JP6548184B2 - Biomarker for determining cancer grade, prognosis and / or efficacy of anticancer drug treatment, companion diagnostic drug for selecting anticancer drug, and anticancer drug - Google Patents
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Description
本発明は、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定するためのバイオマーカーであるマイクロＲＮＡ、これらバイオマーカーを用いたがんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定する方法、前記マイクロＲＮＡ又はこれに対する阻害性核酸を有効成分とする抗がん剤、並びに抗がん剤を選択するための前記マイクロＲＮＡを含むコンパニオン診断薬に関する。 The present invention relates to a microRNA which is a biomarker for determining the malignancy of cancer, prognosis and / or efficacy of anticancer drug treatment, malignancy, prognosis and / or cancer of cancer using these biomarkers. Method for Determining Efficacy of Anti-Cancer Drug Treatment, Anti-cancer Agent Containing the MicroRNA or Inhibitory Nucleic Acid Against It as an Active Ingredient, and Companion Diagnostic Drug Containing the Micro-RNA for Selecting Anti-Cancer Agent About.
様々な疾患に関連して、特異的な塩基配列を有する微小なＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、以下、ｍｉＲと表す）が注目されている。ｍｉＲは、ゲノムＤＮＡから数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（プライマリｍｉＲ、ｐｒｉ−ｍｉＲ）として転写された後、Ｄｒｏｓｈａによるプロセッシングを受けて約６０〜７０塩基程度のヘアピン構造を有するプレカーサーｍｉＲ（ｐｒｅ−ｍｉＲ）となり、さらにＤｉｃｅｒによるプロセッシングを受けて２０〜２５塩基程度の二本鎖成熟ｍｉＲとなる。以下、本明細書では、単にｍｉＲと表したときはこの二本鎖成熟ｍｉＲを指す。 Attention has been focused on minute RNAs (microRNAs, hereinafter referred to as miRs) having specific base sequences in association with various diseases. miR is transcribed from genomic DNA as a primary transcript (primary miR, pri-miR) with a length of several hundred to several thousand bases, and then processed by Drosha to have a hairpin structure of about 60 to 70 bases It becomes a precursor miR (pre-miR), and is further processed by Dicer to form a double-stranded mature miR of about 20 to 25 bases. Hereinafter, in the present specification, the term “miR” simply refers to this double-stranded mature miR.
ｍｉＲは、多くの場合それぞれｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのヘアピンを挟んだ２つのステム部分に由来し、５’末端側に−５ｐ、また３’末端側に−３ｐという符号が付けられる。 The miRs are often derived from the two stems flanking the hairpin of the pre-miRNA, respectively, and are labeled -5p at the 5 'end and -3p at the 3' end.
ｍｉＲは、その一方のＲＮＡ鎖が標的遺伝子のｍＲＮＡに作用して標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現を阻害することで、遺伝子発現及び転写調節に関与すると考えられている。最近では、血液中にもｍｉＲが安定的に存在していることが明らかになり、各種がんの悪性度、患者の生命予後の判定への利用に加え、ＨＩＶ感染、ＨＣＶ感染、関節リウマチ、薬物性肝障害、心筋梗塞や脳梗塞のバイオマーカー又は診断薬としてのｍｉＲの利用に関する研究開発が試みられている（例えば非特許文献１）。 MiRs are considered to be involved in gene expression and transcriptional regulation by one of the RNA strands acting on mRNA of a target gene to inhibit expression of a protein encoded by the target gene. Recently, it has become clear that miRs are also stably present in the blood, and in addition to their use in determining the malignancy of various cancers and the prognosis of patients, HIV infection, HCV infection, rheumatoid arthritis, Research and development has been attempted on the use of miR as a biomarker or diagnostic agent for drug-induced liver injury, myocardial infarction and cerebral infarction (for example, Non-Patent Document 1).
一方、がん患者の血液中のインターロイキン６（ＩＬ−６）の発現レベルが、がんの悪性度、がんの予後及び抗がん剤の投与による治療（以下、抗がん剤治療と表す）の有効性と相関することが、幾つかの研究により明らかにされている。具体的には、血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いがん患者については、がんの悪性度は高く、予後も不良で、抗がん剤治療の有効性も低いと報告されている（例えば非特許文献２〜５）。 On the other hand, the expression level of interleukin 6 (IL-6) in the blood of cancer patients is the malignancy of cancer, prognosis of cancer, and treatment by administration of anticancer agent (hereinafter referred to as anticancer agent treatment and Several studies have shown that it correlates with the effectiveness of Specifically, cancer patients with high expression levels of IL-6 in the blood are reported to have high malignancy, poor prognosis, and low efficacy of anticancer drug treatment (For example, nonpatent literature 2-5).
しかし、がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルに関連したｍｉＲの発現プロファイルに関する報告はなく、かかるｍｉＲのがんの悪性度、予後及び／若しくは抗がん剤治療の有効性を判定するための利用又は適切な抗がん剤を選択するためのコンパニオン診断薬としての利用、あるいはかかるｍｉＲ自身又はその阻害性核酸の抗がん剤としての利用に関する報告はない。 However, there is no report on the expression profile of miR related to the expression level of IL-6 in the blood of cancer patients, and it is determined the cancer malignancy, prognosis and / or efficacy of anticancer drug treatment of such miR There is no report on its use as a companion diagnostic agent for selecting an appropriate anticancer agent, or on the use of such miR itself or its inhibitory nucleic acid as an anticancer agent.
本発明は、がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルと共に又はこれに代わって利用可能な、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性の判定のためのバイオマーカー、前記ｍｉＲを用いたがんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定する方法、並びに前記ｍｉＲを含むコンパニオン診断薬又は抗がん剤を提供することを目的とするものである。 The present invention provides for determining the grade of cancer, prognosis and / or efficacy of anticancer drug treatment which can be used together with or in place of the expression level of IL-6 in the blood of cancer patients. A purpose of the present invention is to provide a biomarker, a method of determining cancer malignancy, prognosis and / or efficacy of anticancer drug treatment using the miR, and a companion diagnostic agent or anticancer agent containing the miR. It is said that.
本発明者らは、血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いがん患者の血液中のｍｉＲを網羅的に解析し、幾つかのｍｉＲの発現レベルが上昇又は低下することを見いだし、下記の各発明を完成させた。
（１）表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲである、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定するためのバイオマーカー。
（３）がん患者におけるがんの悪性度及び／又は予後を判定する方法であって、
１）判定対象のがん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）判定対象のがん患者における表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は判定対象のがん患者における表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、判定対象のがん患者におけるがんの悪性度が高い及び／又は予後が不良であると判定する工程
を含む、前記判定方法。
（４）相対的発現量がグローバルノーマライゼーション法によって算出される、（３）に記載の判定方法。
（５）がんが大腸がんである、（３）又は（４）に記載の判定方法。
（６）がん患者における抗がん剤治療の有効性を判定する方法であって、
１）抗がん剤治療を受けたがん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）抗がん剤治療を受けたがん患者における表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は抗がん剤治療を受けたがん患者における表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、抗がん剤治療が有効でないと判定する工程
を含む、前記判定方法。
（７）表１に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸、その機能的等価物、表２に示されるｍｉＲ及びその機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、抗がん剤。
（８）がんが大腸がんである、（７）に記載の抗がん剤。
（９）（７）又は（８）に記載の抗がん剤を含有する医薬。
（１０）表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲを含む、がん治療のためのコンパニオン診断薬。
（１１）（７）又は（８）に記載の抗がん剤の投与対象となる患者を選定するための、（１０）に記載のコンパニオン診断薬。
The present inventors comprehensively analyze miRs in the blood of cancer patients with high expression levels of IL-6 in the blood and found that the expression levels of some miRs increase or decrease, as described below Each invention was completed.
(1) Cancer malignancy, prognosis and / or anticancer agent which is one or more miRs selected from the group consisting of miRs identified by ID and accession number shown in Table 1 and Table 2 Biomarkers to determine the efficacy of treatment.
(3) A method of determining the grade and / or prognosis of cancer in a cancer patient,
1) measuring the expression level of at least one miR of miRs shown in Table 1 and / or Table 2 in blood collected from a cancer patient to be determined;
2) calculating the relative expression level of at least one or more of the miRs shown in Table 1 and / or Table 2 from the expression level of the miRs,
3) comparing the relative expression level of miR calculated in 2) with the relative expression level in cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit, and 4) If the relative expression level of miRs shown in Table 1 in cancer patients is more than double that in cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit, And / or the relative expression level of miR shown in Table 2 in the cancer patients to be determined is 1 relative to the relative expression level in cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit The method according to the above-mentioned, comprising the step of determining that the degree of malignancy of the cancer in the cancer subject to be determined is high and / or the prognosis is poor when the level is 1/2 or less.
