JP6560203B2 - 遺伝子ターゲッティングのためのユニバーサルドナー系 - Google Patents
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Description
本出願は、35U.S.C.§119(e)のもと、2013年11月4日に出願された米国特許仮出願番号第61/899,543号の利益を主張し、その内容は、本出願にその全文が参照により組み込まれる。
配列表の認証謄本は、2014年11月3日に作製され、100キロバイトの大きさを有し、本明細書と同時に出願された「74435_ST25.txt」と名付けられたファイルとともにASCII形式配列表としてEFS−Webを介して電子的に提出されている。このASCII形式の文書中に含有される配列表は、本明細書の一部であり、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は以下を提供する。
[1]部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメイン、解析ドメインおよびプラスミドドメインを含むポリヌクレオチドドナーカセット。
[2]3Kbp未満の長さを含む、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[3]上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセットを含むトランスジェニック細胞。
[4]トランスジェニック植物細胞である、上記[3]に記載のトランスジェニック細胞。
[5]上記[4]に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。
[6]単子葉植物である、上記[5]に記載のトランスジェニック植物。
[7]上記単子葉植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される、上記[6]に記載のトランスジェニック植物。
[8]双子葉植物である、上記[5]に記載のトランスジェニック植物。
[9]上記双子葉植物が、ダイズ植物、ワタ植物およびキャノーラ植物からなる群から選択される、上記[8]に記載のトランスジェニック植物。
[10]上記[5]に記載のトランスジェニック植物から得られるトランスジェニック種子。
[11]配列番号132に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号133に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号134に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号135に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号136に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号137に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号138に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号139に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号140に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列および配列番号141に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[12]上記部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメインが、2つ以上の部位特異的ヌクレアーゼ結合配列を含む、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[13]上記部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメインに、ジンクフィンガー結合タンパク質、メガヌクレアーゼ結合タンパク質、CRISPR結合タンパク質またはTALEN結合タンパク質が結合している、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[14]上記解析ドメインが、配列番号142に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列および配列番号143に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなる群から選択される、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[15]上記解析ドメインが、1つまたは複数の制限酵素配列を含む、上記[1]または[14]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[16]上記解析ドメインが、約40%〜約60%のグアニンおよびシトシン塩基対パーセンテージを含む、上記[1]または[14]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[17]上記解析ドメインが、9塩基対より長い長さを有する繰り返し配列を含有しないポリヌクレオチドを含む、上記[1]または[14]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[18]上記解析ドメインが、9Bpより長い長さの一連の同一塩基対配列を含有しないポリヌクレオチドを含