JP6562447B2 - Animal internal standard polynucleotide and method for detecting target polynucleotide using the same - Google Patents

Description

本発明は、動物の検査・診断の際に用いることのできる、新規な内部標準に関する。本発明は、動物の研究、医療、ヘルスケア、および畜産等の分野で有用である。   The present invention relates to a novel internal standard that can be used in the examination / diagnosis of animals. The present invention is useful in fields such as animal research, medical care, healthcare, and livestock.

地方病性牛白血病は、牛白血病ウイルス（BLV）によるB細胞性の腫瘍であり、主な症状としてリンパ節の腫大などがある。現在のところ、有効なワクチンや治療法がないため、BLV陽性牛を摘発し、淘汰することが感染の拡大を防ぐための最善の対策である。   Endemic bovine leukemia is a B-cell tumor caused by bovine leukemia virus (BLV), and the main symptoms include enlarged lymph nodes. At present, there is no effective vaccine or treatment, so the best way to prevent the spread of infection is to detect and mock BLV-positive cattle.

BLVのゲノムは、宿主の細胞のゲノムに組みこまれ、プロウイルスとなる。感染細胞は、血液や乳汁を介して、他の感受性動物の体内に入ることで感染が拡大する。感染牛の一部（数%）が長い潜伏期間を経て、数年後に牛白血病を発症する。感染した牛の60〜70%は無症状であり、約30％の牛が持続性リンパ球増多症（PL牛）となるが、いずれも臨床的には異常を示さない。しかしながら、屠畜の際に感染が確認された牛は、法律・規則に基づき廃棄されるため、農家にとっては大きな損失となる。   The BLV genome is incorporated into the host cell genome and becomes a provirus. Infected cells enter the body of other susceptible animals via blood or milk to spread the infection. Some of the infected cattle (a few percent) go through a long incubation period and develop bovine leukemia several years later. 60-70% of infected cattle are asymptomatic and about 30% of cattle have persistent lymphocytosis (PL cattle), none of which show clinical abnormalities. However, cattle that have been confirmed to be infected during slaughter are disposed of in accordance with laws and regulations, which is a major loss for farmers.

現在、BLV検出用のキットが市販されており、これはリアルタイムPCR装置を用いて検出するために必要な、プローブ、プライマー、陽性コントロールからなる（非特許文献１）。   Currently, a BLV detection kit is commercially available, and consists of a probe, a primer, and a positive control necessary for detection using a real-time PCR apparatus (Non-patent Document 1).

一方、リボヌクレアーゼ P（RNase P）は、転移RNA（tRNA）前駆体の5'プロセシングを触媒し、成熟した5'末端を持つtRNAを生産する普遍的な酵素である。このRNase P遺伝子は、ヒトに関してはゲノムに１コピーとして存在することが分かっている。そのため、この遺伝子を検出することにより、実際に細胞数を計数することなく、遺伝子定量により細胞を算出することが可能となっている。ヒトにおいてRNase P遺伝子は、ヒトＴ細胞性白血病、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)、ヒトヘルペスウイルスなどに感染した臨床材料からウイルスを検出する際に、その試験・検査の質を保証するための内部標準遺伝子として利用されている。また、ヒトのRNase P遺伝子を検出するためのキットが市販されている（非特許文献２）。   On the other hand, ribonuclease P (RNase P) is a universal enzyme that catalyzes 5 ′ processing of transfer RNA (tRNA) precursors and produces tRNA with a mature 5 ′ end. This RNase P gene is known to exist as one copy in the genome for humans. Therefore, by detecting this gene, it is possible to calculate cells by gene quantification without actually counting the number of cells. In humans, the RNase P gene guarantees the quality of tests and tests when detecting viruses from clinical materials infected with human T-cell leukemia, human acquired immune deficiency syndrome (AIDS), human herpesvirus, etc. It is used as an internal standard gene. A kit for detecting a human RNase P gene is commercially available (Non-patent Document 2).

研究用TaKaRaウシ白血病ウイルス検出用Probe/Primer/Positive control（製品コードCY415）説明書（2014）、タカラバイオ(株)http://www.takara-bio.co.jp/Probe / Primer / Positive control (product code CY415) for detection of TaKaRa bovine leukemia virus for research (2014), Takara Bio Inc. http://www.takara-bio.co.jp/ TaqMan RNase P reagent kit (Cat No. 4316831), アプライドバイオシステムズ分子生物製品カタログ2010-2011, p105TaqMan RNase P reagent kit (Cat No. 4316831), Applied Biosystems Molecular Biological Product Catalog 2010-2011, p105

牛白血病の発生数は近年増加傾向にある。そのため、拡大を抑制する早急な対策が必要である。PL牛やプロウイルス保有量の多い牛は、プロウイルス量の少ない牛よりも周囲の牛に感染を拡げやすい。そこで、BLV陽性牛のなかでも、感染源となりうるPL牛やプロウイルス保有量の多い牛を選別する必要がある。   The incidence of bovine leukemia has been increasing in recent years. Therefore, urgent measures to suppress the expansion are necessary. PL cattle and cattle with high provirus levels are more likely to spread to surrounding cattle than cattle with low provirus levels. Therefore, it is necessary to select PL cattle that can be the source of infection and cattle with a large amount of provirus among BLV-positive cattle.

現在市販されている非特許文献1のBLV検出用の製品では、検体のDNA量を一定以下に希釈して定量が行われている一方で、内部標準を用いていないという問題がある。一方、本発明者は、非特許文献2のヒトのRNase P遺伝子を検出するキットでは、ウシまたはヒツジから採取した検体中の遺伝子には反応しないことを確認した。   The BLV detection product of Non-Patent Document 1 currently on the market has a problem in that the internal standard is not used while the amount of DNA in the specimen is diluted to a certain level or less. On the other hand, the present inventor confirmed that the kit for detecting the human RNase P gene of Non-Patent Document 2 does not react with a gene in a specimen collected from cattle or sheep.

