JP6532058B2 - Blood marker for detecting uterine sarcoma, kit for detecting uterine sarcoma, and method for acquiring data for diagnosing uterine sarcoma - Google Patents
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本発明は、子宮肉腫検出用血液マーカー、子宮肉腫検出用キット、および、子宮肉腫診断のためのデータの取得方法に関する。 The present invention relates to a blood marker for detecting uterine sarcoma, a kit for detecting uterine sarcoma, and a method for obtaining data for diagnosing uterine sarcoma.
良性腫瘍である子宮筋腫と、悪性腫瘍である子宮肉腫とでは、治療方法が異なる。例えば、子宮筋腫は、成人女性１０万人あたり約３万人に見出される良性腫瘍であって、投薬によって治療され得、症状によっては経過観察されることもある。一方、子宮肉腫は、成人女性１０万人あたり約２人に見出される悪性腫瘍であって、転移等を生じて予後が悪く、早期に摘出する必要がある。それ故に、患者が子宮筋腫または子宮肉腫の何れを患っているのか早期に鑑別して、治療の初期段階にて患者に適した治療方法を選択することが重要である。 The treatment methods are different for benign tumors such as uterine fibroids and malignant tumors for uterine sarcomas. For example, fibroids are benign tumors found in about 30,000 per 100,000 adult women, which can be treated by medication and may be followed up depending on the condition. On the other hand, uterine sarcoma is a malignant tumor found in about 2 of 100,000 adult females, which causes metastasis etc. and has a poor prognosis, and it is necessary to remove it early. Therefore, it is important to differentiate early whether the patient suffers from uterine fibroids or uterine sarcoma and to select a treatment method that is appropriate for the patient at the early stages of treatment.
従来から、子宮筋腫と子宮肉腫との鑑別にＭＲＩ（magnetic resonance imaging）による画像診断が用いられているが、画像診断のみでは両者の鑑別が困難な場合がある。このような場合には、患者から組織を採取して病理組織検査が行われるが、病理組織検査には、煩雑な手間と時間とを要する。また、病理組織検査は、患者から組織を採取する必要があるため、患者の体にかかる負担が大きく、発生頻度が低い子宮肉腫の検査としては現実的な検査ではない。 Conventionally, imaging diagnosis by magnetic resonance imaging (MRI) has been used to distinguish between uterine fibroids and uterine sarcoma, but discrimination between the two may be difficult by imaging alone. In such a case, a tissue is collected from a patient and histopathological examination is carried out, but histopathological examination requires complicated labor and time. In addition, since it is necessary to collect tissue from a patient, histopathology is a burden on the patient's body and is not a practical inspection as a test for uterine sarcoma that occurs less frequently.
そこで、従来から、血液中に存在する、子宮肉腫を検出するためのマーカーの探索が行われている。例えば、非特許文献１には、子宮肉腫（具体的には、uterine sarcoma）のマーカーとして、ＧＤＦ−１５（Growth differentiation factor-15）が記載されている。非特許文献２には、子宮筋腫（具体的には、uterine endometrial carcinoma）のマーカーとして、ミッドカイン（Midkine）が記載されているものの、子宮肉腫のマーカーは、記載されていない。 Therefore, conventionally, a search for a marker for detecting uterine sarcoma, which is present in blood, has been performed. For example, Non-Patent Document 1 describes GDF-15 (Growth differentiation factor-15) as a marker for uterine sarcoma (specifically, uterine sarcoma). Although non-patent document 2 describes midkine (Midkine) as a marker for uterine fibroids (specifically, uterine endometrial carcinoma), markers for uterine sarcoma are not described.
しかしながら、子宮肉腫と子宮筋腫とをより正確に鑑別するために、子宮肉腫に特異的な新たなマーカーを見出す要望があった。 However, there is a need to find new markers specific to uterine sarcomas in order to more accurately distinguish between uterine sarcomas and fibroids.
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、子宮肉腫検出用血液マーカー、子宮肉腫検出用キット、および、子宮肉腫診断のためのデータの取得方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above conventional problems, and its object is to provide a blood marker for detecting uterine sarcoma, a kit for detecting uterine sarcoma, and a method for acquiring data for diagnosing uterine sarcoma. It is.
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、子宮肉腫を患っている患者の血液では、子宮筋腫をはじめとする他の病気を患っている患者の血液と比較して、オステオポンチン蛋白質、および／または、プログラニュリン蛋白質の濃度が有意に高いことを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive investigations in view of the above problems, the present inventors found that in the blood of patients suffering from uterine sarcoma, osteopontin protein, in comparison with the blood of patients suffering from other diseases such as uterine fibroids, And / or, it has been found that the concentration of progranulin protein is significantly high, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明の子宮肉腫検出用血液マーカーは、上記課題を解決するために、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも１つの蛋白質を含んでいることを特徴としている。 That is, the blood marker for detecting uterine sarcoma according to the present invention contains at least one protein selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein in order to solve the above problems. It is characterized by
本発明の子宮肉腫検出用血液マーカーでは、上記オステオポンチン蛋白質は、以下の（１）または（２）の蛋白質であり、上記プログラニュリン蛋白質は、以下の（３）または（４）の蛋白質であり、上記ミッドカイン蛋白質は、以下の（７）または（８）の蛋白質であることが好ましい：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、オステオポンチン蛋白質としての活性を有する蛋白質；
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（４）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プログラニュリン蛋白質としての活性を有する蛋白質；
（７）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（８）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ミッドカイン蛋白質としての活性を有する蛋白質。
In the blood marker for detecting uterine sarcoma of the present invention, the above-mentioned osteopontin protein is a protein of the following (1) or (2), and the above progranin protein is a protein of the following (3) or (4): The above midkine protein is preferably a protein of the following (7) or (8):
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(2) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having activity as an osteopontin protein ;
(3) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, one or several amino acids consist of the amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and the activity as progranulin protein Having protein;
(7) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7;
(8) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, one or several amino acids consist of substituted, deleted, inserted and / or added amino acid sequences, and have activity as a midkine protein protein.
本発明の子宮肉腫検出用キットは、上記課題を解決するために、オステオポンチン蛋白質と特異的に相互作用する物質、プログラニュリン蛋白質と特異的に相互作用する物質、および、ミッドカイン蛋白質と特異的に相互作用する物質からなる群より選択される少なくとも１つの物質を備えていることを特徴としている。 The kit for detecting uterine sarcoma of the present invention is a substance that specifically interacts with osteopontin protein, a substance that specifically interacts with progranulin protein, and a specific substance with midkine protein in order to solve the above problems. And at least one substance selected from the group consisting of substances that interact with.
本発明の子宮肉腫検出用キットでは、上記オステオポンチン蛋白質と特異的に相互作用する物質が、抗オステオポンチン抗体であり、上記プログラニュリン蛋白質と特異的に相互作用する物質が、抗プログラニュリン抗体であり、上記ミッドカイン蛋白質と特異的に相互作用する物質が、抗ミッドカイン抗体であることが好ましい。 In the kit for detecting uterine sarcoma of the present invention, the substance that specifically interacts with the osteopontin protein is an anti-osteopontin antibody, and the substance that interacts specifically with the progranulin protein is an anti-progranin antibody. It is preferable that the substance that specifically interacts with the midkine protein is an anti-midkine antibody.
本発明の子宮肉腫検出用キットでは、上記オステオポンチン蛋白質は、以下の（１）または（２）の蛋白質であり、上記プログラニュリン蛋白質は、以下の（３）または（４）の蛋白質であり、上記ミッドカイン蛋白質は、以下の（７）または（８）の蛋白質であることが好ましい：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、オステオポンチン蛋白質としての活性を有する蛋白質；
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（４）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プログラニュリン蛋白質としての活性を有する蛋白質；
（７）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（８）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ミッドカイン蛋白質としての活性を有する蛋白質。
In the kit for detecting uterine sarcoma of the present invention, the osteopontin protein is the following protein (1) or (2), and the progranulin protein is the protein (3) or (4) below: The midkine protein is preferably a protein of the following (7) or (8):
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(2) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having activity as an osteopontin protein ;
(3) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, one or several amino acids consist of the amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and the activity as progranulin protein Having protein;
(7) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7;
(8) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, one or several amino acids consist of substituted, deleted, inserted and / or added amino acid sequences, and have activity as a midkine protein protein.