む、上記[11]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[19]上記解析ドメインが、−19kcal/molを超える自由エネルギー(ΔG)の二次構造を有するポリヌクレオチドを含む、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[20]上記解析ドメインが、1つまたは複数のプライマー結合配列を含む、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[21]1つまたは複数の相同性アーム配列を含む、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[22]上記1つまたは複数の相同性アーム配列が、50から100塩基対の間の長さである、上記[21]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[23]上記1つまたは複数の相同性アーム配列が、最適ゲノム遺伝子座と少なくとも80%の配列同一性を共有する、上記[21]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[24]上記最適ゲノム遺伝子座が、最適遺伝子座_204637、最適_遺伝子座_204726、最適_遺伝子座_156393、最適_遺伝子座_198387、最適_遺伝子座_31710、最適_遺伝子座_64542、最適_遺伝子座_197372、最適_遺伝子座_232228、最適_遺伝子座_285621および最適_遺伝子座_157315からなる群から選択される、上記[23]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[25]上記解析ドメインが、ペプチドをコードしない、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[26]上記解析ドメインが、ペプチドをコードする、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[27]上記解析ドメインが、導入遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む、上記[26]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[28]上記遺伝子発現カセットが、プロモーターを含む、上記[27]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[29]上記導入遺伝子が、リポーター遺伝子を含む、上記[27]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[30]上記リポーター遺伝子が、yfp遺伝子、gus遺伝子、rfp遺伝子、gfp遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、aad−1遺伝子、aad−12遺伝子、pat遺伝子およびグリホサート耐性遺伝子からなる群から選択される、上記[29]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[31]上記プラスミドドメインが、pUC19プラスミドを含む、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[32]上記プラスミドドメインが、高コピー数複製起点を含む、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[33]上記高コピー数複製起点が、cole1複製起点を含む、上記[32]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[34]上記プラスミドドメインが、選択マーカーを含む、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[35]上記選択マーカーが、カナマイシン選択マーカー、アンピシリン選択マーカー、スペクチノマイシン選択マーカー、クロラムフェニコール選択マーカーおよびリファンピシン選択マーカーからなる群から選択される、上記[30]に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
[36]植物細胞のゲノム内のポリヌクレオチドドナーカセットのターゲッティングされた組込みのための方法であって、
a.少なくとも1つのDNA結合ドメインおよび少なくとも1つのヌクレアーゼドメインを含む部位特異的DNA結合ヌクレアーゼを発現させるステップであって、上記少なくとも1つのDNA結合ドメインが植物細胞のゲノム内の標的部位と結合する、ステップと、
b.上記植物細胞を、上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセットと接触させるステップと、
c.上記植物細胞のゲノム内の標的部位を上記部位特異的DNA結合ヌクレアーゼで切断するステップと、
d.上記[1]に記載のポリヌクレオチドドナーカセットを上記植物細胞のゲノム内の標的部位中に組み込むステップと
を含む、方法。
[37]上記少なくとも1つのDNA結合ドメインが、ジンクフィンガー結合ドメイン、メガヌクレアーゼ結合ドメイン、TALEN結合ドメイン、メガヌクレアーゼおよびCRISPR結合ドメインからなる群から選択される、上記[36]に記載の方法。
[38]上記ヌクレアーゼドメインが、IIS型制限エンドヌクレアーゼに由来する、上記[36]に記載の方法。
[39]上記IIS型制限エンドヌクレアーゼが、FokIおよびStsIからなる群から選択される、上記[38]に記載の方法。