本発明者は、動物（ヒトを除く。）由来のRNase P遺伝子を特定し、BLVの定量系の内部標準として用いることを検討した。また本発明者は、RNase PとBLV遺伝子をそれぞれ定量するシンプレックス法では、ウェルに分注する際の誤差を防ぐことができないと考えた、。そこで、DuplexリアルタイムPCR法により、１つの反応系内で標的BLV遺伝子と内部標準遺伝子それぞれを増幅し、定量することを検討し、本発明を完成した。   The present inventor has identified an RNase P gene derived from an animal (excluding humans) and examined using it as an internal standard for a BLV quantification system. Further, the present inventor considered that the error in dispensing into the wells could not be prevented by the simplex method in which the RNase P and BLV genes were respectively quantified. Therefore, the present inventors completed the present invention by examining the amplification and quantification of the target BLV gene and the internal standard gene in one reaction system by the Duplex real-time PCR method.

本発明は、以下を提供する。
[１] 動物より採取した検体中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
検体中の、下記のいずれか一の内部標準ポリヌクレオチドを検出する工程を含む、方法：
a.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
b.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRNase P活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
c.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と少なくとも80％以上の同一性を有し、かつRNase P活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
[２] 標的ポリヌクレオチドの検出および内部標準ポリヌクレオチドの検出が、一つのリアルタイムPCR反応系で、それぞれの遺伝子領域を同時に増幅することにより行われる、１に記載の方法。
[３] 少なくとも一種類のオリゴヌクレオチドプローブを用い、このときオリゴヌクレオチドプローブが、5'末端付近および3'末端付近のいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている、１〜２のいずれか１項に記載の方法。
[４] 検体が血液である、１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[５] 下記のいずれか一のポリヌクレオチド：
a.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
b.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRNase P活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
c.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と少なくとも80％以上の同一性を有し、かつRNase P活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
[６] 以下を含む、動物の診断のために標的ポリヌクレオチドを検出するためのキット：
・５に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅するための、内部標準増幅用プライマー対；および
・標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅するための、標的増幅用プライマー対。
[７] さらに以下を含む、６に記載のキット：
・少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプローブであって、5'末端付近および3'末端付近のいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている、プローブ。
[８] 内部標準増幅用プライマー対、標的増幅用プライマー対、およびオリゴヌクレオチドプローブを１の溶液として含む、６または７に記載のキット。
[９] 増幅反応をPCR法により行うための、６〜８のいずれか１項に記載のキット。
[１０] 動物より採取した検体中に含まれる、５に記載のポリヌクレオチドを定量する工程を含む、検体中の細胞数の測定方法。 The present invention provides the following.
[1] A method for detecting a target polynucleotide in a specimen collected from an animal, comprising:
Detecting the internal standard polynucleotide of any one of the following in a sample:
a polynucleotide comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
b. a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and encodes a protein having RNase P activity ;
c. A polynucleotide encoding a protein having at least 80% identity with the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and having RNase P activity.
[2] The method according to 1, wherein the detection of the target polynucleotide and the detection of the internal standard polynucleotide are performed by simultaneously amplifying each gene region in one real-time PCR reaction system.
[3] At least one kind of oligonucleotide probe is used, and at this time, either one of the oligonucleotide probe is modified with a fluorescent molecule near the 5 ′ end and near the 3 ′ end, and the other is modified with a quenching molecule. The method of any one of 1-2.
[4] The method according to any one of 1 to 3, wherein the specimen is blood.
[5] Any one of the following polynucleotides:
a polynucleotide comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
b. a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and encodes a protein having RNase P activity ;
c. A polynucleotide encoding a protein having at least 80% identity with the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and having RNase P activity.
[6] A kit for detecting a target polynucleotide for animal diagnosis comprising:
A primer pair for internal standard amplification for amplifying at least a part of the polynucleotide according to 5; and a primer pair for target amplification for amplifying at least a part of the target polynucleotide.
[7] The kit according to 6, further comprising:
A probe that is at least one type of oligonucleotide probe, and either one near the 5 ′ end or near the 3 ′ end is modified with a fluorescent molecule, and the other is modified with a quenching molecule.
[8] The kit according to 6 or 7, comprising a primer pair for internal standard amplification, a primer pair for target amplification, and an oligonucleotide probe as one solution.
[9] The kit according to any one of 6 to 8, wherein the amplification reaction is performed by a PCR method.
[10] A method for measuring the number of cells in a specimen, comprising a step of quantifying the polynucleotide according to 5 contained in a specimen collected from an animal.

本発明は、以下を提供する。
[１] 動物より採取した検体中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
検体中の、下記のいずれか一の内部標準ポリヌクレオチドを検出する工程を含む、方法：
a.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
b.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRNase P活性を有するリボザイムをコードするポリヌクレオチド；
c.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と少なくとも80％以上の同一性を有し、かつRNase P活性を有するリボザイムをコードする、ポリヌクレオチド。
[２] 標的ポリヌクレオチドの検出および内部標準ポリヌクレオチドの検出が、一つのリアルタイムPCR反応系で、それぞれの遺伝子領域を同時に増幅することにより行われる、１に記載の方法。
[３] 少なくとも一種類のオリゴヌクレオチドプローブを用い、このときオリゴヌクレオチドプローブが、5'末端付近および3'末端付近のいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている、１〜２のいずれか１項に記載の方法。
[４] 検体が血液である、１〜３のいずれか１項に記載の方法。
[５] 下記のいずれか一のポリヌクレオチド：
a.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
b.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRNase P活性を有するリボザイムをコードするポリヌクレオチド；
c.配列番号:1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と少なくとも80％以上の同一性を有し、かつRNase P活性を有するリボザイムをコードする、ポリヌクレオチド。
[６] 以下を含む、動物の診断のために標的ポリヌクレオチドを検出するためのキット：
・５に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅するための、内部標準増幅用プライマー対；および
・標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅するための、標的増幅用プライマー対。
[７] さらに以下を含む、６に記載のキット：
・少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプローブであって、5'末端付近および3'末端付近のいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている、プローブ。
[８] 内部標準増幅用プライマー対、標的増幅用プライマー対、およびオリゴヌクレオチドプローブを１の溶液として含む、６または７に記載のキット。
[９] 増幅反応をPCR法により行うための、６〜８のいずれか１項に記載のキット。
[１０] 動物より採取した検体中に含まれる、５に記載のポリヌクレオチドを定量する工程を含む、検体中の細胞数の測定方法。 The present invention provides the following.
[1] A method for detecting a target polynucleotide in a specimen collected from an animal, comprising:
Detecting the internal standard polynucleotide of any one of the following in a sample:
a polynucleotide comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
b. a polynucleotide encoding a ribozyme that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 under stringent conditions and has RNase P activity ;
c. A polynucleotide encoding a ribozyme having at least 80% identity with the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and having RNase P activity.
[2] The method according to 1, wherein the detection of the target polynucleotide and the detection of the internal standard polynucleotide are performed by simultaneously amplifying each gene region in one real-time PCR reaction system.
[3] At least one kind of oligonucleotide probe is used, and at this time, either one of the oligonucleotide probe is modified with a fluorescent molecule near the 5 ′ end and near the 3 ′ end, and the other is modified with a quenching molecule. The method of any one of 1-2.
[4] The method according to any one of 1 to 3, wherein the specimen is blood.
[5] Any one of the following polynucleotides:
a polynucleotide comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
b. a polynucleotide encoding a ribozyme that hybridizes with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 under stringent conditions and has RNase P activity ;
c. A polynucleotide encoding a ribozyme having at least 80% identity with the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and having RNase P activity.
[6] A kit for detecting a target polynucleotide for animal diagnosis comprising:
A primer pair for internal standard amplification for amplifying at least a part of the polynucleotide according to 5; and a primer pair for target amplification for amplifying at least a part of the target polynucleotide.
[7] The kit according to 6, further comprising:
A probe that is at least one type of oligonucleotide probe, and either one near the 5 ′ end or near the 3 ′ end is modified with a fluorescent molecule, and the other is modified with a quenching molecule.
[8] The kit according to 6 or 7, comprising a primer pair for internal standard amplification, a primer pair for target amplification, and an oligonucleotide probe as one solution.
[9] The kit according to any one of 6 to 8, wherein the amplification reaction is performed by a PCR method.
[10] A method for measuring the number of cells in a specimen, comprising a step of quantifying the polynucleotide according to 5 contained in a specimen collected from an animal.

