この遺伝子構築物（複数可）は、機能している染色体外分子としてこの細胞内に存在したままであってもよく、かつ／またはこの細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。ＤＮＡは細胞内に導入されてもよく、そこで、１つまたは複数のプラスミドの形態の別々の遺伝物質として留まる。あるいは、染色体に組み込むことができる直鎖ＤＮＡを、この細胞に導入してもよい。この細胞にＤＮＡを導入する場合、染色体へのＤＮＡ組み込みを促進する薬剤を加えてもよい。組み込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列が、このＤＮＡ分子に含まれてもよい。あるいは、ＲＮＡをこの細胞に投与してもよい。セントロメア、テロメアおよび複製開始点を含む直鎖ミニ染色体としてこの遺伝子構築物を提供することも考えられる。遺伝子構築物は、細胞内で生存する弱毒化された生の微生物または組み換え微生物ベクターの遺伝物質の一部のままであってもよい。遺伝子構築物は、組み換えウイルスワクチンのゲノムの一部であってもよく、ここで、この遺伝物質はこの細胞の染色体に組み込まれるかまたは染色体外に留まるかのいずれかである。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節要素を含む。これらの要素には、プロモーター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、大抵、エンハンサーは、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現に必要とされる。これらの要素は、所望のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されること、およびこれらの調節要素は、これらが投与される個体において作動可能であることが必要である。 Once taken up by a cell, the genetic construct (s) may remain present in the cell as a functioning extrachromosomal molecule and / or may be incorporated into the chromosomal DNA of the cell. . DNA may be introduced into cells where it remains as separate genetic material in the form of one or more plasmids. Alternatively, linear DNA that can be integrated into the chromosome may be introduced into the cell. When introducing DNA into this cell, an agent that promotes DNA integration into the chromosome may be added. DNA sequences useful for facilitating integration may be included in the DNA molecule. Alternatively, RNA may be administered to the cell. It is also conceivable to provide this gene construct as a linear minichromosome containing centromere, telomere and origin of replication. The genetic construct may remain part of the genetic material of a live attenuated microorganism or recombinant microbial vector that survives in the cell. The genetic construct may be part of the genome of the recombinant viral vaccine, where the genetic material is either integrated into the chromosome of the cell or remains extrachromosomal. The gene construct contains regulatory elements necessary for gene expression of the nucleic acid molecule. These elements include a promoter, start codon, stop codon, and polyadenylation signal. In addition, enhancers are often required for gene expression of sequences encoding target proteins or immunoregulatory proteins. These elements need to be operably linked to the sequence encoding the desired protein, and these regulatory elements need to be operable in the individual to which they are administered.
開始コドンおよび終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかし、これらの要素は、この遺伝子構築物が投与される個体において機能的であることが必要である。開始および終止コドンはコード配列と共にフレームの中になければならない。 Start and stop codons are generally considered to be part of a nucleotide sequence encoding the desired protein. However, these elements need to be functional in the individual to whom the gene construct is administered. Start and stop codons must be in frame with the coding sequence.
使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能的でなければならない。 The promoter and polyadenylation signal used must be functional in the cells of the individual.
本発明を実行するのに有用な、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なプロモーターの例として、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＢＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、ＡＬＶプロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。 Examples of promoters useful for practicing the present invention, particularly in the production of human genetic vaccines, include simian virus 40 (SV40) promoter, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, BIV terminal repeat (LTR) promoter, and the like Human immunodeficiency virus (HIV) promoter, Moloney virus promoter, ALV promoter, CMV early promoter, and other cytomegalovirus (CMV) promoters, Epstein-Barr virus (EBV) promoter, Rous sarcoma virus (RSV) promoter and human actin Promoters derived from human genes such as, but not limited to, human myosin, human hemoglobin, human muscle creatine and human metallothionein.
本発明を実行するのに有用な、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なポリアデニル化シグナルの例として、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、それらに限定されない。特に、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）内に存在し、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称されるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを使用する。 Examples of polyadenylation signals useful for practicing the present invention, particularly useful in the production of human genetic vaccines include, but are not limited to, SV40 polyadenylation signals and LTR polyadenylation signals. In particular, the SV40 polyadenylation signal present in the plasmid pCEP4 (Invitrogen, San Diego CA) and referred to as the SV40 polyadenylation signal is used.
ＤＮＡ発現に必要な調節要素に加えて、他の要素もこのＤＮＡ分子の中に含まれてもよい。かかる追加の要素はエンハンサーを含む。このエンハンサーは、以下を含む群から選択されてもよいがそれらに限定されない：ヒトアクチンエンハンサー、ヒトミオシンエンハンサー、ヒトヘモグロビンエンハンサー、ヒト筋肉クレアチンエンハンサーならびにＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶのエンハンサーなどのウイルスエンハンサー。 In addition to the regulatory elements required for DNA expression, other elements may also be included in the DNA molecule. Such additional elements include enhancers. This enhancer may be selected from the group comprising but is not limited to: human actin enhancer, human myosin enhancer, human hemoglobin enhancer, human muscle creatine enhancer and viral enhancers such as CMV, RSV and EBV enhancers.
遺伝子構築物は、染色体外にこの遺伝子構築物を維持し、細胞内でこの構築物の複数のコピーを産生するために、哺乳類複製開始点が供給され得る。インビトロジェン（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４は、組み込まれることなく、高コピーのエピソーム複製を行うエプスタイン・バーウイルス複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。 The genetic construct can be supplied with a mammalian origin of replication to maintain the genetic construct extrachromosomally and produce multiple copies of the construct in the cell. Invitrogen (San Diego, Calif.) Plasmids pVAX1, pCEP4 and pREP4 contain the Epstein-Barr virus origin of replication and the nuclear antigen EBNA-1 coding region, which, without integration, provides high-copy episomal replication.
免疫化の適用に関連するいくつかの好ましい実施形態において、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および追加として、かかる標的タンパク質に対する免疫反応をさらに高めるタンパク質の遺伝子を含む核酸分子（複数可）を送達する。かかる遺伝子の例として、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびシグナル配列が除去され、任意でＩｇＥのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５などの他のサイトカインならびにリンホカインをコードする遺伝子が挙げられる。有用であり得る他の遺伝子には、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能的断片をコードする遺伝子が含まれる。 In some preferred embodiments related to immunization applications, a nucleic acid molecule (s) comprising a nucleotide sequence encoding a protein of the invention and, additionally, a protein gene that further enhances the immune response to such target protein. Deliver. Examples of such genes include α-interferon, γ-interferon, platelet derived growth factor (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, epidermal growth factor (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MHC, CD80, CD86 and signal sequences are removed, such as IL-15, including IL-15, which includes the IgE signal peptide, etc. Examples include genes encoding other cytokines as well as lymphokines. Other genes that may be useful include MCP-1, MIP-1α, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectin, P-selectin, E-selectin, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL- 18 mutant types, CD40, CD40L, vascular growth factor, IL-7, nerve growth factor, vascular endothelial growth factor, Fas, TNF receptor, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo -3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, caspase ICE, Fos c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, interferon response gene, NFkB, Bax, TRAIL , TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK ligand, Ox40, Ox40 ligand, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, AP2 Gene to be included.
何らかの理由で、この遺伝子構築物を受け取る細胞を除去することが望ましい場合、細胞破壊の標的として機能を果たす追加の要素を加えてもよい。発現できる形態のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を、この遺伝子構築物に含めることができる。薬剤ガンシクロビルはこの個体に投与され得、かつこの薬剤はｔｋを産生する全細胞を選択的に死滅させるため、この遺伝子構築物を有する細胞の選択的破壊のための手段をもたらす。 If for any reason it is desirable to remove cells that receive this genetic construct, additional elements that serve as targets for cell destruction may be added. An expressible form of the herpes thymidine kinase (tk) gene can be included in the gene construct. The drug ganciclovir can be administered to this individual and this drug selectively kills all cells producing tk, thus providing a means for selective destruction of cells carrying this genetic construct.
タンパク質産生を最大限するために、この構築物が投与される細胞における遺伝子発現に十分に適した調節配列を選択してもよい。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択してもよい。当業者は、細胞内で機能的なＤＮＡ構築物を作製することができる。 In order to maximize protein production, regulatory sequences well suited for gene expression in the cells to which the construct is administered may be selected. Furthermore, codons that are most efficiently transcribed in the cell may be selected. One skilled in the art can produce DNA constructs that are functional in cells.
一部の実施形態において、本明細書記載のタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドと連結される遺伝子構築物を提供し得る。一部の実施形態において、本明細書記載のタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドと連結される。 In some embodiments, a genetic construct can be provided in which the coding sequence of a protein described herein is linked to an IgE signal peptide. In some embodiments, the proteins described herein are linked to an IgE signal peptide.