[40]上記ポリヌクレオチドドナーカセットが、ポリペプチドを発現する、上記[36]に記載の方法。
[41]上記ポリヌクレオチドドナーカセットが、非コーディング核酸配列を含む、上記[36]に記載の方法。
[42]上記ポリヌクレオチドドナーカセットが、1つまたは複数のジンクフィンガー結合配列を含む、上記[36]に記載の方法。
[43]上記ポリヌクレオチドドナーカセットが、1つまたは複数のプライマー結合配列を含む、上記[36]に記載の方法。
[44]上記組み込むステップが、相同性によって指示される修復機序を含む、上記[36]に記載の方法。
[45]上記組み込むステップが、非相同性末端結合によって指示される修復機序を含む、上記[36]に記載の方法。
[46]上記植物細胞が、単子葉植物細胞である、上記[36]に記載の方法。
[47]上記単子葉植物細胞が、トウモロコシ植物細胞、コムギ植物細胞およびイネ植物細胞からなる群から選択される、上記[46]に記載の方法。
[48]上記植物細胞が、双子葉植物である、上記[36]に記載の方法。
[49]上記双子葉植物細胞が、ダイズ植物細胞、ワタ植物細胞およびキャノーラ植物細胞からなる群から選択される、上記[48]に記載の方法。
[50]上記標的部位が、最適ゲノム遺伝子座を含む、上記[36]に記載の方法。
[51]上記最適ゲノム遺伝子座が、以下の特徴:
a.上記非遺伝子配列のメチル化のレベルが1%以下であること、
b.上記非遺伝子配列が、上記ゲノム中に含有される任意のその他の配列と40%未満の配列同一性を共有すること、
c.上記非遺伝子配列が、既知または予測された発現コード配列の40Kbの領域内に位置すること、
d.上記非遺伝子配列が、0.00041cM/Mbより大きいゲノム内の組換え頻度を示すこと
を含む低メチル化非遺伝子配列である、上記[50]に記載の方法。
本開示は、種々の態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼ結合ドメイン、解析ドメインおよびプラスミドドメインを含むポリヌクレオチドドナーカセットを提供する。その他の態様では、本開示は、植物細胞のゲノム内のポリヌクレオチドドナーカセットのターゲッティングされた組込みを提供する方法を提供する。開示される方法によれば、少なくとも1つのDNA結合ドメインおよび少なくとも1つのヌクレアーゼドメインを含む部位特異的DNA結合ヌクレアーゼを発現させ、それにより少なくとも1つのDNA結合ドメインが植物細胞のゲノム内の標的部位と結合する。さらに、植物細胞を、ポリヌクレオチドドナーカセットと接触させる。その後、植物細胞のゲノム内の標的部位を部位特異的DNA結合ヌクレアーゼで切断し、ポリヌクレオチドドナーカセットを植物細胞のゲノム内の標的部位中に組み込む。
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本願が支配する。文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許およびその他の参考文献は、特許または特許公報の特定の節のみが、参照により組み込まれると示されない限り、個々の刊行物または特許出願が各々、具体的に、個別に、参照により組み込まれるよう示されるように、すべての目的のために参照によりその全文が組み込まれる。
本開示の一実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ結合ドメイン、解析ドメインおよびプラスミドドメインを含むポリヌクレオチドドナーカセットが提供される。
a)前記の非遺伝子配列のメチル化のレベルが1%以下であること、
b)非遺伝子配列が、ゲノム中に含有される任意のその他の配列と40%未満の配列同一性を共有すること、
c)非遺伝子配列が、ゲノム中に含有される任意のその他の配列と40%未満の配列同一性を共有すること、
d)非遺伝子配列が、既知または予測された発現コード配列の40Kbの領域内に位置すること、
e)非遺伝子配列が、0.00041cM/Mbより大きいゲノム内の組換え頻度を示すこと
を有する低メチル化非遺伝子配列である。
a)前記非遺伝子配列の40Kb内に既知または予測された遺伝子コード配列を有すること、
b)前記非遺伝子配列の一方の末端の40Kb内の既知遺伝子の2Kb上流および/または1Kb下流を含む配列を有すること、
c)非遺伝子配列内に1%より大きいDNAメチル化を含有しないこと、
d)ゲノム内の任意のその他の配列に対して40%を超える配列同一性を有する1Kbの配列を含有しないこと、
e)0.00041cM/Mbより大きい組換え頻度の組換えの証拠を例示すること
のうち1、2、3、4または5つを有する低メチル化非遺伝子配列である。
a)非遺伝子配列は、メチル化ポリヌクレオチドを含有しないこと、
b)非遺伝子配列は、0.00041〜62.42cM/Mbの割合のゲノム内の組換えを示すこと、
c)非遺伝子配列は、0〜0.962レベルのゲノムのヌクレオソーム占有を示すこと、
d)非遺伝子配列は、ゲノム中に含有される任意のその他の1Kbの配列と40%未満の配列同一性を共有すること、
e)非遺伝子配列は、染色体セントロメアからのゲノム距離の割合を表す0.00373〜0.99908の相対位置の値を有すること、
f)非遺伝子配列は、25.17〜68.3%の範囲のグアニン/シトシンパーセント含量範囲を有すること、
g)非遺伝子配列が、ゲノム配列に近接して位置すること、
h)前記非遺伝子配列を含むゲノム配列の1Mbの領域が、1つまたは複数の非遺伝子配列を含むこと
のうち2、3、4、5、6、7または8つを含む。