本発明の子宮肉腫診断のためのデータの取得方法は、上記課題を解決するために、生体から取得された血液中の、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも１つの蛋白質を検出する検出工程を有することを特徴としている。 The method for acquiring data for diagnosing uterine sarcoma according to the present invention is selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein in blood obtained from a living body, in order to solve the above problems. And at least one protein is detected.
本発明の子宮肉腫診断のためのデータの取得方法では、上記オステオポンチン蛋白質は、以下の（１）または（２）の蛋白質であり、上記プログラニュリン蛋白質は、以下の（３）または（４）の蛋白質であり、上記ミッドカイン蛋白質は、以下の（７）または（８）の蛋白質であることが好ましい：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、オステオポンチン蛋白質としての活性を有する蛋白質；
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（４）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プログラニュリン蛋白質としての活性を有する蛋白質；
（７）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（８）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ミッドカイン蛋白質としての活性を有する蛋白質。
In the method for acquiring data for diagnosing uterine sarcoma according to the present invention, the above-mentioned osteopontin protein is a protein of the following (1) or (2), and the above-mentioned progranulin protein is a following (3) or (4) Preferably, the midkine protein is a protein of the following (7) or (8):
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(2) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having activity as an osteopontin protein ;
(3) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, one or several amino acids consist of the amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and the activity as progranulin protein Having protein;
(7) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7;
(8) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, one or several amino acids consist of substituted, deleted, inserted and / or added amino acid sequences, and have activity as a midkine protein protein.
本発明であれば、新たな子宮肉腫検出用血液マーカーを用いるので、従来よりも正確に子宮肉腫を診断できる。 According to the present invention, since a new blood marker for detecting uterine sarcoma is used, uterine sarcoma can be diagnosed more accurately than conventional.
本発明であれば、生体から取得された血液を用いるので、子宮肉腫を容易かつ短時間で診断することができる。 According to the present invention, since blood obtained from a living body is used, uterine sarcoma can be diagnosed easily and in a short time.
本発明であれば、患者から病理組織を採取する必要が無いので、患者の体にかかる負担を軽減することができる。 According to the present invention, since it is not necessary to collect pathological tissue from the patient, the burden on the patient's body can be reduced.
本発明であれば、簡便に子宮肉腫を診断できるので、多くの人を対象とした子宮肉腫の検診を普及させることができる。 According to the present invention, since uterine sarcoma can be easily diagnosed, it is possible to spread the examination of uterine sarcoma for many people.
本発明であれば、簡便に子宮肉腫を診断できるので、子宮肉腫の早期発見を可能とし、これによって、子宮肉腫による死亡率を低下させることができる。 According to the present invention, since uterine sarcoma can be easily diagnosed, early detection of uterine sarcoma is possible, thereby reducing the mortality rate due to uterine sarcoma.
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。 Although one embodiment of the present invention is described below, the present invention is not limited to this. The present invention is not limited to the configurations described below, and various modifications can be made within the scope of the claims, and technical means disclosed in different embodiments and examples can be used. Embodiments and examples obtained by combining as appropriate are also included in the technical scope of the present invention. Also, all the academic and patent documents described in the present specification are incorporated herein by reference. Moreover, unless otherwise specified in the present specification, “A to B” representing a numerical range intends “A or more and B or less”.
〔１．子宮肉腫検出用血液マーカー〕
本実施の形態の「子宮肉腫検出用血液マーカー」は、「子宮肉腫検出用血清マーカー」であってもよいし、「子宮肉腫検出用血清腫瘍マーカー」であってもよい。
[1. Blood marker for uterine sarcoma detection]
The “blood marker for detecting uterine sarcoma” in the present embodiment may be “serum marker for detecting uterine sarcoma” or “serum tumor marker for detecting uterine sarcoma”.
本明細書において「子宮肉腫検出用血液マーカー」とは、子宮肉腫を検出するために用いられる「血液マーカー」を意図し、「血液マーカー」とは、血液を試料として用いた検査によって被検体中の特定の病気を検出できる「マーカー」を意図し、「マーカー」とは、試料中のマーカーの有無、濃度、変異の状況などを検出することによって、被検体が特定の病気を患っているか否か判定し得る物質を意図する。 The term "blood marker for detecting uterine sarcoma" as used herein is intended to mean "blood marker" used to detect uterine sarcoma, and "blood marker" means a test using blood as a sample. Intended as a “marker” that can detect a specific disease of a subject, the “marker” refers to whether or not a subject suffers from a specific disease by detecting the presence or absence of a marker in a sample, its concentration, the status of mutation, etc. Intended for substances that can be determined.
本明細書において「子宮肉腫検出用血清マーカー」とは、子宮肉腫を検出するために用いられる「血清マーカー」を意図し、「血清マーカー」とは、血清または血漿を試料として用いた検査によって被検体中の特定の病気を検出できる「マーカー」を意図し、「マーカー」とは、試料中のマーカーの有無、濃度、変異の状況などを検出することによって、被検体が特定の病気を患っているか否か判定し得る物質を意図する。 In the present specification, "serum marker for detecting uterine sarcoma" means "serum marker" used to detect uterine sarcoma, and "serum marker" means a subject using a test using serum or plasma as a sample. Intended as a "marker" that can detect a specific disease in a sample, the "marker" means that the subject suffers from a specific disease by detecting the presence or absence of the marker in the sample, the concentration, the status of mutation, etc. Intended for substances that can be judged whether they are present or not.
本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、オステオポンチン（Osteopontin）蛋白質、プログラニュリン（Progranulin）蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも１つの蛋白質を含んでいる。 The blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment includes at least one protein selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein.
本発明者は、子宮肉腫を患う患者では、子宮筋腫などの他の病気を患う患者と比較して、血液中におけるオステオポンチン蛋白質、および／または、プログラニュリン蛋白質、および／または、ミッドカイン蛋白質の濃度が高いことを見出した。そして、本発明者は、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質を、子宮肉腫を特異的に検出するためのマーカーとして利用し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーを、子宮肉腫検出のポジティブコントロール（例えば、後述するイムノアッセイ法、または、ウエスタンブロット法のポジティブコントロール）として利用すれば、高い特異性をもって子宮肉腫を検出することができる。 The inventor has found that in patients suffering from uterine sarcoma, osteopontin protein and / or progranulin protein and / or midkine protein in blood, as compared to patients suffering from other diseases such as uterine fibroids. It was found that the concentration was high. The present inventors have found that osteopontin protein, progranulin protein and midkine protein can be used as markers for specifically detecting uterine sarcoma, and have completed the present invention. If the blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment is used as a positive control for detecting uterine sarcoma (for example, an immunoassay method described later or a positive control for Western blotting), uterine sarcoma is detected with high specificity. be able to.
子宮肉腫を患っている患者は、ｉ）血液中におけるオステポンチン蛋白質の濃度が高い患者、ｉｉ）血液中におけるプログラニュリン蛋白質の濃度が高い患者、ｉｉｉ）血液中におけるミッドカイン蛋白質の濃度が高い患者、ｉｖ）血液中におけるオステポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも２つの蛋白質の濃度が高い患者、に大別することができる。 Patients suffering from uterine sarcoma: i) patients with high concentration of ostepontin protein in blood, ii) patients with high concentration of progranulin protein in blood, iii) patients with high concentration of midkine protein in blood Iv) It can be roughly divided into patients with high concentrations of at least two proteins selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein and midkine protein in blood.
それ故に、より精度高く子宮肉腫を検出するという観点から、本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、オステポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される２つの蛋白質を含んでいることが好ましく、３つの蛋白質を含んでいることが更に好ましい。 Therefore, from the viewpoint of detecting uterine sarcoma with higher accuracy, the blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment is two selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein and midkine protein. It preferably contains a protein, and more preferably contains three proteins.
ヒトのオステオポンチンについては、既に、蛋白質のアミノ酸配列、および、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列が、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている。より具体的に、蛋白質のアミノ酸配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２３８７５９として登録されており、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２５１８３０として登録されている。 For human osteopontin, the amino acid sequence of a protein and the nucleotide sequence of cDNA (mRNA) have already been registered in GeneBank. More specifically, the amino acid sequence of the protein is as described in Accession No. The nucleotide sequence of cDNA (mRNA), which is registered as NP 001238759, is disclosed in Accession No. It is registered as NM_001251830.
ヒトのオステオポンチンについて、蛋白質の具体的なアミノ酸配列を配列番号１にて示し、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の具体的な塩基配列を配列番号２に示す。 For human osteopontin, the specific amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 1, and the specific base sequence of cDNA (mRNA) is shown in SEQ ID NO: 2.