タンパク質が用いられる一部の実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質を産生および単離することができる。タンパク質が用いられる一部の実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、周知の発現系で使用するための市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生のために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における（タンパク質）産生のために使用してもよい。例えば、市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を昆虫細胞における（タンパク質）産生のために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）を、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳類細胞における（タンパク質）産生のために使用してもよい。当業者は、これらの市販の発現ベクターおよび発現系または他のものを使用して、通例の技術およびすぐに入手できる出発物質によりタンパク質を産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）。従って、所望のタンパク質を原核細胞系および真核細胞系の両方において調製することができ、このタンパク質の一連のプロセシング型をもたらすことができる。 In some embodiments where proteins are used, for example, one of skill in the art can produce and isolate the proteins of the invention using well-known techniques. In some embodiments where a protein is used, for example, one of skill in the art uses well-known techniques to insert a DNA molecule encoding a protein of the invention into a commercially available expression vector for use in a well-known expression system. can do. For example, the commercially available plasmid pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.) May be used for protein production in E. coli. For example, the commercially available plasmid pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.) May be used for (protein) production in the Saccharomyces cerevisiae strain of yeast. For example, the commercially available MAXBAC ™ complete baculovirus expression system (Invitrogen, San Diego, Calif.) May be used for (protein) production in insect cells. For example, the commercially available plasmid pcDNA I or pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif) may be used for (protein) production in mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells. Those skilled in the art can use these commercially available expression vectors and expression systems or others to produce proteins with conventional techniques and readily available starting materials (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning). a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989), which is incorporated herein by reference). Thus, the desired protein can be prepared in both prokaryotic and eukaryotic cell systems, resulting in a series of processing forms of this protein.
当業者は、他の市販の発現ベクターおよび発現系を使用してもよく、または周知の方法およびすぐに入手できる出発物質を用いてベクターを産生してもよい。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、ならびに好ましくはエンハンサーなどの必須の制御配列を含む、様々な種類の宿主に対する発現系は、すぐに入手でき、当業で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照。遺伝子構築物は、この構築物がトランスフェクトされる細胞株において機能的であるプロモーターと作動可能に連結されるタンパク質コード配列を含む。構成的プロモーターの例として、サイトメガロウイルスまたはＳＶ４０のプロモーターが挙げられる。誘導できるプロモーターの例として、マウス乳腺白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。当業者は、すぐに入手できる出発物質から、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を容易に作製することができる。このタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合性宿主を形質転換し、その後、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養し、維持する。 One skilled in the art may use other commercially available expression vectors and expression systems, or produce the vectors using well-known methods and readily available starting materials. Expression systems for various types of hosts are readily available and known in the art, including promoters and polyadenylation signals, and preferably essential regulatory sequences such as enhancers. For example, Sambrook et al. , Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. See Cold Spring Harbor Press (1989). The genetic construct includes a protein coding sequence operably linked to a promoter that is functional in the cell line into which the construct is transfected. Examples of constitutive promoters include cytomegalovirus or SV40 promoters. Examples of inducible promoters include mouse mammary leukemia virus or metallothionein promoter. One skilled in the art can readily make genetic constructs useful for transfecting cells with DNA encoding the proteins of the invention from readily available starting materials. An expression vector containing DNA encoding this protein is used to transform a compatible host, which is then cultured and maintained under conditions that allow expression of the foreign DNA.
産生させたタンパク質を、必要に応じて、かつ当業者に知られるように、これらの細胞を溶解するまたは培地から回収することによって、培養物から回収した。当業者は、周知の方法を用いて、かかる発現系を用いて産生されるタンパク質を単離することができる。上記の特異的タンパク質と特異的に結合する抗体を用いて天然源からタンパク質を精製する方法を、組み換えＤＮＡ法によって産生されるタンパク質の精製に同様に適用してもよい。 The produced protein was recovered from the culture by lysing these cells or recovering them from the medium as needed and as known to those skilled in the art. One skilled in the art can isolate proteins produced using such expression systems using well-known methods. The method of purifying a protein from a natural source using an antibody that specifically binds to the specific protein may be similarly applied to the purification of a protein produced by a recombinant DNA method.
組み換え技術によるタンパク質産生に加えて、自動化ペプチド合成機も使用して、本質的には純粋な単離されるタンパク質を産生してもよい。かかる技術は当業者に周知であり、置換を有する誘導体がＤＮＡにコードされるタンパク質産生において供給されない場合に有用である。 In addition to protein production by recombinant techniques, an automated peptide synthesizer may also be used to produce essentially pure isolated protein. Such techniques are well known to those skilled in the art and are useful when derivatives having substitutions are not provided in the production of DNA-encoded proteins.
ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組み換えワクシニアなどの組み換えベクターを含むいくつかの周知の技術のいずれかを用いて、これらの核酸分子を送達してもよい。 These nucleic acid molecules are delivered using any of a number of well-known techniques, including recombinant vectors such as DNA injection (also referred to as DNA vaccination), recombinant adenovirus, recombinant adenovirus-related virus and recombinant vaccinia. May be.
投与経路には、筋肉内経路、鼻腔内経路、腹腔内経路、皮内経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、眼球内経路、および経口経路、ならびに粘膜組織への吸入剤もしくは坐薬による、例えば、膣、直腸、尿道、頬および舌下の組織への洗浄による局所的経路、経皮的経路が含まれるが、それらに限定されない。好ましい投与経路には、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射および皮下注射が含まれる。遺伝子構築物は、電気穿孔の方法および装置、従来の注射器、無針注射器具、または「微粒子衝撃遺伝子銃」を含むがそれらに限定されない手段により投与されてもよい。 Administration routes include intramuscular route, intranasal route, intraperitoneal route, intradermal route, subcutaneous route, intravenous route, intraarterial route, intraocular route, and oral route, and by inhalants or suppositories to mucosal tissues Examples include, but are not limited to, the topical route by lavage to the tissues of the vagina, rectum, urethra, buccal and sublingual, percutaneous routes. Preferred routes of administration include intramuscular injection, intraperitoneal injection, intradermal injection and subcutaneous injection. The genetic construct may be administered by means including, but not limited to, electroporation methods and devices, conventional syringes, needleless injection devices, or “microparticle bombardment gene guns”.
これらのＤＮＡワクチンの送達を促進するのに好ましい電気穿孔装置および電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより出願された米国特許公開第２００５／００５２６３０号（これらの内容は、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）に記載される例が含まれる。３５ＵＳＣ１１９（ｅ）条の下、２００６年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／９７８，９８２号の利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属で共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（これらの全ては、この全体が本明細書に組み込まれる）に提供されるＤＮＡワクチンの送達を促進する電気穿孔装置および電気穿孔法も好ましい。 Examples of preferred electroporation devices and electroporation methods to facilitate delivery of these DNA vaccines include US Pat. No. 7,245,963 by Draghia-Akli et al., US Patent Publication No. 2005 filed by Smith et al. / 0052630, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. U.S. Provisional Application No. 60 / 852,149 filed on October 17, 2006 and U.S. Provisional Application No. 60 / 978,982 filed on October 10, 2007 under 35 USC 119 (e). No. 11/874072 filed Oct. 17, 2007, all of which are hereby incorporated by reference in their entirety. Also preferred are electroporation devices and electroporation methods that facilitate the delivery of DNA vaccines.
以下は、電気穿孔技術を用いた実施形態の例であり、上記で論じた特許参考文献の中で詳細に論じられる：電気穿孔装置は、使用者により事前に設定された電流入力と同じような定電流を生み出すエネルギーのパルスを、哺乳類の所望の組織へ送達するように配置され得る。この電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極集合体またはハンドル集合体を含む。この電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形自動記録装置、入力要素、状況報告要素、伝達ポート、記録構成要素、電源、および電源スイッチを含む電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、かつ組み込むことができる。この電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、この電気穿孔構成要素と連通する別々の要素（または構成要素）である。一部の実施形態において、この電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の２つ以上の要素として機能することができ、それは、この電気穿孔構成要素から分離する電気穿孔装置のさらに他の要素と連通することができる。これらの要素は１つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能することができるので、改良型ＨＰＶワクチンを送達するためにこの電気穿孔技術を用いることは、１つの電気機械装置または機械装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素に限定されない。この電気穿孔構成要素は、所望の組織に定電流を生み出すエネルギーパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極集合体は、空間的配置に複数の電極を有する電極アレイを含み、ここで、この電極集合体は、この電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け取り、電極を通して所望の組織にエネルギーパルス送る。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達の間は中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定し、この電気穿孔構成要素へインピーダンスを伝える。このフィードバック機構は、測定されるインピーダンスを受け取ることができ、この電気穿孔構成要素によって送達されるエネルギーパルスを調節し、定電流を維持することができる。 The following is an example of an embodiment using electroporation technology and will be discussed in detail in the patent references discussed above: The electroporation device is similar to a current input preset by the user. A pulse of energy that produces a constant current can be arranged to be delivered to the desired tissue in the mammal. The electroporation device includes an electroporation component and an electrode assembly or handle assembly. This electroporation component is one of the electroporation devices including a control device, a current waveform generator, an impedance tester, a waveform automatic recording device, an input element, a status reporting element, a transmission port, a recording component, a power supply, and a power switch. It can include and incorporate two or more different elements. The electroporation component can function as one element of the electroporation device, and the other element is a separate element (or component) in communication with the electroporation component. In some embodiments, the electroporation component can function as more than one element of the electroporation device, which communicates with still other elements of the electroporation device that are separate from the electroporation component. can do. Because these elements can function as a single device or as separate elements in communication with each other, using this electroporation technique to deliver an improved HPV vaccine is a single electromechanical device or mechanical device. It is not limited to the elements of the electroporation device that exist as part of. The electroporation component can deliver an energy pulse that produces a constant current to the desired tissue and includes a feedback mechanism. The electrode assembly includes an electrode array having a plurality of electrodes in a spatial arrangement, wherein the electrode assembly receives energy pulses from the electroporation component and delivers energy pulses through the electrodes to the desired tissue. At least one of the plurality of electrodes is neutral during the delivery of the energy pulse and measures the desired tissue impedance and transmits the impedance to the electroporation component. The feedback mechanism can receive the measured impedance and can regulate the energy pulses delivered by the electroporation component to maintain a constant current.