(A)植物疾患抵抗性遺伝子。植物防御は、植物中の疾患抵抗性遺伝子(R)の生成物と、病原体中の対応する病原性(Avr)遺伝子の生成物間の特定の相互作用によって活性化されることが多い。ある植物の種類が、クローニングされた抵抗性遺伝子を用いて形質転換され、特定の病原体株に対して抵抗性である植物に操作できる。このような遺伝子の例として、クラドスポリウム・フルブム(Cladosporium fulvu)に対する抵抗性のための、トマトCf−9遺伝子(Jones et al., 1994 Science 266:789)、トマト斑葉細菌病に対する抵抗性のためのプロテインキナーゼをコードする、トマトPto遺伝子(Martin et al., 1993 Science 262:1432)およびシュードモナス・シリンゲ(Pseudomonas syringae)に対する抵抗性のための、アラビドプシス属(Arabidopsis)RSSP2遺伝子(Mindrinos et al.、1994 Cell 78:1089)が挙げられる。
このような遺伝子の例として、イネシステインプロテイナーゼ阻害剤(Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793)、タバコプロテイナーゼ阻害剤I(Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985)およびα−アミラーゼ阻害剤(Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243)が挙げられる。
(A)成長点または***組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン(imidazalinone)、スルホンアニリドまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性または耐性をコードする遺伝子。このカテゴリー中の例示的遺伝子は、突然変異体ALS酵素をコードし(Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241)、これは、AHAS酵素としても知られている(Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449)。
(A)植物のステアリン酸含量を増大させるために、例えば、アンチセンス遺伝子またはステアロイル−ACP不飽和化酵素を用いて、トウモロコシまたはアブラナ属(Brassica)を形質転換することによって修飾された脂肪酸代謝(Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624。
(1)クロコウジカビ(Aspergillus niger)フィターゼ遺伝子などのフィターゼをコードする遺伝子の導入(Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸を形質転換植物に付加する。
(2)フィチン酸含量を低下させる遺伝子は、導入され得る。トウモロコシでは、これは、例えば、クローニングすることおよび次いで、低レベルのフィチン酸を特徴とするトウモロコシ突然変異体と関連している単一の対立遺伝子と関連しているDNAを再導入することによって達成され得る(Raboy et al., 1990 Maydica 35:383)。
本開示の特定の実施形態において記載されるユニバーサルドナーポリヌクレオチドを検出するために、種々のアッセイが使用され得る。以下の技術は、種々の状態において有用であり、一実施形態では、植物細胞における導入遺伝子をコードする核酸分子および/またはポリペプチドの存在の検出において有用である。例えば、分子の存在は、配列のプライマーまたはプローブを使用すること、コードされたタンパク質を検出するためのELISAアッセイ、タンパク質を検出するためのウエスタンブロットまたはRNAもしくはDNAを検出するためのノーザンもしくはサザンブロットを含めた種々の方法で決定され得る。ユニバーサルドナーポリヌクレオチドを検出するための酵素的アッセイが使用され得る。さらに、ユニバーサルドナーポリヌクレオチドタンパク質の存在を検出し得る抗体が、当技術分野で認識された手順を使用して作製され得る。特定の植物器官および組織における組換え構築物の存在または発現を検出するために、in situハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などのさらなる技術も使用され得る。ユニバーサルドナーポリヌクレオチド中に含有される導入遺伝子は、植物のいくつかの組織において、もしくはいくつかの発達段階で選択的に発現され得るか、または、ユニバーサルドナーポリヌクレオチド中に含有される導入遺伝子は、実質的にすべての植物組織において、実質的にその全生活環に沿って発現され得る。しかし、任意の組合せ発現様式も適用可能である。
[実施例]
ターゲッティング可能なトウモロコシ(Zea mays)ゲノム遺伝子座の同定されたDNA配列に対して向けられるジンクフィンガータンパク質を、以前に記載されたように設計した。例えば、Urnov et al.,(2005) Nature 435:646-551を参照のこと。例示的標的配列および認識へリックスが、表1(認識ヘリックス領域設計)および表2(標的部位)に示されている。表2には、ZFP認識へリックスによって接触される標的部位中のヌクレオチドが、大文字で示されており、接触されないヌクレオチドは、小文字で示されている。トウモロコシ(Zea mays)中の72種の選択されたゲノム遺伝子座のすべてについて、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)標的部位を設計した。多数のZFP設計を開発し、試験して、トウモロコシ(Zea mays)において同定および選択された72種の異なる代表的なゲノム遺伝子座標的部位を用いる酵母プロキシ系において最高レベルの効率で結合するフィンガーを同定した。ジンクフィンガー認識配列と最高レベルの効率で結合した特定のZFP認識へリックス(表1)を、トウモロコシ(Zea mays)ゲノム内のドナー配列のターゲッティングおよび組込みのために使用した。
