JP6541114B2 - ナノポアによる標的検出法 - Google Patents
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Description
循環腫瘍細胞、細菌、およびウイルスのようなナノスケールおよびマイクロスケールの粒子の検出は、無限の臨床的利用可能性を有する。現在利用可能な方法には、免疫組織化学および核酸に基づく検出が含まれ、典型的には、高感度検出を実施する前に、細胞増殖が必要とされる。
本明細書に開示された様々な局面は、前述の必要性のうちの一つ以上を満たすことができる。本明細書に記載された系および方法は、各々、いくつかの局面を有し、そのうちの一つが単独で望ましい属性を担うのではない。下記の特許請求の範囲によって表される本開示の範囲を限定することなく、より顕著な特色を以下に簡単に記述する。この記述を考慮した後、具体的には、「詳細な説明」という表題のセクションを参照した後、本明細書に記載されたサンプル特色がいかに改善された系および方法を提供するかが理解されるであろう。
(a)標的分子または標的粒子がリガンドに結合し、結合ドメインが結合モチーフに結合することを可能にする条件の下で、(i)標的分子または標的粒子に結合することができるリガンドと結合ドメインとを含む融合分子および(ii)融合分子の結合ドメインが結合することができる少なくとも一つの結合モチーフを含むポリマー足場と、試料を接触させる工程;(b)装置の内部空間を二つのボリュームへ分離する孔を含み、孔を通過する物体を同定するよう構成されたセンサーを含む装置へ、ポリマーを負荷し、ポリマーを孔を通して一方のボリュームから他方のボリュームへ通過させるよう装置を構成する工程;ならびに(c)センサーによって、結合モチーフに結合した融合分子が標的分子または標的粒子に結合しているか否かを決定し、それによって、試料中の標的分子または標的粒子の存在または欠如を検出する工程。
[本発明1001]
以下の工程を含む、試料中に存在すると推測される標的分子または標的粒子を検出する方法:
(a)標的分子または標的粒子がリガンドに結合し、結合ドメインが結合モチーフに結合することを可能にする条件の下で、(i)標的分子または標的粒子に結合することができるリガンドと結合ドメインとを含む融合分子および(ii)該結合ドメインが結合することができる少なくとも一つの結合モチーフを含むポリマー足場と、試料を接触させる工程;
(b)装置の内部空間を二つのボリュームへ分離する孔を含み、孔を通過する物体を同定するよう構成されたセンサーを含む装置へ、ポリマーを負荷し、ポリマーを孔を通して一方のボリュームから他方のボリュームへ通過させるよう装置を構成する工程;ならびに
(c)センサーによって、結合モチーフに結合した融合分子が標的分子または標的粒子に結合しているか否かを決定し、それによって、試料中の標的分子または標的粒子の存在を検出する工程。
[本発明1002]
標的分子が、タンパク質、ペプチド、核酸、化学化合物、イオン、および元素からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
標的粒子が、タンパク質複合体または凝集物、タンパク質/核酸複合体、断片化されたまたは完全に集合したウイルス、細菌、細胞、および細胞凝集物からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
工程(a)が工程(b)の前に実施される、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
工程(b)が工程(a)の前に実施される、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1006]
標的分子または標的粒子とリガンドとの間の結合を改変すると推測される条件を適用し、決定を再び実施する工程をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記条件が、試料からの標的分子または標的粒子の除去、標的分子もしくは標的粒子またはリガンドと結合について競合する薬剤の添加、およびpH、塩、または温度の変化からなる群より選択される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
結合モチーフが結合ドメインとの結合のための化学的修飾を含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
化学的修飾が、アセチル化、メチル化、SUMO化(summolation)、グリコシル化、リン酸化、および酸化からなる群より選択される、本発明1008の方法。
[本発明1010]
ポリマーが、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ペプチド核酸(PNA)、DNA/RNAハイブリッド、およびポリペプチドのうちの少なくとも一つである、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
結合ドメインが、ヘリックスターンヘリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウイングドヘリックス、ウイングドヘリックスターンヘリックス、ヘリックスループヘリックス、およびHMG(high mobility group)ボックスからなる群より選択される、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
結合ドメインが、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)、デンドリマー、ペプチド、およびアプタマーからなる群より選択される、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1013]