一部の実施形態において、複数の電極は、分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができる。一部の実施形態において、複数の電極は、プログラムされた順番の下で、電極制御を介して分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができ、使用者が、プログラムされた順番を電気穿孔構成要素に入力する。一部の実施形態において、プログラムされた順番は、順に送達される複数のパルスを含み、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの次のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極の別の１つによって送達される。 In some embodiments, the plurality of electrodes can deliver energy pulses in a distributed pattern. In some embodiments, the plurality of electrodes can deliver energy pulses in a distributed pattern via electrode control under a programmed order so that the user can configure the programmed order to electroporation Enter in the element. In some embodiments, the programmed order includes a plurality of pulses delivered in sequence, each pulse of the plurality of pulses being delivered by at least two active electrodes with one neutral pole measuring impedance, The next of the plurality of pulses is delivered by another one of the at least two active electrodes with one neutral pole measuring impedance.
一部の実施形態において、このフィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行される。好ましくは、このフィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行われる。好ましくは、このフィードバックは、毎５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓで生じるが、好ましくはリアルタイムなフィードバックつまり瞬間的（すなわち、反応時間を決定するために利用できる技術によって決定されるような事実上瞬間的）である。一部の実施形態において、中性電極は、所望の組織においてインピーダンスを測定し、インピーダンスをこのフィードバック機構へ伝達し、このフィードバック機構はインピーダンスに応答し、事前設定電流と同じような値で定電流を維持するためにエネルギーパルスを調節する。一部の実施形態において、このフィードバック機構は、エネルギーパルス送達の間、連続的にかつ瞬間的に定電流を維持する。 In some embodiments, this feedback mechanism is performed by either hardware or software. Preferably, this feedback mechanism is performed by an analog closed loop circuit. Preferably, this feedback occurs every 50 μs, 20 μs, 10 μs, or 1 μs, but preferably real-time feedback or instantaneous (ie, virtually instantaneous as determined by techniques available to determine reaction time) ). In some embodiments, the neutral electrode measures impedance in the desired tissue and transmits the impedance to the feedback mechanism, which responds to the impedance and has a constant current at a value similar to the preset current. Adjust the energy pulse to maintain. In some embodiments, the feedback mechanism maintains a constant current continuously and instantaneously during energy pulse delivery.
一部の実施形態において、この核酸分子を、ポリヌクレオチド機能エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進剤の投与と併用して、これらの細胞に送達する。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号および１９９４年１月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日に提出された米国特許第０２１，５７９号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。核酸分子と併用して投与する助剤を、核酸分子の投与前後に、この核酸分子との混合物として投与するか、または別々に、同時に投与してもよい。さらに、トランスフェクション剤および／または複製剤および／または炎症性薬剤として機能し得、かつＧＶＦと一緒に投与され得る他の薬剤には、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などの増殖因子、サイトカインおよびリンホカイン、ならびに線維芽細胞増殖因子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバンド、モノホスホリルリピドＡ（ＷＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンスクアレンなどの小胞が含まれ、かつヒアルロン酸も、この遺伝子構築物と併用して投与に使用してもよい。一部の実施形態において、免疫調節タンパク質を、ＧＶＦとして使用してもよい。一部の実施形態において、この核酸分子はＰＬＧと関連して提供され、送達および取り込みを高める。 In some embodiments, the nucleic acid molecule is delivered to these cells in combination with administration of a polynucleotide function enhancer or genetic vaccine enhancer. Polynucleotide function enhancers are described in US Pat. Nos. 5,593,972, 5,962,428 and International Application No. PCT / US94 / 00899 filed on Jan. 26, 1994, Each of which is incorporated herein by reference. Genetic vaccine promoters are described in US Pat. No. 021,579 filed Apr. 1, 1994, which is incorporated herein by reference. The adjuvant administered in combination with the nucleic acid molecule may be administered as a mixture with the nucleic acid molecule before or after the administration of the nucleic acid molecule, or may be administered separately or simultaneously. In addition, other agents that can function as transfection and / or replication agents and / or inflammatory agents and can be administered with GVF include α-interferon, γ-interferon, GM-CSF, platelet derived proliferation Factors (PDGF), TNF, epidermal growth factor (EGF), growth factors such as IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 and IL-15, cytokines and lymphokines , And surface active agents such as fibroblast growth factor, immune stimulating complex (ISCOMS), LPS analogs including Freund's incomplete adjuvant, monophosphoryl lipid A (WL), muramyl peptides, quinone analogs and squalene squalene , And hyaluronic acid is also administered in combination with this gene construct May be used for In some embodiments, immunomodulating proteins may be used as GVF. In some embodiments, the nucleic acid molecule is provided in association with PLG to enhance delivery and uptake.
本発明による医薬組成物は、約１ｎｇ〜約２０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による医薬組成物は、約５ｎｇ〜約１０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１０ｎｇ〜約８００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約０．１〜約５００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１〜約３５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約２５〜約２５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１００〜約２００μｇのＤＮＡを含む。 The pharmaceutical composition according to the present invention comprises about 1 ng to about 2000 μg of DNA. In some preferred embodiments, the pharmaceutical compositions according to the invention comprise about 5 ng to about 1000 μg of DNA. In some preferred embodiments, these pharmaceutical compositions comprise about 10 ng to about 800 μg of DNA. In some preferred embodiments, these pharmaceutical compositions contain about 0.1 to about 500 μg of DNA. In some preferred embodiments, these pharmaceutical compositions contain about 1 to about 350 μg of DNA. In some preferred embodiments, these pharmaceutical compositions contain about 25 to about 250 μg of DNA. In some preferred embodiments, these pharmaceutical compositions contain about 100 to about 200 μg of DNA.
本発明による医薬組成物を、使用する投与方法に従って処方する。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合において、注射可能な医薬組成物は無菌であり、発熱物質も粒子も含まない。好ましくは、等張製剤を使用する。一般に、等張にするための添加剤には、塩化ナトリウム、Ｄ型グルコース、マンニトール、ソルビトールおよび乳糖が含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。一部の実施形態において、血管収縮剤をこの製剤に加える。 The pharmaceutical composition according to the invention is formulated according to the method of administration used. Where the pharmaceutical composition is an injectable pharmaceutical composition, the injectable pharmaceutical composition is sterile and does not contain pyrogens or particles. Preferably, an isotonic formulation is used. In general, additives for isotonicity may include sodium chloride, D-type glucose, mannitol, sorbitol and lactose. In some cases, isotonic solutions such as phosphate buffered saline are preferred. Stabilizers include gelatin and albumin. In some embodiments, a vasoconstrictor is added to the formulation.
本発明の一部の実施形態によると、免疫反応を誘導する方法が提供される。このワクチンは、タンパク質に基づく、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組み換えワクチンまたは核酸もしくはＤＮＡワクチンであってもよい。一部の実施形態において、粘膜免疫反応を誘導する方法を含む、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片またはそれらの発現できるコード配列のうちの１つ以上を、本発明のタンパク質をコードする単離した核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換えワクチン、および／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンと組み合わせて、この個体に投与することを含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片のうちの１つ以上を、免疫原をコードする単離した核酸分子；および／もしくは免疫原をコードする組み換えワクチンおよび／もしくは免疫原を含むサブユニットワクチンおよび／もしくは弱毒化生ワクチンおよび／もしくは不活化ワクチンの投与前に、それらの投与と同時に、またはそれらの投与の後に投与してもよい。一部の実施形態において、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣおよびそれらの機能的断片からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離した核酸分子を、この個体に投与する。 According to some embodiments of the invention, a method for inducing an immune response is provided. This vaccine may be a protein-based live attenuated vaccine, a cellular vaccine, a recombinant vaccine or a nucleic acid or DNA vaccine. In some embodiments, a method of inducing an immune response against an immunogen in an individual, including a method of inducing a mucosal immune response, comprises CTACK protein, TECK protein, MEC protein and functional fragments thereof or codes capable of expressing them One or more of the sequences may comprise an isolated nucleic acid molecule encoding the protein of the invention and / or a recombinant vaccine encoding the protein of the invention, and / or a subunit vaccine and / or attenuation of the protein of the invention. Administration to this individual in combination with a live and / or inactivated vaccine. An isolated nucleic acid molecule that encodes an immunogen with one or more of the CTACK protein, TECK protein, MEC protein, and functional fragments thereof; and / or a recombinant vaccine and / or immunogen that encodes the immunogen The subunit vaccine and / or the attenuated live vaccine and / or the inactivated vaccine may be administered before, simultaneously with, or after their administration. In some embodiments, an isolated nucleic acid molecule encoding one or more proteins selected from the group consisting of CTACK, TECK, MEC and functional fragments thereof is administered to the individual.