本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、配列番号１に示されるオステオポンチン蛋白質を含んでいてもよいし、配列番号１に示されるオステオポンチン蛋白質の変異体を含んでいてもよい。すなわち、本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、ヒトのオステオポンチン蛋白質に変異が生じた変異蛋白質を含んでいてもよいし、ヒト以外の生物種のオステオポンチン蛋白質や、当該オステオポンチン蛋白質に変異が生じた変異蛋白質を含んでいてもよい。 The blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment may contain the osteopontin protein shown in SEQ ID NO: 1, or may contain a variant of the osteopontin protein shown in SEQ ID NO: 1. That is, the blood marker for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment may contain a mutant protein in which a human osteopontin protein is mutated, or a mutation in an osteopontin protein of a species other than human or the osteopontin protein. It may contain the resulting mutant protein.
より具体的に、本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーに含まれるオステオポンチン蛋白質は、以下の（１）または（２）の蛋白質であってもよい。つまり、
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、オステオポンチン蛋白質としての活性を有する蛋白質。
More specifically, the osteopontin protein contained in the blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment may be the following protein (1) or (2). In other words,
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(2) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having activity as an osteopontin protein .
なお、オステオポンチン蛋白質は、従来から細胞増殖活性、および、細胞運動促進活性などを有していることが知られている。周知の方法にしたがって、任意の蛋白質のこれらの活性を測定し、任意の蛋白質がこれらの活性を有していれば、当該蛋白質を、オステオポンチン蛋白質としての活性を有する蛋白質と判定することができる。 The osteopontin protein is conventionally known to have cell proliferation activity, cell movement promoting activity and the like. According to a known method, these activities of any protein can be measured, and if any protein has these activities, it can be determined that the protein has an activity as an osteopontin protein.
子宮肉腫を患っている患者では、血液中におけるオステオポンチン蛋白質の濃度が、略３，０００ｐｇ／ｍＬ以上になっており、当該数値を基準として、子宮肉腫を患っている患者と、子宮肉腫を患っていない患者とを鑑別することができる。 In patients suffering from uterine sarcoma, the concentration of osteopontin protein in blood is about 3,000 pg / mL or higher, and on the basis of this value, patients suffering from uterine sarcoma and uterine sarcoma It is possible to distinguish it from patients who do not.
つまり、被検体から取得した血液中のオステオポンチン蛋白質の濃度が３，０００ｐｇ／ｍＬ以上であれば、当該被検体は子宮肉腫を患っていると判定することができ、被検体から取得した血液中のオステオポンチン蛋白質の濃度が３，０００ｐｇ／ｍＬ未満であれば、当該被検体は子宮肉腫を患っていないと判定することができる。 That is, if the concentration of osteopontin protein in the blood obtained from the subject is 3,000 pg / mL or more, it can be determined that the subject suffers from uterine sarcoma, and the blood in the blood obtained from the subject If the concentration of osteopontin protein is less than 3,000 pg / mL, it can be determined that the subject does not suffer from uterine sarcoma.
ヒトのプログラニュリンについては、既に、蛋白質のアミノ酸配列、および、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列が、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている。より具体的に、蛋白質のアミノ酸配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００２０７８として登録されており、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２０８７として登録されている。 For human progranulin, the amino acid sequence of protein and the base sequence of cDNA (mRNA) have already been registered in GeneBank. More specifically, the amino acid sequence of the protein is as described in Accession No. The nucleotide sequence of cDNA (mRNA), which is registered as NP 002078, is as in Accession No. Registered as NM_002087.
ヒトのプログラニュリンについて、蛋白質の具体的なアミノ酸配列を配列番号３にて示し、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の具体的な塩基配列を配列番号４に示す。 For human progranulin, the specific amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 3, and the specific base sequence of the cDNA (mRNA) is shown in SEQ ID NO: 4.
本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、配列番号３に示されるプログラニュリン蛋白質を含んでいてもよいし、配列番号３に示されるプログラニュリン蛋白質の変異体を含んでいてもよい。すなわち、本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、ヒトのプログラニュリン蛋白質に変異が生じた変異蛋白質を含んでいてもよいし、ヒト以外の生物種のプログラニュリン蛋白質や、当該プログラニュリン蛋白質に変異が生じた変異蛋白質を含んでいてもよい。 The blood marker for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment may contain progranulin protein shown in SEQ ID NO: 3 or may contain a variant of progranulin protein shown in SEQ ID NO: 3 . That is, the blood marker for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment may contain a mutated protein in which a human progranulin protein is mutated, or a progranulin protein of a species other than human, or the program. It may contain a mutated protein in which a mutation occurs in the nurin protein.
より具体的に、本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーに含まれるプログラニュリン蛋白質は、以下の（３）または（４）の蛋白質であってもよい。つまり、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（４）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プログラニュリン蛋白質としての活性を有する蛋白質。
More specifically, the progranulin protein included in the blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment may be the following protein (3) or (4). In other words,
(3) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
(4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, one or several amino acids consist of the amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and the activity as progranulin protein Protein with.
なお、プログラニュリン蛋白質は、従来から成長因子様の作用、炎症反応性、および、細胞遊走性などを有していることが知られている。周知の方法にしたがって、任意の蛋白質のこれらの活性を測定し、任意の蛋白質がこれらの活性を有していれば、当該蛋白質を、プログラニュリン蛋白質としての活性を有する蛋白質と判定することができる。 The progranulin protein is conventionally known to have a growth factor-like action, inflammatory reactivity, cell migration and the like. According to a known method, the activity of any protein is measured, and if any protein has these activities, the protein is determined to be a protein having activity as a progranulin protein. it can.
子宮肉腫を患っている患者では、血液中におけるプログラニュリン蛋白質の濃度が、略１２，０００ｐｇ／ｍＬ以上になっており、当該数値を基準として、子宮肉腫を患っている患者と、子宮肉腫を患っていない患者とを鑑別することができる。 In patients suffering from uterine sarcoma, the concentration of progranulin protein in the blood is about 12,000 pg / mL or higher, and based on the said value, patients suffering from uterine sarcoma and uterine sarcoma It can be distinguished from patients who do not suffer.
つまり、被検体から取得した血液中のプログラニュリン蛋白質の濃度が１２，０００ｐｇ／ｍＬ以上であれば、当該被検体は子宮肉腫を患っていると判定することができ、被検体から取得した血液中のプログラニュリン蛋白質の濃度が１２，０００ｐｇ／ｍＬ未満であれば、当該被検体は子宮肉腫を患っていないと判定することができる。 That is, if the concentration of progranulin protein in blood obtained from the subject is 12,000 pg / mL or more, it can be determined that the subject suffers from uterine sarcoma, and the blood obtained from the subject If the concentration of progranulin protein in it is less than 12,000 pg / mL, it can be determined that the subject does not have uterine sarcoma.
ヒトのミッドカインについては、既に、蛋白質のアミノ酸配列、および、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列が、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている。より具体的に、蛋白質のアミノ酸配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０１２３３３として登録されており、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０１２３３３として登録されている。 For human midkine, the amino acid sequence of a protein and the base sequence of cDNA (mRNA) have already been registered in GeneBank. More specifically, the amino acid sequence of the protein is as described in Accession No. The nucleotide sequence of cDNA (mRNA), which is registered as NP — 001012333, is the accession No. It is registered as NM_001012333.
ヒトのミッドカインについて、蛋白質の具体的なアミノ酸配列を配列番号７にて示し、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の具体的な塩基配列を配列番号８に示す。 The specific amino acid sequence of the protein for human midkine is shown in SEQ ID NO: 7, and the specific base sequence of cDNA (mRNA) is shown in SEQ ID NO: 8.
本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、配列番号７に示されるミッドカイン蛋白質を含んでいてもよいし、配列番号７に示されるミッドカイン蛋白質の変異体を含んでいてもよい。すなわち、本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、ヒトのミッドカイン蛋白質に変異が生じた変異蛋白質を含んでいてもよいし、ヒト以外の生物種のミッドカイン蛋白質や、当該ミッドカイン蛋白質に変異が生じた変異蛋白質を含んでいてもよい。 The blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment may contain the midkine protein shown in SEQ ID NO: 7 or may contain a variant of the midkine protein shown in SEQ ID NO: 7. That is, the blood marker for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment may contain a mutated protein in which human midkine protein is mutated, or a midkine protein of a species other than human or the midkine protein May contain a mutated protein which has been mutated.