リガンドが、抗体、抗体断片、エピトープ、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子、細胞認識分子、核酸、ペプチド、アプタマー、および受容体からなる群より選択される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
結合ドメインおよびリガンドが、融合分子を形成するため、共有結合、水素結合、イオン結合、金属結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、および平面スタッキング相互作用からなる群より選択される相互作用を介して連結されているか、または連続的なポリペプチドとして翻訳されている、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
標的分子もしくは標的粒子または標的分子もしくは標的粒子/リガンド複合体に結合することができる検出可能標識と試料を接触させる工程をさらに含む、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記ポリマーが少なくとも2単位の結合モチーフを含む、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記ポリマーが少なくとも2種の異なる結合モチーフを含み;少なくとも2種の異なる結合モチーフのうちの異なる1種に結合することができる異なる結合ドメインと、異なる標的分子または標的粒子に結合することができる異なるリガンドとを各々が含む少なくとも2種の融合分子に、試料が接触し;各結合モチーフに結合した融合分子が標的分子または標的粒子に結合しているか否かを同定するよう、センサーが構成される、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
二つのボリュームの間に電位差を印加し、孔を通る電流を測定するよう、さらに構成された電極を、センサーが含む、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
装置が、上チャンバー、中央チャンバー、および下チャンバーを含み、
上チャンバーが第1の孔を通して中央チャンバーと連絡しており、中央チャンバーが第2の孔を通して下チャンバーと連絡しており;
第1の孔および第2の孔が、直径約1nm〜約100nmであり、相互に約10nm〜約1000nm離れており;
チャンバーの各々が電源との接続のための電極を含む、
本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
各結合モチーフに結合した融合分子が標的分子または標的粒子に結合しているか否かを再び同定するように、結合モチーフが孔を通過した後、ポリマーを逆方向に移動させる工程をさらに含む、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
以下のものを含む、標的分子または標的粒子の存在を検出するためのキット、パッケージ、または混合物:
(a)標的分子または標的粒子に結合することができるリガンドと結合ドメインとを含む融合分子;
(b)結合ドメインが結合することができる少なくとも一つの結合モチーフを含むポリマー足場;および
(c)装置の内部空間を二つのボリュームへ分離する孔を含み、ポリマーを孔を通して一方のボリュームから他方のボリュームへ通過させるよう構成されており、(i)結合モチーフが融合分子に結合しており、リガンドが標的分子もしくは標的粒子に結合しているか、(ii)結合モチーフが融合分子に結合しており、リガンドが標的分子もしくは標的粒子に結合していないか、または(iii)結合モチーフが融合分子に結合していないかを同定するよう構成された、孔に隣接したセンサーをさらに含む装置。
[本発明1022]
標的分子または標的粒子を含有していると推測される試料をさらに含む、本発明1021のキット、パッケージ、または混合物。
[本発明1023]
試料が、標的分子もしくは標的粒子または標的分子もしくは標的粒子/リガンド複合体に結合することができる検出可能標識をさらに含む、本発明1022のキット、パッケージ、または混合物。
本願の全体において、本文は、本発明の装置、組成物、系、および方法の様々な態様に言及する。記載された様々な態様は、多様な例示的な例を提供するためのものであって、代替種の説明として解釈されるべきでない。むしろ、本明細書に提供される様々な態様の説明は、重複する範囲のものであり得ることに注意するべきである。本明細書に記述された態様は、例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。
本開示は、分子の検出および定量化のための方法および系を提供する。さらに、方法および系は、もう一つの分子と結合する分子の親和性を測定するよう構成されてもよい。さらに、そのような検出、定量化、および測定を、多重に実施し、効率を大きく増加させることが可能である。
本開示は、いくつかの局面において、タンパク質、タンパク質凝集物、オリゴマー、もしくはタンパク質/DNA複合体のような粒子、またはウイルス、細菌、および細胞凝集物を含む、細胞および微生物の検出、定量化、および測定のための方法および系も提供する。
本発明のテクノロジーにおいて使用するために適当なポリマー足場は、ナノポア装置へ負荷され、孔を一方の端から他方の端へ貫通することができる足場である。