(4) The determination method according to (3), wherein the relative expression level is calculated by the global normalization method.
(5) The method according to (3) or (4), wherein the cancer is colon cancer.
(6) A method of determining the efficacy of anticancer drug treatment in a cancer patient,
1) measuring the expression level of at least one miR of miRs shown in Table 1 and / or Table 2 in blood collected from cancer patients who have received an anticancer drug treatment,
2) calculating the relative expression level of at least one or more of the miRs shown in Table 1 and / or Table 2 from the expression level of the miRs,
3) comparing the relative expression level of miR calculated in 2) with the relative expression level in cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit, and 4) anticancer The relative expression level of miRs shown in Table 1 in cancer patients receiving drug treatment is twice that of the relative expression level in cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit If the relative expression level of miRs shown in Table 2 in cancer patients treated with anti-cancer drug and / or cancer treatment is above, the expression level of IL-6 in blood is below the detection limit Determining the anticancer drug treatment is not effective when the relative expression level in the patient is 1⁄2 or less.
(7) At least one or more nucleic acids selected from the group consisting of inhibitory nucleic acids against miR shown in Table 1, functional equivalents thereof, miRs shown in Table 2 and functional equivalents thereof as an active ingredient, Anti-cancer agent.
(8) The anticancer agent according to (7), wherein the cancer is colon cancer.
(9) A medicament comprising the anticancer agent according to (7) or (8).
(10) A companion diagnostic agent for cancer treatment, which comprises one or more miRs selected from the group consisting of miRs identified by ID and accession number shown in Table 1 and Table 2.
(11) The companion diagnostic agent according to (10), for selecting a patient to whom the anticancer agent according to (7) or (8) is to be administered.
本発明によれば、がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルと共に又はこれに代えて、血液中のＩＬ−６の発現レベルに関連したｍｉＲを測定することで、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を、がん患者の免疫体質又は免疫状態をも考慮した形で判定することができる。さらには、本発明で特定されるｍｉＲ、これに対する阻害性核酸又はそれらの機能的等価物は、がん細胞内に導入されることでがん細胞の増殖を抑制することができ、いずれも抗がん剤として利用することができる。 According to the present invention, the malignancy of cancer can be determined by measuring miRs related to the expression level of IL-6 in the blood, together with or instead of the expression level of IL-6 in the blood of cancer patients. Prognostic and / or efficacy of anti-cancer drug treatment can be determined in consideration of the immunological constitution or immune status of the cancer patient. Furthermore, miRs specified in the present invention, inhibitory nucleic acids therefor, or functional equivalents thereof can be introduced into cancer cells to suppress the growth of cancer cells, and any of them can It can be used as a cancer agent.
＜定義＞
本明細書を通じ、ｍｉＲのＩＤ及びアクセション番号は、ｍｉＲの配列情報等を集めたデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）に定められたものが使用される。各ｍｉＲの塩基配列は、前記データベースに登録されているとおりである。
<Definition>
Throughout the present specification, the miR ID and accession number are those defined in miRBase (http: // www. Mirbase. Org /), which is a database for collecting miR sequence information and the like. The nucleotide sequences of each miR are as registered in the above database.
本明細書における血液は、末梢血、末梢血から常法によって調製される血清及び血漿と交換可能に用いられる。例えば、血液中の発現レベルは、末梢血の発現レベル、血清中の発現レベル又は血漿中の発現レベルを意味する。本発明において好ましい態様は血清である。 The blood in the present specification is used interchangeably with peripheral blood and serum and plasma prepared from peripheral blood by a conventional method. For example, the expression level in blood means the expression level in peripheral blood, the expression level in serum or the expression level in plasma. A preferred embodiment in the present invention is serum.
血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いとは、例えばＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のＢＤ ＯｐｔＥＩＡＴＭ Ｈｕｍａｎ ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔその他のＩＬ−６測定用試薬を用いた免疫学的測定法において陽性と判定される程度以上にＩＬ−６が発現していることを意味し、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるとは、上記の免疫学的測定法においてＩＬ−６の発現量が検出できない又は実質的に発現しているとは言えないレベル以下であることを意味する。なお、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であることを血液中のＩＬ−６の発現レベルが低いと表すこともある。 The expression levels of IL-6 in the blood is high, is judged to be positive in the example BD Bioscience Co. BD OptEIA TM Human IL-6 ELISA Set immunological measurement method using the other IL-6 measurement reagent The expression level of IL-6 in the blood is below the detection limit means that the expression level of IL-6 in the above immunological assay is It means that it is below the level which can not be said to be detected or substantially expressed. Note that the expression level of IL-6 in blood is below the detection limit may be expressed as low expression level of IL-6 in blood.
本明細書にいう相対的発現量とは、ｍｉＲの発現量を比較解析方法によって補正した値を意味する。かかる方法としては、グローバルノーマライゼーション法、ｑｕａｎｔｉｌｅ法、ｌｏｗｅｓｓ法、７５ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ法などを挙げることができる。これらの方法は、いかなる検体であっても複数の遺伝子の発現データを一塊とし、遺伝子発現データ群としてとらえた場合には、発現量に差がないという原理を前提とするものである。 The relative expression level as referred to herein means a value obtained by correcting the expression level of miR by a comparative analysis method. As such a method, global normalization method, quantile method, lowess method, 75 percentile method and the like can be mentioned. These methods are premised on the principle that there is no difference in the amount of expression when the expression data of a plurality of genes are regarded as one mass and the gene expression data group is regarded as a group regardless of the sample.
相対的発現量は、定量ＰＣＲで測定した結果から算出してもよい。例えば、被験者から採取した血液サンプルについて、市販の定量ＰＣＲキットを使用して本発明にかかるｍｉＲ及び各キットで標準として使用されるコントロールｓｍａｌｌＲＮＡをそれぞれ定量し、各ｍｉＲ発現量をコントロールｓｍａｌｌＲＮＡについて標準化することで、相対的発現量を算出してもよい。 The relative expression level may be calculated from the result of measurement by quantitative PCR. For example, for a blood sample collected from a subject, the miR according to the present invention and the control small RNA used as a standard in each kit are quantified using a commercially available quantitative PCR kit, and the miR expression level is normalized with respect to the control small RNA Thus, the relative expression level may be calculated.
ｍｉＲの発現量は、便宜上、本明細書においては、ＤＮＡマイクロアレイ上に搭載した全遺伝子の発現量の中央値を求め、この中央値が２５になるように補正するグローバルノーマライゼーション法（例えば特開２０１４−００７９９５号公報など）で算出された相対的発現量を採用して説明する。 For convenience, in the present specification, the median of the expression levels of all the genes loaded on the DNA microarray is calculated and corrected so that the median becomes 25 (for example, JP-A-2014). Will be described using the relative expression amount calculated in the publication No. -007995).
がんの悪性度とは、がんとしての性質（たち）の悪さ、増殖・転移・再発しやすさの程度を意味する。例えば、がん細胞の増殖又は腫瘍の成長が早い、転移しやすい又は再発しやすい場合には、がんの悪性度は高いなどと表される。またがんの予後とは、がんに罹患した後の、とくに何らかの治療的処置が行われた後のがんの進行又は治療効果などの医学的な経過についての見通しを意味する。例えば、がんが進行しない、がんの進行が遅い、治療効果が期待できる又は認められる場合には予後は良好であるなどと表され、がんが進行する、がんの進行が早い、治療効果が期待できない又は認められない場合には予後は不良であるなどと表される。なお、本明細書においては、がん、腫瘍及び悪性腫瘍はいずれも交換可能に用いられる。 The degree of malignancy of cancer means the degree of the nature (s) of the cancer as bad, proliferation, metastasis and relapse. For example, when the growth of a cancer cell or the growth of a tumor is fast, easily metastasized or prone to relapse, the malignancy of the cancer is expressed as high. In addition, the prognosis of cancer means the prospect of medical progress such as cancer progression or therapeutic effect after suffering from cancer, particularly after some therapeutic treatment has been performed. For example, it indicates that the cancer does not progress, the cancer progresses slowly, the treatment effect can be expected or the prognosis is good, etc., the cancer progresses, the cancer progresses quickly, the treatment If the effect can not be expected or is not recognized, the prognosis is expressed as poor. In the present specification, cancer, tumor and malignant tumor are all used interchangeably.
