JP6559709B2 - Her1のベータ−ヘアピンに結合するher1抗原結合タンパク質 - Google Patents
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Description
ヒトHER1(別名上皮増殖因子受容体EGFR又はErb−B1)は、c−erbBがん原遺伝子によってコードされる170kDa膜貫通型受容体であり、固有のチロシンキナーゼ活性を示す(Modjtahedi, H.等、Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235;Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611)。SwissProtデータベースエントリー番号P00533は、HER1の配列を提供する(配列番号2)。限定されずにSwissprotデータベースエントリー番号P00533−1、P00533−2、P00533−3及びP00533−4によって特定されるものを含む、HER1のアイソフォーム及び変異体(例えば、代替RNA転写物、切除型、多型等)もある。HER1は、α)、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子−α(TGF)、アンフィレグリン、ヘパリン結合性EGF(hb−EGF)、ベータセルリン及びエピレグリンを含むリガンドに結合することが公知である(Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611;Mendelsohn, J.及びBaselga, J.、Oncogene 19 (2000) 6550-6565)。HER1は、細胞の増殖、分化、細胞生存、アポトーシス、血管新生、有糸***及び転移をコントロールするシグナル伝達経路の活性化を限定されずに含む、チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路を通して多数の細胞プロセスを調節する(Atalay, G.等、Ann. Oncology 14 (2003) 1346-1363;Tsao, A.S.及びHerbst, R.S.、Signal 4 (2003) 4-9;Herbst, R.S.及びShin, D.M.、Cancer 94 (2002) 1593-1611;Modjtahedi, H.等、Br. J. Cancer 73 (1996) 228-235)。
抗原結合性タンパク質、特に抗体はヒトHER1のPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合し;
a)配列番号1のアミノ酸配列を含む
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドが、a)の下の少なくとも1つのポリペプチドへの結合を示す抗原結合性タンパク質、特に抗体を選択するために用いられ、
それによって、ヒトHER1のPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する抗原結合性タンパク質、特に抗体を選択する方法を提供する。
配列番号13 TtSlyDcys−HER1;又は
配列番号18 TgSlyDcys−HER1
のポリペプチドに結合する。
配列番号13 TtSlyDcys−HER1
のポリペプチドに結合する。
配列番号18 TgSlyDcys−HER1
のポリペプチドに結合する。
抗原結合性タンパク質は、
配列番号13のTtSlyDcys−HER1のポリペプチドに含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGK
のアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する。
抗原結合性タンパク質は、
配列番号18のTgSlyDcys−HER1のポリペプチドに含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGK
のアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する。
配列番号13 TtSlyDcys−HER1;又は
配列番号18 TgSlyDcys−HER1
のポリペプチドに結合する。
配列番号13 TtSlyDcys−HER1
のポリペプチドに結合する。
配列番号18 TgSlyDcys−HER1
のポリペプチドに結合する。
a)配列番号1のアミノ酸配列に結合する;並びに/又は
b)活性化HER1のアミノ酸配列の配列番号1に結合する;並びに/又は
c)
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する、
並びに/又は
d)HER1のβ−ヘアピン領域に結合する;並びに/又は
e)HER1/HER2ヘテロダイマーのヘテロ二量体化を阻害する;並びに/又は
f)HER2、HER3及び/若しくはHER4と交差反応性を有さない;並びに/又は
g)抗体はアミノ酸配列TYQMDVNPEG(配列番号19)を含む15アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する;及び/又は
h)TYQMDVNPEG(配列番号19)からなるポリペプチドに結合する;並びに/又は
i)抗体はアミノ酸配列MLYNPTTYQ(配列番号20)を含む15アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する;及び/又は
j)MLYNPTTYQ(配列番号20)からなるポリペプチドに結合する;並びに/又は
k)EGFの非存在下でA549がん細胞(ATCC CCL−185)においてHER1のリン酸化を誘導しない;並びに/又は
l)EGFの非存在下でHER1のリン酸化に関して非アゴニスト抗体である;並びに/又は
m)HER1発現A549細胞(ATCCCCL−185)を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの存在下でHER1の70パーセントを超える内部移行を示し、HER1発現A549細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの非存在下でHER1の55パーセント未満の内部移行を示す。
a)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240)の全ての3つの重鎖HVR及び全ての3つの軽鎖HVR;
b)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)の全ての3つの重鎖HVR及び全ての3つの軽鎖HVR;
c)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238)の全ての3つの重鎖HVR及び全ての3つの軽鎖HVR;
d)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239)の全ての3つの重鎖HVR及び全ての3つの軽鎖HVR。
a)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240)の全ての3つの重鎖HVR及び全ての3つの軽鎖HVR;
b)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)の全ての3つの重鎖HVR及び全ての3つの軽鎖HVR;
c)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238)の全ての3つの重鎖HVR及び全ての3つの軽鎖HVR;
d)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239)の全ての3つの重鎖HVR及び全ての3つの軽鎖HVR。
i)配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
ii)配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
iii)配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
iv)配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
v)配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
vi)配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択されるポリペプチドであり、このポリペプチドは配列番号1のアミノ酸配列を含む。
i)配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
ii)配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
iii)配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
iv)配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
v)配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
vi)配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択されるそのようなポリペプチドの1つの使用をさらに提供する。