より具体的に、本実施の形態の子宮肉腫検出用マーカーに含まれるミッドカイン蛋白質は、以下の（７）または（８）の蛋白質であってもよい。つまり、
（７）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（８）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ミッドカイン蛋白質としての活性を有する蛋白質。
More specifically, the midkine protein contained in the marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment may be a protein of the following (7) or (8). In other words,
(7) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7;
(8) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, one or several amino acids consist of substituted, deleted, inserted and / or added amino acid sequences, and have activity as a midkine protein protein.
なお、ミッドカイン蛋白質は、従来から、成長因子様の作用、細胞増殖活性、および、細胞運動促進活性などを有していることが知られている。周知の方法にしたがって、任意の蛋白質のこれらの活性を測定し、任意の蛋白質がこれらの活性を有していれば、当該蛋白質を、ミッドカイン蛋白質としての活性を有する蛋白質と判定することができる。 Midkine proteins are conventionally known to have growth factor-like actions, cell proliferation activities, cell movement promoting activities, and the like. According to a known method, these activities of any protein can be measured, and if any protein has these activities, the protein can be determined as a protein having an activity as a midkine protein .
子宮肉腫を患っている患者では、血液中におけるミッドカイン蛋白質の濃度が、略２，０００ｐｇ／ｍＬ以上になっており、当該数値を基準として、子宮肉腫を患っている患者と、子宮肉腫を患っていない患者とを鑑別することができる。 In patients suffering from uterine sarcoma, the concentration of midkine protein in blood is approximately 2,000 pg / mL or higher, and on the basis of this value, patients suffering from uterine sarcoma and uterine sarcoma Can be distinguished from patients who are not
つまり、被検体から取得した血液中のミッドカイン蛋白質の濃度が２，０００ｐｇ／ｍＬ以上であれば、当該被検体は子宮肉腫を患っていると判定することができ、被検体から取得した血液中のミッドカイン蛋白質の濃度が２，０００ｐｇ／ｍＬ未満であれば、当該被検体は子宮肉腫を患っていないと判定することができる。 That is, if the concentration of midkine protein in blood obtained from the subject is 2,000 pg / mL or more, it can be determined that the subject suffers from uterine sarcoma, and the blood in the blood obtained from the subject If the concentration of midkine protein is less than 2,000 pg / mL, it can be determined that the subject does not have uterine sarcoma.
本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、上述した３つの蛋白質に加えて、更に、ＧＤＦ−１５（Growth differentiation factor-15）蛋白質を含んでいることが好ましい。子宮肉腫を患う患者では、血液中におけるＧＤＦ−１５蛋白質の濃度が高い。それ故に、当該構成であれば、更に精度高く子宮肉腫を検出することができる。 The blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment preferably further includes GDF-15 (Growth differentiation factor-15) protein in addition to the three proteins described above. Patients with uterine sarcoma have high levels of GDF-15 protein in the blood. Therefore, with this configuration, uterine sarcoma can be detected with higher accuracy.
ヒトのＧＤＦ−１５については、既に、蛋白質のアミノ酸配列、および、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列が、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている。より具体的に、蛋白質のアミノ酸配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００４８５５として登録されており、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００４８６４として登録されている。 For human GDF-15, the amino acid sequence of a protein and the base sequence of cDNA (mRNA) have already been registered in GeneBank. More specifically, the amino acid sequence of the protein is as described in Accession No. The nucleotide sequence of cDNA (mRNA), which is registered as NP_004855, is disclosed in Accession No. Registered as NM_004864.
ヒトのＧＤＦ−１５について、蛋白質の具体的なアミノ酸配列を配列番号５にて示し、ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の具体的な塩基配列を配列番号６に示す。 For human GDF-15, the specific amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO: 5, and the specific base sequence of cDNA (mRNA) is shown in SEQ ID NO: 6.
本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、配列番号５に示されるＧＤＦ−１５蛋白質を含んでいてもよいし、配列番号５に示されるＧＤＦ−１５蛋白質の変異体を含んでいてもよい。すなわち、本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーは、ヒトのＧＤＦ−１５蛋白質に変異が生じた変異蛋白質を含んでいてもよいし、ヒト以外の生物種のＧＤＦ−１５蛋白質や、当該ＧＤＦ−１５蛋白質に変異が生じた変異蛋白質を含んでいてもよい。 The blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment may contain the GDF-15 protein shown in SEQ ID NO: 5 or may contain the variant of the GDF-15 protein shown in SEQ ID NO: 5 . That is, the blood marker for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment may contain a mutant protein in which a human GDF-15 protein is mutated, or a GDF-15 protein of a species other than human, or the GDF It may contain a mutant protein in which a mutation occurs in -15 protein.
より具体的に、本実施の形態の子宮肉腫検出用血液マーカーに含まれるＧＤＦ−１５蛋白質は、以下の（５）または（６）の蛋白質であってもよい。つまり、
（５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（６）配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＤＦ−１５蛋白質としての活性を有する蛋白質。
More specifically, the GDF-15 protein contained in the blood marker for detecting uterine sarcoma of the present embodiment may be the following protein (5) or (6). In other words,
(5) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5;
(6) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, one or several amino acids consist of the amino acid sequence substituted, deleted, inserted and / or added, and the activity as GDF-15 protein is Protein with.
なお、ＧＤＦ−１５蛋白質は、従来から成長因子様の作用、細胞の増殖能、および、細胞の分化能などを有していることが知られている。周知の方法にしたがって、任意の蛋白質のこれらの活性を測定し、任意の蛋白質がこれらの活性を有していれば、当該蛋白質を、ＧＤＦ−１５蛋白質としての活性を有する蛋白質と判定することができる。 In addition, GDF-15 protein is conventionally known to have a growth factor-like action, cell proliferation ability, cell differentiation ability and the like. According to a known method, the activity of any protein is measured, and if any protein has these activities, the protein is determined as a protein having an activity as a GDF-15 protein. it can.
子宮肉腫を患っている患者では、血液中におけるＧＤＦ−１５蛋白質の濃度が、略３００ｐｇ／ｍＬ以上になっており、当該数値を基準として、子宮肉腫を患っている患者と、子宮肉腫を患っていない患者とを鑑別することができる。 In patients suffering from uterine sarcoma, the concentration of GDF-15 protein in blood is about 300 pg / mL or higher, and on the basis of the said value, patients suffering from uterine sarcoma and uterine sarcoma It is possible to distinguish it from patients who do not.
つまり、被検体から取得した血液中のＧＤＦ−１５蛋白質の濃度が３００ｐｇ／ｍＬ以上であれば、当該被検体は子宮肉腫を患っていると判定することができ、被検体から取得した血液中のＧＤＦ−１５蛋白質の濃度が３００ｐｇ／ｍＬ未満であれば、当該被検体は子宮肉腫を患っていないと判定することができる。 That is, if the concentration of GDF-15 protein in the blood obtained from the subject is 300 pg / mL or more, it can be determined that the subject suffers from uterine sarcoma, and the blood in the blood obtained from the subject If the concentration of GDF-15 protein is less than 300 pg / mL, it can be determined that the subject does not have uterine sarcoma.
本明細書において「１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、特に限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異蛋白質作製法により、置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは９個以下、より好ましくは８個以下、より好ましくは７個以下、より好ましくは６個以下、より好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、最も好ましくは１個以下）のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意図する。
〔２．子宮肉腫診断のためのデータの取得方法〕
本実施の形態の子宮肉腫診断のためのデータの取得方法は、生体から取得された血液中の、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも１つの蛋白質を検出する検出工程を有している。より精度高いデータを取得するという観点から、検出工程では、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される２つの蛋白質を検出することが好ましく、３つの蛋白質を検出することが更に好ましい。
In the present specification, "one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added" is not particularly limited, but known sites such as site-directed mutagenesis The number of mutations (preferably 10 or less, more preferably 9 or less, more preferably 8 or less, more preferably 7 or less) that can be substituted, deleted, inserted and / or added according to the method for producing a mutant protein of More preferably, 6 or less, more preferably 5 or less, more preferably 4 or less, more preferably 3 or less, more preferably 2 or less, most preferably 1 or less) amino acids are substituted or deleted , Intended to be inserted and / or added.