一般に、悪性度の高いがんに関する予後は不良であり、また悪性度の低いがんに関する予後は良好であるという相関が経験的に認められている。本発明においても、「悪性度が高い」は予後が不良であると、また「悪性度が低い」は予後が良好であると、それぞれ交換可能に用いられる。 Generally, it has been empirically recognized that the prognosis for high grade cancer is poor and the prognosis for low grade cancer is good. Also in the present invention, “high grade” is used interchangeably as the poor prognosis, and “low grade” as the good prognosis.
本発明において、抗がん剤は、制がん剤、抗がん作用を示す化合物その他のがんの治療に有効な物質を含む。 In the present invention, anti-cancer agents include anti-cancer agents, compounds exhibiting anti-cancer activity and other substances effective for the treatment of cancer.
本発明における複数のｍｉＲとは、表１又は表２に示されるｍｉＲの２種以上、好ましくは５種以上、より好ましくは１０種以上、さらに好ましくは２０種以上のｍｉＲをいう。 The plurality of miRs in the present invention refer to two or more, preferably five or more, more preferably ten or more, and even more preferably twenty or more miRs shown in Table 1 or Table 2.
本発明の第一の態様は、表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲである、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定するためのバイオマーカーに関する。 The first aspect of the present invention relates to cancer malignancy, prognosis, and one or more miRs selected from the group consisting of miRs identified by ID and accession number shown in Table 1 and Table 2. And / or to a biomarker for determining the efficacy of anti-cancer drug treatment.
また本発明の第二の態様は、上記第一の態様に関連して、被験者におけるがんの悪性度及び／又は予後を判定する方法であって、
１）判定対象のがん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）判定対象のがん患者における表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は判定対象のがん患者における表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、判定対象のがん患者におけるがんの悪性度が高い及び／又は予後が不良であると判定する工程を含む、前記判定方法に関する。
In the second aspect of the present invention, there is provided a method of determining the malignancy and / or prognosis of cancer in a subject in relation to the first aspect described above,
1) measuring the expression level of at least one miR of miRs shown in Table 1 and / or Table 2 in blood collected from a cancer patient to be determined;
2) calculating the relative expression level of at least one or more of the miRs shown in Table 1 and / or Table 2 from the expression level of the miRs,
3) comparing the relative expression level of miR calculated in 2) with the relative expression level in cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit, and 4) When the relative expression level of miRs shown in Table 1 in cancer patients is more than doubled relative to the relative expression level in cancer patients whose IL-6 expression level in blood is below the detection limit, and And / or the relative expression level of miRs shown in Table 2 in the cancer patients to be determined is 1/2 the relative expression level in cancer patients whose IL-6 expression level in blood is below the detection limit The present invention relates to the above-mentioned determination method including the step of determining that the degree of malignancy of the cancer in the cancer patient to be determined is high and / or the prognosis is poor, in the following cases.
さらに本発明の第三の態様は、がん患者に対する抗がん剤治療の有効性を判定する方法であって、
１）抗がん剤治療を受けたがん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）抗がん剤治療を受けたがん患者における表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は抗がん剤治療を受けたがん患者における表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、抗がん剤治療が有効でないと判定する工程を含む、前記判定方法に関する。
Furthermore, a third aspect of the present invention is a method of determining the efficacy of an anticancer drug treatment for a cancer patient,
1) measuring the expression level of at least one miR of miRs shown in Table 1 and / or Table 2 in blood collected from cancer patients who have received an anticancer drug treatment,
2) calculating the relative expression level of at least one or more of the miRs shown in Table 1 and / or Table 2 from the expression level of the miRs,
3) comparing the relative expression level of miR calculated in 2) with the relative expression level in cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit, and 4) anticancer The relative expression level of miRs shown in Table 1 in cancer patients receiving drug treatment is twice that of the relative expression level in cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit If the relative expression level of miRs shown in Table 2 in cancer patients treated with anti-cancer drug and / or cancer treatment is above, the expression level of IL-6 in blood is below the detection limit The present invention relates to the aforementioned determination method, which comprises the step of determining that the anticancer drug treatment is not effective when the relative expression level in the patient is 1/2 or less.
本発明者らは、大腸がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルを測定するとともに、ＩＬ−６の発現レベルが高い患者群とＩＬ−６の発現レベルが低い患者群それぞれについてＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて、血液中に含まれるｍｉＲの発現量を網羅的に解析した。その結果、ＩＬ−６の発現レベルの高低に相関した、特徴的なｍｉＲの発現変動パターンが確認された。 The present inventors measure the expression level of IL-6 in the blood of colon cancer patients, and at the same time, DNA microarrays for each of the patient group with high IL-6 expression level and the patient group with low IL-6 expression level Using the technology, we comprehensively analyzed the expression level of miR contained in blood. As a result, a characteristic miR expression fluctuation pattern correlated with high and low expression levels of IL-6 was confirmed.
表１に示されるｍｉＲは、血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して、血液中のＩＬ−６発現レベルが高い大腸がん患者の血液における相対的発現量が２倍以上であるｍｉＲである。また表２に示されるｍｉＲは、血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して、血液中のＩＬ−６発現レベルが高い大腸がん患者の血液における相対的発現量が１／２倍以下であるｍｉＲである。なお、１／２倍以下には、実質的に０、すなわちｍｉＲの発現が検出できない場合も含まれる。 The miRs shown in Table 1 have a high level of IL-6 expression in blood compared to the relative expression level in blood of cancer patients whose IL-6 expression level in blood is below the detection limit. It is a miR whose relative expression level in patient's blood is more than doubled. The miRs shown in Table 2 also show that in the large intestine, the IL-6 expression level in blood is higher compared to the relative expression level in blood of cancer patients whose IL-6 expression level in blood is below the detection limit. MiR whose relative expression level in the blood of cancer patients is half or less. In addition, the case where it is substantially zero, ie, the expression of miR, can not be detected is contained in 1/2 or less times as much.
先に言及したように、血液中のＩＬ−６の発現レベルの高低とがんの悪性度、予後及び抗がん剤治療の有効性との間には、例えば血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いときは、がんの悪性度は高い、予後は不良である、又は抗がん剤治療の有効性は低い等の相関が認められている。したがって、表１及び表２に示されるｍｉＲの相対的発現量はいずれも、血液中のＩＬ−６の発現レベルの確認と共に又はこれに代えて、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性の判定に利用することができる。 As mentioned above, expression of IL-6 in blood, for example, between high and low expression levels of IL-6 in blood and malignancy of cancer, prognosis and efficacy of anticancer drug treatment When the level is high, correlations such as high grade of cancer, poor prognosis, or low efficacy of anti-cancer drug treatment have been found. Therefore, the relative expression level of miRs shown in Tables 1 and 2 can be used together with or instead of the confirmation of the expression level of IL-6 in the blood to determine the grade, prognosis and / or anti-cancer status of the cancer. It can be used to determine the efficacy of cancer treatment.
具体的には、あるがん患者の血液における表１に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して２倍以上であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。また、あるがん患者の血液における表２に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して１／２以下であるときは、その被験者にかかるがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。 Specifically, the relative expression level of at least one miR shown in Table 1 in the blood of a certain cancer patient is measured, and the value indicates that the level of IL-6 expression in the blood is below the detection limit. When the relative expression level in the blood of the cancer patient is more than doubled, it can be determined that the cancer patient's cancer has high malignancy or a poor prognosis. In addition, the relative expression level of at least one miR shown in Table 2 in the blood of a certain cancer patient is measured, and the value of the relative expression level of IL-6 in the blood is below the detection limit. When the relative expression level in blood is 1⁄2 or less, it can be determined that the malignancy of the subject's cancer is high or its prognosis is poor.
また、あるがん患者の血液における表１に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表３に示される血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者における相対的発現量（表中のＩＬ−６高値患者における相対的発現量）と実質的に同じかそれ以上であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。同様に、あるがん患者の血液における表２に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表４に示される血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者における相対的発現量（表中のＩＬ−６高値患者における相対的発現量）と実質的に同じかそれ以下であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。ここで表３は、表１の各ｍｉＲについて血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者及びＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である患者の各混合血液における相対的発現量を表した表であり、表４は表２の各ｍｉＲについて血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者及びＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である患者の各混合血液における相対的発現量を表した表である。 In addition, the relative expression level of at least one miR shown in Table 1 is measured in the blood of a certain cancer patient, and the value is shown in Table 3 in patients with high expression levels of IL-6 in the blood. When the relative expression level (relative expression level in high IL-6 patients in the table) is substantially the same or higher, the cancer patient's cancer has high malignancy or its prognosis is poor It can be determined that there is. Similarly, the relative expression level of at least one miR shown in Table 2 is measured in the blood of a certain cancer patient, and the expression level of IL-6 in the blood is as shown in Table 4. When the relative expression level in the patient (the relative expression level in high IL-6 patients in the table) is substantially the same or less, the malignancy of the cancer of the cancer patient is high or its prognosis is poor It can be determined that Here, Table 3 shows the relative expression level in each mixed blood of patients with high expression level of IL-6 in blood and patients with expression level of IL-6 below detection limit for each miR of Table 1 Table 4 shows the relative expression levels in each mixed blood of patients with high expression levels of IL-6 in blood and patients with expression levels of IL-6 below the detection limit for each miR of Table 2. Table.