RNaseP プラスミド検量線。同じコピー数では、線状型のプラスミドで増幅曲線の早い立ち上がりが見られ、より少ないCt値で検出されていた。RNaseP plasmid calibration curve. At the same copy number, the linear plasmid showed a rapid rise in the amplification curve and was detected with a lower Ct value. RNase Pの1細胞あたりのコピー数。牛：1.33〜2.34コピー/細胞(平均値1.71)、羊：1.21〜2.68コピー/細胞(平均値1.81)。Number of copies of RNase P per cell. Cattle: 1.33 to 2.34 copies / cell (mean value 1.71), sheep: 1.21 to 2.68 copies / cell (mean value 1.81). ゲノムDNA量を50 ng〜300 ngと変化させた場合の反応性。ゲノムDNAの量を変化させた場合でも容量依存性に定量が可能である。Reactivity when the amount of genomic DNA is changed from 50 ng to 300 ng. Even when the amount of genomic DNA is changed, it can be quantified in a volume-dependent manner. ヒトおよび各種動物の塩基配列Nucleotide sequences of humans and various animals ヒトおよび各種動物の塩基配列の比較Comparison of human and various animal base sequences

数値範囲を「ｍ〜ｎ」で表すときは、特に記載した場合を除き、その範囲は両端の値ｍおよびｎを含む。「Ｘおよび／またはＹ」は、ＸおよびＹの少なくとも一方を指す意図で用いられており、具体的には、Ｘのみである場合、Ｙのみである場合、ＸおよびＹである場合のいずれかを指す。   When a numerical range is expressed as “m to n”, the range includes the values m and n at both ends, unless otherwise specified. “X and / or Y” is used with the intention of referring to at least one of X and Y. Specifically, when X is only, Y is only, or X and Y are either Point to.

本発明は、動物（非ヒト動物およびヒト）より採取した検体中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、検体中の、内部標準ポリヌクレオチドを検出する工程を含む、方法を提供する。   The present invention provides a method for detecting a target polynucleotide in a specimen collected from animals (non-human animals and humans), comprising the step of detecting an internal standard polynucleotide in the specimen.

標的ポリヌクレオチドとは、検体中において、有無または存在量を測定することが求められ、検出・診断の対象となるポリヌクレオチドである。標的ポリヌクレオチドは、典型的には、病気の原因となるウイルス由来の遺伝子である。   A target polynucleotide is a polynucleotide that is required to measure the presence or absence or abundance in a sample and is a target for detection and diagnosis. The target polynucleotide is typically a gene from a virus that causes disease.

本発明の方法においては、標的ポリヌクレオチドのほか、内部標準ポリヌクレオチドも検出される。本発明においては、内部標準ポリヌクレオチドとして、動物のRNase P遺伝子を用いる。動物のRNase Pは、下記のいずれかである。
a.配列番号: 1〜4のいずれか一に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
b.配列番号: 1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRNase P活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
c.配列番号: 1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と少なくとも80％以上の同一性を有し、かつRNase P活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。 In the method of the present invention, in addition to the target polynucleotide, an internal standard polynucleotide is also detected. In the present invention, an animal RNase P gene is used as the internal standard polynucleotide. Animal RNase P is one of the following:
a polynucleotide consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
b. a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and encodes a protein having RNase P activity ;
c. A polynucleotide encoding a protein having at least 80% identity with the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and having RNase P activity.

本発明の方法においては、標的ポリヌクレオチドのほか、内部標準ポリヌクレオチドも検出される。本発明においては、内部標準ポリヌクレオチドとして、動物のRNase P遺伝子を用いる。動物のRNase P遺伝子は、下記のいずれかである。
a.配列番号: 1〜4のいずれか一に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
b.配列番号: 1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつRNase P活性を有するリボザイムをコードするポリヌクレオチド；
c.配列番号: 1〜4のいずれか一に記載の塩基配列と少なくとも80％以上の同一性を有し、かつRNase P活性を有するリボザイムをコードする、ポリヌクレオチド。 In the method of the present invention, in addition to the target polynucleotide, an internal standard polynucleotide is also detected. In the present invention, an animal RNase P gene is used as the internal standard polynucleotide. The RNase P gene in animals is one of the following:
a polynucleotide consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4;
b. a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and encodes a ribozyme having RNase P activity ;
c. A polynucleotide encoding a ribozyme having at least 80% identity with the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 and having RNase P activity.