[2. Method of acquiring data for uterine sarcoma diagnosis]
The method of acquiring data for diagnosing uterine sarcoma according to the present embodiment is at least one protein selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein in blood obtained from a living body Detection step of detecting From the viewpoint of acquiring more accurate data, in the detection step, it is preferable to detect two proteins selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein, and three proteins are detected. It is more preferable to do.
子宮肉腫を患う患者では、血液中におけるオステオポンチン蛋白質、および／または、プログラニュリン蛋白質、および／または、ミッドカイン蛋白質の濃度が高い。それ故に、被検体から取得された血液中の、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも１つの蛋白質を検出することによって、子宮肉腫診断のための精度の高いデータを取得することができる。 Patients suffering from uterine sarcoma have high concentrations of osteopontin protein and / or progranulin protein and / or midkine protein in the blood. Therefore, accuracy for diagnosing uterine sarcoma by detecting at least one protein selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein in blood obtained from a subject High data can be obtained.
被検体から取得された血液中の、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも１つの蛋白質の量が、健常者や、子宮筋腫などの他の病気を患っている患者から取得された血液中のこれらの蛋白質の量よりも相対的に多ければ、被検体が子宮肉腫を患っていると判断することができる。 The amount of at least one protein selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein in the blood obtained from the subject may be normal subjects or other diseases such as fibroids. If the amount of these proteins in the blood obtained from the afflicted patient is relatively large, it can be determined that the subject suffers from uterine sarcoma.
あるいは、被検体から取得された血液中における、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも１つの蛋白質の濃度が、カットオフ値（オステオポンチン蛋白質のカットオフ値：略３，０００ｐｇ／ｍＬ、プログラニュリン蛋白質のカットオフ値：略１２，０００ｐｇ／ｍＬ、ミッドカイン蛋白質のカットオフ値：略２，０００ｐｇ／ｍＬ）以上であれば、被検体が子宮肉腫を患っていると判断することができる。逆に、被検体から取得された血液中における、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも１つの蛋白質の濃度が、上述したカットオフ値未満であれば、被検体は子宮肉腫を患っていないと判断することができる。 Alternatively, the concentration of at least one protein selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein in the blood obtained from the subject is a cutoff value (osteopontin protein cutoff value If the value is approximately 3,000 pg / mL, the cutoff value of progranulin protein: approximately 12,000 pg / mL, the cutoff value of midkine protein: approximately 2,000 pg / mL), the subject has uterine sarcoma It can be judged that he is suffering. Conversely, if the concentration of at least one protein selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein in blood obtained from the subject is less than the above-mentioned cutoff value The subject can be determined not to have uterine sarcoma.
それ故に、検出工程では、生体から取得された血液中の、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質からなる群より選択される少なくとも１つの蛋白質の量を検出してもよいし、これらの蛋白質の血中濃度（または、血清中の濃度）を検出してもよい。 Therefore, in the detection step, the amount of at least one protein selected from the group consisting of osteopontin protein, progranulin protein, and midkine protein in blood obtained from a living body may be detected. The blood levels (or serum levels) of these proteins may be detected.
検出工程では、上述した３つの蛋白質に加えて、生体から取得された血液中の、ＧＤＦ−１５蛋白質を検出することが更に好ましい。 In the detection step, it is further preferable to detect the GDF-15 protein in blood obtained from a living body, in addition to the three proteins mentioned above.
子宮肉腫を患う患者では、上述した３つの蛋白質に加えて、血液中におけるＧＤＦ−１５蛋白質の濃度が高い。それ故に、被検体から取得された血液中の、ＧＤＦ−１５蛋白質を検出することによって、子宮肉腫診断のための更に精度の高いデータを取得することができる。 In patients with uterine sarcoma, in addition to the three proteins mentioned above, the concentration of GDF-15 protein in blood is high. Therefore, more accurate data for uterine sarcoma diagnosis can be obtained by detecting GDF-15 protein in blood obtained from a subject.
被検体から取得された血液中の、ＧＤＦ−１５蛋白質の量が、健常者や、子宮筋腫などの他の病気を患っている患者から取得された血液中のこれらの蛋白質の量よりも相対的に多ければ、被検体が子宮肉腫を患っていると、更に精度高く判断することができる。 The amount of GDF-15 protein in the blood obtained from the subject is relative to the amount of these proteins in the blood obtained from a healthy subject or a patient suffering from another disease such as uterine fibroid If there are many, it can be judged with high accuracy that the subject suffers from uterine sarcoma.
あるいは、被検体から取得された血液中における、ＧＤＦ−１５蛋白質の濃度が、カットオフ値（ＧＤＦ−１５のカットオフ値：略３００ｐｇ／ｍＬ）以上であれば、被検体が子宮肉腫を患っていると、更に精度高く判断することができる。逆に、被検体から取得された血液中における、ＧＤＦ−１５蛋白質の濃度が、上述したカットオフ値未満であれば、被検体は子宮肉腫を患っていないと判断することができる。 Alternatively, the subject suffers from uterine sarcoma if the concentration of GDF-15 protein in blood obtained from the subject is equal to or higher than the cutoff value (cutoff value of GDF-15: about 300 pg / mL) It is possible to judge with higher accuracy. Conversely, if the concentration of GDF-15 protein in blood obtained from the subject is less than the above-mentioned cutoff value, it can be determined that the subject does not suffer from uterine sarcoma.
それ故に、検出工程では、生体から取得された血液中の、ＧＤＦ−５蛋白質の量を検出してもよいし、当該蛋白質の血中濃度（または、血清中の濃度）を検出してもよい。 Therefore, in the detection step, the amount of GDF-5 protein may be detected in blood obtained from a living body, or the blood concentration (or concentration in serum) of the protein may be detected. .
本実施の形態の子宮肉腫診断のためのデータの取得方法に用いる血液は、血清であってもよい。なお、血清を調製する場合には、被検体から血液を取得し、当該血液を遠心分離にかけ、遠心分離によって分離した上清を血清として取得すればよい。また、当該血液を取得する生体は、特に限定されず、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳類を挙げることができる。 The blood used in the method of acquiring data for diagnosing uterine sarcoma of the present embodiment may be serum. In the case of preparing serum, blood may be obtained from a subject, centrifuged, and the supernatant separated by centrifugation may be obtained as serum. Further, the living body from which the blood is obtained is not particularly limited, and examples thereof include mammals such as humans, dogs, cats, sheep, goats, mice, rats, rabbits, cows, horses, and pigs.
検出工程にて、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、ＧＤＦ−１５蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質を検出する場合には、オステオポンチン蛋白質と特異的に相互作用する物質（例えば、抗オステオポンチン抗体、または、オステオポンチン結合蛋白質（例えば、インテグリン（例えば、αｖβ３、α５β１、α８β１、αｖβ１、αｖβ５）））、プログラニュリン蛋白質と特異的に相互作用する物質（例えば、抗プログラニュリン抗体、または、プログラニュリン結合蛋白質（例えば、ソルチリン、腫瘍壊死因子受容体Ｔｏｌｌ様受容体−９））、ＧＤＦ−１５蛋白質と特異的に相互作用する物質（例えば、抗ＧＤＦ−１５抗体、または、ＧＤＦ−１５結合蛋白質（例えば、トランスフォーミング増殖因子受容体））、および、ミッドカイン蛋白質と特異的に相互作用する物質（例えば、抗ミッドカイン抗体、または、ミッドカイン結合蛋白質（例えば、プロテオグリカン、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ、low density lipoprotein receptor-related protein、anaplastic leukemia kinase、インテグリンα４β１、インテグリンα６β１、Ｎｏｔｃｈ−２））を用いればよい。 When detecting osteopontin protein, progranulin protein, GDF-15 protein, and midkine protein in the detection step, a substance that specifically interacts with osteopontin protein (for example, anti-osteopontin antibody, or osteopontin) A binding protein (eg, integrin (eg, αvβ3, α5β1, α8β1, αvβ1, αvβ5)), a substance which specifically interacts with progranulin protein (eg, anti-progranulin antibody, or progranulin binding protein) (Eg sortilin, tumor necrosis factor receptor Toll-like receptor-9), substances which specifically interact with GDF-15 protein (eg anti-GDF-15 antibody, or GDF-15 binding protein (eg Transforming growth factor receptor)), , A substance that specifically interacts with midkine protein (eg, anti-midkine antibody, or midkine binding protein (eg, proteoglycan, receptor protein tyrosine phosphatase, low density lipoprotein receptor-related protein, anaplastic leukemia kinase, integrin) α4β1, integrin α6β1, Notch-2)) may be used.