さらに、あるがん患者の血液における表１に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表３に示される血液中のＩＬ−６の発現レベルが低い患者における相対的発現量（表中のＩＬ−６低値患者における相対的発現量）の２倍以上であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。同様に、あるがん患者の血液における表２に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表４に示される血液中のＩＬ−６の発現レベルが低い患者における相対的発現量（表中のＩＬ−６低値患者における相対的発現量）の１／２以下であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。 Furthermore, the relative expression level of at least one miR shown in Table 1 in the blood of a certain cancer patient is measured, and the value is shown in Table 3 in patients with low expression levels of IL-6 in the blood When the relative expression level (relative expression level in low IL-6 patients in the table) is twice or more, the cancer patient's cancer has high malignancy or its prognosis is poor It can be determined. Similarly, the relative expression level of at least one or more of miRs shown in Table 2 in the blood of a certain cancer patient is measured, and the value is shown in Table 4 When the relative expression level in (less than the relative expression level in low IL-6 patients in the table) is 1/2 or less, the malignancy of the cancer of the cancer patient is high or its prognosis is poor And can be determined.
同様に、抗がん剤治療を受けているがん患者の血液における表１に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して２倍以上であるときは、その被験者に対してその抗がん剤治療の有効性はない又は低い、と判定することができる。また、抗がん剤治療を受けているがん患者の血液における表２に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して１／２以下であるときは、その被験者に対してその抗がん剤治療の有効性はない又は低い、と判定することができる。 Similarly, the relative expression level of at least one miR shown in Table 1 is measured in the blood of cancer patients receiving anticancer drug treatment, and the value is the expression level of IL-6 in the blood. Is more than twice the relative expression level in the blood of cancer patients whose detection limit is below the detection limit, it is judged that the anticancer drug treatment is not effective or not for the subject be able to. In addition, the relative expression level of at least one miR shown in Table 2 is measured in the blood of cancer patients receiving anticancer drug treatment, and the level is detected as the level of IL-6 expression in the blood When it is 1/2 or less compared with the relative expression level in the blood of cancer patients who are below the limit, it is judged that the effectiveness of the anticancer agent treatment is not or low for the subject. Can.
また、抗がん剤治療の有効性の判定においても、がんの悪性度及び／又は予後の判定と同様に、表３及び表４における各ｍｉＲの血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者の相対的発現量又は血液中のＩＬ−６の発現レベルが低い患者の相対的発現量に基づいても、判定することができる。 Also, in the determination of the efficacy of anticancer drug treatment, the expression level of IL-6 in the blood of each miR in Table 3 and Table 4 is high, as in the determination of the malignancy and / or prognosis of cancer. It can also be determined based on the relative expression level of the patient or the expression level of IL-6 in the blood.
前記第一の態様において、表１〜表４に示されるバイオマーカーであるｍｉＲはいずれか一種を単独で利用してもよいが、複数のｍｉＲを利用することが好ましい。同様に、前記第二〜第三の態様において、表１〜表４に示されるバイオマーカーであるｍｉＲのいずれか１種の相対的発現量を単独で利用してもよいが、好ましくは複数のｍｉＲの相対的発現量を利用して判定することが好ましい。さらに好ましくは、表１又は表３に示される複数のｍｉＲ及び表２又は表４に示される複数のｍｉＲの相対的発現量を利用して判定することが好ましい。このように、複数のｍｉＲを対象とすることで、本発明の方法による判定の信頼性は向上する。ただし、複数のｍｉＲを対象とした場合、必ずしも全てのｍｉＲの相対的発現量の結果を全て反映させて判定することは必要とはされない。 In the first embodiment, any one of the biomarkers miR shown in Tables 1 to 4 may be used alone, but it is preferable to use a plurality of miRs. Similarly, in the second to third embodiments, the relative expression amount of any one of the biomarkers miR shown in Tables 1 to 4 may be used alone, but preferably a plurality of them are preferably used. It is preferable to determine using the relative expression level of miR. More preferably, determination is made using relative expression amounts of a plurality of miRs shown in Table 1 or Table 3 and a plurality of miRs shown in Table 2 or Table 4. Thus, by targeting multiple miRs, the reliability of the determination by the method of the present invention is improved. However, when targeting multiple miRs, it is not always necessary to reflect the results of the relative expression levels of all miRs.
本発明の第四の態様は、表１に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸、その機能的等価物、表２に示されるｍｉＲ及びその機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも１種以上の核酸を有効成分とする抗がん剤である。 A fourth aspect of the present invention relates to at least one or more selected from the group consisting of inhibitory nucleic acids against miRs shown in Table 1, functional equivalents thereof, miRs shown in Table 2 and functional equivalents thereof It is an anticancer agent containing nucleic acid as an active ingredient.
先に言及したように、悪性度の高い又は予後が不良であるがんに関連して、表１に示されるｍｉＲは相対的発現量が上昇するｍｉＲであり、表２に示されるｍｉＲは相対的発現量が低下するｍｉＲである。したがって、表１に示されるｍｉＲの機能を阻害することのできる核酸、その機能的等価物、表２に示されるｍｉＲ又はこれらの機能的等価物は、がん患者に投与されることにより抗腫瘍効果が発揮させることができる、すなわち抗がん剤として利用することができると期待される。後の実施例に示すように、表１に示されるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐに対する阻害性核酸は、がん細胞株に導入されることでそのがん細胞株の生存率を低下させる、すなわちがん細胞を死滅させる活性を有している。 As mentioned earlier, the miRs shown in Table 1 are miRs with increased relative expression levels in relation to high grade or poor prognosis cancers, while miRs shown in Table 2 are relative Is a miR whose expression level decreases. Therefore, a nucleic acid capable of inhibiting the function of miR shown in Table 1, a functional equivalent thereof, a miR shown in Table 2 or a functional equivalent thereof are administered as an antitumor agent by being administered to a cancer patient. It is expected that the effect can be exhibited, that is, it can be used as an anticancer agent. As shown in the following examples, the inhibitory nucleic acid against hsa-miR-4708-3p shown in Table 1 reduces the survival rate of the cancer cell line by being introduced into the cancer cell line, ie, It has an activity to kill cancer cells.
本発明における抗腫瘍効果とは、がん細胞を死滅させる、がん細胞の増殖を抑制する、がん細胞の薬剤感受性を高める、腫瘍を縮退させる又は腫瘍の成長を抑制する効果を意味する。がん細胞に対する効果は、本発明の抗がん剤を適当な培地中のがん細胞に適用し、好ましくはがん細胞内に導入することで、がん細胞の増殖が抑制される又はがん細胞が死滅することを、公知の細胞増殖アッセイ又は細胞生存率アッセイを用いて確認することができる。腫瘍に対する効果は、適当な担がんモデル動物の体内に好ましくは腫瘍に直接投与することで、腫瘍の成長の抑制又は縮退を公知の方法で観察することで確認することができる。 The antitumor effect in the present invention means an effect of killing cancer cells, suppressing the growth of cancer cells, enhancing drug sensitivity of cancer cells, degenerating a tumor or suppressing the growth of a tumor. The effect on cancer cells can be achieved by applying the anticancer agent of the present invention to cancer cells in a suitable culture medium, preferably by introducing it into cancer cells, thereby suppressing the growth of cancer cells or Cell death can be confirmed using known cell proliferation assays or cell viability assays. The effect on a tumor can be confirmed by observing inhibition or degeneration of tumor growth by a known method by direct administration to a tumor, preferably directly into the tumor-bearing animal model.
