JP6548293B2 - bFGFの精製方法およびbFGFの製造方法 - Google Patents
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Description
前記粗精製サンプルの塩濃度を調整する工程と、
前記調整後の粗精製サンプルを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、精製bFGFを取得する工程とを含み、
前記調整後の粗精製サンプルにおける塩濃度が、1.5mol/Lを超えることを特徴とする。
前記精製工程が、前記本発明のbFGFの精製方法により実施されることを特徴とする。
前記精製bFGFの取得工程において、前記液体画分を前記疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記精製bFGFを取得する。
得られたbFGFを発現する大腸菌からbFGFを含むサンプルを調製する工程とを含む。
本発明のbFGFの精製方法(以下、「精製方法」ともいう。)は、前述のように、bFGFを含むサンプル(以下、「bFGFサンプル」ともいう。)を陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、bFGFを含む粗精製サンプルを取得する工程(粗精製工程)と、前記粗精製サンプルの塩濃度を調整する工程(塩濃度調整工程)と、前記調整後の粗精製サンプル(以下、「調整サンプル」ともいう。)を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、精製bFGFを取得する工程(bFGF取得工程)とを含み、前記調整後の粗精製サンプルにおける塩濃度が、1.5mol/Lを超えることを特徴とする。本発明の精製方法は、前記調整サンプルにおける塩濃度が、1.5mol/Lを超えることを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。
(B2)前記(B1)のアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質
(B3)前記(B1)のアミノ酸配列に対して、所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質
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(b2)前記(b1)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b3)前記(b1)の塩基配列に対して、所定の同一性を有する塩基配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b4)前記(b1)の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b5)配列番号1〜5および6からなる群から選択された少なくとも1つのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b6)配列番号1〜5および6からなる群から選択された少なくとも1つのアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b7)配列番号1〜5および6からなる群から選択された少なくとも1つのアミノ酸配列に対して、所定の同一性を有するアミノ酸配列からなり、線維芽細胞の増殖活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
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本発明のbFGFの製造方法(以下、「製造方法」ともいう。)は、前述のように、bFGFを含むサンプルから精製bFGFを精製する工程を含み、前記精製工程が、前記本発明のbFGFの精製方法により実施されることを特徴とする。本発明の製造方法は、前記精製工程が、前記本発明の精製方法により実施されることが特徴であり、その他工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法によれば、簡便に精製されたbFGFを製造できる。本発明の製造方法において、前記精製工程は、例えば、前記本発明の精製方法の説明を援用できる。
本発明の精製方法により、bFGFが精製できることを確認した。
ヒト由来cDNAを鋳型として、ヒト由来bFGFの16.5KDaアイソフォーム(配列番号1)をコードする下記ヒトbFGF 16.5KDa cDNA(配列番号7)を増幅後、lacプロモーターを含むベクター(pET−3a、ノバジェン社製)に連結し、bFGF発現ベクターを作製した。前記ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含む。
陽イオン交換クロマトグラフィーに使用する充填剤(第1の充填剤)としては、TOYOPEARL(登録商標)SP-550Cを使用した。100mLの前記第1の充填剤を精製水で3回洗浄後、エコノカラム(5.0×10cm、Bio-rad社製、第1のカラム)に充填した。前記第1のカラムに、200mLの第1の平衡化バッファーを負荷し、前記第1のカラムを平衡化した。前記第1の平衡化バッファーは、20mmol/L リン酸二水素ナトリウムを含む緩衝液(pH7.2)とした。つぎに、前記第1のカラムに、前記bFGFサンプルを負荷した。前記負荷後、800mLの第1の洗浄液を前記第1のカラムに負荷し、洗浄した。前記第1の洗浄液は、20mmol/L リン酸二水素ナトリウムおよび0.2mol/L NaClを含む緩衝液(pH7.2)とした。さらに、前記第1のカラムに、800mLの第1の溶出液を負荷し、溶出された溶液の全量を、前記粗精製サンプルとして取得した。前記第1の溶出液は、20mmol/L リン酸二水素ナトリウムおよび0.6mol/L NaClを含む緩衝液(pH7.2)とした。なお、陽イオン交換クロマトグラフィーは、室温(25℃)で行なった。