また、蛋白質の検出（より具体的に、蛋白質の血中濃度の検出）には、具体的な方法として、イムノアッセイ法（例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）、または、ＩＲＭＡ（Immunoradiometric assay）など）、または、ウエスタンブロット法を採用すればよい。より感度が高く簡便であるという観点から、上述した方法の中では、イムノアッセイ法を採用することが好ましい。以下に、これらの方法を採用する実施形態の一例を示すが、本発明は、勿論これらの例に限定されない。 In addition, for detection of protein (more specifically, detection of blood concentration of protein), as a specific method, immunoassay method (for example, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), IRMA (immunoradiometric assay), etc. Or Western blotting may be employed. Among the methods described above, it is preferable to use an immunoassay method from the viewpoint of higher sensitivity and convenience. Below, although an example of embodiment which employ | adopts these methods is shown, this invention is not of course limited to these examples.
（例１）
イムノアッセイ法を採用する場合の一実施形態では、例えば、血液中に含まれる蛋白質を支持体（例えば、マルチウエルプレート、または、ビーズ）上に固定化し、その後、目的の蛋白質（具体的には、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、ＧＤＦ−１５蛋白質、または、ミッドカイン蛋白質）と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ａと呼ぶ）を、支持体上に固定化された目的の蛋白質に結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された抗体を、物質Ａに結合させる。最後に、物質Ａに結合している標識を検出することによって、目的の蛋白質を検出（より具体的には、目的の蛋白質の血液中の濃度を算出）すればよい。
(Example 1)
In one embodiment where an immunoassay method is employed, for example, a protein contained in blood is immobilized on a support (for example, a multiwell plate or a bead), and then the protein of interest (specifically, A substance that specifically interacts with osteopontin protein, progranulin protein, GDF-15 protein, or midkine protein (hereinafter referred to as substance A) is bound to the target protein immobilized on a support. Let Next, an antibody to which a label (eg, alkaline phosphatase or peroxidase) has been attached is bound to substance A. Finally, the target protein may be detected (more specifically, the concentration of the target protein in blood may be calculated) by detecting the label bound to the substance A.
（例２）
イムノアッセイ法を採用する場合の別の実施形態では、例えば、目的の蛋白質（具体的には、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、ＧＤＦ−１５蛋白質、または、ミッドカイン蛋白質）と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ｂと呼ぶ）を支持体上に固定化する。次いで、当該支持体に血液を加え、支持体上に固定化された物質Ｂに目的の蛋白質を結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された抗体を、目的の蛋白質に結合させる。最後に、目的の蛋白質に結合している標識を検出することによって、目的の蛋白質を検出（より具体的には、目的の蛋白質の血液中の濃度を算出）すればよい。
(Example 2)
In another embodiment of the immunoassay method, for example, the protein specifically interacts with a protein of interest (specifically, osteopontin protein, progranulin protein, GDF-15 protein, or midkine protein) A substance (hereinafter referred to as substance B) is immobilized on a support. Then, blood is added to the support, and the target protein is bound to the substance B immobilized on the support. Then, an antibody to which a label (for example, alkaline phosphatase or peroxidase) has been attached is bound to the protein of interest. Finally, the target protein may be detected (more specifically, the concentration of the target protein in blood may be calculated) by detecting the label bound to the target protein.
（例３）
イムノアッセイ法を採用する場合の別の実施形態では、例えば、目的の蛋白質（具体的には、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、ＧＤＦ−１５蛋白質、または、ミッドカイン蛋白質）に結合する抗体を支持体上に固定化する。次いで、当該支持体に血液を加え、支持体上に固定化された抗体に目的の蛋白質を結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された、目的の蛋白質と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ｃと呼ぶ）を、目的の蛋白質に結合させる。最後に、目的の蛋白質に結合している標識を検出することによって、目的の蛋白質を検出（より具体的には、目的の蛋白質の血液中の濃度を算出）すればよい。なお、上記抗体および物質Ｃは、各々、目的の蛋白質の異なる部位と相互作用するものである。
(Example 3)
In another embodiment in the case of employing an immunoassay method, for example, an antibody that binds to a protein of interest (specifically, an osteopontin protein, progranulin protein, GDF-15 protein, or midkine protein) is used as a support. Immobilize on top. Then, blood is added to the support, and the target protein is bound to the antibody immobilized on the support. Next, a substance (hereinafter, referred to as substance C) to which a label (for example, alkaline phosphatase or peroxidase) is added and which specifically interacts with the target protein is bound to the target protein. Finally, the target protein may be detected (more specifically, the concentration of the target protein in blood may be calculated) by detecting the label bound to the target protein. The above antibody and substance C each interact with different sites of the target protein.
（例４）
イムノアッセイ法を採用する場合の別の実施形態では、例えば、目的の蛋白質（具体的には、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、ＧＤＦ−１５蛋白質、または、ミッドカイン蛋白質）と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ｄと呼ぶ）を支持体上に固定化する。次いで、当該支持体に血液を加え、支持体上に固定化された物質Ｄに目的の蛋白質を結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された、目的の蛋白質と特異的に相互作用する物質（以下、物質Ｅと呼ぶ）を、目的の蛋白質に結合させる。最後に、目的の蛋白質に結合している標識を検出することによって、目的の蛋白質を検出（より具体的には、目的の蛋白質の血液中の濃度を算出）すればよい。なお、上記物質Ｄおよび物質Ｅは、各々、目的の蛋白質の異なる部位と相互作用するものである。
(Example 4)
In another embodiment of the immunoassay method, for example, the protein specifically interacts with a protein of interest (specifically, osteopontin protein, progranulin protein, GDF-15 protein, or midkine protein) A substance (hereinafter referred to as substance D) is immobilized on a support. Next, blood is added to the support, and the target protein is bound to the substance D immobilized on the support. Next, a substance (hereinafter referred to as substance E) which is given a label (for example, alkaline phosphatase or peroxidase) and which specifically interacts with the target protein is bound to the target protein. Finally, the target protein may be detected (more specifically, the concentration of the target protein in blood may be calculated) by detecting the label bound to the target protein. The substance D and the substance E each interact with different sites of the target protein.
（例５）
ウエスタンブロット法を採用する場合の一実施形態では、例えば、生体から取得された血液中に含まれる蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した後、当該蛋白質をニトロセルロース膜などに転写する。次いで、ニトロセルロース膜に転写された目的の蛋白質（具体的には、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、ＧＤＦ−１５蛋白質、または、ミッドカイン蛋白質）に、当該蛋白質と特異的に相互作用する物質（以下物質Ｆと呼ぶ）を結合させる。次いで、標識（例えば、アルカリフォスファターゼ、または、ペルオキシダーゼ）が付与された抗体を、物質Ｆに結合させる。最後に、物質Ｆに結合している標識を検出することによって、目的の蛋白質を検出（より具体的には、目的の蛋白質の血液中の濃度を算出）すればよい。
(Example 5)
In one embodiment using Western blotting, for example, proteins contained in blood obtained from a living body are separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and then the proteins are transferred to a nitrocellulose membrane or the like. Then, a substance that specifically interacts with the protein of interest (specifically, osteopontin protein, progranulin protein, GDF-15 protein, or midkine protein) transferred to the nitrocellulose membrane Hereinafter referred to as substance F). Then, the antibody to which a label (eg, alkaline phosphatase or peroxidase) has been attached is bound to substance F. Finally, the target protein may be detected (more specifically, the concentration of the target protein in blood may be calculated) by detecting the label bound to the substance F.
目的の蛋白質（具体的には、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、ＧＤＦ−１５蛋白質、または、ミッドカイン蛋白質）と特異的に相互作用する物質として抗体を用いる場合、当該抗体としては、市販の抗体を用いることも可能であるし、周知の方法にて作製した抗体を用いることも可能である。 When an antibody is used as a substance that specifically interacts with a target protein (specifically, osteopontin protein, progranulin protein, GDF-15 protein, or midkine protein), a commercially available antibody may be used as the antibody. It is also possible to use an antibody produced by a well-known method.
例えば、ＨａｒＬｏｗらの「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ，講談社（１９９１）」に記載の方法にしたがって、抗体を作製すればよい。 For example, antibodies are prepared according to the method described in HarLow et al., "Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)", Iwasaki et al., "Monoclonal antibody hybridoma and ELISA, Kodansha (1991)". do it.