ｍｉＲに対する阻害性核酸を設計及び生産する手法は、当業者に広く知られている。また、このような阻害性核酸の設計から生産を受託により行う会社等も多数存在する。例えばこの様な受託生産は、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ａｎｄ−ｒｎａｉ／ｍｉｒｎａ／ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ．ｈｔｍｌ）、ＱＩＡＧＥＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃａｔａｌｏｇ／ａｓｓａｙ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ｍｉｒｎａ／ｍｉｓｃｒｉｐｔ−ｍｉｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂ／ｅｎ／ＵＳ／ａｄｉｒｅｃｔ／ａｂ？ｃｍｄ＝ｃａｔＮａｖｉｇａｔｅ２＆ｃａｔＩＤ＝６０２４００）などが行っている。このような受託先に本明細書に記載の各表中のＩＤ又はアクセッション番号から特定される塩基配列を提供すれば、阻害性核酸を入手することができる。なお、ｍｉＲの塩基配列に相補する塩基配列からなる核酸は、阻害性核酸の一例である。 Techniques for designing and producing inhibitory nucleic acids against miRs are widely known to those skilled in the art. In addition, there are many companies and the like that contract to produce from the design of such inhibitory nucleic acid. For example, such consignment production can be performed by SIGMA-ALDRICH (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/mirna/microrna-mimics.html), QIAGEN (http: // www) .Qiagen.com / products / catalog / assay-technologies / mirna / miscript-mirna-mimics), Applied Bioscience (https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=602400 ) And so on That. An inhibitory nucleic acid can be obtained by providing such a consignee with a base sequence identified from the ID or accession number in each of the tables described herein. In addition, the nucleic acid which consists of a base sequence complementary to the base sequence of miR is an example of an inhibitory nucleic acid.
本発明における機能的等価物とは、表１のｍｉＲに対する阻害性核酸及び表２に示されるｍｉＲ（以下、これらをｍｉＲｓと表す）に関連して、下記のいずれかの核酸を意味する。
ａ）ｍｉＲｓの各塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を示す塩基配列からなり、かつ抗腫瘍効果を有するＲＮＡ、
ｂ）生体内においてｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを産生することができる核酸、
ｃ）ｍｉＲｓ、ａ）又はｂ）のＲＮＡの塩基配列において一部の塩基がデオキシリボヌクレオチドに置き換えられたキメラ核酸であって、かつ抗腫瘍効果を有する核酸、
ｄ）ｍｉＲｓ又はａ）〜ｃ）のＲＮＡ若しくは核酸とこれに相補するＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖とのハイブリッド核酸であって、かつ抗腫瘍効果を有する核酸、又は
ｅ）ｍｉＲｓ又はａ）〜ｄ）のＲＮＡ若しくは核酸の塩基配列の一部が修飾された又は非天然塩基によって置換された塩基配列からなり、かつ抗腫瘍効果を有する核酸。
The functional equivalent in the present invention means any of the following nucleic acids in relation to inhibitory nucleic acids against miRs of Table 1 and miRs shown in Table 2 (hereinafter referred to as miRs).
a) RNA having an antitumor effect, comprising a nucleotide sequence showing at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more identity to each base sequence of miRs,
b) a nucleic acid capable of producing the miRs or a) RNA in vivo,
c) A chimeric nucleic acid in which some bases are replaced with deoxyribonucleotides in the base sequence of the miRs, a) or b) RNA, and a nucleic acid having an antitumor effect,
d) A hybrid nucleic acid of the RNA or nucleic acid of miRs or a) to c) and a DNA strand or RNA strand complementary thereto, and having a antitumor effect, or e) miRs or a) to d) A nucleic acid consisting of a base sequence in which a part of the base sequence of RNA or nucleic acid is modified or substituted by a non-natural base, and having an antitumor effect.
ａ）のＲＮＡは、ｍｉＲｓのいずれかの塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失又は置換されており、あるいは１若しくは数個の塩基が挿入されており、ｍｉＲｓの塩基配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を示す塩基配列からなり、かつ抗腫瘍効果を有するＲＮＡである。 In the RNA of a), one or several bases of any base sequence of miRs are deleted or substituted, or one or several bases are inserted, and at least the base sequence of miRs is inserted. It is an RNA having an antitumor effect, which is composed of a base sequence showing an identity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
「同一性」とは、当該技術分野において公知のアルゴリズムを用いて算出される最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方若しくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。 "Identity" refers to the optimal alignment calculated using algorithms known in the art (preferably, the algorithm may consider the introduction of gaps in one or both sequences for optimal alignment. Mean the ratio (%) of identical nucleotide residues to total overlapping nucleotide residues.
同一性は例えば、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。 For example, using the NCBI BLAST-2 (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool), the following conditions (gap open = 5 penalty; gap extension = 2 penalty; x_drop off = 50; expectation value = 10) It can be calculated by aligning the two nucleotide sequences with: filtering = ON).
ｂ）の生体内においてｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを産生することができる核酸の一つの例は、ｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡに対するｐｒｉ−ｍｉＲ若しくはｐｒｅ−ｍｉＲに相当するＲＮＡである。かかるＲＮＡは細胞内においてＤｒｏｓｈａ及び／又はＤｉｃｅｒによってプロセッシングされ、最終的にｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを産生することができる。なお、２以上のｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡが連結された塩基配列からなり、プロセッシングによって２以上のｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡが同時に産生されるＲＮＡも含まれる。 One example of a nucleic acid capable of producing the miRs or a) RNA in vivo in vivo is an RNA corresponding to pri-miR or pre-miR for the miRs or a) RNA. Such RNA can be processed intracellularly by Drosha and / or Dicer to finally produce the miRs or a) RNA. In addition, RNA which consists of a base sequence to which 2 or more miRs or a) RNA was connected, and 2 or more miRs or a) RNA is simultaneously produced by processing is also included.
ｂ）の生体内においてｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを産生することができる核酸の他の例は、ｍｉＲｓ、ａ）のＲＮＡ又はそれらのｐｒｉ−ｍｉＲ若しくはｐｒｅ−ｍｉＲに相当するＲＮＡを転写誘導することができるＤＮＡである。 Another example of the nucleic acid capable of producing the miRs or a) RNA in vivo in b) is to induce transcription of the miRs, a) RNA or an RNA corresponding to their pri-miR or pre-miR It is a DNA that can
ｂ）のＤＮＡは、制御可能な適当な発現プロモーター配列、特にがん細胞の中で高い発現誘導能を有するプロモーター配列の支配下に置かれることが好ましい。かかるＤＮＡががん細胞内に導入されることで、ｍｉＲｓ、ａ）のＲＮＡ又はそれらのｐｒｉ−ｍｉＲ若しくはｐｒｅ−ｍｉＲに相当するＲＮＡが転写発現され、さらにこれらがプロセッシングされることで、最終的にｍｉＲｓ又は上記ａ）のＲＮＡが産生される。なお２以上のｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡが連結された塩基配列からなるＲＮＡを転写誘導することができ、プロセッシングによって２以上のｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを同時に産生することができるＤＮＡも含まれる。 The DNA of b) is preferably placed under the control of an appropriate controllable expression promoter sequence, particularly a promoter sequence having high expression inducibility in cancer cells. By introducing such DNA into cancer cells, RNAs of miRs, a) or RNAs corresponding to their pri-miRs or pre-miRs are transcribed and expressed, and these are further processed. MiRs or RNA of a) above are produced. Furthermore, it is also possible to induce transcription of RNA consisting of a base sequence to which two or more miRs or a) RNAs are linked, and also include DNA capable of simultaneously producing two or more miRs or a) RNAs by processing.
ｂ）のＤＮＡは、前記プロモーター配列を含む発現ベクターの形態であることが好ましい。発現ベクターは、プロモーター配列の他に、転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばオペレーター配列、エンハンサーなどをさらに含んでいてもよい。これらの機能性塩基配列は、上記ＤＮＡと機能的に連結され得る。 The DNA of b) is preferably in the form of an expression vector containing the promoter sequence. The expression vector may further contain, in addition to the promoter sequence, any functional base sequence that regulates transcriptional expression, such as an operator sequence, an enhancer and the like. These functional base sequences can be functionally linked to the above DNA.
発現ベクターの構築方法としては、当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を挙げることができる。また市販のキットや試薬を使用するときは、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従うことが好ましい。 As a method for constructing an expression vector, techniques known or well known to those skilled in the art, for example, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. Edition” by Sambrook et al. (1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. And the like) may be mentioned in the other textbooks or handbooks in the art and widely used by those skilled in the art. When a commercially available kit or reagent is used, it is preferable to follow the protocol and / or parameters defined by the manufacturer of the kit or reagent.
ｃ）のキメラ核酸は、ｍｉＲｓ、ａ）又はｂ）のＲＮＡの一部の塩基が対応するデオキシリボヌクレオチドに置き換えられた核酸であって、かつ抗腫瘍効果を有する核酸である。 The chimeric nucleic acid c) is a nucleic acid in which part of the bases of the miRs, a) or b) RNA is replaced with the corresponding deoxyribonucleotide, and is a nucleic acid having an antitumor effect.