a)実験動物に、
i)配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
ii)配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
iii)配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
iv)配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
v)配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
vi)配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
なる群から選択されるポリペプチドを少なくとも1回投与する工程であって、ポリペプチドは配列番号1のアミノ酸配列を有するHER1のβ−ヘアピンを含む、工程、
b)ポリペプチドの最後の投与の3日から10日後に配列番号1のアミノ酸配列を有するHER1のβ−ヘアピンに特異的に結合する抗体を生成するB細胞を実験動物から回収する工程、並びに
c)配列番号1のアミノ酸配列を有するHER1のβ−ヘアピンに特異的に結合する抗体をコードする核酸を含む細胞を培養し、細胞又は培地から抗体を回収し、それによって標的抗原に特異的に結合する抗体を生成する工程。
i)配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
ii)配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
iii)配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
iv)配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
v)配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
vi)配列番号18 TgSlyDcys−HER1
からなる群から選択されるポリペプチドの使用をさらに提供し、ポリペプチドは配列番号1のアミノ酸配列を有するHER1のβ−ヘアピンにエピトープを含む。
本明細書において、「アクセプターヒトフレームワーク」は、下に規定されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことができるか、又はそれはアミノ酸配列変化を含有することができる。一部の実施態様では、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下又は2以下である。一部の実施態様では、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
(a)アミノ酸残基26−32(L1)、50−52(L2)、91−96(L3)、26−32(H1)、53−55(H2)及び96−101(H3)で見られる超可変ループ(Chothia及びLesk、J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b)アミノ酸残基24−34(L1)、50−56(L2)、89−97(L3)、31−35b(H1)、50−65(H2)及び95−102(H3)で見られるCDR(Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD (1991));
(c)アミノ酸残基27c−36(L1)、46−55(L2)、89−96(L3)、30−35b(H1)、47−58(H2)及び93−101(H3)で見られる抗原接触部(MacCallum等、J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));及び
(d)HVRアミノ酸残基46−56(L2)、47−56(L2)、48−56(L2)、49−56(L2)、26−35(H1)、26−35b(H1)、49−65(H2)、93−102(H3)及び94−102(H3)を含む(a)、(b)及び/又は(c)の組合せ。
分数X/Y×100
上式で、XはAとBのそのプログラムのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムALIGN−2により同一の組合せとして評価されるアミノ酸残基の数であり、YはBの中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さに等しくない場合は、AのBとのアミノ酸配列%同一性は、BのAとのアミノ酸配列%同一性と等しくない。特記されていない限り、本明細書で用いられる全てのアミノ酸配列同一性%値は、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて直前の段落に記載の通りに得られる。
一態様では、本発明は、SlyD足場の中に三次元配向で機能的に提示されるHER1のベータ−ヘアピン(例えば、図2、並びに配列番号12から16及び18のポリペプチドを参照されたい)を用いることによって、HER1のベータ−ヘアピンに特異的である(及びHER2、HER3及び/又はHER4と交差反応しない)抗体を選択することが可能であったとの知見に一部基づく。
本発明は、ヒトHER1に結合する単離された抗原結合性タンパク質を提供し、抗原結合性タンパク質は以下からなる群から選択されるポリペプチドに結合する:
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1。
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1。
a)抗原結合性タンパク質は、
配列番号13 TtSlyDcys−Her1
のポリペプチドに結合する。
抗原結合性タンパク質は、ELISAアッセイで、
配列番号13 TtSlyDcys−Her1
のポリペプチドに、
配列番号11 TtSlyDcas
のポリペプチドへの結合と比較して少なくとも50倍高いELISAシグナル(好ましくは少なくとも100倍高く、別の好ましい実施態様では少なくとも500倍高い)で結合し、ここで、TtSlyDcys−HER1及びTtSlyDcasは0.5μg/mlの濃度で固定化されている。
a)抗原結合性タンパク質は、配列番号13のポリペプチド(TtSlyDcys−Her1)に含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する。
a)抗体は以下からなる群から選択されるポリペプチドに結合する:
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1。
a)抗体は以下からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する:
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1。
a)抗体は、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1
のポリペプチドに結合する。
a)抗体は、配列番号13のポリペプチド(TtSlyDcys−Her1)に含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する。
a)抗体は配列番号1のアミノ酸配列に結合する;並びに/又は
b)抗体は活性化HER1のアミノ酸配列の配列番号1に結合する;並びに/又は
c)抗体は、
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する、
並びに/又は
d)HER1のβ−ヘアピン領域に結合する;並びに/又は
e)HER1/HER2ヘテロダイマーのヘテロ二量体化を阻害する;並びに/又は
f)HER2、HER3及び/若しくはHER4と交差反応性を有さない;並びに/又は
g)抗体はアミノ酸配列TYQMDVNPEG(配列番号19)を含む15アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する;並びに/又は
h)TYQMDVNPEG(配列番号19)からなるポリペプチドに結合する;並びに/又は
i)抗体はアミノ酸配列MLYNPTTYQ(配列番号20)を含む15アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する;並びに/又は
j)MLYNPTTYQ(配列番号20)からなるポリペプチドに結合する;並びに/又は
k)EGFの非存在下でA549がん細胞においてHER1のリン酸化を誘導しない(実施例6を参照されたい);並びに/又は
l)EGFの非存在下でHER1のリン酸化に関して非アゴニスト抗体である(実施例6を参照されたい);並びに/又は
m)HER1発現A549細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの存在下でHER1の70パーセントを超える内部移行を示し、HER1発現A549細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの非存在下でHER1の55パーセント未満の内部移行を示す(実施例5を参照されたい)。
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240);
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241);