本発明を、以下の実施例においてさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すが、単なる説明の目的で与えられるということが理解されるべきである。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を突き止めることができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に本発明を適用するために、本発明の様々な変更および改良を行うことができる。したがって、本明細書に示され、記載される改良に加えて、本発明の様々な改良は、先の記載から当業者に明らかになるであろう。かかる改良は、添付の特許請求の範囲に入ることも意図される。 The invention is further described in the following examples. While these examples illustrate preferred embodiments of the present invention, it should be understood that they are given for illustrative purposes only. From the above description and these examples, those skilled in the art can ascertain the essential features of the present invention and to apply the present invention to various uses and conditions without departing from the spirit and scope of the present invention. Various modifications and improvements of the present invention can be made. Accordingly, in addition to the improvements shown and described herein, various modifications of the present invention will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are also intended to fall within the scope of the appended claims.
米国特許、米国特許出願、および本開示の全体を通して引用される参考文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。 Each of the US patents, US patent applications, and references cited throughout the present disclosure are hereby incorporated by reference in their entirety.
実施例
本発明を、さらに以下の実施例で定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のみの目的で与えられることを理解されたい。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の本質的特徴を確認することができ、様々な使用および条件に適合させるために、本発明の様々な変化および変更を行うことができる。したがって、本明細書に示し、記載したものに加えて、前述の記載から本発明の様々な変更が当業者には明らかであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内であることも意図される。
Examples The invention is further defined in the following examples. While these examples illustrate preferred embodiments of the present invention, it should be understood that they are given for illustrative purposes only. From the above description and these examples, those skilled in the art can ascertain the essential features of the present invention without departing from the spirit and scope of the present invention and to adapt it to various uses and conditions. Various changes and modifications of the invention can be made. Accordingly, various modifications of the invention will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description, in addition to those shown and described herein. Such modifications are also intended to fall within the scope of the appended claims.
実施例１
ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６／Ｅ７のワクチン設計ならびに発現
ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６／Ｅ７コンセンサスに基づく融合免疫原の構築
ＨＰＶ６型またはＨＰＶ１１型のＥ６／Ｅ７遺伝子配列をＧｅｎｅＢａｎｋから収集し、コンセンサスＥ６およびＥ７のヌクレオチド配列を、多重アライメントを行った後に取得した。ＨＰＶ６のＥ６またはＥ７タンパク質のコンセンサス配列を、それぞれ９８個または２０個の配列から作製し、ＨＰＶ１１のＥ６またはＥ７タンパク質のコンセンサス配列を、それぞれ７６個または１３個の配列から作製した。系統発生的研究に適用される多重アライメント手順には、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ（２．０版）の適用が含まれていた。図１Ａおよび図１Ｂに示す通り、ＨＰＶ株間であって、それらのＥ６およびＥ７タンパク質の同じ型に属するＨＰＶ株間で配列分散が約０〜２％存在した。しかし、遺伝距離は、ＨＰＶ６とＨＰＶ１１の間でＥ６タンパク質では１９．３％まで、Ｅ７タンパク質では１６．３％まで上げることができた。系統発生分析のこれらの結果に基づいて、２つの型特異的なＥ６／Ｅ７コンセンサスＤＮＡワクチンを開発した。
Example 1
HPV6 and HPV11 E6 / E7 vaccine design and expression Construction of fusion immunogens based on HPV6 and HPV11 E6 / E7 consensus HPV6 or HPV11 E6 / E7 gene sequences were collected from GeneBank and consensus E6 and E7 nucleotides The sequence was obtained after performing multiple alignments. HPV6 E6 or E7 protein consensus sequences were generated from 98 or 20 sequences, respectively, and HPV11 E6 or E7 protein consensus sequences were generated from 76 or 13 sequences, respectively. Multiple alignment procedures applied to phylogenetic studies included the application of Clustal X (version 2.0). As shown in FIGS. 1A and 1B, there was approximately 0-2% sequence variance between HPV strains and among HPV strains belonging to the same type of their E6 and E7 proteins. However, the genetic distance could be increased between HPV6 and HPV11 to 19.3% for the E6 protein and 16.3% for the E7 protein. Based on these results of phylogenetic analysis, two type-specific E6 / E7 consensus DNA vaccines were developed.
コンセンサスＥ６／Ｅ７融合配列を作製した後に、いくつかの変更を行った（図１Ｃ）。発現を促進させるために、高性能リーダー配列を開始コドンの上流にインフレームで融合した。コドンおよびＲＮＡの最適化も、以前に記載されたとおりに行った（Ｊ.Ｙａｎ,ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ＨＰＶ１８ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ Ｅ６／Ｅ７ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ,Ｖａｃｃｉｎｅ.２６（２００８）５２１０−５２１５；およびＪ.Ｙａｎ,ｅｔ ａｌ.,Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＨＰＶ−１６ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ Ｅ６／Ｅ７ ｆｕｓｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ,Ｖａｃｃｉｎｅ.２７（２００９）４３１−４４０）。適切なタンパク質フォールディングおよび良好なＣＴＬプロセシングのために、細胞内タンパク質分解切断部位をＥ６およびＥ７タンパク質の間に導入した。遺伝子工学処理した合成６Ｅ６Ｅ７遺伝子と１１Ｅ６Ｅ７遺伝子の両方は、長さが８４０ｂｐであった。さらなる研究のために、配列を確認した合成遺伝子を、それぞれｐＶＡＸ発現ベクターのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。コンセンサスヌクレオチド配列を翻訳することによって、コンセンサスアミノ酸配列を取得した。 Several changes were made after creating the consensus E6 / E7 fusion sequence (FIG. 1C). A high performance leader sequence was fused in-frame upstream of the start codon to facilitate expression. Codon and RNA optimization was also performed as previously described (J. Yan, et al., Cellular Immunity Induced By a Novel HPV18 DNA vaccine encoding an E6 / E7 fusion concein in m .26 (2008) 5210-5215; and J. Yan, et al., Induction of anti-immunity in vivo following the delivery of a novel HPV-16 DNA vaccine encoding in E7 / 200 e7 / 200. 440). An intracellular proteolytic cleavage site was introduced between the E6 and E7 proteins for proper protein folding and good CTL processing. Both the genetically engineered synthetic 6E6E7 and 11E6E7 genes were 840 bp in length. For further study, the sequence confirmed synthetic genes were subcloned into the BamHI and XhoI sites of the pVAX expression vector, respectively. A consensus amino acid sequence was obtained by translating the consensus nucleotide sequence.
ＨＰＶ６および１１のコンセンサスＥ６配列ならびにＨＰＶ６および１１のコンセンサスＥ７配列を取得した後に、コドン最適化およびＲＮＡ最適化を以前に記載された通りに行った（Ｊ.Ｙａｎ,ｅｔ ａｌ.,Ｖａｃｃｉｎｅ.２６（２００８）５２１０−５２１５；およびＪ.Ｙａｎ,ｅｔ ａｌ.,Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ,Ｖａｃｃｉｎｅ.２７（２００９）４３１−４４０）。ＨＰＶ６型または１１型のコンセンサスＥ６／Ｅ７融合タンパク質のいずれかをコードする融合遺伝子（６Ｅ６Ｅ７または１１Ｅ６Ｅ７）を合成し、配列を確認した。合成した６Ｅ６Ｅ７または１１Ｅ６Ｅ７を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化し、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下の発現ベクターｐＶＡＸ（インビトロジェン社）にクローニングし、これらのコンストラクトをｐ６Ｅ６Ｅ７またはｐ１１Ｅ６Ｅ７と命名した。 After obtaining HPV6 and 11 consensus E6 sequences and HPV6 and 11 consensus E7 sequences, codon optimization and RNA optimization were performed as previously described (J. Yan, et al., Vaccine. 26 ( 2008) 5210-5215; and J. Yan, et al., Induction, Vaccine. 27 (2009) 431-440). A fusion gene (6E6E7 or 11E6E7) encoding either HPV type 6 or type 11 consensus E6 / E7 fusion protein was synthesized and sequence confirmed. The synthesized 6E6E7 or 11E6E7 was digested with BamHI and XhoI and cloned into the expression vector pVAX (Invitrogen) under the control of the cytomegalovirus immediate early promoter, and these constructs were named p6E6E7 or p11E6E7.