以前に記載されたように同定されたZFN遺伝子発現構築物を含有するプラスミドベクターを設計し、当技術分野で一般的に知られている技能および技術を使用して完成した(例えば、AusubelまたはManiatisを参照のこと)。各ZFNコード配列を、ジンクフィンガーヌクレアーゼの上流に位置するopaque−2核局在性シグナル(Maddaloni et al., (1989) Nuc. Acids Res. 17:7532)をコードする配列と融合した。非標準ジンクフィンガーコード配列を、IIS型制限酵素FokIのヌクレアーゼドメイン(Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569の配列のの配列のアミノ酸384〜579)と融合した。融合タンパク質の発現は、5’非翻訳領域(UTR)を含むトウモロコシ(Zea mays)ユビキチン遺伝子に由来する強力な構成的プロモーターによって駆動された(Toki et al., (1992) Plant Physiology 100;1503-07)。発現カセットはまた、トウモロコシ(Zea mays)ペルオキシダーゼ5遺伝子(Per5)遺伝子に由来する3’UTRも含んでいた(転写ターミネーターおよびポリアデニル化部位を含む)(米国特許公開第2004/0158887号)。トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス由来のヌクレオチド配列をコードする自己加水分解性2A(Szymczak et al., (2004) Nat Biotechnol. 22:760-760)を、構築物中にクローニングされた2種のジンクフィンガーヌクレアーゼ融合タンパク質の間に加えた。
多数の標的遺伝子座の迅速試験を支援するために、新規の可動性のユニバーサルドナー系配列を設計し、構築した。ユニバーサルドナーポリヌクレオチド配列は、ハイスループットベクター構築方法論および解析と適合する。ユニバーサルドナー系は、少なくとも3つのモジュラードメイン:非可変性ZFN結合ドメイン、解析によっておよびユーザーによって規定される特徴のドメインならびにベクタースケールアップのための簡単なプラスミド骨格から構成されていた。非可変性ユニバーサルドナーポリヌクレオチド配列は、すべてのドナーに共通しており、トウモロコシ(Zea mays)標的部位のすべてにわたって使用され得る有限のセットのアッセイの設計を可能にし、したがって、ターゲッティング評価の均一性を提供し、解析サイクル時間を低減した。これらのドメインのモジュラー性が、ハイスループットドナーアセンブリーを可能にした。さらに、ユニバーサルドナーポリヌクレオチド配列は、下流の解析を簡単にすることおよび結果の解釈を増強することを目的としたその他の独特の特徴を有していた。PCR産物の診断上予測される大きさへの消化を可能にする非対称の制限部位配列を含有していた。PCR増幅において問題になると予測された第2の構造を含む配列を除去した。ユニバーサルドナーポリヌクレオチド配列の大きさは小さかった(3.0Kb未満)。最後に、ユニバーサルドナーポリヌクレオチド配列は、多量の試験DNAが適時にかさ高くなることを可能にする高コピーpUC19骨格の上に成り立っていた。
トウモロコシ(Zea mays)栽培種Hi−IIプロトプラストに送達する前に、各ZFN構築物のプラスミドDNAを、PURE YIELD PLASMID MAXIPREP SYSTEM(登録商標)(Promega Corporation、Madison、WI)またはPLASMID MAXI KIT(登録商標)(Qiagen、Valencia、CA)を使用し、供給業者の使用説明書に従って大腸菌(E. coli)の培養物から調製した。
トウモロコシ(Zea mays)栽培種Hi−II懸濁液細胞を、3.5日の維持スケジュールで維持し、4mLの血中血球容積(PCV)の細胞を回収し、20mLの酵素溶液(0.6%PECTOLYASE(商標)、6%CELLULASE(商標)(「Onozuka」R10;Yakult Pharmaceuticals、Japan)、4mM MES(pH5.7)、0.6Mマンニトール、15mM MgCl2)を含有する50mLの滅菌コニカルチューブ(Fisher Scientific)に移した。培養物をキャップし、PARAFILM(商標)で巻き、プロトプラストが放出されるまで室温で16〜18時間のインキュベーションのために速度設定10のプラットフォームロッカー(Thermo Scientific、Vari Mix platform Rocker)に置いた。インキュベーション後、細胞を、消化の品質について顕微鏡によって評価した。消化された細胞を100μmのセルストレーナーを通して濾過し、10mLのW5培地[2mM MES(pH5.7)、205mM NaCl、167mM CaCl2、6.7mM KCl]ですすぎ、続いて、70μmおよび40μmセルストレーナーを通して濾過した。100μmおよび40μmストレーナーを10mLのW5培地ですすいだ。濾過したプロトプラストをすすいだ培地とともに50mlの遠心管に回収し、最終容量は、およそ40mLであった。次いで、8mLの「Heavy Gradient溶液」[500mMスクロース、1mM CaCl2、5mM MES(pH6.0)]を、プロトプラスト/酵素溶液の底にゆっくりと添加し、スイングアームバケットローターを備えた遠心機中、300〜350×gで15分間遠心分離した。遠心分離後、約7〜8mLのプロトプラストバンドを回収し、25mLのW5で洗浄し、180〜200×gで15分間遠心分離した。次いで、プロトプラストを10mLのMMG溶液[4mM MES(pH5.7)、0.6Mマンニトール、15mM MgCl2]に再懸濁した。血球計算器またはフローサイトメーターを使用してプロトプラストをカウントし、MMGを使用して1mlあたり167万個に希釈した。