iii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238);及び
iv)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239)。
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240);及び
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)。
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240);
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241);
iii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238);及び
iv)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239)
からなる群から選択される全部で6つのHVRを含む抗HER1抗体を提供し、抗体は、以下の特性の1つ又は複数を有する:
a)抗体は配列番号1のアミノ酸配列に結合する;並びに/又は
b)抗体は活性化HER1のアミノ酸配列の配列番号1に結合する;並びに/又は
c)抗体は、
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択されるポリペプチドに含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する、
並びに/又は
d)HER1のβ−ヘアピン領域に結合する;並びに/又は
e)HER1/HER2ヘテロダイマーのヘテロ二量体化を阻害する;並びに/又は
f)HER2、HER3及び/又はHER4と交差反応性を有さない;並びに/又は
g)抗体はアミノ酸配列TYQMDVNPEG(配列番号19)を含む15アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する;並びに/又は
h)TYQMDVNPEG(配列番号19)からなるポリペプチドに結合する;並びに/又は
i)抗体はアミノ酸配列MLYNPTTYQ(配列番号20)を含む15アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する;並びに/又は
j)MLYNPTTYQ(配列番号20)からなるポリペプチドに結合する;並びに/又は
k)EGFの非存在下でA549がん細胞においてHER1のリン酸化を誘導しない(実施例6を参照);並びに/又は
l)EGFの非存在下でHER1のリン酸化に関して非アゴニスト抗体である(実施例6を参照されたい);並びに/又は
m)HER1発現A549細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの存在下でHER1の70パーセントを超える内部移行を示し、HER1発現A549細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの非存在下でHER1の55パーセント未満の内部移行を示す(実施例5を参照されたい)。
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240);
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241);
iii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238);及び
iv)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239)。
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240);又は
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)。
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240);
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241);
iii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238);及び
iv)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239)。
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240);及び
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM又は≦0.001nM(例えば、10−8M以下、例えば10−8Mから10−13M、例えば10−9Mから10−13M)の解離定数KDを有する。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、限定されずに、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv及びscFv断片、並びに下記の他の断片が含まれる。ある特定の抗体断片の概説については、Hudson,P.J.等、Nat.Med.9(2003)129−134を参照されたい。scFv断片の概説については、例えば、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、113巻、Rosenburg及びMoore(編)、Springer−Verlag、New York(1994)p269−315中のPlueckthun,A.を参照;国際公開第93/16185号;並びに米国特許第5571894号及び5587458号も参照する。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するFab及びF(ab’)2断片の考察については、米国特許第5869046号を参照されたい。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4816567号;及びMorrison,S.L.等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81(1984)6851−6855に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域)及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のものから変化している「クラススイッチ」された抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合性断片を含む。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知である様々な技術を用いて生成することができる。ヒト抗体は、van Dijk,M.A.及びvan de Winkel,J.G.、Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368−374及びLonberg,N.、Curr.Opin.Immunol.20(2008)450−459に一般に記載されている。
本発明の抗体は、所望の活性(複数可)を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするために、様々な方法が当該技術分野で公知である。そのような方法は、例えば、Methods in Molecular Biology 178(2001)1−37中のHoogenboom,H.R.等で概説され、さらに、例えば、McCafferty,J.等、Nature 348(1990)552−554;Clackson,T.等、Nature 352(1991)624−628;Marks,J.D.等、J.Mol.Biol.222(1992)581−597;Methods in Molecular Biology 248(2003)161−175中のMarks,J.D.及びBradbury,A.;Sidhu,S.S.等、J.Mol.Biol.338(2004)299−310;Lee,C.V.等、J.Mol.Biol.340(2004)1073−1093;Fellouse,F.A.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467−12472;及びLee,C.V.等、J.Immunol.Methods 284(2004)119−132に記載されている。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、結合特異性の1つはHER1に対してであり、他は任意の他の抗原に対してである。HER1を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するために、二重特異性抗体を用いることもできる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を向上させることが望ましいことがある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することができる。そのような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列中の残基からの欠失、及び/又はそれへの挿入及び/又はその置換が含まれる。その最終コンストラクトが所望の特徴、例えば抗原結合性を有する限り、最終コンストラクトに到達するために欠失、挿入及び置換の任意の組合せを作成することができる。