本発明でポリヌクレオチドに関し、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」というときは、特に記載した場合を除き、いずれのポリヌクレオチドにおいても、ハイブリダイゼーションの条件は、Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed.（Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press）およびHybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Supports (ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138, 267-284 (1984))の記載に従い、取得しようとするポリヌクレオチドに合わせて適宜選定することができる。例えば８５％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、２倍濃度のＳＳＣ溶液および５０％ホルムアミドの存在下、４５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６０℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また９０％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、２倍濃度のＳＳＣ溶液および５０％ホルムアミドの存在下、５０℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液）を用い、６５℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。   Regarding the polynucleotide in the present invention, the term “hybridizes under stringent conditions” refers to the conditions for hybridization in any of the polynucleotides unless otherwise specified. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press) and Hybridization of Nucleic Acid Immobilization on Solid Supports (ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 138, 267-284 (1984)) can do. For example, when DNA having 85% or more identity is obtained, hybridization is performed at 45 ° C. in the presence of a 2 × concentration SSC solution and 50% formamide, and then a 0.1 × concentration SSC solution (1 × The composition of the concentration SSC solution is 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate), and the conditions for washing the filter at 60 ° C. may be used. In addition, when DNA having 90% or more identity is obtained, hybridization is performed at 50 ° C. in the presence of a 2 × concentration SSC solution and 50% formamide, and then a 0.1 × concentration SSC solution) is used. The conditions for washing the filter at 65 ° C. may be used.

本発明で塩基配列（ヌクレオチド配列ということもある。）に関し「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列においても、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドの個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(1990)403-410に記載されるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列またはアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。   In the present invention, the term “identity” with respect to a base sequence (sometimes referred to as a nucleotide sequence) means that two base sequences are aligned in an optimal manner in any base sequence, unless otherwise specified. It means the percentage of the number of matched nucleotides shared between two sequences. That is, identity = (number of matched positions / total number of positions) × 100, which can be calculated using a commercially available algorithm. Such algorithms are also incorporated into the NBLAST and XBLAST programs described in Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410. More specifically, a search / analysis relating to the identity of a base sequence or amino acid sequence can be performed by an algorithm or program (for example, BLASTN, BLASTP, BLASTX, ClustalW) well known to those skilled in the art. Those skilled in the art can appropriately set parameters when using a program, and the default parameters of each program may be used. Specific techniques for these analysis methods are also well known to those skilled in the art.

本明細書において、塩基配列に関し、同一性というときは、特に記載した場合を除き、いずれの場合も、少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７．５％以上さらに好ましくは９９％以上の配列の同一性を指す。   In the present specification, regarding identity of a base sequence, unless otherwise specified, in any case, at least 70%, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and still more preferably 90% or more, unless otherwise specified. More preferably, it indicates 95% or more, more preferably 97.5% or more, more preferably 99% or more sequence identity.

本発明で用いるポリヌクレオチドまたは遺伝子、およびリボザイムは、当業者であれば、従来技術を利用して調製することができる。   The polynucleotide or gene and ribozyme used in the present invention can be prepared by those skilled in the art using conventional techniques.

本発明においては、標的ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー対（例えば、配列番号:5および6）および内部標準ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー対（例えば、配列番号:7および8）を用いる。増幅反応は、種々の方法で行い得る。例えば、PCR法、SDA法、TMA法、NASBA法、TRC法、ICAN法、SmartAmp法、RCA法、LAMP法等の核酸の増幅のための方法を適用しうる。好ましくは、PCR法であり、より好ましくは、リアルタイムPCR法である。   In the present invention, a primer pair (for example, SEQ ID NOs: 5 and 6) for amplifying a target polynucleotide and a primer pair (for example, SEQ ID NOs: 7 and 8) for amplifying an internal standard polynucleotide are used. The amplification reaction can be performed by various methods. For example, methods for nucleic acid amplification such as PCR method, SDA method, TMA method, NASBA method, TRC method, ICAN method, SmartAmp method, RCA method, and LAMP method can be applied. The PCR method is preferable, and the real-time PCR method is more preferable.

本発明においてはまた、オリゴヌクレオチドプローブを用いることができる。プローブの5'末端付近または3'末端付近のいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている。このようなプローブの典型的な例は、TaqMan（登録商標）プローブである。   In the present invention, an oligonucleotide probe can also be used. Either one near the 5 ′ end or near the 3 ′ end of the probe is modified with a fluorescent molecule, and the other is modified with a quenching molecule. A typical example of such a probe is the TaqMan® probe.

蛍光分子としては、例えば、N-(3-フルオランチル)マレイミド（N-(3-Fluoranthyl)maleimide 、FAM）、フルオレセイン、ダンシル、カスケードイエロー、フルオレスカミン、オレゴングリーン、ピレン、テキサスレッド、パシフィックブルー、マリンブルー、アレクサ、ルシファーイエロー、ボディパイ（BODIPY）、クーマリン、ピンポ（PyMPO）、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ROX、VIC、HEX、TAMRA、SYBR Green、NBD等を用いることができる。消光分子としては、例えば、4-ジメチルアミノアゾベンゼン-4'-カルボン酸（4-dimethylaminoazobenzene-4'-carboxylic acid、Dabcyl）、QSY-7、QSY-21、QSY-35、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、Eclipse等の蛍光を発しない物質（ダーククエンチャーと言われる）を用いてもよいし、上記蛍光分子が発する波長領域に吸収帯を持つ蛍光物質を消光分子として利用してもよい。蛍光分子および消光分子をオリゴヌクレオチドに結合させる方法、ならびに蛍光強度の変化を検出する方法は当該技術分野においてよく知られている。   Examples of fluorescent molecules include N- (3-fluoranthyl) maleimide (N- (3-Fluoranthyl) maleimide, FAM), fluorescein, dansyl, cascade yellow, fluorescamine, oregon green, pyrene, Texas red, Pacific blue, Use marine blue, alexa, lucifer yellow, body pie (BODIPY), coumarin, pinpo (PyMPO), TET, JOE, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7, ROX, VIC, HEX, TAMRA, SYBR Green, NBD, etc. Can do. Examples of quenching molecules include 4-dimethylaminoazobenzene-4'-carboxylic acid (Dabcyl), QSY-7, QSY-21, QSY-35, BHQ-0, BHQ- 1, BHQ-2, BHQ-3, Eclipse and other non-fluorescent substances (referred to as dark quenchers) may be used, and fluorescent substances having an absorption band in the wavelength region where the fluorescent molecules emit are used as quenching molecules It may be used as Methods for attaching fluorescent and quenching molecules to oligonucleotides and methods for detecting changes in fluorescence intensity are well known in the art.