上記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。また、上記抗体は、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗体フラグメントであってもよい。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全な抗体のＦｃを欠いており、結合の特異性が向上しているため、好ましい（Wahlら、J. Nucl. Med., 24：316-325（1983））。
〔３．子宮肉腫検出用キット〕
本実施の形態の子宮肉腫検出用キットは、オステオポンチン蛋白質と特異的に相互作用する物質、プログラニュリン蛋白質と特異的に相互作用する物質、および、ミッドカイン蛋白質と特異的に相互作用する物質からなる群より選択される少なくとも１つを備えている。より精度高く子宮肉腫を検出するという観点から、本実施の形態の子宮肉腫検出用キットは、オステオポンチン蛋白質と特異的に相互作用する物質、プログラニュリン蛋白質と特異的に相互作用する物質、および、ミッドカイン蛋白質と特異的に相互作用する物質からなる群より選択される２つを備えていることが好ましく、３つを備えていることが更に好ましい。
The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The antibodies may also be antibody fragments, such as Fab and F (ab ') 2 fragments. Fab and F (ab ') 2 fragments are preferred because they lack the full antibody Fc and have improved binding specificity (Wahl et al., J. Nucl. Med., 24: 316-325 ( 1983)).
[3. Uterine sarcoma detection kit]
The kit for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment comprises a substance that specifically interacts with the osteopontin protein, a substance that specifically interacts with the progranulin protein, and a substance that specifically interacts with the midkine protein And at least one selected from the group consisting of From the viewpoint of detecting uterine sarcoma with higher accuracy, the kit for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment is a substance that specifically interacts with osteopontin protein, a substance that specifically interacts with progranulin protein, and It is preferable to include two selected from the group consisting of substances that specifically interact with midkine protein, and it is more preferable to include three.
オステオポンチン蛋白質と特異的に相互作用する物質としては、例えば、抗オステオポンチン抗体、または、オステオポンチン結合蛋白質（例えば、インテグリン（例えば、αｖβ３、α５β１、α８β１、αｖβ１、αｖβ５））を挙げることができる。 Examples of the substance that specifically interacts with the osteopontin protein include anti-osteopontin antibodies or osteopontin binding proteins (eg, integrins (eg, αvβ3, α5β1, α8β1, αvβ1, αvβ5)).
プログラニュリン蛋白質と特異的に相互作用する物質としては、例えば、抗プログラニュリン抗体、または、プログラニュリン結合蛋白質（例えば、ソルチリン、腫瘍壊死因子受容体Ｔｏｌｌ様受容体−９）を挙げることができる。 Examples of substances that specifically interact with progranulin protein include anti-progranin antibodies, or progranulin binding proteins (eg sortilin, tumor necrosis factor receptor Toll-like receptor-9). Can.
ミッドカイン蛋白質と特異的に相互作用する物質としては、例えば、抗ミッドカイン抗体、または、ミッドカイン結合蛋白質（例えば、プロテオグリカン、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼ、low density lipoprotein receptor-related protein、anaplastic leukemia kinase、インテグリンα４β１、インテグリンα６β１、Ｎｏｔｃｈ−２）を挙げることができる。 Examples of substances that specifically interact with midkine proteins include anti-midkine antibodies, or midkine binding proteins (eg, proteoglycans, receptor protein tyrosine phosphatases, low density lipoprotein receptor-related proteins, anaplastic leukemia kinase, Integrin α4β1, integrin α6β1, Notch-2) can be mentioned.
本実施の形態の子宮肉腫検出用キットは、上述した３つの物質に加えて、ＧＤＦ−１５蛋白質と特異的に相互作用する物質を備えていることが好ましい。当該構成であれば、更に精度高く子宮肉腫を検出することができる。 It is preferable that the kit for detecting uterine sarcoma of the present embodiment includes, in addition to the above-described three substances, a substance that specifically interacts with the GDF-15 protein. With this configuration, uterine sarcoma can be detected more accurately.
ＧＤＦ−１５蛋白質と特異的に相互作用する物質としては、例えば、抗ＧＤＦ−１５抗体、または、ＧＤＦ−１５結合蛋白質（例えば、トランスフォーミング増殖因子受容体）を挙げることができる。 As a substance that specifically interacts with the GDF-15 protein, for example, an anti-GDF-15 antibody or a GDF-15 binding protein (for example, a transforming growth factor receptor) can be mentioned.
本実施の形態の子宮肉腫検出用キットは、目的の蛋白質（具体的には、オステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、ＧＤＦ−１５蛋白質、または、ミッドカイン蛋白質）と特異的に相互作用する物質を備えていることによって、血液中に含まれる目的の蛋白質を検出し（より具体的には、血液中に含まれる目的の蛋白質の濃度を測定）、これによって、当該血液が由来する被検体が子宮肉腫を患っているか否か、知ることができる。 The kit for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment includes a substance that specifically interacts with a target protein (specifically, osteopontin protein, progranulin protein, GDF-15 protein, or midkine protein). By detecting the protein of interest contained in the blood (more specifically, measuring the concentration of the protein of interest contained in the blood), whereby the subject from which the blood is derived is a uterine sarcoma You can know if you are suffering from
子宮肉腫検出用キットに備えられる目的の蛋白質と特異的に相互作用する物質は、一例として、上述した〔２．子宮肉腫診断のためのデータの取得方法〕の欄で説明した物質Ａ〜物質Ｆの何れかとして利用することができる。なお、物質Ａ〜物質Ｆの具体的な利用方法は既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。 The substance that specifically interacts with the target protein provided in the uterine sarcoma detection kit is described above as an example [2. Method of Obtaining Data for Uterine Sarcoma Diagnosis] [0172] The method can be used as any of the substances A to F described in the section of the section. In addition, since the specific usage method of the substance A-the substance F was already demonstrated, the description is abbreviate | omitted here.
本実施の形態の子宮肉腫検出用キットには、蛋白質と特異的に相互作用する物質が固定化された支持体が備えられていてもよい。当該支持体としては、例えば、イムノアッセイ用のプレート、および、イムノアッセイ用のビーズを挙げることができる。 The uterine sarcoma detection kit of the present embodiment may be provided with a support on which a substance that specifically interacts with a protein is immobilized. As the said support body, the plate for immunoassays and the bead for immunoassays can be mentioned, for example.
支持体がプレートである場合、１つの支持体上に複数種類の物質が固定化されていてもよいし、１つの支持体上に１種類の物質が固定化されていてもよい。１つの支持体上に複数の物質が固定化されている場合には、同じエリア（例えば、プレート内の１つのウエル）内に複数の物質が固定化されていてもよいし、同じエリア内に１種類の物質が固定化されていてもよいが、より精度高く子宮肉腫を検出するという観点（換言すれば、観察時のバックグラウンドを下げるという観点）からは、同じエリア内に１種類の物質が固定化されていることが好ましい。 When the support is a plate, multiple types of substances may be immobilized on one support, or one type of substance may be immobilized on one support. In the case where multiple substances are immobilized on one support, multiple substances may be immobilized in the same area (for example, one well in the plate) or in the same area. One substance may be immobilized, but from the viewpoint of detecting uterine sarcoma more accurately (in other words, from the viewpoint of lowering the background at the time of observation), one substance in the same area Is preferably immobilized.
支持体がビーズである場合、１つの支持体上に複数種類の物質が固定化されていてもよいし、１つの支持体上に１種類の物質が固定化されていてもよいが、より精度高く子宮肉腫を検出するという観点（換言すれば、観察時のバックグラウンドを下げるという観点）からは、１つの支持体上に１種類の物質が固定化されていることが好ましい。 When the support is a bead, multiple types of substances may be immobilized on one support, or one type of substance may be immobilized on one support, but more accurate From the viewpoint of highly detecting uterine sarcoma (in other words, from the viewpoint of lowering the background at the time of observation), it is preferable that one type of substance is immobilized on one support.
支持体を形成する材料は、目的の蛋白質と特異的に相互作用する物質を支持体上の固定化し得るものであればよく、特に限定されない。支持体を形成する材料としては、例えば、無機系材料（例えば、ガラス、および、シリコンウエハ）、天然高分子（例えば、紙）、合成高分子（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、および、ポリスチレン）、並びに、天然高分子および／または合成高分子によって形成されたゲル、を挙げることができる。 The material forming the support is not particularly limited as long as it can immobilize a substance that specifically interacts with the target protein on the support. As materials for forming a support, for example, inorganic materials (for example, glass and silicon wafer), natural polymers (for example, paper), synthetic polymers (for example, nitrocellulose, nylon and polystyrene), And gels formed by natural polymers and / or synthetic polymers.