ある特定の実施態様では、1つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型突然変異誘発のための目的の部位には、HVR及びFRが含まれる。表1に「好ましい置換」の項目名の下に、保存的置換を示す。表1に「例示的な置換」の項目名の下に、及びアミノ酸側鎖クラスに関して下でさらに記載されるように、より実質的な変化が提供される。アミノ酸置換を目的の抗体に導入することができ、生成物を所望の活性、例えば、保持/改善された抗原結合性、低下した免疫原性又は改善されたADCC若しくはCDCについてスクリーニングすることができる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変更される。抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、1つ又は複数のグリコシル化部位が形成又は除去されるように、アミノ酸配列を変更することによって簡便に達成することができる。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体のFc領域に1つ又は複数のアミノ酸改変を導入し、それによってFc領域変異体を生成することができる。Fc領域変異体は、1つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば、置換)を含むヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4のFc領域)を含むことができる。
ある特定の実施態様では、抗体の1つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されるシステイン操作抗体、例えば「thioMAb」を作製することが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。本明細書にさらに記載されるように、それらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に置かれ、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分にコンジュゲートさせてイムノコンジュゲートを作製するために用いることができる。ある特定の実施態様では、以下の残基の任意の1つ又は複数をシステインで置換することができる:軽鎖のV205(カバット番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。例えば米国特許第7521541号に記載されるように、システイン操作抗体を生成することができる。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で公知であって直ちに利用できるさらなる非タンパク質部分を含有するように、さらに改変することができる。抗体の誘導体化のために適する部分には、限定されずに水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーの非限定例には、限定されずに、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダム共重合体)、及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有することができる。ポリマーは任意の分子量であってもよく、分枝状であっても非分枝状であってもよい。抗体に付着するポリマーの数は異なってもよく、1を超える数のポリマーが付着する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために用いられるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されずに、改善する抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定条件下の療法で用いられるかどうか、などを含む考慮事項に基づいて決定することができる。
抗体は、例えば米国特許第4816567号に記載されているように、組換え方法及び組成物を用いて生成することができる。一実施態様では、本明細書に記載される抗HER1抗体をコードする単離核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/又はVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードすることができる。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む1つ又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる実施態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような実施態様では、宿主細胞は、以下のものを含む(例えば、以下のもので形質転換されている):(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター。一実施態様では、宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様では、抗HER1抗体を作製する方法であって、上で提供されるような抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を抗体の発現に適する条件下で培養すること、及び任意選択的に宿主細胞(又は宿主細胞培地)から抗体を回収することを含む方法が提供される。
本明細書で提供される抗HER1抗体は、当該技術分野で公知の様々なアッセイによってそれらの物理的/化学的特性及び/又は生物学的活性について特定するか、スクリーニングするか又は特徴付けることができる。
ここで、
a)配列番号1のアミノ酸配列を含む
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドが;
a)の下の少なくとも1つのポリペプチドへの結合を示す抗体(又は抗原結合性タンパク質)を(結合アッセイで)選択するために用いられ、
それによって、ヒトHER1のPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する抗原結合性タンパク質、特に抗体を選択する方法である。
配列番号11 TtSlyDcas
配列番号17 TgSlyDΔIF
からなる群から選択されるポリペプチドで逆スクリーニングされる(ポリペプチドへの結合について試験される)工程をさらに含む。
a)配列番号1のアミノ酸配列を有するHER1のβ−ヘアピンへの複数の抗体(又は抗原結合性タンパク質)の結合親和性を判定する工程であって、HER1のβ−ヘアピンは、配列番号1のアミノ酸配列を有するHER1のβ−ヘアピンを含む:
i)配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
ii)配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
iii)配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
iv)配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
v)配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
vi)配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択されるポリペプチドとして提示される工程、
b)所定の閾値レベルを上回る明らかな複合安定性を有する抗体(又は抗原結合性タンパク質)を選択する工程
を含む方法。
一態様では、本発明の抗体(又は抗原結合性タンパク質)は、例えば、表面プラズモン共鳴(BIACORE)を含む、ELISA、ウェスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240);
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241);
iii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238);又は
iv)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239);
と競合する抗体を特定するために、競合アッセイを用いることができる。
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240);
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241);
iii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238);又は
iv)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239)