本発明に用いられるプライマーおよびプローブは、上述の遺伝子増幅法の原理に基づき、また従来のプライマー、プローブの設計方法を参考に、適宜設計できる。プライマー、プローブの設計方法のためには、ソフトウェアが市販されており、本発明のためにも使用できる。   The primers and probes used in the present invention can be appropriately designed based on the principle of the gene amplification method described above and referring to conventional primer and probe design methods. Software is commercially available for designing primers and probes and can be used for the present invention.

プライマーの設計は、通常、Tm値、各プライマー領域の末端安定性、GC含量、二次構造の4つに留意して行う。本発明においても同様である。Tm値は、60〜68℃、場合により64〜66℃、場合により59〜61℃、または64〜66℃とすることができる。また適宜微調整することができる。各プライマー領域の末端は、核酸合成の起点となるため安定性が要求される。末端の自由エネルギーが、−4kcal/ mol 以下になるように設定するとよい。プライマーのGC含量は、35〜75%、場合により40〜65％になるように設計することができる。好ましくは、50〜60％となるように設計することもできる。二次構造に関しては、極端に二次構造をとらないように設計するとよい。また、プライマーダイマーの生成を防ぐために、末端が相補的にならないように設計するとよい。プライマー間の距離も適宜設計することができる。   Primers are usually designed with attention to the following four points: Tm value, terminal stability of each primer region, GC content, and secondary structure. The same applies to the present invention. The Tm value can be 60-68 ° C, optionally 64-66 ° C, optionally 59-61 ° C, or 64-66 ° C. Also, fine adjustment can be made as appropriate. The end of each primer region is a starting point for nucleic acid synthesis, and thus stability is required. It is better to set the free energy at the end to be -4kcal / mol or less. The GC content of the primer can be designed to be 35-75% and in some cases 40-65%. Preferably, it can also be designed to be 50 to 60%. Regarding the secondary structure, it is preferable to design so as not to take the secondary structure extremely. In order to prevent the generation of primer dimers, it is preferable to design the ends so as not to be complementary. The distance between primers can also be designed as appropriate.

プライマー設計上、長さは15〜30塩基、好ましくは17〜25塩基である。プローブ設計上、長さは12〜30塩基、好ましくは14〜25塩基である。このような塩基長であれば、意図した相補配列との特異的な会合のために有効だからである。   In terms of primer design, the length is 15 to 30 bases, preferably 17 to 25 bases. In terms of probe design, the length is 12 to 30 bases, preferably 14 to 25 bases. This is because such a base length is effective for specific association with the intended complementary sequence.

設計されたプライマーおよびプローブは、当業者にはよく知られた既存の方法により合成することができる。   The designed primers and probes can be synthesized by existing methods well known to those skilled in the art.

上述のプライマーおよびプローブを用いて実施される遺伝子増幅は、典型的には、PCR法による各工程を含む。PCR法を実施する場合は、従来のPCR法に用いられる酵素が利用できる。工程の温度および時間は、使用する酵素等に応じて適宜設定することができる。   Gene amplification performed using the above-described primers and probes typically includes each step by PCR. When carrying out the PCR method, enzymes used in conventional PCR methods can be used. The temperature and time of the process can be appropriately set according to the enzyme used.

PCR法は、通常のPCR法と同様、数十μl程度のスケールで実施することができる。用いる鋳型ヌクレオチド、プライマー、プローブの量は、当業者であれば適宜設定できる。   The PCR method can be performed on a scale of about several tens of μl as in the normal PCR method. Those skilled in the art can appropriately set the amounts of template nucleotide, primer, and probe used.

系の組成は、上述の鋳型、プライマーおよびプローブの使用量または濃度のほか、当業者には明らかであるように、4種のdNTP、緩衝剤、塩、界面活性剤等を含むことができる。   The composition of the system can include four dNTPs, buffers, salts, surfactants, etc., as will be apparent to those skilled in the art, in addition to the amounts or concentrations of the templates, primers and probes described above.

本発明は、本発明の方法を実施するための、プライマー対、プローブ、プローブおよびプライマー対のセット、並びにキットを提供する。標的ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー対（例えば、配列番号:7および8）および内部標準ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー対（例えば、配列番号:9および10）はいずれも、1または数個分（例えば、1〜4個、1〜3個、1または2個）の末端の塩基を欠失するかまたは伸長することにより、改変することができる。伸長する場合、その部分は、会合する領域に相補する配列を有するようにすることができる。プローブ（例えば、配列番号:11および12）はいずれも、上述したように、欠失、伸長または置換により改変することができる。本発明は、このようなものから選択される任意の改変プライマーおよび改変プローブからなるセットも提供する。   The present invention provides primer pairs, probes, probe and primer pair sets, and kits for performing the methods of the present invention. One or several primer pairs (eg, SEQ ID NOs: 7 and 8) for amplifying the target polynucleotide and primer pairs (eg, SEQ ID NOs: 9 and 10) for amplifying the internal standard polynucleotide Modifications can be made by deleting or extending the terminal bases of minutes (eg, 1-4, 1-3, 1 or 2). When extended, the portion may have a sequence that is complementary to the associated region. Any of the probes (eg, SEQ ID NOs: 11 and 12) can be modified by deletion, extension, or substitution as described above. The present invention also provides a set consisting of any modified primer and modified probe selected from such.

本発明において、遺伝子増幅の対象となる鋳型核酸の由来する組織は、特に限定されない。また鋳型核酸の調製方法も特に限定されない。末梢血のほか、毛髪や組織から調製しても良い。代表的なものとしては、血液のほか、口腔粘膜、尿、髄液、喀痰、病理組織からキットを用いて精製されたものが挙げられる。既存の核酸精製方法としては、ヨウ化ナトリウム法、アルカリ抽出法、フェノールクロロホルム法、キットとしては、Genomix (Talent SRL)、MagExtractor (東洋紡)、QIAamp DNA Blood Mini Kit (キアゲン) などが知られる。   In the present invention, the tissue from which the template nucleic acid to be amplified is derived is not particularly limited. The method for preparing the template nucleic acid is not particularly limited. In addition to peripheral blood, it may be prepared from hair or tissue. Representative examples include those purified from the oral mucosa, urine, spinal fluid, sputum, and pathological tissue using a kit in addition to blood. Known methods for purifying nucleic acids include sodium iodide method, alkali extraction method, phenol chloroform method, and examples of kits include Genomix (Talent SRL), MagExtractor (Toyobo), and QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen).