２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートで培養し、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、インディアナ州インディアナポリス）を用いてｐＶＡＸ、ｐ６Ｅ６Ｅ７、またはｐ１１Ｅ６Ｅでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、これらの細胞を、改変ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液を用いて溶解させ、細胞可溶化液を回収した。抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）を用いてウエスタンブロット解析を行い、ＥＣＬＴＭウエスタンブロット解析システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）で可視化した。 293T cells were cultured in 6-well plates and transfected with pVAX, p6E6E7, or p11E6E using FuGENE6 transfection reagent (Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.). Two days after transfection, these cells were lysed using a modified RIPA cell lysis buffer, and the cell lysate was collected. Western blot analysis was performed using an anti-HA monoclonal antibody (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) and horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG (Sigma) using an ECLTM Western blot analysis system (Amersham, Piscataway, NJ). -Visualization with Aldrich, St. Louis, MO.
ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の発現を確認するために、ヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）を用いて間接免疫蛍光アッセイを行った。チャンバースライドで培養したＲＤ細胞を、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔｉｎ ８．０（Ｏｒｉｇｅｎｅ社、メリーランド州ロックビル）を用いてｐＶＡＸ、ｐ６Ｅ６Ｅ７またはｐ１１Ｅ６Ｅ７でトランスフェクトした。その後、これらの細胞をＰＦＡで固定し、ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで透過処理した。これらの細胞を、１次抗体および２次抗体と１〜２時間それぞれインキュベートし、２回のインキュベーションの間に、グリシンおよびＢＳＡを補充したＰＢＳで洗浄した。使用した１次抗体および２次抗体は、それぞれモノクローナルマウス抗ＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）およびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）であった。ヘキスト染色も行って、細胞核を識別し、ＲＤ細胞を局在化させた。全てのインキュベーションが完了した後に、これらの細胞をマウントとし、ガラススライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、アラバマ州バーミンガム）で固定した。これらの試料を、共焦点顕微鏡（ＣＤＢ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｃｏｒｅ、ペンシルベニア大学、細胞発生生物学、ペンシルベニア州フィラデルフィア）を用いて観察し、撮像した。 To confirm the expression of p6E6E7 and p11E6E7, an indirect immunofluorescence assay was performed using human rhabdomyosarcoma cells (RD cells). RD cells cultured on chamber slides were transfected with pVAX, p6E6E7 or p11E6E7 using Turbofectin 8.0 (Origene, Rockville, Md.). Thereafter, these cells were fixed with PFA and permeabilized with 0.1% Triton-X in PBS. These cells were incubated with primary and secondary antibodies for 1-2 hours, respectively, and washed with PBS supplemented with glycine and BSA between the two incubations. The primary and secondary antibodies used were monoclonal mouse anti-HA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) and FITC-conjugated anti-mouse IgG (Abcam, Cambridge, Mass.), Respectively. Hoechst staining was also performed to identify cell nuclei and localize RD cells. After all incubation was complete, the cells were mounted and glass slides were fixed with Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, Alab.). These samples were observed and imaged using a confocal microscope (CDB Microscopy Core, University of Pennsylvania, Cell Developmental Biology, Philadelphia, PA).
実施例２
マウスおよび処置群の免疫化
６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスをこの実験に用いた。マウスを、ジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から入手した。これらのマウスを、米国国立衛生研究所およびペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）)の方針に従って、ペンシルベニア大学の動物資源研究所に収容し、維持した。これらの実験で用いたマウスを、免疫化のために４群に分けた。マウスをｐ６Ｅ６Ｅ７、ｐ１１Ｅ６Ｅ７、または両方のコンストラクトで免疫化し、ｐＶＡＸ群を陰性対照とした。
Example 2
Immunization of mice and treatment groups Female C57BL / 6 mice 6-8 weeks old were used in this experiment. Mice were obtained from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine). These mice were housed and maintained at the Institute of Animal Resources at the University of Pennsylvania according to the policies of the National Institutes of Health and the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) at the University of Pennsylvania. The mice used in these experiments were divided into 4 groups for immunization. Mice were immunized with p6E6E7, p11E6E7, or both constructs and the pVAX group served as a negative control.
ＤＮＡワクチン接種および電気穿孔法
各マウスに、１４日の間隔を空けて各ＤＮＡプラスミド２０μｇを３回投与した。ｐ６Ｅ６Ｅ７とｐ１１Ｅ６Ｅ７との両方を接種される群のマウスは、ワクチン接種あたり両方のプラスミド２０μｇ、合計４０μｇのＤＮＡを接種された。これらのＤＮＡコンストラクトを、右大腿四頭筋への筋肉注射により投与し、その後、短形波をＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）エレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ペンシルベニア州ブルーベル）により生成させた。このエレクトロポレーターを、５２ｍｓ／パルス、０．２アンペアで、１秒遅れの間隔で２つの電気パルスを送るように構成した。電気穿孔手順は、以前に記載された通りに行った（１２、１３）。
DNA vaccination and electroporation Each mouse was administered 3 times with 20 μg of each DNA plasmid, 14 days apart. The group of mice vaccinated with both p6E6E7 and p11E6E7 were vaccinated with 20 μg of both plasmids per vaccination for a total of 40 μg of DNA. These DNA constructs were administered by intramuscular injection into the right quadriceps, and then a short wave was generated by a CELLECTRA ™ electroporator (Inobio Pharmaceuticals, Inc., Bluebell, Pa.). The electroporator was configured to send two electrical pulses at an interval of 1 second at 52 ms / pulse, 0.2 amps. The electroporation procedure was performed as previously described (12, 13).
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
治療群と対照群との両方のマウスを、３回目の免疫化の１週間後に屠殺した。脾臓を各マウスから採取し、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｒ１０）に移した。ストマッカー（Ｓｅｗａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ニューヨーク州ボヘミア）を用いて、脾臓を粉砕し、その後、セルストレーナーを通して移し、ＡＣＫ溶解緩衝液に懸濁させた。赤血球を除去した後、脾細胞を単離し、Ｒ１０培地に懸濁した。高タンパクＩＰ９６−ウェルマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）（商標）プレート（ミリポア社、マサチューセッツ州ベッドフォード）を、モノクローナルマウスＩＦＮ−γ捕捉抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）で予めコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。１×XＰＢＳで３回洗浄した後、これらのプレートを１×ＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび５％スクロースで、周囲温度で２時間ブロッキングした。Ｒ１０培地中の単離した脾細胞を計数し、ウェル当たり２×１０5細胞で３連のウェルに添加した。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のコンセンサスＥ６／Ｅ７配列に及ぶ２組のペプチドを、ＤＭＳＯ（ＵＳＡ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で再構成した。これらのペプチドは１５個のアミノ酸配列を含み、そのうちの８残基が各シーケンシャルペプチドと重複していた。ＨＰＶ６および１１のペプチドを、それぞれＤＭＳＯ中２μｇ／ｍｌの濃度で２つのプール（一方のプールはＥ６、別のプールはＥ７）に分けた。陽性対照および陰性対照用のウェルに、それぞれ、ペプチドの代わりにコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ミズーリ州セントルイス）およびＲ１０培地を入れた。その後、プレートを、５％のＣＯ２雰囲気のインキュベーターに入れた。３７℃で２４時間インキュベーションした後、これらのウェルを１×ＰＢＳで洗浄した。ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γ検出抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を各ウェルに添加し、次いで、４℃で一晩インキュベートした。その後、これらのプレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＰおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴプラス（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、Ｒ＆Ｄシステムズが提供する発色プロトコールにより処理した。これらのウェルを一晩空気乾燥し、ウェル内部のスポットを、ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーシステムによりＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）３およびＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）４のソフトウェアを用いてスキャンし、計数した（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ.、オハイオ州シェーカーハイツ）。報告されたスポット形成細胞数を変換し、演算を使用して、１×１０6個の脾細胞あたりのスポット形成単位を示した。
IFN-γ ELISpot assay Both treatment and control mice were sacrificed one week after the third immunization. Spleens were collected from each mouse and transferred to RPMI-1640 medium (R10) containing 10% FBS and antibiotics. The spleen was crushed using a stomacher (Seward Laboratory Systems, Bohemia, NY) and then transferred through a cell strainer and suspended in ACK lysis buffer. After removing red blood cells, splenocytes were isolated and suspended in R10 medium. High protein IP96-well Multiscreen ™ plates (Millipore, Bedford, Mass.) Were pre-coated with monoclonal mouse IFN-γ capture antibody (R & D Systems, Minneapolis, MN) and incubated at 4 ° C. Incubated overnight. After washing 3 times with 1 × XPBS, the plates were blocked with 1% BSA and 5% sucrose in 1 × PBS for 2 hours at ambient temperature. Isolated splenocytes in R10 medium were counted and added to triplicate wells at 2 × 10 5 cells per well. Two sets of peptides spanning the HPV6 and HPV11 consensus E6 / E7 sequences were reconstituted with DMSO (USA GenScript, Piscataway, NJ). These peptides contained a 15 amino acid sequence, of which 8 residues overlapped with each sequential peptide. HPV6 and 11 peptides were divided into two pools (E6 for one pool and E7 for another pool) at a concentration of 2 μg / ml in DMSO, respectively. Concanavalin A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) and R10 medium were placed in the positive and negative control wells, respectively, instead of peptide. The plates were then placed in an incubator with a 5% CO2 atmosphere. After incubation for 24 hours at 37 ° C., the wells were washed with 1 × PBS. Biotinylated anti-mouse IFN-γ detection antibody (R & D Systems, Minneapolis, Minn.) Was added to each well and then incubated overnight at 4 ° C. The plates were then washed and processed with streptavidin-AP and BCIP / NBT Plus (R & D Systems, Minneapolis, Minn.) According to the color protocol provided by R & D Systems. The wells were air-dried overnight, and the spots inside the wells were scanned and counted using the ImmunoSpot® 3 and ImmunoSpot® 4 software with an ELISpot plate reader system (Cellular Technology Ltd., Shaker Heights, Ohio). The reported spot-forming cell numbers were converted and used to show spot-forming units per 1 × 10 6 splenocytes.