およそ50万個プロトプラスト(MMG溶液中300μL)を、2mLの試験管に移し、40μLのDNAと混合し、室温で5〜10分間インキュベートした。次いで、300μLの新たに調製されたPEG溶液(36%PEG4000、0.3Mマンニトール、0.4M CaCl2)を添加し、混合物を、反転によって周期的に混合しながら室温で15〜20分間インキュベートした。インキュベートした後、1mLのW5洗浄液をゆっくりと添加し、細胞を穏やかに混合し、プロトプラストを180〜200×gで15分間の遠心分離によってペレットにした。ペレットを1mlのWI培地[4mM MES(pH5.7)、0.6Mマンニトール、20mM KCl]に再懸濁し、試験管にアルミニウムホイルを巻き、室温で一晩、約16時間インキュベートした。
選択されたゲノム遺伝子座の各々について、トウモロコシ(Zea mays)プロトプラストを、yfp遺伝子発現対照、ZFN単独、ドナー単独およびZFNとドナーの1:10比(重量で)の混合物を用いてトランスフェクトした。50万個プロトプラストのトランスフェクションのためのDNAの総量を80μgとした。すべての処理は、3または6個のいずれかの複製物で実施した。使用したyfp遺伝子発現対照は、トウモロコシ(Zea mays)ユビキチン1プロモーター−黄色蛍光タンパク質コード配列−トウモロコシ(Zea mays)Per5 3’UTRおよびRice Actin1プロモーター−patコード配列−トウモロコシ(Zea mays)リパーゼ3’UTR遺伝子発現カセットを含有するpDAB8393(図14)であった。通常のターゲッティング実験では、4μgのZFNを、単独でまたは36μgのドナーとともに同時トランスフェクトし、各処理に40μgのyfpリポーター遺伝子構築物を添加した。増量剤として一貫した量のyfp遺伝子発現プラスミドを含めることによって、複数の遺伝子座および複製物処理にわたってトランスフェクション品質の評価が可能となる。さらに、一貫した量のyfp遺伝子発現プラスミドの使用によって、ドナー挿入の迅速なターゲッティング解析での任意の技術的問題の迅速なトラブルシューティングが可能となる。
ZFNをトランスフェクトされたトウモロコシ(Zea mays)栽培種Hi−IIプロトプラストを、2mL EPPENDORF(商標)試験管中での1600rpmでの遠心分離によってトランスフェクションの24時間後に回収し、上清を除去した。QIAGEN PLANT DNA EXTRACTION KIT(商標)(Qiagen、Valencia、CA)を使用してゲノムDNAをプロトプラストペレットから抽出した。単離されたDNAを50μLの水に再懸濁し、NANODROP(登録商標)(Invitrogen、Grand Island、NY)によって濃度を決定した。DNAの完全性は、0.8%アガロースゲル電気泳動でサンプルを流すことによって推定した。すべてのサンプルは、PCR増幅のために正規化して(20〜25ng/μL)、配列決定のためにアンプリコンを作製した(Illumina,Inc.、San Diego、CA)。処理されたサンプルおよび対照サンプルから得られた各試験ZFN認識配列を包含する領域を増幅するためのバーコード付きPCRプライマーを設計し、IDT(Coralville、IA、HPLC purified)から購入した。最適増幅条件は、23.5μLの反応物で、0.2μMの適当なバーコード付きプライマー、ACCUPRIME PFX SUPERMIX(商標)(Invitrogen、Carlsbad、CA)および100ngの鋳型ゲノムDNAを使用して勾配PCRによって同定した。サイクリングパラメータは、95℃(5分)の最初の変性と、それに続く、変性(95℃、15秒)、アニーリング(55〜72℃、30秒)、伸長(68℃、1分)の35サイクルおよび最終伸長(68℃、7分)とした。増幅産物を、3.5%TAEアガロースゲルで解析し、各プライマーの組合せの適当なアニーリング温度を決定し、上記のような対照およびZFN処理されたサンプルからアンプリコンを増幅するために使用した。すべてのアンプリコンは、3.5%アガロースゲルで精製し、水に溶出し、NANODROP(商標)によって濃度を決定した。次の作製、配列決定のために、ZFN処理されたおよび対応するトウモロコシプロトプラスト対照から得られたおよそ100ngのPCRアンプリコンを一緒にプールし、Illumina Next Generation Sequencing(NGS)を使用して配列決定した。
ジンクフィンガーヌクレアーゼによるトウモロコシ(Zea mays)中のゲノム遺伝子座内の配列
非相同末端結合(NHEJ)媒介性ドナー挿入による、トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的内のユニバーサルドナーポリヌクレオチド配列のターゲッティングの検証を、半スループットプロトプラストベースの迅速ターゲッティング解析方法を使用して実施した。各トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的について、Next Generation Sequencing方法(図15)および接合部In−Out PCRによるドナー挿入(図16)によって、3〜6種のZFN設計を試験し、ZFN媒介性切断を測定することによってターゲッティングを評価した。両アッセイにおいて陽性であったトウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座をターゲッティング可能な遺伝子座として同定した。
トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的が、ドナー挿入のためにターゲッティングされ得るかどうかを判定するために、ZFN構築物およびユニバーサルドナーポリヌクレオチド構築物を、トウモロコシプロトプラストに同時送達し、これを24時間インキュベートし、その後、解析のためにゲノムDNAを抽出した。発現されたZFNが、トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的で、およびドナーにおいての両方で標的結合部位を切断できた場合、非相同末端結合(NHEJ)経路によってトウモロコシゲノム中の切断された標的部位中に直線化されたドナーを挿入した。トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的でのターゲッティングされた組込みの確認は、「Out」プライマーが天然のゲノム遺伝子座の配列を認識し、「In」プライマーがドナーDNA内の配列と結合する「In−Out」PCR戦略に基づいて完了した。プライマーは、ドナーDNAが、トウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的で挿入される場合にのみ、PCRアッセイが予測された大きさの増幅産物を生成するような方法で設計した。In−Out PCRアッセイは、挿入接合部の5’および3’末端の両方で実施される。組み込まれたポリヌクレオチドドナー配列の解析に使用されるプライマーは、表5に提供されている。
すべてのPCR増幅を、TAKARA EX TAQ HS(商標)キット(Clonetech、Mountain View、CA)を使用して実施した。第1のIn−Out PCRは、1× TAKARA EX TAQ HS(商標)バッファー、0.2mM dNTP、0.2μM「Out」プライマー(表5)、0.05μM「In」プライマー(上記のユニバーサルドナーカセットから設計された)、0.75ユニットのTAKARA EX TAQ HS(商標)ポリメラーゼおよび10ngの抽出されたトウモロコシプロトプラストDNAを含有する20μLの最終反応容量で実施した。次いで、反応を、94℃で2分、98℃で12秒および68℃で2分と、それに続く72℃で10分の20サイクルからなるPCRプログラムを使用して実施し、4℃で保持した。最終PCR産物を、アガロースゲルで、可視化のために1KB PLUS DNA LADDER(商標)(Life Technologies、Grand Island、NY)とともに泳動した。
ドナープラスミドおよびトウモロコシ(Zea mays)の選択されたゲノム遺伝子座標的を特異的に切断するように設計された1種のZFNを、トウモロコシ(Zea mays)栽培種Hi−IIプロトプラスト中にトランスフェクトし、細胞を24時間後に回収した。In−Out接合部PCRによる、対照、ZFN処理されたおよびドナーとともにZFN処理されたプロトプラストから単離されたゲノムDNAの解析は、ZFNによるゲノムDNA切断の結果としてのユニバーサルドナーポリヌクレオチドのターゲッティングされた挿入を示した(表8)。これらの研究は、ユニバーサルドナーポリヌクレオチド系は、候補ZFNをスクリーニングするために内因性部位でのターゲッティングを評価するために使用され得ることを示す。最後に、プロトプラストベースの迅速ターゲッティング解析および新規ユニバーサルドナーポリヌクレオチド配列系は、植物における正確なゲノムエンジニアリング取り組みのためにゲノム標的およびZFNをスクリーニングするための改善された系を提供する。方法は、DNA二本鎖または一本鎖破壊を導入する任意のヌクレアーゼを使用する対象の任意の系において、ゲノム標的での部位特異的切断およびドナー挿入を評価するよう拡張できる。
Claims (17)
- 部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメイン、解析ドメインおよびプラスミドドメインを含むポリヌクレオチドドナーカセットであって、
前記部位特異的ヌクレアーゼ結合ドメインが、ジンクフィンガー部位特異的ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ部位特異的ヌクレアーゼ、CRISPR部位特異的ヌクレアーゼ、またはTALEN部位特異的ヌクレアーゼに結合する部位特異的ヌクレアーゼ結合配列を含み、
前記解析ドメインが、配列番号142に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列および配列番号143に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む、
ポリヌクレオチドドナーカセット。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドドナーカセットを含むトランスジェニック細胞。
- トランスジェニック植物細胞である、請求項2に記載のトランスジェニック細胞。
- 請求項2に記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物であって、以下の要件:
i)前記植物が単子葉植物である、
ii)前記植物が双子葉植物である、
のうちの少なくとも1つを満たす、トランスジェニック植物。 - 前記単子葉植物が、トウモロコシ植物、コムギ植物およびイネ植物からなる群から選択される、請求項4に記載のトランスジェニック植物。
- 前記双子葉植物が、ダイズ植物、ワタ植物およびキャノーラ植物からなる群から選択される、請求項4に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項3に記載のトランスジェニック植物から得られるトランスジェニック種子。