核酸の増幅は、主に遺伝子関連検査のために行われる。遺伝子関連検査には、感染症の原因となるウイルスや細菌などの外来遺伝子や、ゲノムに組み込まれたプロウイルスを検出する病原体遺伝子検査が含まれる。   Nucleic acid amplification is mainly performed for gene-related tests. Genetic-related tests include pathogen genetic tests that detect foreign genes such as viruses and bacteria that cause infections, and proviruses that are integrated into the genome.

以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。   The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.

1.材料と方法
RNase P遺伝子検出用primer/probeの構築：
牛および羊から末梢血単核細胞（PBMC）を分離し、DNAの抽出を行った後、RNase P component H1遺伝子領域のPCRを行った。これらPCR産物の塩基配列（配列番号:1〜4）を元にリアルタイムPCRのprimer/probeを作製した。 1. Materials and methods
Construction of primer / probe for RNase P gene detection:
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from cattle and sheep, and DNA was extracted, followed by PCR of the RNase P component H1 gene region. A primer / probe for real-time PCR was prepared based on the base sequences of these PCR products (SEQ ID NOs: 1 to 4).

ウシ
・Forward primer: 5’-CTACGAGCTGAGTGCGCTTAGTC-3’ (BOS RPPH1-F)（配列番号:7）
・Reverse primer: 5’-CCTATGGCCCTAGTCTCAGACCTT-3’ (BOS RPPH1-R) （配列番号:8）
・probe: 5’-VIC-TCTGTCCATTGTCCC-MGB-3’(BOS RPPH1-54T) （配列番号:11） Bovine Forward primer: 5'-CTACGAGCTGAGTGCGCTTAGTC-3 '(BOS RPPH1-F) (SEQ ID NO: 7)
・ Reverse primer: 5'-CCTATGGCCCTAGTCTCAGACCTT-3 '(BOS RPPH1-R) (SEQ ID NO: 8)
・ Probe: 5'-VIC-TCTGTCCATTGTCCC-MGB-3 '(BOS RPPH1-54T) (SEQ ID NO: 11)

ヒツジ
・Forward primer: 5’-GCCGGAGCTTGGAACAGA-3’ (Ov_RPPH1_F) （配列番号:9）
・Reverse primer: 5’-ACCTCACCTCAGCCATTGAACT-3’ (Ov_RPPH1_R) （配列番号:10）
・probe: 5’-VIC-TCACGGCCAGCGAA-MGB-3’（Ov_RPPH1-S7T）（配列番号:12） Sheep Forward primer: 5'-GCCGGAGCTTGGAACAGA-3 '(Ov_RPPH1_F) (SEQ ID NO: 9)
・ Reverse primer: 5'-ACCTCACCTCAGCCATTGAACT-3 '(Ov_RPPH1_R) (SEQ ID NO: 10)
・ Probe: 5'-VIC-TCACGGCCAGCGAA-MGB-3 '(Ov_RPPH1-S7T) (SEQ ID NO: 12)

標準プラスミドの作製：
BLV tax遺伝子および牛と羊のRNase P遺伝子をPCRで増幅後、プラスミドベクター(pENTER-D-TOPOまたはpCR2.1, Invitorogen)に組み込んだもの（環状型）ならびにそれらを制限酵素で処理したもの（線状型）を作製した。 Preparation of standard plasmid:
BLV tax gene and cattle and sheep RNase P gene amplified by PCR and incorporated into a plasmid vector (pENTER-D-TOPO or pCR2.1, Invitorogen) (circular type) and those treated with restriction enzymes ( A linear mold) was produced.

リアルタイム PCR反応：
酵素としてPremix Ex Taq^TM (Probe qPCR) (TaKaRa)を用い、Step One Plus (Applied biosystems)にて95℃ 20秒の後、95℃ 1秒、60℃ 20秒、40サイクルの2ステップPCRを行った。
Duplex系の作出：
Duplex反応がSimplex反応と同様の結果を示すかを検証するために、標準プラスミドおよびBLV感染動物から抽出したゲノムDNAを鋳型として、上記と同様反応においてリアルタイムPCRを行い、両反応系のCt値を比較した。さらに、Duplex反応の再現性を評価するために、Intra−Interアッセイを行った。 Real-time PCR reaction:
Premix Ex Taq ^TM (Probe qPCR) (TaKaRa) is used as the enzyme, and Step One Plus (Applied biosystems) performs 95 ° C for 20 seconds, followed by 95 ° C for 1 second, 60 ° C for 20 seconds, 40 cycles of 2-step PCR. It was.
Duplex creation:
In order to verify whether the Duplex reaction shows the same result as the Simplex reaction, real-time PCR was performed in the same reaction as above using the standard plasmid and genomic DNA extracted from BLV-infected animals as templates, and the Ct values of both reaction systems were calculated. Compared. Furthermore, Intra-Inter assay was performed to evaluate the reproducibility of the Duplex reaction.

2.結果
標準プラスミドの作製：
ベクターに、牛および羊のRNase P component H1遺伝子（配列番号:1および2）と、BLV tax遺伝子をそれぞれ組み込みさらに、制限酵素処理を行った線状型と、処理を行わない環状型を作製した。これらのプラスミドからそれぞれ10倍階段希釈系列を作製し、リアルタイムPCRで定量し、環状型、線状型の希釈系列から得られた検量線を比較した。 2.Result
Preparation of standard plasmid:
Cattle and sheep RNase P component H1 gene (SEQ ID NO: 1 and 2) and BLV tax gene were incorporated into the vector, and a linear type with restriction enzyme treatment and a circular type without treatment were prepared. . A 10-fold serial dilution series was prepared from each of these plasmids and quantified by real-time PCR, and calibration curves obtained from circular and linear dilution series were compared.

その結果を図１に示した。図１では、縦軸にCt値を、横軸に希釈系列中のプラスミドコピー数を示した。牛と羊のRNase PおよびBLVの、すべての検量線で線状型のプラスミドでは10⁰〜10⁵の範囲で検出され、直線性が見られた。環状型プラスミドの検量線では、10⁰〜10¹コピーで検出されないか、直線性が失われた。さらに、同じコピー数では、線状型のプラスミドで増幅曲線の早い立ち上がりが見られ、より少ないCt値で検出された。 The results are shown in FIG. In FIG. 1, the vertical axis represents the Ct value, and the horizontal axis represents the plasmid copy number in the dilution series. Cattle and sheep RNase P and BLV, in all calibration linear type plasmid is detected in a range of 10 ^{0 -} 10 ^5, linearity was observed. The calibration curve of the circular plasmid, or not detected at 10 ^{0 -} 10 ¹ copy, the linearity is lost. In addition, at the same copy number, the linear plasmid showed a rapid rise in the amplification curve and was detected with a lower Ct value.