が結合するのと同じエピトープ(例えば、線状又は立体配置的エピトープ)に結合する。
一態様では、生物活性を有する、その抗HER1抗体(又は抗原結合性タンパク質)を特定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、HER1リン酸化の阻害、EGFの非存在下でのHER1リン酸化に関する非アゴニスト活性、HER1を発現又は過剰発現するがん細胞のがん細胞増殖の阻害、HER1/HER1ホモ二量体化の阻害、HER1/HER2ヘテロ二量体化の阻害、ウェスタンブロット又はFACSアッセイによる(時間依存的)内部移行、異種移植HER1を発現又は過剰発現するがん細胞を有する異種移植動物(例えば、マウス又はラット)モデルでのインビボ腫瘍増殖阻害を含めることができる。そのような生物活性を有する抗体は、単独で、又はインビボ及び/又はインビトロで細胞傷害性剤とのイムノコンジュゲートとしても提供される。
本発明は、1つ又は複数の細胞傷害性剤、例えば化学療法剤若しくは薬物、増殖阻害剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物起源のタンパク質毒素、酵素活性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗HER1抗体(又は抗原結合性タンパク質)を含むイムノコンジュゲートも提供する。
ある特定の実施態様では、本明細書で提供される抗HER1抗体(又は抗原結合性タンパク質)のいずれも、生物学的試料中のHER1の存在をそれぞれ検出するのに有益である。本明細書で用いる用語「検出する」は、定量的又は定性的検出を包含する。ある特定の実施態様では、生物学的試料は、腫瘍組織などの細胞又は組織を含む。
本明細書に記載される抗HER1抗体(又は抗原結合性タンパク質)の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような抗体を、1つ又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences、16版、Osol, A.(編)(1980))と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、採用される投薬量及び濃度でレシピエントに一般に無毒であり、限定されずに以下のものが含まれる:バッファー、例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンザルコニウムクロライド;ベンゼトニウムクロライド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;ポリ(ビニルピロリドン)などの親水性ポリマー;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン;単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えばZn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体には、間質性の薬物分散剤、例えば可溶型中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えばヒト可溶型PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)がさらに含まれる。rhuPH20を含む有用なある特定の例示的なsHASEGP及び方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号及び第2006/0104968号に記載されている。一態様では、sHASEGPはコンドロイチン分解酵素などの1つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
本明細書で提供される、抗HER1抗体(又は抗原結合性タンパク質)又は細胞傷害性剤にコンジュゲートされた抗HER1抗体(又は抗原結合性タンパク質)のイムノコンジュゲートのいずれも、治療方法で用いることができる。
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び/又は診断のために有益な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器の上に又はそれに関連して表示又は添付文書を含む。適する容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料で形成することができる。容器は、それ自体が有効であるか、又は状態を治療、予防及び/若しくは診断するために有効な別の組成物と組み合わされた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有することができる(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿刺可能なストッパを有するバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本発明の抗体である。表示又は添付文書は、組成物が選択された状態を治療するために用いられることを示す。さらに、製造品は、(a)本発明の抗体を含む組成物を含有する第1の容器;及び(b)さらなる細胞傷害性の、さもなければ治療用の薬剤を含む組成物を含有する第2の容器を含むことができる。本発明のこの実施態様で、製造品は、特定の状態を治療するために組成物を用いることができることを示す添付文書をさらに含むことができる。あるいは、又はさらに、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水、リンガー液及びデキストローズ溶液を含む第2の(又は第3の)容器をさらに含むことができる。それは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの見地から望ましい他の材料をさらに含むことができる。
配列番号1 ヒトHER1のβ−ヘアピン
配列番号2 ヒトHER1
配列番号3 ヒトHER1細胞外ドメイン(ECD)
配列番号4 ヒトEGF
配列番号5 ヒトHER2
配列番号6 ヒトHER2細胞外ドメイン(ECD)
配列番号7 ヒトHER3
配列番号8 ヒトHER3細胞外ドメイン(ECD)
配列番号9 ヒトHER4
配列番号10 ヒトHER4細胞外ドメイン(ECD)
配列番号11 TtSlyDcas
配列番号12 TtSlyDcas−HER1
配列番号13 TtSlyDcys−HER1
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1
配列番号17 TgSlyDΔIF
配列番号18 TgSlyDcys−HER1
配列番号19 HER1抗体M−47−13のHER1結合性エピトープ
配列番号20 HER1抗体M−50−14(寄託されたMAK<HER1−DIB>M−50.097.14)及びM−50−23(寄託されたMAK<HER1−DIB>M−50.110.23)のHER1結合性エピトープ
配列番号21 ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号22 ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号23 IgG1に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号24 L234A及びL235A突然変異IgG1に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号25 L234A、L235A及びP329G突然変異IgG1に由来するヒト重鎖定常領域
配列番号26 IgG4に由来するヒト重鎖定常領域
1.ヒトHER1に結合する抗原結合性タンパク質を選択する方法であって、抗原結合性タンパク質はヒトHER1のPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合し、
ここで、
a)配列番号1のアミノ酸配列を含む
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドが;a)の下の少なくとも1つのポリペプチドへの結合を示す抗原結合性タンパク質を選択するために用いられ、
それによって、ヒトHER1のPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する抗原結合性タンパク質を選択する方法。
2.実施態様1の選択方法によって得られる抗原結合性タンパク質。
3.抗原結合性タンパク質が抗体である、実施態様1の方法又は実施態様2の抗原結合性タンパク質。
4.ヒトHER1に結合する単離された抗原結合性タンパク質であって、
ELISAアッセイで、
配列番号13 TtSlyDcys−Her1、
のポリペプチドに、
配列番号11 TtSlyDcas
のポリペプチドへの結合と比較して少なくとも50倍高いELISAシグナルで結合し、ここで、TtSlyDcys−HER1及びTtSlyDcasは0.5μg/mlの濃度で固定化されている、抗原結合性タンパク質。
5.ヒトHER1に結合する単離された抗原結合性タンパク質であって、配列番号13のポリペプチド(TtSlyDcys−Her1)に含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する、抗原結合性タンパク質。
6.抗原結合性タンパク質が抗体である、実施態様4又は5の抗原結合性タンパク質。