- 配列番号132に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号133に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号134に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号135に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号136に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号137に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号138に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号139に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、配列番号140に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列および配列番号141に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
- 前記解析ドメインが、9塩基対長よりも長い一連の同一の塩基対配列を含まないポリヌクレオチドを含む、請求項8に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
- 1つ以上の相同性アーム配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
- 前記1つ以上の相同性アーム配列が、最適遺伝子座_204637(配列番号210)、最適_遺伝子座_204726(配列番号211)、最適_遺伝子座_156393(配列番号212)、最適_遺伝子座_198387(配列番号213)、最適_遺伝子座_31710(配列番号214)、最適_遺伝子座_64542(配列番号215)、最適_遺伝子座_197372(配列番号216)、最適_遺伝子座_232228(配列番号217)、最適_遺伝子座_285621(配列番号218)および最適_遺伝子座_157315(配列番号219)からなる群から選択される最適ゲノム遺伝子座と少なくとも95%の配列同一性を有していてもよい、請求項10に記載のポリヌクレオチドドナーカセット。
- 植物細胞のゲノム内のポリヌクレオチドドナーカセットのターゲッティングされた組込みのための方法であって、
a.少なくとも1つのDNA結合ドメインおよび少なくとも1つのヌクレアーゼドメインを含む部位特異的DNA結合ヌクレアーゼを発現させるステップであって、前記少なくとも1つのDNA結合ドメインが植物細胞のゲノム内の標的部位と結合する、ステップと、
b.前記植物細胞を、請求項1に記載のポリヌクレオチドドナーカセットと接触させるステップと、
c.前記植物細胞のゲノム内の標的部位を前記部位特異的DNA結合ヌクレアーゼで切断するステップと、
d.請求項1に記載のポリヌクレオチドドナーカセットを前記植物細胞のゲノム内の標的部位中に組み込むステップと
を含む、方法。 - 以下の少なくとも1つを含む、請求項12に記載の方法:
i)前記少なくとも1つのDNA結合ドメインが、ジンクフィンガー結合ドメイン、メガヌクレアーゼ結合ドメイン、TALEN結合ドメイン、メガヌクレアーゼおよびCRISPR結合ドメインからなる群から選択される、
ii)前記ヌクレアーゼドメインが、IIS型制限エンドヌクレアーゼに由来する、
iii)前記ポリヌクレオチドドナーカセットが、ポリペプチドを発現する、
iv)前記ポリヌクレオチドドナーカセットが、非コーディング核酸配列を含む、
v)前記ポリヌクレオチドドナーカセットが、1つまたは複数のジンクフィンガー結合
配列を含む、
vi)前記ポリヌクレオチドドナーカセットが、1つまたは複数のプライマー結合配列を含む、
vii)前記組み込むステップが、相同性によって指示される修復機序(homology directed repair mechanism)を含む、
viii)前記組み込むステップが、非相同性末端結合によって指示される修復機序(non-homologous end joining directed repair mechanism)を含む、
ix)前記植物細胞が、単子葉植物細胞である、
x)前記植物細胞が、双子葉植物である、
xi)前記標的部位が、最適ゲノム遺伝子座を含む。 - 前記IIS型制限エンドヌクレアーゼが、FokIおよびStsIからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記単子葉植物細胞が、トウモロコシ植物細胞、コムギ植物細胞およびイネ植物細胞からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記双子葉植物細胞が、ダイズ植物細胞、ワタ植物細胞およびキャノーラ植物細胞からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記最適ゲノム遺伝子座が、以下の特徴を含む低メチル化非遺伝子配列である、請求項13に記載の方法:
a.前記非遺伝子配列のメチル化のレベルが1%以下であること、
b.前記非遺伝子配列が、前記ゲノム中に含有される任意のその他の配列と40%未満の配列同一性を共有すること、
c.前記非遺伝子配列が、既知または予測された発現コード配列の40Kbの領域内に位置すること、
d.前記非遺伝子配列が、0.00041cM/Mbより大きいゲノム内の組換え頻度を示すこと。
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