これらのことから、線状型のプラスミドが検量線を引く際の鋳型として適切であることがわかったので、以降の実験では線状型を検量標準として用いた。   From these facts, it was found that the linear type plasmid was suitable as a template for drawing a calibration curve. Therefore, the linear type was used as a calibration standard in the subsequent experiments.

RNase P遺伝子コピー数の決定：
作製した検量線を用いて、牛と羊におけるRNase P遺伝子のコピー数を定量し、シングルコピー遺伝子であるかを検討した。 Determination of RNase P gene copy number:
Using the prepared calibration curve, the number of copies of the RNase P gene in cattle and sheep was quantified to determine whether it was a single copy gene.

牛と羊のPBMCから抽出したゲノムDNA100ngを鋳型として、RNase PをターゲットとしたリアルタイムPCRを行った。ゲノムDNA重量から、100ng中の細胞数を算出できるので、これを基準としてRNase Pの1細胞あたりのコピー数を算出した。その結果、RNase Pは牛で１細胞あたり1.33〜2.34コピー、羊で1.21〜2.68コピーとなり、それぞれの平均値は1.71コピー、1.81コピーであった（図２）。1.5コピー〜2.5コピーより若干外れる結果が数サンプルで見られたが、ほとんどの結果がこの範囲内であることから、牛、羊においてもRNase P遺伝子は１細胞に２コピー存在するシングルコピー遺伝子であると考えられる。   Real-time PCR targeting RNase P was performed using 100 ng of genomic DNA extracted from PBMC of cattle and sheep as a template. Since the number of cells in 100 ng can be calculated from the genomic DNA weight, the copy number per cell of RNase P was calculated based on this. As a result, RNase P was 1.33 to 2.34 copies per cell in cattle and 1.21 to 2.68 copies in sheep, and the average values were 1.71 and 1.81 copies, respectively (FIG. 2). Although some samples were slightly different from 1.5 to 2.5 copies, most of the results were within this range. Therefore, in cows and sheep, the RNase P gene is a single-copy gene that exists in two copies per cell. It is believed that there is.

さらに、反応中の鋳型ゲノムDNA量を変化させて、RNase Pを定量した結果を図３に示しした。図３では横軸に反応中の鋳型ゲノムDNA量を、縦軸にRNase Pの定量されたコピー数を示し、理論値から予測されるコピー数を点線で、実際に検出されたコピー数を縦棒で示した。   Furthermore, FIG. 3 shows the results of quantifying RNase P by changing the amount of template genomic DNA during the reaction. In FIG. 3, the horizontal axis indicates the amount of template genomic DNA during the reaction, the vertical axis indicates the quantified copy number of RNase P, the copy number predicted from the theoretical value is indicated by a dotted line, and the actually detected copy number is indicated by the vertical axis. Shown with a stick.

この結果より、実測値は予測値に近い値となり、反応中のゲノムDNAの量を変化させてもRNase Pを容量依存性に定量が可能であると考えられる。   From this result, the measured value is close to the predicted value, and it is considered that RNase P can be quantified in a volume-dependent manner even if the amount of genomic DNA in the reaction is changed.

BLV tax/RNase P Duplex リアルタイムPCR法の検討：
RNase Pが内部標準遺伝子として適切であることが証明されたので、BLV taxとRNase PのDuplexリアルタイムPCR法を検討した。検討方法として、Simplex法との比較によるDuplex法の反応性の評価と、イントラーインターアッセイによるDuplex法の再現性の評価を行った。 Examination of BLV tax / RNase P Duplex real-time PCR method:
Since RNase P was proved to be suitable as an internal standard gene, a duplex real-time PCR method for BLV tax and RNase P was examined. As a study method, the reactivity of the Duplex method was evaluated by comparison with the Simplex method, and the reproducibility of the Duplex method was evaluated by an intra-interassay.

牛の反応系におけるDuplexとSimplexの比較の結果を下表に示した。表の数値は、検量線に使用しているそれぞれのプラスミドと、ゲノムDNAを鋳型として、同じプレート上でSimplex法とDuplex法でリアルタイムPCRを行った場合のそれぞれのCt値と、その差の割合を表す。   The table below shows the results of comparison between Duplex and Simplex in cattle reaction systems. The values in the table are the respective Ct values obtained by real-time PCR using Simplex and Duplex methods on the same plate with each plasmid used in the calibration curve and genomic DNA as a template, and the ratio of the difference. Represents.

Ct値の差の割合が十分に小さい値であることから、Duplex反応系はSimplex反応系と相違なく検出できているといえる。   Since the ratio of the difference in Ct values is sufficiently small, it can be said that the Duplex reaction system can be detected without any difference from the Simplex reaction system.

同様に羊の反応系において、DuplexとSimplexで比較を行った結果を下表に示す。   Similarly, the following table shows the results of comparison between Duplex and Simplex in the sheep reaction system.

羊の反応系においてもCt値の差の割合は３%以下であったため、Simplex系と相違なく検出できているといえる。   Even in the sheep reaction system, the ratio of the difference in Ct values was 3% or less, so it can be said that detection was possible without any difference from the Simplex system.

次に、Duplex法の再現性に関して、イントラーインターアッセイを行い、評価した結果を下表に示した。検量線用プラスミドとゲノムDNAを鋳型として、イントラアッセイは各反応を同じプレート内で３回行い、インターアッセイは各反応を、日時を変えて５回行った。その結果得られた変動係数CV値の割合の最大値を表した（CV＝標準偏差/平均値：相対的なばらつきを示す。）。   Next, with respect to the reproducibility of the Duplex method, Intra interassay was performed and the evaluation results are shown in the table below. Using the calibration curve plasmid and genomic DNA as templates, the intraassay performed each reaction three times in the same plate, and the interassay performed each reaction five times at different dates. The maximum value of the ratio of the coefficient of variation CV values obtained as a result was expressed (CV = standard deviation / average value: indicates relative variation).