ｄ）のハイブリッド核酸は、ＲＮＡ鎖及びＤＮＡ鎖からなる二本鎖又は三本鎖の核酸であって、少なくとも一の鎖の塩基配列がｍｉＲｓ又はａ）〜ｃ）のＲＮＡに相当する塩基配列からなる核酸をいう。 The hybrid nucleic acid d) is a double-stranded or triple-stranded nucleic acid consisting of an RNA strand and a DNA strand, and the base sequence of at least one strand corresponds to the RNA of miRs or a) to c) Nucleic acid that
ｅ）のｍｉＲｓ又はａ）〜ｄ）のＲＮＡ若しくは核酸の塩基配列の一部が修飾された又は非天然塩基によって置換された塩基配列からなり、かつ抗腫瘍効果を有する核酸の例としては、ｍｉＲｓ若しくはａ〜ｄ）のＲＮＡの塩基配列の一部がヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させることのできる修飾を受けたＲＮＡ、又はｍｉＲｓ若しくはａ）〜ｄ）のＲＮＡの塩基配列の一部がヌクレアーゼによる分解に耐性を示す非天然塩基に置換されたＲＮＡを挙げることができる。 Examples of a nucleic acid having an antitumor effect, which is composed of a nucleotide sequence in which a part of the nucleotide sequence of RNA or nucleic acid of miRs or a) to d) in e) is modified or substituted by a non-natural base, Or a part of the base sequence of ad) RNA can improve the stability against degradation by nuclease, or a part of the base sequence of miRs or a) to d) RNA And RNA substituted with a non-natural base that is resistant to degradation by
ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための修飾としては、２’Ｏ−メチル化、２’−Ｆ化、４’−チオ化などを挙げることができる。また、リン酸部分やヒドロキシル部分がビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等によって修飾されたものであってもよい。 Modifications to improve the stability against degradation by nucleases can include 2'O-methylation, 2'-Fation, 4'-thioation and the like. In addition, the phosphate moiety or the hydroxyl moiety may be modified by biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group or the like.
ヌクレアーゼによる分解に耐性を示す非天然塩基としては、例えば５‐（２‐アミノ）プロピルウリジン又は５‐ブロモウリジンなどの５位修飾ウリジン又はシチジン、例えば８‐ブロモグアノシンなどの８位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどのＯ−又はＮ−アルキル化ヌクレオチドを挙げることができるが、これらには限定されない。 Examples of non-natural bases resistant to degradation by nucleases include 5-position modified uridine or cytidine such as 5- (2-amino) propyluridine or 5-bromouridine, 8-position modified adenosine or guanosine such as 8-bromoguanosine For example, but not limited to, deazanucleotides such as 7-deaza-adenosine, O- or N-alkylated nucleotides such as N6-methyl adenosine.
修飾される又は置換される塩基の種類又は個数は、抗腫瘍効果を失わない限り、特に制限は無い。 The type or number of bases to be modified or substituted is not particularly limited as long as the antitumor effect is not lost.
本発明の抗がん剤の有効成分となるｍｉＲｓ又はそれらの機能的等価物である核酸は、その機能を妨げない限りにおいて、５’又は３’末端に付加的な塩基を有していてもよい。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 The miRs as the active ingredient of the anticancer agent of the present invention or the nucleic acid as the functional equivalent thereof may have an additional base at the 5 'or 3' end unless it interferes with its function. Good. Examples of sequences of such additional bases include, for example, ug-3 ', uu-3', tg-3 ', tt-3', ggg-3 ', guuu-3', gttt-3 ', ttttt-3. Sequences such as ', uuuuu-3' and the like can be mentioned, but are not limited thereto.
本発明の抗がん剤の有効成分となるｍｉＲｓ又はそれらの機能的等価物である核酸は、遺伝子組み換え技術又は化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。遺伝子組み換え方法、核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法としては、当業者に知られ又は周知である方法を採用することができる。またいわゆるＤＮＡシンセサイザーなどの機器を用いることで、核酸を合成してもよい。 The miRs, which are active ingredients of the anticancer agent of the present invention, or the nucleic acids that are functional equivalents thereof can be artificially synthesized using genetic engineering technology or chemical synthesis technology. Methods known to those skilled in the art or well-known can be adopted as a method of genetic recombination, a method of chemical synthesis of nucleic acids, a method of synthesizing non-natural bases, or a method of synthesizing nucleic acids containing the same. Alternatively, a nucleic acid may be synthesized by using a device such as a so-called DNA synthesizer.
本発明の抗がん剤の有効成分となるｍｉＲｓ又はそれらの機能的等価物はそのまま生体に投与されてもよいが、腫瘍に対して選択的に投与される方法、特に腫瘍中の細胞内に導入することができる方法により投与されることが好ましい。かかる目的において、本発明の抗がん剤は、核酸導入用試薬と組み合わせて使用されることが好ましい。該核酸導入用試薬の例としては、アテロコラーゲン、リポソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を挙げることができる。また、適当なウイルスベクターを用いて腫瘍中の細胞内に導入してもよい。 Although miRs or their functional equivalents serving as active ingredients of the anticancer agent of the present invention may be directly administered to a living body, the method is selectively administered to a tumor, in particular, in cells in the tumor. Preferably, it is administered by a method that can be introduced. For such purpose, the anticancer agent of the present invention is preferably used in combination with a nucleic acid introduction reagent. Examples of the nucleic acid transfer reagent include atelocollagen, liposome, nanoparticles, Lipofectin, Lipofectamine, DOGS (transfectam), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, polybrene, poly (ethyleneimine) (PEI), etc. Cationic lipids and the like. Alternatively, it may be introduced into cells in a tumor using an appropriate viral vector.
本発明の抗がん剤は、薬学的に許容される賦形剤、担体その他の成分と共に医薬、特に医薬組成物を形成し又は製剤化して使用することができる。特に、核酸製剤の調製に好適な賦形剤等の利用が好ましい。かかる医薬も、本発明の一態様である。 The anticancer agent of the present invention can be used together with a pharmaceutically acceptable excipient, carrier and other components to form or formulate a medicine, particularly a pharmaceutical composition. In particular, the use of an excipient or the like suitable for preparation of a nucleic acid preparation is preferable. Such a medicament is also an aspect of the present invention.
薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。また、ＲＮＡ干渉誘導性核酸などを含む製剤で利用されている各種の成分を利用することが好ましい。治療対象となる疾患に応じて、本発明の抗がん剤とその他の医薬とを併用して使用してもよい。 Pharmaceutically acceptable ingredients are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can, within the scope of ordinary practice, for example Therefore, they can be selected appropriately and used. In addition, it is preferable to use various components used in a preparation containing RNA interference-inducing nucleic acid and the like. Depending on the disease to be treated, the anticancer agent of the present invention and other medicine may be used in combination.
本発明の抗がん剤を含む医薬は、通常、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いられる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった、製剤において通常用いられる水性担体が挙げられる。本発明の抗がん剤を含む医薬はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の成分を含んでもよい。 The medicament containing the anticancer agent of the present invention is usually used in the form of parenteral preparations such as injections and drips. Carriers that can be used for parenteral preparations include, for example, aqueous carriers commonly used in preparations, such as physiological saline, isotonic solutions containing glucose, D-sorbitol and the like. The medicament comprising the anticancer agent of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable buffer, stabilizer, preservative and other ingredients.
また、本発明の抗がん剤を含む医薬は、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、マイクロスフェア及びナノスフェアなどの適切なＤＤＳに封入及び／又は固定することもできる。 In addition, the drug containing the anticancer agent of the present invention can also be encapsulated and / or immobilized in a suitable DDS such as polymeric micelles, liposomes, emulsions, microspheres and nanospheres.
本発明の抗がん剤又はこれを含む医薬の投与方法は特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、腫瘍内又はその近傍への局所投与などを挙げることができる。好ましい態様の一つにおいて、本発明の抗がん剤又はこれを含む医薬は、静脈内投与又は腫瘍内若しくはその近傍への局所投与により対象に投与される。 The administration method of the anticancer agent of the present invention or a drug containing the same is not particularly limited, but in the case of parenteral preparation, for example, intravascular administration (preferably intravenous administration), intraperitoneal administration, enteral administration, tumor Local administration to the inside or its vicinity etc. can be mentioned. In one of the preferred embodiments, the anti-cancer agent of the present invention or the medicament comprising the same is administered to a subject by intravenous administration or local administration in or near a tumor.