それらの感度及びＴ細胞活性を示す能力を前提として、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＨＰＶ６または１１のＥ６およびＨＰＶ６または１１のＥ７ペプチドのいずれかでの刺激に反応して、抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌細胞数を決定した。 Given their sensitivity and ability to exhibit T cell activity, the IFN-γ ELISpot assay was used to respond to stimulation with either HPV6 or 11 E6 and HPV6 or 11 E7 peptides in an antigen-specific manner. The number of IFN-γ secreting cells was determined.
図３Ａおよび３Ｂに示すように、ｐ６Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスのＳＦＵ／１０６脾細胞の平均数は１４４２．８であり、ｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスのＳＦＵ／１０６脾細胞の平均数は２８４５であり、これらは全て、陰性対照群を著しく上回っていた。したがって、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の両方は、マウスにおいて強力な型特異的Ｅ６およびＥ７特異的免疫反応を誘発するのに有効であった。 As shown in FIGS. 3A and 3B, the mean number of SFU / 106 splenocytes from mice immunized with p6E6E7 is 1442.8, and the mean number of SFU / 106 splenocytes from mice immunized with p11E6E7 is 2845, All were significantly above the negative control group. Thus, both p6E6E7 and p11E6E7 were effective in inducing strong type-specific E6 and E7-specific immune responses in mice.
興味深いことに、交差反応性の細胞性免疫反応も、ｐ６Ｅ６Ｅ７またはｐ１１Ｅ６Ｅ７での免疫化により誘導された。ｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫化したマウスにおけるＨＰＶ６のＥ６／Ｅ７ペプチドに対するＳＦＵ／１０６脾細胞の添加頻度は、５５２．８ＳＦＵ／１０６脾細胞であり、ｐ６Ｅ６Ｅ７で免疫化したマウスにおけるＨＰＶ１１のＥ６／Ｅ７特異的免疫反応は、８８８．３ＳＦＵ／１０６脾細胞であった。ＨＰＶ６または１１のＥ６タンパク質は、約８０％の同一性を共有し、ＨＰＶ６または１１のＥ７タンパク質は、約８４％の同一性を共有した。ＨＰＶ６または１１のＥ６抗原とＨＰＶ６または１１のＥ７抗原の間にはいくつかの共有免疫エピトープが存在し得る。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイから観察される交差反応性は、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６抗原とＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ７抗原との間に共有免疫エピトープがあることを示した。 Interestingly, cross-reactive cellular immune responses were also induced by immunization with p6E6E7 or p11E6E7. The frequency of addition of SFU / 106 splenocytes to HPV6 E6 / E7 peptide in mice immunized with p11E6E7 is 552.8 SFU / 106 splenocytes, and HPV11 E6 / E7 specific immune response in mice immunized with p6E6E7 Was 888.3 SFU / 106 splenocytes. HPV6 or 11 E6 proteins shared about 80% identity and HPV6 or 11 E7 proteins shared about 84% identity. There may be several covalent immune epitopes between the HPV6 or 11 E6 antigen and the HPV6 or 11 E7 antigen. The cross-reactivity observed from the IFN-γ ELISpot assay indicated that there was a shared immune epitope between the HPV6 and HPV11 E6 antigens and the HPV6 and HPV11 E7 antigens.
ｐ６Ｅ６Ｅ７とｐ１１Ｅ６Ｅ７（組み合わせ群）の両方を受け取ったマウスの脾細胞も、これらの２つのコンストラクトを一緒に免疫化する場合に、任意の免疫干渉があるか否かを調べるために、上記のＥＬＩＳｐｏｔアッセイに供した（図３Ａおよび図３Ｂ）。ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７ペプチドに対する組み合わせ群の平均値は、１６７０ＳＦＵ／１０６脾細胞（σ＝５５．７、Ｐ＜０．００１）であった。ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７ペプチドに対する脾細胞の同じグループは、２０１０ＳＦＵ／１０６脾細胞（σ＝２４７．８、Ｐ＝０．００２）をもたらした。これらのデータは、２つのコンストラクトでの同時免疫化が、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１に対して統計的に有意なＥ６およびＥ７特異的細胞性反応を誘発することができ、これらの反応は互いに干渉しないことを示唆する。 To determine whether splenocytes from mice receiving both p6E6E7 and p11E6E7 (combination group) also have any immune interference when immunizing these two constructs together, the ELISpot assay described above. (Figs. 3A and 3B). The average value of the combination group for HPV6 E6 and E7 peptides was 1670 SFU / 106 splenocytes (σ = 55.7, P <0.001). The same group of splenocytes for HPV11 E6 and E7 peptides resulted in 2010 SFU / 106 splenocytes (σ = 247.8, P = 0.002). These data show that co-immunization with the two constructs can elicit statistically significant E6 and E7 specific cellular responses to HPV6 and HPV11, and these responses do not interfere with each other. Suggest.
エピトープマッピング
Ｅ６／Ｅ７コンセンサス抗原内の免疫優性ペプチドを決定するために、エピトープマッピング試験を行い、ペプチドプール内の優性エピトープを決定した（図４Ａおよび図４Ｂ）。これらの試験は、前述のIＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイと同様に行った。プールの代わりに、個々のペプチドを用いて、脾細胞を刺激した。
Epitope mapping To determine the immunodominant peptides within the E6 / E7 consensus antigen, an epitope mapping test was performed to determine the dominant epitopes within the peptide pool (Figures 4A and 4B). These tests were performed in the same manner as the IFN-γ ELISpot assay described above. Instead of the pool, individual peptides were used to stimulate splenocytes.