7.抗体が、EGFの非存在下でA549がん細胞(ATCC CCL−185)においてHER1のリン酸化を誘導しない(EGFの非存在下でA549がん細胞(ATCC CCL−185)においてHER1のリン酸化に関して非アゴニスト抗体である)、実施態様1から6のいずれか1つの単離された抗原結合性タンパク質又は抗体。
8.HER1発現A549細胞(ATCC CCL−185)を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの存在下でHER1の70パーセントを超える内部移行を示し、HER1発現A549細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの非存在下でHER1の55パーセント未満の内部移行を示す、実施態様1から7のいずれか1つの単離された抗体。
9.ヒトHER1に結合する単離された抗体であって、TYQMDVNPEGのアミノ酸配列(配列番号19)を含む、15アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する抗体。
10.ヒトHER1に結合する単離された抗体であって、MLYNPTTYQのアミノ酸配列(配列番号20)を含む、15アミノ酸の長さのポリペプチドに結合する抗体。
11.ヒト、ヒト化された又はキメラの抗体である、実施態様6から10の抗体。
12.ヒトHER1に結合する抗体断片である、実施態様6から10の抗体。
13.ヒトHER1に結合する単離された抗体であって、
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;
iii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;
iv)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;
を含み、全てのHVRはカバットに従って決定される抗体。
14.完全長IgG1抗体又はIgG4抗体である、実施態様6から13のいずれか1つの抗体。
15.Fab断片である、実施態様6から13のいずれか1つの抗体。
16.実施態様6から13のいずれか1つの抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲート。
17.実施態様6から13のいずれか1つの抗体又は実施態様16のイムノコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
18.医薬として用いるための、実施態様6から13のいずれか1つの抗体又は実施態様16のイムノコンジュゲート。
19.がんの治療で用いるための実施態様6から13のいずれか1つの抗体又は実施態様16のイムノコンジュゲート。
20.HER1/HER2及び/又はHER1/HER1二量体化の阻害で用いるための実施態様6から13のいずれか1つの抗体。
21.医薬の製造での、実施態様6から13のいずれか1つの抗体又は実施態様16のイムノコンジュゲートの使用。
22.医薬ががん治療のためである、実施態様20の使用。
23.HER1/HER2及び/又はHER1/HER1二量体化の阻害のための医薬の製造における、実施態様6から13のいずれか1つの抗体の使用。
24.がんを有する個体を治療する方法であって、実施態様1から23のいずれか1つの抗体又は実施態様1から23のいずれか1つの抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む方法。
25.がんを患っている個体でがん細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、実施態様1から24のいずれか1つの抗体及び細胞傷害性剤を含むイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与し、それによって個体でがん細胞のアポトーシスを誘導することを含む方法。
26.実施態様6から11のいずれか1つの抗体をコードする、単離された核酸。
27.実施態様26の核酸を含む宿主細胞。
28.抗体が生成されるように実施態様27の宿主細胞を培養することを含む、抗体の生成方法。
29.配列番号1のアミノ酸配列を含む
i)配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
ii)配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
iii)配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
iv)配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
v)配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
vi) 配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択されるポリペプチド。
Budapest条約に従って、以下の生体物質がLeibniz−Institut Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)、Inhoffenstr.7B、38124 Braunschweig、Germanyに寄託されている。
組換えDNA技術
DNAを操作するために、Sambrook,J.等、Molecular Cloning:A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989に記載の通りに標準方法を用いた。分子生物学的試薬は、製造業者の指示に従って用いた。
化学的合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを調製した。PCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーションによって、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に連なる長さ400−1600bpの遺伝子セグメントを組み立て、その後、指示された制限部位、例えばEcoRI/BlpI又はBsmI/XhoIを介して下記の発現ベクターにクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定によって確認した。遺伝子合成断片は、Geneart(Regensburg、Germany)において所与の仕様書により注文した。
Sequiserve GmbH(Vaterstetten、Germany)で実施された二本鎖配列決定によって、DNA配列は決定された。
配列の形成、マッピング、分析、アノテーション及び図示のために、InfomaxのVector NT1 Advanceセットのバージョン11.5.0を用いた。
抗原の調製及びタンパク質スクリーニング−HER1のβ−ヘアピンに結合する抗体を選択するための機能的β−ヘアピンHER1コンストラクトの生成
機能的β−ヘアピンHER1コンストラクトを生成するために、FKBPドメインを含むSlyDポリペプチドフレームワークにHER1β−ヘアピンHER1のアミノ酸配列を接いだ。そのようなコンストラクトでは、HER1の天然の不活性化立体配置の隠れた構造と対照的に、接いだβ−ヘアピンは自由にアクセス可能である(例えばEGFのようにリガンドの非存在下で)(HER1のβ−ヘアピンが隠れている、図1及び2を参照する)。
a)免疫化及びHER1抗体の選択
HER1のβ−ヘアピンに対する抗体の生成のために、Balb/C、NMRI又はSJLマウスを異なる抗原で免疫化した。抗原として、以下のタンパク質を用いた:完全長HER1 ECD、又はエピトープ足場タンパク質TtSlyDcas−HER1、TtSlyDcys−HER1及びTtSlyD(GSG)−HER1。TtSlyDcas−HER1変異体は、HER1二量体化ドメイン特異的抗体の生成のために用いられる、第一世代のエピトープ足場を表す。
それぞれの免疫原及びスクリーニングタンパク質に対する血清力価の決定のために、免疫化の実施開始後11週目に各マウスの血清の少量を収集した。ELISAのために、免疫原又はスクリーニング足場タンパク質をプレート表面に固定化した。HER1 ECDを1μg/mlの濃度で固定化し、足場タンパク質TtSlyDcas−HER1、TtSlyDcys−HER1、TtSlyD(GSG)−HER1、TtSlyDcas、TgSlyDΔIF及びTgSlyDcys−HER1は0.5μg/mlの濃度で用いた。足場タンパク質TtSlyDcas及びTgSlyDΔIFは、ネガティブコントロールとして用いた。各マウスからの血清を1%BSA含有PBSで希釈し、希釈溶液をプレートに加えた。血清は、1:300、1:900、1:2700、1:8100、1:24300、1:72900、1:218700及び1:656100の希釈で試験した。結合した抗体は、HRP標識F(ab’)2ヤギ抗マウスFcγ(Dianova)及び基質としてABTS(Roche)で検出した。