前記粗精製サンプルに、等量の20mmol/L リン酸二水素ナトリウムおよび4mol/L 硫酸アンモニウムを含む緩衝液(pH7.2)を添加し、塩として、2mol/L 硫酸アンモニウムを含む調整サンプルを調製した。前記緩衝液の添加後、前記調整サンプルを4℃の条件下で1時間撹拌した。つぎに、前記調整サンプルを20000g、4℃、20分の条件で、遠心分離を行い、得られた上清を回収した。さらに、前記上清を、0.42μmセルロースアセテート膜(ADVANTEC社製)で濾過し、前記調整サンプルの液体画分を調製した。
疎水性相互作用クロマトグラフィーに使用する充填剤(第2の充填剤)としては、TOYOPEARL(登録商標)Butyl-650Mを使用した。前記第2の充填剤を精製水で3回洗浄後、前記エコノカラム(第2のカラム)に充填した。前記第2のカラムに、200mLの第2の平衡化バッファーを負荷し、前記カラムを平衡化した。前記第2の平衡化バッファーは、20mmol/L リン酸二水素ナトリウムおよび2mol/L 硫酸アンモニウムを含む緩衝液(pH7.2)とした。つぎに、前記第2のカラムに、前記調整サンプルの液体画分を負荷した。なお、前記液体画分を負荷後に前記第2のカラムから得られた液体画分を、フロースルー画分として回収した。前記負荷後、800mLの第2の洗浄液を前記第2のカラムに負荷し、洗浄した。前記第2の洗浄液は、20mmol/L リン酸二水素ナトリウムおよび1.8mol/L 硫酸アンモニウムを含む緩衝液(pH7.2)とした。さらに、前記第2のカラムに、800mLの第2の溶出液を負荷し、溶出された溶液の全量を、精製bFGFとして取得した。前記第2の溶出液は、20mmol/L リン酸二水素ナトリウムおよび1.3mol/L 硫酸アンモニウムを含む緩衝液(pH7.2)とした。そして、前記精製bFGFについて、限外濾過にて濃縮後、280nmの吸光度に基づき、1mg/mL bFGF(精製サンプル)となるように濃度を調整した。なお、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、室温(25℃)で行なった。
0.5μgのbFGFを含む精製サンプルについて、等量のサンプルバッファーで懸濁し、5分間煮沸した。前記煮沸後、2μLの煮沸後の精製サンプルについて、17.5% SDS−PAGEゲルを用い、電気泳動した。つぎに、前記ゲルについて、CBB染色液を用い、30分間染色した。前記染色後のゲルを脱色液で脱色した。前記脱色後、前記ゲルを精製水に浸漬し、1時間インキュベートし、バンドの検出を行なった。また、前記精製サンプルに代えて、前記bFGFサンプル、前記粗精製サンプル、前記調整サンプルの液体画分、前記フロースルー画分、およびリコンビナントヒト由来bFGFを用いた以外は同様にして、バンドの検出を行なった。前記サンプルバッファーは、62.5 mmol/L Tris−HCl(pH6.8)、2%(w/v)SDS、25%(w/v)グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルーおよび5%(w/v)β−メルカプトエタノールを含む緩衝液とした。
前記粗精製サンプルの塩濃度の調整により、夾雑物が析出されることを確認した。
Claims (12)
- bFGFを含むサンプルを陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、bFGFを含む粗精製サンプルを取得する工程と、
前記粗精製サンプルの塩濃度を調整する工程と、
前記調整後の粗精製サンプルを疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、精製bFGFを取得する工程とを含み、
前記調整後の粗精製サンプルにおける硫酸アンモニウムの濃度が、2mol/Lであることを特徴とする、bFGFの精製方法。 - 前記調整後の粗精製サンプルにおける塩化ナトリウムの濃度が、0.3mol/Lである、請求項1記載のbFGFの精製方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーの充填剤の官能基が、スルホプロピル基である、請求項1または2記載のbFGFの精製方法。
- 前記疎水性相互作用クロマトグラフィーの充填剤の疎水性リガンドが、ブチル基である、請求項1から3のいずれか一項に記載のbFGFの精製方法。
- 前記bFGFを含むサンプルが、還元剤を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のbFGFの精製方法。
- 前記調整後の粗精製サンプルから液体画分を回収する工程を含み、
前記精製bFGFの取得工程において、前記液体画分を前記疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、前記精製bFGFを取得する、請求項1から5のいずれか一項に記載のbFGFの精製方法。 - 前記bFGFを含むサンプルが、bFGFを発現する大腸菌の破砕物である、請求項1から6のいずれか一項に記載のbFGFの精製方法。
- 前記bFGFを含むサンプルが、bFGFを発現する大腸菌の破砕物の液体画分である、請求項1から6のいずれか一項に記載のbFGFの精製方法。
- bFGF遺伝子が形質導入された大腸菌を培養し、前記大腸菌にbFGFを発現させる工程と、
得られたbFGFを発現する大腸菌からbFGFを含むサンプルを調製する工程とを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のbFGFの精製方法。 - 大腸菌にbFGF遺伝子を形質導入する工程を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のbFGFの精製方法。
- bFGFを含むサンプルから精製bFGFを取得する工程を含み、
前記精製工程が、請求項1から10のいずれか一項に記載のbFGFの精製方法により実施されることを特徴とする、bFGFの製造方法。 - 前記精製工程で得られたbFGFの純度が、96%以上である、請求項11記載のbFGFの製造方法。
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