この単一ペプチド分析に用いた各ペプチドは、ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１のＥ６抗原およびＨＰＶ６またはＨＰＶ１１のＥ７抗原の部分的に重複する断片を示した。マッピングデータは、配列番号１１のペプチド７（ＴＡＥＩＹＳＹＡＹＫＱＬＫＶＬ）が、ＨＰＶ６のＥ６およびＥ７免疫原の優性エピトープであることを示した（図４Ａ）。配列番号１１のＴＡＥＩＹＳＹＡＹＫＱＬＫＶＬは、ＮＩＨ ＢＩＭＡＳによって入手可能なＨＬＡ結合予測ソフトウェアによって制限されるＨ２−Ｋｂであることが確認された８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒのアミノ酸エピトープをそれぞれ含んでいた。さらに、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７特異的Ｔ細胞免疫反応について記載する（図４Ｂ）。また、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７の重複断片を用いてペプチド分析も行った。エピトープマッピングにより、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７抗原の優性エピトープが、配列番号１２のペプチド７（ＴＡＥＩＹＡＹＡＹＫＮＬＫＶＶ）および配列番号１３のペプチド２７（ＨＣＹＥＱＬＥＤＳＳＥＤＥＶＤ）であることが示された。ＨＰＶ６エピトープマッピングアッセイにおけるペプチド７と同様に、ＢＩＭＡＳ ＨＬＡ結合予測ソフトウェアにより、配列番号１２のＴＡＥＩＹＡＹＡＹＫＮＬＫＶＶがＨ２−Ｋｂ制限エピトープであることが確認された。ＮＩＨ ＮＩＡＩＤが提供する別のＨＬＡ結合ペプチドデータベース、免疫エピトープデータベースおよび分析リソースは、配列番号１３のＨＣＹＥＱＬＥＤＳＳＥＤＥＶＤがＨ２−Ｋｂ制限エピトープであることを確認した。準有意の３つの免疫ペプチドである配列番号１４の番号６（ＦＣＫＮＡＬＴＴＡＥＩＹＳＹＡ）、配列番号１５の番号９（ＬＦＲＧＧＹＰＹＡＡＣＡＣＣＬ）、および配列番号１６の番号１３（ＹＡＧＹＡＴＴＶＥＥＥＴＫＱＤ）を、このエピトープマッピング研究を経て同定した。 Each peptide used in this single peptide analysis showed a partially overlapping fragment of HPV6 or HPV11 E6 antigen and HPV6 or HPV11 E7 antigen. Mapping data showed that peptide 7 of SEQ ID NO: 11 (TAEIYSYAYKQLKVL) is the dominant epitope of E6 and E7 immunogens of HPV6 (Figure 4A). TAEIYSYYAYKQLKVL of SEQ ID NO: 11 contained 8mer, 9mer and 10mer amino acid epitopes, respectively, which were confirmed to be H2-Kb restricted by the HLA binding prediction software available by NIH BIMAS. Furthermore, the E6 and E7 specific T cell immune responses of HPV11 are described (FIG. 4B). Peptide analysis was also performed using overlapping fragments of HPV11 E6 and E7. Epitope mapping showed that the dominant epitopes for HPV11 E6 and E7 antigens were peptide 7 of SEQ ID NO: 12 (TAEIYAYAYKNLKVV) and peptide 27 of SEQ ID NO: 13 (HCYEQLEDSSEDEVD). Similar to peptide 7 in the HPV6 epitope mapping assay, BIMAS HLA binding prediction software confirmed that TAEIYAYAYKNLKVV of SEQ ID NO: 12 is an H2-Kb restricted epitope. Another HLA-binding peptide database, immune epitope database and analysis resources provided by NIH NIAID confirmed that HCYELEDSSEDEVD of SEQ ID NO: 13 is an H2-Kb restricted epitope. Three semi-significant immune peptides, SEQ ID NO: 14 number 6 (FCKNALTTAEIYSYYA), SEQ ID NO: 15 number 9 (LFRGGGYPYAACACCL), and SEQ ID NO: 16 number 13 (YAGYATTVEEETKQD) were identified through this epitope mapping study.
細胞内サイトカイン染色
ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって示される高い免疫反応を考慮して、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７により誘導される細胞性反応のより包括的な概要を提供するために、細胞内サイトカイン染色アッセイを行った。免疫化したマウス群および未処理のマウス群の脾細胞を単離し、５％ＣＯ２環境中、３７℃で４時間、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６ならびにＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ７領域にまたがるペプチドで刺激した。このアッセイにおいて陽性対照および陰性対照を、それぞれ、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）およびＲ１０細胞培地中に細胞を入れることによって用いた。インキュベーション後、これらの細胞を最初にＶｉＶｉＤ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）で染色し、生細胞および死細胞を区別し、次いで、全細胞を、ＡＰＣ−Ｃｙ７ハムスター抗マウスＣＤ３ｅ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５ラット抗マウスＣＤ４、およびＡＰＣラット抗マウスＣＤ８ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）、の表面マーカー抗体で染色した。その後、これらの細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて固定した。製造業者のプロトコールに従って固定した後、これらの細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００ラット抗マウスＩＦＮ−γ、ＰＥ−Ｃｙ７ラット抗マウスＴＮＦクローン、およびＰＥラット抗マウスＩＬ−２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンディエゴ）の細胞マーカー抗体で染色した。染色後、これらの細胞を、２％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液で固定した。調製した細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）が搭載されたＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いて得た。取得したデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、オレゴン州アッシュランド）の最新バージョンを使用して分析した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋のイベントを、ＦＳＣ−Ａ対ＦＳＣ−Ｈからのシングレット、ＦＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ａからの全脾細胞、ＶｉＶｉＤ染料（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ社）対ＳＳＣ−Ａからの生細胞、ＣＤ３（ＡＰＣ−Ｃｙ７）対ＳＳＣ−ＡからのＣＤ３＋細胞、ＣＤ４（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５：陽性−ＣＤ４＋、陰性−ＣＤ８＋）対ＳＳＣ−ＡからのＣＤ４＋またはＣＤ８＋というゲートの順番を用いて単離した。最後の２つの集団を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、ＰＥ−Ｃｙ７、およびＰＥに対してゲーティングし、それぞれＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生の変化を観察した。
Intracellular cytokine staining In view of the high immune response exhibited by the IFN-γ ELISpot assay, an intracellular cytokine staining assay was performed to provide a more comprehensive overview of cellular responses induced by p6E6E7 and p11E6E7 . Spleen cells from the immunized and untreated groups of mice were isolated and stimulated with peptides spanning HPV6 and HPV11 E6 and HPV6 and HPV11 E7 regions in a 5% CO2 environment at 37 ° C for 4 hours. In this assay, positive and negative controls were used by placing cells in phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and R10 cell media, respectively. After incubation, these cells are first stained with ViViD dye (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) To distinguish between live and dead cells, and then whole cells are APC-Cy7 hamster anti-mouse CD3e, PerCP-Cy5. 5 rat anti-mouse CD4 and APC rat anti-mouse CD8a (BD Biosciences, San Diego, Calif.) Were stained with surface marker antibodies. These cells were then fixed using the Cytofix / Cytoperm kit (BD Biosciences, San Diego, Calif.). After fixing according to the manufacturer's protocol, these cells were transfected with Alexa Fluor 700 rat anti-mouse IFN-γ, PE-Cy7 rat anti-mouse TNF clone, and PE rat anti-mouse IL-2 (BD Biosciences, San Diego, CA). Stained with cell marker antibody. After staining, these cells were fixed with a PBS solution containing 2% paraformaldehyde. The prepared cells were obtained using an LSRII flow cytometer equipped with BD FACSDiva software (BD Biosciences, San Jose, Calif.). The acquired data was analyzed using the latest version of FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR). CD4 + and CD8 + events were analyzed for singlets from FSC-A vs. FSC-H, whole splenocytes from FSC-A vs. SSC-A, ViViD dye (Pacific Blue) vs. live cells from SSC-A, CD3 (APC -Cy7) vs. CD3 + cells from SSC-A, CD4 (PerCP-Cy5.5: positive-CD4 +, negative-CD8 +) vs. CD4 + or CD8 + from SSC-A gated order. The last two populations were gated against Alexa Fluor700, PE-Cy7, and PE, and changes in IL-2, IFN-γ and TNF-α production were observed, respectively.
細胞内サイトカイン染色データが、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の反応により区別することができるように細胞をゲーティングした。ＨＰＶ６ Ｅ６およびＥ７特異的なペプチドで刺激した場合、ｐ６Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生する全ＣＤ４＋細胞の平均値は、それぞれ０．１６３％（σ＝０．０９）、０．００３％（σ＝０．０７）、０．１８８％（σ＝０．２０）であった（図５Ａ）。マウスの同じグループのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生する全ＣＤ８＋細胞の平均値は、それぞれ３．３２３％（σ＝１．３９）、０．８３８％（σ＝０．３２）、および１．１７２％（σ＝１．８１）であった。同じ細胞内サイトカインデータを、ＨＰＶ１１のＥ６およびＥ７抗原とのインキュベーション後にｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスの脾細胞を用いて収集した（図５Ｂ）。ｐ１１Ｅ６Ｅ７免疫化マウスの全ＣＤ４＋細胞のうち、ＩＦＮ−γを産生した細胞の平均値は０．０５１％（σ＝０．０４）、ＴＮＦ−αを産生した細胞の平均値は０．０６８％（σ＝０．０９）、ＩＬ−２を産生した細胞の平均値は０．０２６％（σ＝０．０３７）であった。さらに、ｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫したマウスにおいて、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生した全ＣＤ８＋細胞の平均値は、それぞれ４．５２％（σ＝２．５３）、２．０８％（σ＝１．５６）、および０．２１％（σ＝０．２２）であった。いくつかのパネルを除いて、処理群対それらのそれぞれの未処理群のサイトカイン産生細胞の割合は、８９％以上の信頼水準で統計的に有意であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカイン産生の程度の観察により、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７によって誘発される免疫反応は、全てのモデルにおいてそれらの細胞クリアランスと関連付けられるＣＤ８＋リンパ球の駆動に向かって大きく偏っていると結論付けることができる。 Cells were gated so that intracellular cytokine staining data could be distinguished by CD4 + and CD8 + cell responses. When stimulated with HPV6 E6 and E7 specific peptides, the mean value of total CD4 + cells producing IFN-γ, TNF-α, and IL-2 in mice immunized with p6E6E7 was 0.163% (σ = 0.09), 0.003% (σ = 0.07), and 0.188% (σ = 0.20) (FIG. 5A). The average values of all CD8 + cells producing IFN-γ, TNF-α, and IL-2 from the same group of mice were 3.332% (σ = 1.39) and 0.838% (σ = 0.0.3, respectively). 32), and 1.172% (σ = 1.81). The same intracellular cytokine data were collected using splenocytes from mice immunized with p11E6E7 after incubation with HPV11 E6 and E7 antigens (FIG. 5B). Among all CD4 + cells of p11E6E7 immunized mice, the average value of cells that produced IFN-γ was 0.051% (σ = 0.04), and the average value of cells that produced TNF-α was 0.068% ( σ = 0.09), and the average value of cells that produced IL-2 was 0.026% (σ = 0.039). Furthermore, in mice immunized with p11E6E7, the average values of all CD8 + cells that produced IFN-γ, TNF-α, and IL-2 were 4.52% (σ = 2.53) and 2.08% ( σ = 1.56), and 0.21% (σ = 0.22). With the exception of some panels, the proportion of cytokine-producing cells in the treated group versus their respective untreated group was statistically significant at a confidence level of 89% or higher. Observation of the degree of cytokine production of CD4 + T cells versus CD8 + T cells concludes that the immune response elicited by p6E6E7 and p11E6E7 is largely biased towards driving CD8 + lymphocytes associated with their cell clearance in all models Can be attached.