ここに記載されるエピトープ足場技術の使用は、HER1二量体化ドメイン(HER1のβ−ヘアピン)を標的にする抗体の発達のための2つの戦略を主に提供する。1つの戦略は、完全長HER1 ECDで免疫化し、二量体化ドメイン特異的抗体についてスクリーニングするために足場を用いることである。他の戦略は、免疫化のための足場の直接使用、及び、HER1 ECD、別の骨格を有する足場又は逆スクリーニングのために挿入なしの足場を用いることである。一次B細胞をP3X63Ag8.653骨髄腫細胞と融合することによって、抗体をハイブリドーマ技術で生じさせた。最終ブースター免疫化の2日後に、免疫化マウスを屠殺し、脾細胞集団を調製した。PEG融合技術を用いることにより、脾細胞をP3X63Ag8.653と融合させた。融合からの細胞バッチ培養を、5%CO2の下の37℃で一晩インキュベートした。翌日、融合細胞を含有する細胞バッチを300gで10分間遠心分離した。その後、細胞を0.1×アザセリン−ヒポキサンチン(Sigma)加用ハイブリドーマ選択培地に懸濁し、96ウェルプレートの1ウェルにつき細胞数2.5×104の濃度で播種した。5%CO2の下の37℃で少なくとも1週間、プレートを培養した。ELISA分析の3日前に、選択培地を交換した。
c)免疫組織化学
選択したクローンを、反応性及び特異性についてIHCで試験した。したがって、完全長HER1、HER2、HER3又はHER4をそれぞれコードするプラスミドで、HEK293細胞を一時的にトランスフェクトさせた。トランスフェクションの2日後に、今やHER1、HER2、HER3又はHER4を発現する異なる細胞株を収集し、その後IHCコントロールの生成のためにホルマリンで固定し、アガロースに包埋した。ホルマリンでの夜通しの追加の固定の後、アガロースブロックをパラフィンに包埋した。トランスフェクトしていないHEK293細胞はネガティブコントロールとして用い、トランスフェクトした細胞の通りに処理した。パラフィン包埋の後、ミクロトームを用いて3μmの薄切片を調製した。切片をガラス製顕微鏡スライドに載せ、2時間乾燥させた。免疫組織化学的染色手法の全てのさらなる工程を、Ventana Benchmark XTを用いて実行した。1時間加熱してスライドからワックスを除去し、抗原の回収を実施した。抗原回収のために、VentanaバッファーCC1を用いた。抗体は、1μg/mlの濃度で用いた。結合した抗体の検出のために、Ventana UltraView検出キットを用いた。結果は、図5に示す。全ての試験したクローンはHER1への結合を示し、HER2、HER3又はHER4に対する交差反応性は検出されなかった。
d)選択された抗Her1ハイブリドーマのDNA配列決定
選択されたハイブリドーマクローンのDNA配列を得るために、5’Race PCRを実行した。RT−PCRのために、全RNA精製キット(Qiagen)を用いて5×106個の細胞から全RNAを調製する。5’プライムRACE PCRキット(Roche)を用いて、逆転写及びPCRを実行した。重鎖及び軽鎖から生じたPCR断片を、ゲル電気泳動及び以降のゲル精製によって精製する。TopoZero−Bluntクローニングキット(Invitrogen)を用いてPCR断片をクローニングし、コンピテント細胞に形質転換させる。選択されたクローンのためのコンセンサス配列を得るために、各ハイブリドーマからのいくつかのクローン(例えば、クローンM−31−22、M−37.058.09(MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238))、M−37−15(MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239))、M−47−01、M−47−04、M−47−06、M−47−08、M−47−09、M−47−12、M−47−13、M−46−14、M−47−15、M−47−16、M−50−14(MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240))、M−50−21、M−50−23(MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241))、M−50−24、M−50−37、M−50−38及びM−50−40)が配列決定にかけられる。
抗HER1抗体(M−47−13)の例示的なエピトープマッピングペプチドベースの2Dエピトープマッピング
別の実施態様では、CelluSpots(商標)合成及びエピトープマッピング技術を用いて、HER1 ECDエピトープを特徴付けるために、ペプチドベースのエピトープマッピング実験を実行した。エピトープマッピングは、ヒトHER1 ECD、HER2 ECD、HER3 ECD及びHER4 ECDペプチドヘアピンの配列に対応する、重複した固定化されたペプチド断片(長さ:15アミノ酸)のライブラリーによって実行した。図6に、エピトープマッピングの戦略を示す。それらの構造的な埋め込み(構造的)を含む、HER1(EGFR)ECD、HER2 ECD、HER3 ECD及びHER4 ECDのペプチドヘアピン配列(β−ヘアピン)を調査した。システインは、セリンと置き換えた。合成した各ペプチドを1アミノ酸シフトさせた、すなわち、それは前及び後のペプチドとそれぞれ14アミノ酸の重複部分を有していた。ペプチドアレイの調製のために、Intavis CelluSpots(商標)技術を採用した。この手法では、合成後溶解する修飾されたセルロースディスクの上で、ペプチドを自動合成装置(Intavis MultiPep RS)で合成する。高分子セルロースに共有結合している個々のペプチドの溶液を、コーティングされた顕微鏡スライドの上へ次にスポットする。CelluSpots(商標)合成は、384ウェル合成プレートのアミノ修飾セルロースディスクの上で9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学を利用して段階的に実行した。各カップリングサイクルでは、対応するアミノ酸を、DMF中のDIC/HOBtの溶液で活性化した。カップリング工程の間で、反応していないアミノ基は、無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミン及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物でキャップした。合成の終了後、セルロースディスクを96ウェルプレートに移し、側鎖脱保護のためにトリフルオロ酢酸酸(TFA)、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン(TIS)及び水の混合物で処理した。切断溶液の除去の後、TFA、TFMSA、TIS及び水の混合物でセルロース結合ペプチドを溶解し、ジイソプロピルエーテルで沈殿させ、DMSOに再懸濁する。その後、Intavisスライドスポッティングロボットを用いて、Intavis CelluSpots(商標)スライドの上へペプチド溶液をスポットした。
抗HER1β−ヘアピン抗体の動態スクリーニング/結合特性
動態スクリーニングは、Biacore CM5センサーを載せたBIAcore 4000機器で、Schraeml等(Schraml, M.及びM. Biehl、Methods Mol Biol 901 (2012) 171-181)に従って実施する。全てのアッセイで、試験抗体が捕捉される。このシステムは、ソフトウェアバージョンV1.1の制御下にある。機器バッファーは、HBS−EP(10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05(w/v)%P20)であった。システムは、25℃で操作される。10mM酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)中の30μg/mlウサギポリクローナル抗体(RAM IgG、(Fcガンマ特異性を有するウサギ抗マウスIgG)GE Healthcare)を、製造業者の使用説明書に従い、EDC/NHS化学を用いてフローセル1、2、3及び4のスポット1、2、4及び5の上に固定化する。センサーは、1Mエタノールアミンを用いて飽和する。各フローセルで、参照シグナルはスポット1−2及びスポット5−4を用いて計算され、スポット3はブランクコントロールの役目を果たす。抗原(HER1のβ−ヘアピンペプチド(配列番号1)を含む、ヒト組換えHER1 ECD、及び組換えテルムス・テルモフィルスTtSlyDcas−HER1、TtSlyDcys−HER1、TtSlyD−(GSG)−HER1、TtSlyD−(CC)−HER1、TtSlyD−(SS)−HER1、テルモコックス・ガンマトレランスTgSlyDcys−HER1の1つ)を、非特異的結合を抑制するために1mg/mlのCMD(カルボキシメチルデキストラン、Sigma)を追加した機器バッファーで150nMに希釈する。それらを加える前に、ハイブリドーマ培養上清を機器バッファーで1:5に希釈する。希釈した混合物を、30μl/分の流速で2分間注入する。応答単位で表した抗体捕捉レベル(CL)を監視する。その直後、それぞれの抗原を3分の結合時間の間30μl/分の流速で注入する。その後、抗体抗原複合体の解離シグナルを5分間記録する。10mMグリシンHCl溶液(pH1.7)を30μl/分の流速で2分間注入することによって、センサーを再生する。抗原の注入の終了の直前に記録したシグナルは、応答単位において、遅い結合(BL)と表される。解離の記録の終了の直前に記録したシグナルは、応答単位において、遅い安定性(SL)と表される。解離速度定数を判定、計算する。分で表した抗体抗原複合体の安定性は、以下の式で計算される:ln(2)/60*kd。モル比は、以下の式で計算された:MW(抗体)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗体)。
ウェスタンブロットによる抗HER1β−ヘアピン抗体の時間依存的内部移行分析!