変動係数の基準範囲はイントラアッセイで５％未満、インターアッセイで10％未満であるので、すべての系でこの範囲内であり、再現性は高いといえる。   Since the reference range of the coefficient of variation is less than 5% in the intra-assay and less than 10% in the inter-assay, it is within this range in all systems, and the reproducibility is high.

3.考察
本研究より牛と羊のRNase P遺伝子はヒトと同様、1細胞あたり2コピー存在し、それらが内部標準遺伝子として使用可能であることが示された。さらに、BLVプロウイルスとRNase P遺伝子の同時定量を行うDuplex系の作製を試みたところ、その検出感度はそれぞれSimplex系と相違ないこと、また、そのCVはIntra assay < 5 %、Inter assay < 10 %の範囲内にあり再現性も高いことが示された。今後は、BLVプロウイルス遺伝子の検出に内部標準としてRNase Pを用いることで、より正確な定量が可能となり、BLV感染牛の清浄化に大きく貢献することが期待される。 3. Discussion This study showed that RNase P genes in cattle and sheep are present in two copies per cell, as in humans, and can be used as internal standard genes. Furthermore, we attempted to create a Duplex system for simultaneous quantitation of BLV provirus and RNase P gene. The detection sensitivity of each was not different from that of the Simplex system, and its CV was Intra assay <5% and Inter assay <10 It was in the range of% and showed high reproducibility. In the future, the use of RNase P as an internal standard for the detection of BLV proviral genes will enable more accurate quantification, and is expected to contribute greatly to the purification of BLV-infected cattle.

配列番号:1 Bos taurus RPPH1 seq1
配列番号:2 Bos taurus RPPH1 seq2
配列番号:3 Ovis aries RPPH1 seq
配列番号:4 Felis catus RPPH1 seq
配列番号:5 Homo sapiens RPPH1 (NR_002312.1)
配列番号:6 Bos taurus RPPH1 (NC 007308.5)
配列番号:7
配列番号:8 Reverse primer (BOS RPPH1-R)
配列番号:9 Forward primer (Ov_RPPH1_F)
配列番号:10 Reverse primer (Ov_RPPH1_R)
配列番号:11 probe (BOS RPPH1-54T)
配列番号:12 probe (Ov_RPPH1-S7T)
配列番号:13 BLV tax gene SEQ ID NO: 1 Bos taurus RPPH1 seq1
SEQ ID NO: 2 Bos taurus RPPH1 seq2
SEQ ID NO: 3 Ovis aries RPPH1 seq
SEQ ID NO: 4 Felis catus RPPH1 seq
SEQ ID NO: 5 Homo sapiens RPPH1 (NR_002312.1)
SEQ ID NO: 6 Bos taurus RPPH1 (NC 007308.5)
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 8 Reverse primer (BOS RPPH1-R)
SEQ ID NO: 9 Forward primer (Ov_RPPH1_F)
SEQ ID NO: 10 Reverse primer (Ov_RPPH1_R)
SEQ ID NO: 11 probe (BOS RPPH1-54T)
SEQ ID NO: 12 probe (Ov_RPPH1-S7T)
SEQ ID NO: 13 BLV tax gene

Claims (9)

反芻動物より採取した検体中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
検体中の、下記のaまたはcの内部標準ポリヌクレオチドを検出する工程を含む、方法：
a.配列番号:1〜3のいずれか一に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
c.配列番号:1〜3のいずれか一に記載の塩基配列と少なくとも95％以上の同一性を有し、かつRNase P活性を有するリボザイムをコードする、ポリヌクレオチド。 A method for detecting a target polynucleotide in a specimen collected from a ruminant,
Detecting a following internal standard polynucleotide of a or c in a sample:
a polynucleotide comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 ;
c. A polynucleotide encoding a ribozyme having at least 95% identity with the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and having RNase P activity. 標的ポリヌクレオチドの検出および内部標準ポリヌクレオチドの検出が、一つのリアルタイムPCR反応系で、それぞれの遺伝子領域を同時に増幅することにより行われる、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the detection of the target polynucleotide and the detection of the internal standard polynucleotide are carried out by simultaneously amplifying each gene region in one real-time PCR reaction system. 少なくとも一種類のオリゴヌクレオチドプローブを用い、このときオリゴヌクレオチドプローブが、5'末端付近および3'末端付近のいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている、請求項１または２に記載の方法。 At least one kind of oligonucleotide probe is used, and at this time, either one of the oligonucleotide probe is modified with a fluorescent molecule near the 5 ′ end and near the 3 ′ end, and the other is modified with a quenching molecule. Item 3. The method according to Item 1 or 2 . 検体が血液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the specimen is blood. 以下を含む、反芻動物の診断のために標的ポリヌクレオチドを検出するためのキット：
・配列番号:1〜3のいずれか一に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅するための、内部標準増幅用プライマー対；および
・標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部を増幅するための、標的増幅用プライマー対。 A kit for detecting a target polynucleotide for ruminant diagnosis, comprising:
A primer pair for internal standard amplification for amplifying at least a part of the polynucleotide consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 ; and amplifying at least a part of the target polynucleotide Of the target amplification primer pair. さらに以下を含む、請求項５に記載のキット：
・少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドプローブであって、5'末端付近および3'末端付近のいずれか一方が蛍光分子で修飾されており、他方が消光分子で修飾されている、プローブ。 The kit of claim 5 further comprising:
A probe that is at least one type of oligonucleotide probe, and either one near the 5 ′ end or near the 3 ′ end is modified with a fluorescent molecule, and the other is modified with a quenching molecule. 内部標準増幅用プライマー対、標的増幅用プライマー対、およびオリゴヌクレオチドプローブを１の溶液として含む、請求項５または６に記載のキット。 The kit according to claim 5 or 6 , comprising a primer pair for internal standard amplification, a primer pair for target amplification, and an oligonucleotide probe as one solution. 増幅反応をPCR法により行うための、請求項５〜７のいずれか１項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 5 to 7 , for carrying out an amplification reaction by a PCR method. 反芻動物より採取した検体中に含まれる、配列番号:1〜3のいずれか一に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを定量する工程を含む、検体中の細胞数の測定方法。 A method for measuring the number of cells in a specimen, comprising a step of quantifying a polynucleotide comprising the base sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 contained in a specimen collected from a ruminant.