ウイルスベクターを利用して哺乳動物の体内で本発明の抗がん剤の発現を誘導する場合、その用量範囲は、例えば、ヒト対象１人あたり、１×１０３〜１×１０１４、好ましくは１×１０５〜１×１０１２、より好ましくは１×１０６〜１×１０１１、最も好ましくは１×１０７〜１×１０１０のプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）であることができる。 When expression of the anticancer agent of the present invention is induced in the mammalian body using a viral vector, the dose range is, for example, 1 × 10 3 to 1 × 10 14 , preferably 1 human subject. 1 × 10 5 to 1 × 10 12 , more preferably 1 × 10 6 to 1 × 10 11 , most preferably 1 × 10 7 to 1 × 10 10 plaque forming units (pfu) Can.
本発明の第五の態様は、表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲを含む、がん治療のためのコンパニオン診断薬である。特に好ましい態様は、本発明の第四の態様である抗がん剤の投与対象となる患者を選定するためのコンパニオン診断薬である。 According to a fifth aspect of the present invention, there is provided a companion diagnostic for cancer treatment comprising one or more miRs selected from the group consisting of miRs identified by ID and accession number shown in Table 1 and Table 2. It is a medicine. A particularly preferred embodiment is a companion diagnostic agent for selecting a patient to whom the anticancer agent according to the fourth embodiment of the present invention is to be administered.
本発明の第一の態様により表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの発現パターンを確認することで、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定することができること、並びにかかるｍｉＲの発現パターン及びがんの悪性度、予後及び抗がん剤治療の有効性と血液中のＩＬ−６の発現レベル、具体的には血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いこととの間には相関があることは先に説明したとおりである。したがって、表１又は表２に示されるｍｉＲは、血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いことを判定するために有用であり、例えば登録商標アクテラム（一般名トリシズマブ）などの抗ＩＬ−６抗体の投与の適否を判定するためのコンパニオン診断薬として利用することができる。 Determining cancer malignancy, prognosis and / or efficacy of anticancer drug treatment by confirming the miR expression pattern shown in Table 1 and / or Table 2 according to the first aspect of the present invention And the expression pattern of such miR and the malignancy of cancer, prognosis, and efficacy of anticancer drug treatment and expression levels of IL-6 in blood, specifically expression levels of IL-6 in blood As described above, there is a correlation between the higher Thus, the miRs shown in Table 1 or Table 2 are useful for determining high expression levels of IL-6 in the blood, eg, anti-IL-6 antibodies such as Actarum® (generic name tricizumab). It can be used as a companion diagnostic for determining the propriety of administration of
また表１又は表２に示されるｍｉＲは、本発明の抗がん剤すなわち表１に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸又はその機能的等価物である抗がん剤又は表２に示されるｍｉＲ又はその機能的等価物である抗がん剤の投与が有効であり得るか否かを判定するためのコンパニオン診断薬としても利用することができる。 The miRs shown in Table 1 or Table 2 are the anticancer agents of the present invention, that is, the inhibitory nucleic acids for miRs shown in Table 1 or their functional equivalents, or the miRs shown in Table 2 It can also be used as a companion diagnostic agent to determine whether administration of its functional equivalent, an anticancer agent, may be effective.
具体的には、がん患者の血液中の表１に示されるｍｉＲの相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して２倍以上であるときは、そのｍｉＲに対する阻害性核酸又はその機能的等価物の投与が有効であると判定することができる。同様に、がん患者の血液中の表２に示されるｍｉＲの相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して１／２倍以下であるときは、そのｍｉＲ又はその機能的等価物の投与が有効であると判定することができる。 Specifically, the relative expression level of miR shown in Table 1 in the blood of cancer patients is measured, and in the blood of cancer patients whose level of IL-6 expression in the blood is below the detection limit When the relative expression level is twice or more compared to the relative expression level, it can be determined that the administration of the inhibitory nucleic acid or its functional equivalent to the miR is effective. Similarly, the relative expression level of miR shown in Table 2 in the blood of cancer patients is measured, and the relative value in the blood of cancer patients whose level of IL-6 expression in the blood is below the detection limit When the amount is 1/2 or less as compared to the expression level, it can be determined that the administration of the miR or a functional equivalent thereof is effective.
なお、コンパニオン診断薬としての使用においても、表３及び表４における各ｍｉＲの血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者の相対的発現量又は血液中のＩＬ−６の発現レベルが低い患者の相対的発現量に基づいて、判定することができる。 In addition, also in use as a companion diagnostic agent, a patient having a high expression level of IL-6 in the blood of each miR in Tables 3 and 4 or a patient having a low expression level of IL-6 in the blood It can be determined based on the relative expression level of
本発明はまた、本発明の抗がん剤を投与して哺乳動物の悪性腫瘍を治療する、予防する、転移を抑制する及び／又は再発を防止する方法を提供する。具体的には、哺乳動物に有効量の本発明の抗がん剤又はこれを含む医薬を投与して哺乳動物における悪性腫瘍を治療する、予防する、転移を抑制する及び／又は再発を防止する方法を提供する。 The present invention also provides a method of treating, preventing, suppressing metastasis and / or preventing recurrence of a malignant tumor in a mammal by administering the anticancer agent of the present invention. Specifically, a mammal is administered an effective amount of the anticancer agent of the present invention or a medicament containing the same to treat, prevent, suppress metastasis, and / or prevent recurrence of a malignant tumor in the mammal. Provide a way.
本明細書中で用いられる「哺乳動物」の例としてはヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコ等を挙げることができるが、本発明の方法は特にヒトを対象とする。 Examples of "mammals" as used herein may include humans, cows, horses, dogs, cats and the like, but the method of the present invention is particularly directed to humans.
本明細書中で用いられる「有効量」とは、哺乳動物における悪性腫瘍の増殖又は症状の悪化を抑制する、悪性腫瘍を縮退させる、がんの転移を抑制する及び／又は再発を防止するのに効果的な抗がん剤の量を意味する。かかる有効量は疾患の種類、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。 As used herein, the term "effective amount" means to suppress the growth or deterioration of malignancy in a mammal, to reduce malignancy, to suppress metastasis of cancer and / or to prevent recurrence. Means effective amount of anti-cancer drug. The effective amount is appropriately adjusted according to the type of disease, severity of symptoms, patient and other medical factors.
以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。実施例において、市販のキットを用いた操作はキット製造者のプロトコルに従って行った。なお本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種及び属、コンストラクト並びに試薬に限定されるものではなく、これらは適宜変更することができるものであることは当業者に容易に理解されるものである。 The invention will now be described in more detail by way of non-limiting examples. In the examples, operations with commercially available kits were performed according to the kit manufacturer's protocol. It is noted that the present invention is not limited to the particular methodology, protocols, cell lines, animal species and genera, constructs and reagents described herein, which may be modified as appropriate. It is easily understood by the trader.
＜実施例１＞
１）血液の調製
６９名の大腸がん患者から採取した血液から常法に従って調製した血清について、ＢＤ ＯｐｔＥＩＡＴＭ Ｈｕｍａｎ ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてＩＬ−６の発現量を測定した。この測定によってＩＬ−６の発現量が約１５ｐｇ／ｍＬ血清以上と測定された患者（ＩＬ−６高値患者）５名及びＩＬ−６の発現が上記測定では検出限界以下であった患者（ＩＬ−６低値患者）５名を選択した。各患者の血清の一部を別々に保存した残りを、ＩＬ−６高値患者、ＩＬ−６低値患者それぞれで一つに纏めて混合した。
Example 1
1) The serum was prepared according to a conventional method from blood collected from a colon cancer patient's blood in preparation 69 persons, measuring the expression level of IL-6 using a BD OptEIA TM Human IL-6 ELISA Set (BD Bioscience , Inc.) did. Five patients (IL-6 high patients) whose expression level of IL-6 was measured to be about 15 pg / mL serum or more by this measurement and patients whose expression of IL-6 was below the detection limit by the above measurement (IL- 6 low level patients) 5 people were selected. A portion of each patient's serum was stored separately, and the remainder was mixed together in a high IL-6 patient and a low IL-6 patient.
２）マイクロアレイ解析
１）で調製した２種類の混合血清に対して、東レ株式会社に委託して「ｍｉＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ ｃｈｉｐ」を用いたマイクロアレイ解析を行い、検出されたｍｉＲごとの相対的発現量をグローバルノーマライゼーション法によって算出した。
2) Microarray analysis The two types of mixed sera prepared in 1) were commissioned by Toray Industries, Inc., and microarray analysis using “miRNA Oligo chip” was performed, and the relative expression amount for each detected miR was globalized Calculated by the normalization method.