抗HER1β−ヘアピン抗体への抗HER1β−ヘアピン抗体の結合及びその内部移行を、HER1発現がん細胞株A549を用いるウェスタンブロットで分析した。
HER1発現A549及びA431がん細胞での抗HER1抗体結合によるHER1リン酸化の阻害(誘導なし)
24ウェルプレート(細胞数3×105/ウェル、10%FCS含有培地)に、HER1発現A549(ATCC(登録商標)CCL−185(商標)肺癌)細胞及びA431(ATCC(登録商標)CRL−1555(商標)−皮膚がん/類表皮癌)細胞を播種した。翌日に、培地を絶食培地(0.5%FCS)に置き換えた。4時間後に(細胞溶解の24時間前に)、抗体を185μg/mlの最終濃度まで各細胞株の2つのウェルに加えた。翌日、抗体を以下の時点で再び加えた:細胞溶解の6時間、4時間、2時間、1時間前。細胞溶解の10分前に、各時点の1つのウェルを、hEGF(最終濃度200ng/ml)で刺激した。細胞を、40μlのTriton溶解バッファーで溶解した。SDS−PAGEを実施し、続いて半湿式ウェスタンブロッティングを実施した。膜は、HER1(Upstate#06−847)、ホスホHER1(Epitomics#1139−1)及びホスホチロシン(Millipore#16−105)に対する抗体とインキュベートした。
抗HER1β−ヘアピン抗体(ELISA)の存在下でのHER1(EGFR)−ECDへのリガンドEGFの結合
ストレプトアビジンをコーティングした96ウェルプレートを、SBP標識HER1−ECDを含有する細胞培養上清と4℃でインキュベートした。翌日に、洗浄バッファー(PBS+0.05%Tween−20)でウェルを3回洗浄し、1%BSAを含有するPBSで1時間ブロックした。洗浄バッファーによるさらなる3回の洗浄の後、所望の最終濃度(10−3から103nM)の2×保存液として40μlの抗体溶液(Delfia結合バッファー中)を各ウェルに加えた。直ちに、10nMの最終濃度を達成するために40μlの20nMユウロピウム標識EGFを加えた。室温で2時間、プレートを振盪機の上でインキュベートした。Delfia洗浄バッファーによる3回の洗浄の後、Delfia強化溶液を加え、振盪機の上で15分間インキュベートした(光保護)。最後に、時間分解蛍光測定プロトコールを用いてTecan Infinite F200リーダーでプレートを測定した。HER1dib上清は、1:1から1:10e7の希釈で用いた。抗HER1抗体M−50−14(50.097.14=MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240.);M−50−23(50.110.23=MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241.);M−47−15(M−47.259.15);M−31−22(M−31.021.22);M−37−09(MAK<HER1−DIB>M−37.058.09(DSM ACC3238);M−37−15(MAK<HER1−DIB>M−37.186.15(DSM ACC3239)の結果を図10に示す。
Claims (20)
- ヒトHER1に結合する単離された抗体を選択する方法であって、該抗体はヒトHER1のPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合し、
ここで、
a)配列番号1のアミノ酸配列を含む
配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドが、a)の下の少なくとも1つのポリペプチドへの結合を示す抗体を選択するために用いられ、
それによって、ヒトHER1のPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合する抗体を選択する方法。 - 請求項1の選択方法によって得られる単離された抗体であって、
該抗体が、
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;又は
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;
を含み、
全てのHVRはカバットに従って決定され、
該抗体がHER2、HER3及び/又はHER4と交差反応性を有さない、抗体。 - 該抗体がHER2、HER3及び/又はHER4と交差反応性を有さない、請求項1に記載の方法。
- ヒトHER1に結合する単離された抗体であって、
該抗体が、
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;又は
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;
を含み、
全てのHVRはカバットに従って決定され、
該抗体が、
配列番号13 TtSlyDcys−Her1
のポリペプチドに結合し、HER2、HER3及び/又はHER4と交差反応性を有さない、抗体。 - ヒトHER1に結合する単離された抗体であって、
ELISAアッセイで、
配列番号13 TtSlyDcys−Her1
のポリペプチドに、
配列番号11 TtSlyDcas
のポリペプチドへの結合と比較して少なくとも50倍高いELISAシグナルで結合し、ここで、TtSlyDcys−HER1及びTtSlyDcasは0.5μg/mlの濃度で固定化されており、
該抗体が、
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;又は
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;
を含み、
全てのHVRはカバットに従って決定され、
該抗体がHER2、HER3及び/又はHER4と交差反応性を有さない、抗体。 - ヒトHER1に結合する単離された抗体であって、配列番号13のポリペプチド(TtSlyDcys−Her1)に含まれるPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKのアミノ酸配列(配列番号1)の中で結合し、
該抗体が、
i)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.097.14(DSM ACC3240)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;又は
ii)寄託された抗体MAK<HER1−DIB>M−50.110.23(DSM ACC3241)の(a)HVR−H1;(b)HVR−H2;(c)HVR−H3;(d)HVR−L1;(e)HVR−L2;及び(f)HVR−L3;
を含み、
全てのHVRはカバットに従って決定され、
該抗体がHER2、HER3及び/又はHER4と交差反応性を有さない、抗体。 - EGFの非存在下でA549がん細胞(ATCC CCL−185)においてHER1のリン酸化を誘導しない、請求項2及び4から6のいずれか一項に記載の抗体。
- HER1発現A549細胞(ATCC CCL−185)を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの存在下でHER1の70パーセントを超える内部移行を示し、HER1発現A549細胞を用いるウェスタンブロットアッセイで抗体とのインキュベーションから2時間後にEGFの非存在下でHER1の55パーセント未満の内部移行を示す、請求項2及び4から7のいずれか一項に記載の単離された抗体。
- ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項7又は8に記載の抗体。
- 完全長IgG1抗体又はIgG4抗体である、請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体。
- Fab断片である、請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体及び細胞傷害剤を含む、イムノコンジュゲート。
- 請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体又は請求項12に記載のイムノコンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
- 医薬としての使用のための、請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体又は請求項12に記載のイムノコンジュゲート。
- がんの治療における使用のための、請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体又は請求項12に記載のイムノコンジュゲート。
- HER1/HER2及び/又はHER1/HER1二量体化の阻害における使用のための、請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
- i)配列番号12 TtSlyDcas−HER1、
ii)配列番号13 TtSlyDcys−HER1、
iii)配列番号14 TtSlyD(GSG)−HER1、
iv)配列番号15 TtSlyD(CC)−HER1、
v)配列番号16 TtSlyD(SS)−HER1、及び
vi)配列番号18 TgSlyDcys−HER1、
からなる群から選択されるポリペプチドであって、配列番号1のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。 - がんを治療するための医薬であって、請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体又は請求項12に記載のイムノコンジュゲートを含む、医薬。
- HER1/HER2及び/又はHER1/HER1二量体化を阻害するための薬剤であって、請求項7から9のいずれか一項に記載の抗体又は請求項12に記載のイムノコンジュゲートを含む、薬剤。
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