ポリマー足場のような核酸およびポリペプチドについて、結合モチーフは、結合ドメインによって認識可能なヌクレオチド配列またはペプチド配列であり得る。結合ドメインはタンパク質である必要はないが、いくつかの態様において、結合ドメインは、タンパク質の機能性の一部分を形成するペプチド配列である。核酸については、例えば、プロモーター、エンハンサー、チミンチミンダイマーのような配列(モチーフ)、ならびに湾曲したヌクレオチドおよび一本鎖破壊を含む配列のようなある種の二次構造を特異的に認識しそれに結合するタンパク質が存在する。
本発明のテクノロジーにおいて、標的分子または標的粒子は、ポリマー足場に結合する融合分子の中のリガンドとの結合によって検出されるかまたは定量化される。標的分子または標的粒子および対応する結合リガンドは、相互に認識し結合することができる。粒子については、リガンドが結合するために適当な表面分子または表面マーカーが存在し得る(従って、マーカーおよびリガンドが結合対を形成する)。
「融合分子」とは、二つの機能性の領域、結合ドメインおよびリガンドを含有している分子または複合体を意味するものとする。結合ドメインは、ポリマー足場上の結合モチーフに結合することができ、リガンドは標的分子に結合することができる。
本発明のテクノロジーは、2個の分子の間の結合親和性を測定し、その他の結合動力学を決定するためにも使用され得る。例えば、結合モチーフがナノポア装置の孔を通過した後、結合モチーフが再び孔を通過することができるよう、装置を(下記のように)ポリマー足場の移動方向を逆転させるよう再構成することができる。
いくつかの局面において、上記のように同一の種類の結合モチーフを複数個含むのではなく、ポリマー足場は、各々異なる対応する結合ドメインを有する複数の型の結合モチーフを含んでいてもよい。そのような態様において、試料は、異なる対応する結合ドメインのうちの一つと、異なる標的分子または標的微生物のためのリガンドとを各々含む、複数の型の融合分子を含むことができる。
提供されるナノポア装置は、装置の内部空間を二つのボリュームへ分離する構造の中の開口部を形成する少なくとも1個の孔、および(例えば、物体の指標となるパラメーターの変化を検出することによって)孔を通過する物体を同定するよう構成された少なくとも1個のセンサーを含む。
上述のように、様々な局面において、ナノポア装置は、結合モチーフの結合状態の同定を実施するための1個以上のセンサーをさらに含む。
ナノポア器機は、開いた孔を通るイオン電流I0を測定しながら、孔に電圧Vを印加するため、高感度電位固定増幅器を使用する(図6a)。二本鎖DNA(dsDNA)のような単一の荷電分子が捕獲され、電気泳動によって孔に通される時(図6b)、I0からIBへの測定された電流シフトおよびシフト量ΔI=I0-IBおよび持続時間tDが、イベントを特徴付けるために使用される。実験において多くのイベントを記録した後、イベントの分布(図6c)を、対応する分子を特徴付けるため、分析する。このようにして、ナノポアは、バイオマーカー感知のための、単純な、標識なしの、純粋に電気的な単一分子法を提供する。
VspRタンパク質は、高いマイクロモル濃度の親和性でdsDNAに直接結合するコレラ菌(V.cholerae)由来の90kDaタンパク質である(参照:Yildiz,Fitnat H.,Nadia A.Dolganov,and Gary K.Schoolnik.「2成分制御系の応答制御因子のメンバーVpsRはコレラ菌O1 El Torにおける生合成遺伝子の発現およびEPSETr関連表現型のために必要とされる(VpsR,a Member of the Response Regulators of the Two-Component Regulatory Systems,Is Required for Expression of Biosynthesis Genes and EPSETr-Associated Phenotypes in Vibrio cholerae O1 El Tor.)」Journal of bacteriology 183,no.5(2001):1716-1726を参照すること)。ナノポアテクノロジーを使用した標的検出のこの実施例において、VspRは、部位特異的DNA結合ドメインと、抗体または糖を含む多様な標的を検出する目的で操作され得るリガンド特異的結合部位とを含む融合分子として働く。この証明において、本発明者らは、モデル融合分子としてDNA足場上のVspRの検出を示す。足場は10個のVspR特異的結合部位を含有している(図8)。dsDNA結合のためのVspRの親和性を保存するため、本発明者らは、実施例1および図7において示されるように単独のDNAの移行が電流増強を引き起こす塩濃度、0.1M KClを使用する。5.631kb DNA足場は、全部で10個のVspR結合部位:ある配列(14塩基対)5個、異なる配列(18塩基対)3個、第3の配列(27bp)2個を含有している。3種の異なる配列は、等しい親和性でVspRに結合しなくてもよい。実験において、VspRタンパク質濃度は、記録緩衝液中では18nM、標識(結合工程)中は180nMである。これは、DNA上の結合部位に対して18倍過剰のVspRタンパク質をもたらす。実験を、pH8.0(VspRタンパク質のpIは5.8である)で実行した。KdおよびDNA濃度を考慮に入れると、DNAの0.1〜1%のみがVspRによって完全に占有されており、より大きい割合が部分的に占有されており、DNAの不明な割合の残りが完全に未結合であるはずである。ナノポア実験において、溶液中には遊離型VspRタンパク質も存在する。
RecAは、融合分子の要素を含み、この実施例は、標的バイオマーカーを検出するためにこれらの要素を使用する能力を証明する。具体的には、融合分子は、DNAに結合するRecAの部分(即ち、DNA結合ドメイン)と、バイオマーカー(抗RecA抗体)のベイトとなるRecAの部分(エピトープ)とからなる。DNAおよびRecAの実験を、最初に、抗RecA抗体の非存在下で、次いで、抗RecA抗体の存在下で実施した。