３）ｍｉＲの特定
混合血清についてのマイクロアレイ解析結果から、ＩＬ−６高値患者の血清における相対的発現量がＩＬ−６低値患者の血清における相対的発現量に対して２倍以上であるｍｉＲを選択し、それらのＩＤ、アクセッション番号及び測定された相対的発現量を前記表３に示した。同様に、ＩＬ−６高値患者の血清における相対的発現量がＩＬ−６低値患者の血清における相対的発現量に対して１／２倍以下であるｍｉＲを選択した。それらのＩＤ、アクセッション番号及び測定された相対的発現量を前記表４に示した。なお、表３及び表４は、表１及び表２に対して、各ｍｉＲのＩＬ−６高値患者の混合血清及びＩＬ−６低値患者の混合血清におけるそれぞれの相対的発現量を追記したものである。
3) Identification of miRs Based on microarray analysis results for mixed sera, miRs in which the relative expression level in the serum of high IL-6 patients is at least twice the relative expression level in the sera of low IL-6 patients The selected ID, the accession number and the relative expression level measured are shown in Table 3 above. Similarly, miRs were selected whose relative expression level in the serum of high IL-6 patients is 1/2 or less of that in the serum of low IL-6 patients. Their ID, accession number and relative expression level measured are shown in Table 4 above. In Tables 3 and 4, the relative expression levels in the mixed serum of patients with high IL-6 and in the serum of low IL-6 patients of each miR are added to Table 1 and Table 2, respectively. It is.
また、ＩＬ−６高値患者及びＩＬ−６低値患者の各混合血清におけるｍｉＲの相対的発現量（グローバルノーマライゼーション値）の値の二次元プロットを図１に示す。なお、非特許文献１で大腸がんの予後判定因子の一つとなり得ると報告されているｈｓａ−ｍｉＲ−２１は、上記の選択基準では表３又は表４のいずれの群にも属さないことが確認された。
Moreover, the two-dimensional plot of the value of the relative expression level (global normalization value) of miR in each mixed serum of IL-6 high level patients and IL-6 low level patients is shown in FIG. Note that hsa-miR-21, which is reported to be one of the prognostic factors for colorectal cancer in
さらに、別に保存した患者個々の血清の一部について、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１９及びｈｓａ−ｍｉＲ−１５３８の各発現量を定量ＰＣＲによって測定した。ＩＬ−６高値患者一名及びＩＬ−６低値患者一名における前記定量ＰＣＲの結果を図２〜４に示す。各ｍｉＲの発現レベルの差異は、混合血清におけるそれと一致していた。 Furthermore, the expression level of each of hsa-miR-4708-3p, hsa-miR-4319 and hsa-miR-1538 was measured by quantitative PCR for a part of separately stored patient's serum. The results of the quantitative PCR in one patient with high IL-6 and one patient with low IL-6 are shown in FIGS. The difference in expression levels of each miR was consistent with that in mixed sera.
＜実施例２＞
表１に示されるｍｉＲの一つであるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐに対する阻害性核酸（ＤＮＡ）を、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨに依頼して化学合成した。
Example 2
The inhibitory nucleic acid (DNA) against hsa-miR-4708-3p, which is one of the miRs shown in Table 1, was chemically synthesized by request to SIGMA-ALDRICH.
ヒト大腸がん細胞株ＤＬＤ−１（５×１０３個／ウェル／９６穴プレート）を２４時間培養した後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者のプロトコルに従って上記阻害性核酸及びネガティブコントロールｍｉＲ各３０ｐｍｏｌ／ウェルを別々のウェルに加えた。４８時間後における大腸がん細胞株の生存率を、ＭＴＴアッセイ（Ｃｅｌｌ Ｑｕａｎｔ ＭＴＴ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ社）を行って評価した。その結果を、ネガティブコントロールｍｉＲを導入したがん細胞株群に対する阻害性核酸が導入されたがん細胞株群のＯＤ値の比として、図５に示す。 After culturing the human colon cancer cell line DLD-1 (5 × 10 3 cells / well / 96-well plate) for 24 hours, the above-mentioned inhibitory property is demonstrated according to the manufacturer's protocol using lipofectamine (registered trademark) (life Technologies) 30 pmol / well of nucleic acid and negative control miR were added to separate wells. The survival rate of the colon cancer cell line after 48 hours was evaluated by performing MTT assay (Cell Quant MTT Assay Kit (BioAssay System)) The result is inhibition to the cancer cell line group to which the negative control miR has been introduced. The ratio of the OD value of the cancer cell line group into which the nucleic acid has been introduced is shown in FIG.
図５に示されるように、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐに対する阻害性核酸を導入されたがん細胞株の増殖は抑制された。この結果から、かかる阻害性核酸は抗がん剤として有効であることが確認された。 As shown in FIG. 5, the growth of the cancer cell line into which the inhibitory nucleic acid against hsa-miR-4708-3p was introduced was suppressed. From this result, it was confirmed that such inhibitory nucleic acid is effective as an anticancer agent.
表１及び表２に示されるｍｉＲであるバイオマーカーは、がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルと共に又はこれに代わり、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性の判定に利用することができる。また本発明は、悪性度が高い又は予後が不良ながんに対する有効な医薬を選択するためのコンパニオン診断薬として、さらにはかかるがんに対する抗がん剤として有用である。
The biomarkers that are miRs shown in Tables 1 and 2 may be used together with or instead of the expression level of IL-6 in the blood of cancer patients for the treatment of cancer malignancy, prognosis and / or anticancer drug treatment. It can be used to determine the effectiveness. In addition, the present invention is useful as a companion diagnostic agent for selecting an effective medicine for cancers with high grade or poor prognosis, and further as an anticancer agent for such cancers.
Claims (7)
１）判定対象の大腸がん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）判定対象の大腸がん患者における前記表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は判定対象の大腸がん患者における前記表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、判定対象の大腸がん患者における大腸がんの悪性度が高い及び／又は予後が不良であると判定する工程
を含む、前記判定方法。 A method of determining the grade and / or prognosis of colorectal cancer, comprising
1) measuring the expression level of at least one miR of miRs shown in Table 1 and / or Table 2 in blood collected from colorectal cancer patients to be determined;
3) comparing the relative expression level of miR calculated in 2) with the relative expression level in colorectal cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit, and 4) to be judged The relative expression level of miRs shown in Table 1 above in colorectal cancer patients is at least twice the relative expression level in colorectal cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit If it is, and / or relative expression level of miR shown in table 2 in colorectal cancer patients to be determined is the relative in colorectal cancer patients IL-6 expression levels in the blood is below the detection limit Determining that the grade of colorectal cancer in the subject colon cancer to be determined is high and / or the prognosis is poor when the level is 1/2 or less of the target expression amount.
１）抗がん剤治療を受けた大腸がん患者から採取された血液における、請求項１に記載の表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から前記表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）抗がん剤治療を受けた大腸がん患者における前記表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は抗がん剤治療を受けた大腸がん患者における前記表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、抗がん剤治療が有効でないと判定する工程
を含む、前記判定方法。 A method of determining the efficacy of anticancer drug treatment for colorectal cancer , comprising
1) Measuring the expression level of at least one miR of miRs shown in Table 1 and / or Table 2 according to claim 1 in blood collected from colon cancer patients who received anticancer drug treatment Process,
2) calculating the relative expression level of at least one or more of the miRs shown in Table 1 and / or Table 2 from the expression level of the miRs,
3) comparing the relative expression level of miR calculated in 2) with the relative expression level in colorectal cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit, and 4) anti The relative expression level of miRs shown in the above Table 1 in colorectal cancer patients receiving cancer treatment is the relative expression level in colorectal cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit The relative expression level of miRs shown in the above Table 2 in colorectal cancer patients treated with anti-cancer drug is more than doubled, and / or the expression level of IL-6 in blood is detected The method according to the above-mentioned, comprising the step of determining that the anti-cancer agent treatment is not effective when the relative expression level in colorectal cancer patients, which is below the limit, is 1⁄2 or less.
１）判定対象の大腸がん患者から採取された血液における、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐの発現量を測定する工程、1) measuring the expression level of hsa-miR-4708-3p in blood collected from a colon cancer patient to be determined;
２）前記発現量から相対的発現量を算出する工程、2) calculating a relative expression level from the expression level,
３）２）で算出された相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐの相対的発現量と比較する工程、及び3) comparing the relative expression level calculated in 2) with the relative expression level of hsa-miR-4708-3p in colorectal cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit ,as well as
４）判定対象の大腸がん患者における相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合に、判定対象の大腸がん患者は前記抗がん剤の投与が有効であると判定する工程を含む、前記判定方法。4) When the relative expression level in colorectal cancer patients to be determined is more than twice the relative expression level in colorectal cancer patients whose expression level of IL-6 in blood is below the detection limit The method according to claim 1, comprising the step of determining that administration of the anticancer agent is effective for colon cancer patients to be determined.
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