統計分析
スチューデントｔ検定を行い、この研究で生じた全ての定量的データの統計的有意性を解析した。特に明示しない限り、ｐ値を計算し、様々な信頼レベルで統計的有意性を決定した。
Statistical analysis Student t-tests were performed to analyze the statistical significance of all quantitative data generated in this study. Unless otherwise stated, p-values were calculated and statistical significance was determined at various confidence levels.
この研究は、ＤＮＡワクチンが、実績があり従来から使用されている他のワクチンプラットフォームを用いた実験で見出された免疫原性のレベルを達成することができる可能性の説得力のある証拠を示した。他の類似のＥ６およびＥ７特異的ＨＰＶ ＤＮＡワクチン研究で測定された高レベルの細胞性反応は、予防的および治療的な抗腫瘍効果を示唆するデータと関連していた。ほとんどのＨＰＶ関連の研究および疾患の負荷モデルは、子宮頸癌に焦点を当てている。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１が、他のＨＰＶ血清型と同じくらい子宮頸癌と関係しないことを考慮すると、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の治療効果は、完全に従来のＨＰＶ疾患の負荷モデルを用いて評価することはできない。適切な疾患の負荷モデルが利用可能である場合、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の保護ならびに治療の可能性を判断することは洞察に満ちている。したがって、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイおよび細胞内サイトカイン染色によって定量化される高レベルのＩＦＮ−γならびにサイトカイン産生を調べることにより、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１Ｅ６Ｅ７の免疫原性の有効性を推測することができる。それにもかかわらず、そのようなレベルは、大きさが著しく強いこと、かつ２つのコンストラクトが、実質的なレベルの細胞性免疫反応を誘発するという見込みを示すことが見出された。ＨＰＶ関連の悪性腫瘍が、一般に、複数の血清型の同時感染に続発しているため、ウイルスの異なる血清型を対象としたワクチンを組み合わせることの実現可能性をさらに調べる必要性が大いに存在する。Ｔ細胞の動態およびワクチン競争を調べるさらなる研究は、これらの２つのプラスミドの同時免疫化の効果をさらに特徴づけることを保証する。 This study provides compelling evidence that DNA vaccines may be able to achieve the level of immunogenicity found in experiments with other proven and used vaccine platforms. Indicated. High levels of cellular response measured in other similar E6 and E7 specific HPV DNA vaccine studies were associated with data suggesting prophylactic and therapeutic anti-tumor effects. Most HPV-related studies and disease burden models focus on cervical cancer. Given that HPV6 and HPV11 are not as related to cervical cancer as other HPV serotypes, the therapeutic effects of p6E6E7 and p11E6E7 cannot be fully evaluated using traditional HPV disease burden models. It is insightful to determine the protection and therapeutic potential of p6E6E7 and p11E6E7 when appropriate disease burden models are available. Thus, by examining the high levels of IFN-γ and cytokine production quantified by ELISpot assay and intracellular cytokine staining, the immunogenic efficacy of p6E6E7 and p11E6E7 can be inferred. Nevertheless, it has been found that such levels are significantly stronger in size and show the prospect that the two constructs will elicit a substantial level of cellular immune response. Since HPV-related malignancies are generally secondary to co-infection of multiple serotypes, there is a great need to further explore the feasibility of combining vaccines directed against different serotypes of the virus. Further studies examining T cell kinetics and vaccine competition warrant further characterizing the effects of co-immunization of these two plasmids.
細胞内サイトカイン染色により、ｐ６Ｅ６Ｅ７およびｐ１１１Ｅ６Ｅ７での免疫化は、かなりの割合のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生するＴ細胞を誘発することができることが示された。免疫系における現在知られている機能を考慮して、ＩＦＮ−γは、従来、細胞性免疫反応の指標として用いられてきた。これらの重要な役割のいくつかには、自然免疫および獲得免疫を調節し、刺激する能力が含まれる。さらに、ＩＦＮ−γの主な生産者は、ＩＦＮ−γ産生を、抗原に対する所定のワクチン曝露後の細胞免疫原性を測定するのに許容されるモードにさせるＴ細胞であることが広く認められている。ＴＮＦ−αは、免疫系の調節に関与する別のサイトカインである。アポトーシスを誘導し、腫瘍増殖を調節するＴＮＦ−αの既知の能力により、ＴＮＦ−αは、ワクチン接種後の免疫反応を特徴づける際に考慮すべき重要なパラメータになる。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１の潜在的な腫瘍増殖特性を考慮すると、ＴＮＦ−α産生はさらに興味深いものとなり得る。ＩＬ−２は、免疫系におけるＴ細胞の増殖および分化において中心的な役割を果たすことが観察されている別のシグナル伝達分子である。そのため、ＩＬ−２は、特定の免疫反応の程度および品質について更なる見解を得るために、他のサイトカインと組み合わせて検討される場合が多い。上記を考慮すると、ｐ６Ｅ６Ｅ７での免疫化後の顕著な割合のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生するＣＤ４＋ならびにＣＤ８＋細胞は、このワクチンが、強力な免疫反応を誘導することに成功したことを示唆する。ＩＬ−２を分泌するＣＤ４＋細胞を除いて、ｐ１１Ｅ６Ｅ７で免疫化したマウスから単離した細胞についても同じ傾向が当てはまる。さらに、ＣＤ８＋細胞が、免疫化マウスにおける免疫反応を著しく促進したこと（これらの２つのプラスミドの抗腫瘍効果を評価する上で重要である特性）を観察することは注目に値する。 Intracellular cytokine staining showed that immunization with p6E6E7 and p111E6E7 can induce T cells that produce significant proportions of IFN-γ, TNF-α, and IL-2. In view of currently known functions in the immune system, IFN-γ has traditionally been used as an indicator of cellular immune responses. Some of these important roles include the ability to modulate and stimulate innate and acquired immunity. Furthermore, it is widely recognized that the primary producer of IFN-γ is T cells that make IFN-γ production into an acceptable mode for measuring cellular immunogenicity following a given vaccine exposure to antigen. ing. TNF-α is another cytokine involved in the regulation of the immune system. The known ability of TNF-α to induce apoptosis and regulate tumor growth makes TNF-α an important parameter to consider in characterizing post-vaccination immune responses. In view of the potential tumor growth properties of HPV6 and HPV11, TNF-α production can be even more interesting. IL-2 is another signaling molecule that has been observed to play a central role in T cell proliferation and differentiation in the immune system. Therefore, IL-2 is often considered in combination with other cytokines to gain further insight about the extent and quality of a particular immune response. In view of the above, CD4 + and CD8 + cells that produce a significant proportion of IFN-γ, TNF-α, and IL-2 after immunization with p6E6E7, suggest that this vaccine induces a strong immune response. Suggest success. The same trend applies for cells isolated from mice immunized with p11E6E7, except for CD4 + cells that secrete IL-2. Furthermore, it is noteworthy to observe that CD8 + cells significantly enhanced the immune response in immunized mice (a property that is important in assessing the antitumor effects of these two plasmids).
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７８６個以上のヌクレオチドを含む、配列番号１のヌクレオチド配列の断片
からなる群から選択される、ＨＰＶ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。 The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and
A nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding an HPV antigen selected from the group consisting of fragments of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, comprising 786 or more nucleotides .
２５２個以上のアミノ酸を含む、配列番号２のアミノ酸配列の断片をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。 The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and 252 or more amino acids, comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence encoding a fragment of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the nucleic acid molecule.
２５２個以上のアミノ酸を含む、配列番号２のアミノ酸配列の断片
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。 A protein comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and an amino acid sequence selected from the group consisting of fragments of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, comprising 252 or more amino acids.
７８６個以上のヌクレオチドを含む、配列番号１のヌクレオチド配列の断片
からなる群から選択される、ＨＰＶ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、医薬組成物。 Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and
7 Fragment of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 comprising more than 86 nucleotides
A pharmaceutical composition comprising a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding an HPV antigen selected from the group consisting of:
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