以前の実施例は、RecAによってコーティングされたdsDNA複合体に結合したRecA抗体の検出を調査している。RecAは3bp領域に非特異的に結合し、従って、RecA抗体はdsDNA上の任意のRecAと結合することができるため、標的が特定の部位に結合することを可能にするアプローチを証明することも望ましい。具体的には、本発明者らは、アビジンファミリーメンバー(例えば、ニュートラアビジンおよびまたは1価ストレプトアビジン)に結合するためのビオチン化された部位を各々3個有するPNAを用いて、12残基長ペプチド核酸(PNA)分子に結合するよう操作された5.6kb dsDNA足場を使用する(図15a)。足場は、全部で75個ものアビジンバイオマーカー結合部位が局在する25個の異なる部位を有する(図15b)。本発明者らのデータ(図16)は、DNA/PNA/Neut複合体が、他のバックグラウンドイベント型(未結合DNA単独、ニュートラアビジン単独、PNA/ニュートラアビジン単独)を超えて検出可能であり、従って、完全に組み立てられた(即ち、DNA/PNA/ニュートラアビジン)イベントとしてタグ付けされ得るイベントサインを引き起こすことを示す。このセットアップにおいて、足場+融合分子として働くのは完全に組み立てられたDNA/PNA/ニュートラアビジン複合体である。実施例の残りにおいて、本発明者らは、ナノポアによってDNA/PNA/ニュートラアビジン複合体が検出され得ることを示すために十分な詳細を提供する。
と結合するタンパク質核酸分子(PNA)である(図15b)。PNA分子は、相補配列と対合することができるA塩基、T塩基、C塩基、G塩基を有するオリゴヌクレオチドと類似しているが、典型的なオリゴヌクレオチドのようなリン酸骨格の代わりに、骨格がタンパク質である。これは、リン酸骨格によって提供される負の電荷を排除し、従って、PNA分子は、相補DNA鎖に置き換わることによってdsDNAへ組み入れられ、PNA分子を包含する短いストレッチについて新しいDNA/PNAハイブリッドを作成する。実験において使用されたPNAは、配列GAA*AGT*GAA*AGT(SEQ ID NO: 1)を有していた。*は、リジンアミノ酸とのカップリングによって、PNA骨格のγ位にビオチンが組み入れられていることを示し、従って、各PNAは3個のビオチン分子を有する(PNABio)。融合分子結合足場を作出するため、60nM足場を2分間95℃に加熱し、60℃に冷却し、1時間、15mM NaClにおいて、可能な結合部位に対して10倍過剰のPNAと共にインキュベートし、次いで、4℃に冷却する。過剰のPNAを、10mMトリスpH8.0に対して2時間透析する(20k MWCO、Thermo Scientific)。次いで、このDNA/PNA複合体を、(透析におけるPNAの60%の低下を仮定して)可能なビオチン部位に対して10倍過剰のニュートラアビジンタンパク質(Pierce/Thermo Scientific)によって標識する。純度、濃度、および可能性のある凝集を査定するため、上記のように、反応物を電気泳動にかける。この試薬、DNA/PNA/ニュートラアビジン(D/P/N)は、使用まで-20℃で保管される。
Claims (23)
- 以下の工程を含む、試料中に存在すると推測される標的分子または標的粒子を検出する方法:
(a)標的分子または標的粒子がリガンドに結合し、結合ドメインが結合モチーフに結合することを可能にする条件の下で、(i)標的分子または標的粒子に結合することができるリガンドと結合ドメインとを含む融合分子および(ii)該結合ドメインが結合することができる少なくとも一つの結合モチーフを含むポリマー足場と、試料を接触させる工程;
(b)装置の内部空間を二つのボリュームへ分離する孔を含み、孔を通過する物体を同定するよう構成されたセンサーを含む装置へ、ポリマー足場を負荷し、融合分子に結合したポリマー足場を孔を通して一方のボリュームから他方のボリュームへ通過させるよう装置を構成する工程;ならびに
(c)センサーによって、結合モチーフに結合した融合分子が標的分子または標的粒子に結合しているか否かを決定し、それによって、試料中の標的分子または標的粒子の存在を検出する工程。 - 標的分子が、タンパク質、ペプチド、核酸、化学化合物、イオン、および元素からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 標的粒子が、タンパク質複合体または凝集物、タンパク質/核酸複合体、断片化されたまたは完全に集合したウイルス、細菌、細胞、および細胞凝集物からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)が工程(b)の前に実施される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)が工程(a)の前に実施される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子または標的粒子とリガンドとの間の結合を改変すると推測される条件を適用し、決定を再び実施する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記条件が、試料からの標的分子または標的粒子の除去、標的分子もしくは標的粒子またはリガンドと結合について競合する薬剤の添加、およびpH、塩、または温度の変化からなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- 結合モチーフが結合ドメインとの結合のための化学的修飾を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 化学的修飾が、アセチル化、メチル化、SUMO化(summolation)、グリコシル化、リン酸化、および酸化からなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- ポリマー足場が、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ペプチド核酸(PNA)、DNA/RNAハイブリッド、およびポリペプチドのうちの少なくとも一つである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 結合ドメインが、ヘリックスターンヘリックス、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ウイングドヘリックス、ウイングドヘリックスターンヘリックス、ヘリックスループヘリックス、およびHMG(high mobility group)ボックスからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 結合ドメインが、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)、デンドリマー、ペプチド、およびアプタマーからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- リガンドが、抗体、抗体断片、エピトープ、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、増殖因子、細胞認識分子、核酸、ペプチド、アプタマー、および受容体からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 結合ドメインおよびリガンドが、融合分子を形成するため、共有結合、水素結合、イオン結合、金属結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、および平面スタッキング相互作用からなる群より選択される相互作用を介して連結されているか、または連続的なポリペプチドとして翻訳されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子もしくは標的粒子または標的分子もしくは標的粒子/リガンド複合体に結合することができる検出可能標識と試料を接触させる工程をさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリマー足場が少なくとも2単位の結合モチーフを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリマー足場が少なくとも2種の異なる結合モチーフを含み;少なくとも2種の異なる結合モチーフのうちの異なる1種に結合することができる異なる結合ドメインと、異なる標的分子または標的粒子に結合することができる異なるリガンドとを各々が含む少なくとも2種の融合分子に、試料が接触し;各結合モチーフに結合した融合分子が標的分子または標的粒子に結合しているか否かを同定するよう、センサーが構成される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 二つのボリュームの間に電位差を印加し、孔を通る電流を測定するよう、さらに構成された電極を、センサーが含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 装置が、上チャンバー、中央チャンバー、および下チャンバーを含み、
上チャンバーが第1の孔を通して中央チャンバーと連絡しており、中央チャンバーが第2の孔を通して下チャンバーと連絡しており;
第1の孔および第2の孔が、直径約1nm〜約100nmであり、相互に約10nm〜約1000nm離れており;
チャンバーの各々が電源との接続のための電極を含む、
請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。 - 各結合モチーフに結合した融合分子が標的分子または標的粒子に結合しているか否かを再び同定するように、結合モチーフが孔を通過した後、ポリマー足場を逆方向に移動させる工程をさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 以下のものを含む、標的分子または標的粒子の存在を検出するためのキット、パッケージ、または混合物:
(a)標的分子または標的粒子に結合することができるリガンドと結合ドメインとを含む融合分子;
(b)結合ドメインが結合することができる少なくとも一つの結合モチーフを含むポリマー足場;および
(c)装置の内部空間を二つのボリュームへ分離する孔を含み、融合分子に結合したポリマー足場を孔を通して一方のボリュームから他方のボリュームへ通過させるよう構成されており、(i)結合モチーフが融合分子に結合しており、リガンドが標的分子もしくは標的粒子に結合しているか、(ii)結合モチーフが融合分子に結合しており、リガンドが標的分子もしくは標的粒子に結合していないか、または(iii)結合モチーフが融合分子に結合していないかを同定するよう構成された、孔に隣接したセンサーをさらに含む装置。 - 標的分子または標的粒子を含有していると推測される試料をさらに含む、請求項21に記載のキット、パッケージ、または混合物。
- 試料が、標的分子もしくは標的粒子または標的分子もしくは標的粒子/リガンド複合体に結合することができる検出可能標識をさらに含む、請求項22に記載のキット、パッケージ、または混合物。
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