抗体を用いてポリペプチドを検出する公知の手法は、本発明においても適用可能である。例えば、サイファージェン・バイオシステムズ社より、プロテインチップの１種としてバイオロジカルチップが販売されている。当該チップは、基板（支持体）の表面に活性基（例えば、カルボニルイミダゾール、または、エポキシ）を備えたものであって、ユーザーが、所望のポリペプチド等を固定化して使用するものである。例えば、目的の蛋白質と特異的に相互作用する物質を、当該チップの基板の表面に固定化してもよい。 Known techniques for detecting polypeptides using antibodies are also applicable in the present invention. For example, biological chips are marketed as one of the protein chips from Ciphergen Biosystems. The chip is provided with an active group (for example, carbonylimidazole or epoxy) on the surface of a substrate (support), and a user immobilizes and uses a desired polypeptide or the like. For example, a substance that specifically interacts with a protein of interest may be immobilized on the surface of the substrate of the chip.
本実施の形態の子宮肉腫検出用キットは、上述した構成以外を備えていてもよい。本実施の形態の子宮肉腫検出用キットは、イムノアッセイ法、または、ウエスタンブロット法を行うための構成（具体的には、支持体、標識された２次抗体、発色用試薬、または、洗浄用緩衝液）を備えていてもよい。また、本実施の形態の子宮肉腫検出用キットは、検出時のポジティブコントロールとして、または、血中濃度を算出するための検量線の作製用試料として、本発明の子宮肉腫検出用血液マーカーを備えていてもよい。 The uterine sarcoma detection kit of the present embodiment may have a configuration other than that described above. The kit for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment has a configuration for performing immunoassay or Western blotting (specifically, a support, a labeled secondary antibody, a coloring reagent, or a washing buffer Liquid) may be provided. In addition, the kit for detecting uterine sarcoma according to the present embodiment is provided with the blood marker for detecting uterine sarcoma according to the present invention as a positive control at the time of detection or as a sample for preparation of a standard curve for calculating blood concentration. It may be
市販のキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ）を用いて、各種疾患（子宮筋腫、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、または、子宮肉腫）を患っている患者から取得した血液中に含まれるオステオポンチン蛋白質、プログラニュリン蛋白質、ＧＤＦ−１５蛋白質、および、ミッドカイン蛋白質の濃度を測定した。なお、本試験では、子宮筋腫を患う１２例の患者、卵巣癌を患う８例の患者、子宮頸癌を患う１０例の患者、子宮体癌を患う６例の患者、および、子宮肉腫を患う６例の患者から取得した血液について試験した。 Contained in blood obtained from patients suffering from various diseases (Uterine fibroid, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, or uterine sarcoma) using a commercially available kit (R & D Systems, Quantikine ELISA Kit) The concentrations of osteopontin protein, progranulin protein, GDF-15 protein, and midkine protein were measured. In this study, 12 patients with uterine fibroid, 8 patients with ovarian cancer, 10 patients with cervical cancer, 6 patients with uterine body cancer and uterine sarcoma The blood obtained from 6 patients was examined.
具体的な試験方法は、上述したキットに添付のプロトコールにしたがった。以下に、試験方法について簡単に説明する。 The specific test method followed the protocol attached to the kit mentioned above. The test method is briefly described below.
患者から取得した血液から、１００μＬの血清を分離した。また、血液中に含まれる各物質の濃度を算出するための検量線を作製するために、オステオポンチン蛋白質を様々な濃度にて含むスタンダード溶液を作製した。 From blood obtained from the patient, 100 μL of serum was separated. Also, in order to prepare a calibration curve for calculating the concentration of each substance contained in blood, a standard solution containing osteopontin protein at various concentrations was prepared.
まず、抗オステオポンチン抗体（１次抗体）が固定化されたプレートの複数のウエルの各々に、上述した血清、および、オステオポンチン蛋白質を様々な濃度にて含むスタンダード溶液を加えた後、室温にて２時間インキュベートした。 First, after adding the above-mentioned serum and osteopontin protein at various concentrations to each of a plurality of wells on the plate on which the anti-osteopontin antibody (primary antibody) is immobilized, 2 at room temperature Incubated for time.
キットに備えられた洗浄溶液を用いて各ウエルを洗浄した後、各ウエルに、検出用の標識（ＨＲＰ：horse radish peroxidase）が結合した抗オステオポンチン抗体（２次抗体）を加え、室温にて２時間インキュベートした。 After washing each well using the washing solution provided in the kit, an anti-osteopontin antibody (secondary antibody) conjugated with a detection label (HRP: horse radish peroxidase) is added to each well, Incubated for time.
キットに備えられた洗浄溶液を用いて各ウエルを洗浄した後、各ウエルに、上述した標識の基質を含む溶液を加えた後、室温にて２５分間インキュベートした。 After washing each well using the washing solution provided in the kit, a solution containing the substrate for the above-mentioned label was added to each well and then incubated for 25 minutes at room temperature.
キットに備えられた反応停止液を各ウエルに加えて、標識と基質との反応を停止させた。その後、プレートリーダーにて、各ウエルにおける４５０ｎｍの吸光度を測定した。４５０ｎｍの吸光度の値を５４０ｎｍまたは５７０ｎｍの吸光度の値に基づいて補正し、補正後の４５０ｎｍの吸光度の値を、測定値とした。 The reaction stop solution provided in the kit was added to each well to stop the reaction between the label and the substrate. Thereafter, the absorbance at 450 nm in each well was measured with a plate reader. The absorbance value at 450 nm was corrected based on the absorbance value at 540 nm or 570 nm, and the absorbance value at 450 nm after correction was taken as the measurement value.
オステオポンチン蛋白質を様々な濃度にて含むスタンダード溶液の測定値に基づいて、検量線を作製した。より具体的に、スタンダード溶液中に含まれるオステオポンチン蛋白質の濃度をＸ軸に、スタンダード溶液の測定値をＹ軸にプロットすることにより、検量線を作製した。 A calibration curve was prepared based on the measured values of a standard solution containing osteopontin protein at various concentrations. More specifically, a calibration curve was prepared by plotting the concentration of osteopontin protein contained in the standard solution on the X-axis and the measured value of the standard solution on the Y-axis.
次いで、血清の測定値を検量線の関数に代入することによって、血清（換言すれば、血液）中に含まれるオステオポンチン蛋白質の濃度を算出した。 Subsequently, the concentration of osteopontin protein contained in the serum (in other words, blood) was calculated by substituting the measured value of the serum into the function of the calibration curve.
プログラニュリン蛋白質の濃度、ＧＤＦ−１５蛋白質の濃度、および、ミッドカイン蛋白質の濃度についても、同様の方法にて測定した。これらについては、具体的な説明を省略する。 The concentration of progranulin protein, the concentration of GDF-15 protein, and the concentration of midkine protein were also measured by the same method. A detailed description of these will be omitted.
図１〜４に、試験結果を示す。具体的に、図１は、オステオポンチン蛋白質の試験結果を示し、図２は、プログラニュリン蛋白質の試験結果を示し、図３は、ミッドカイン蛋白質の試験結果を示し、図４は、ＧＤＦ−１５蛋白質の試験結果を示している。 The test results are shown in FIGS. Specifically, FIG. 1 shows the test results of osteopontin protein, FIG. 2 shows the test results of progranulin protein, FIG. 3 shows the test results of midkine protein, and FIG. 4 shows GDF-15. The test results of the protein are shown.
図１〜４に示すように、子宮肉腫を患っている患者では、他の病気を患っている患者と比較して、血液中に含まれるオステオポンチン蛋白質（カットオフ値：略３，０００ｐｇ／ｍＬ）、プログラニュリン蛋白質（カットオフ値：略１２，０００ｐｇ／ｍＬ）、ミッドカイン蛋白質（カットオフ値：略２，０００ｐｇ／ｍＬ）、および、ＧＤＦ−１５蛋白質（略３００ｐｇ／ｍＬ）の濃度が有意に高かった。 As shown in FIGS. 1 to 4, in patients suffering from uterine sarcoma, osteopontin protein (cutoff value: approximately 3,000 pg / mL) contained in blood as compared with patients suffering from other diseases. , Progranulin protein (cut-off value: approximately 12,000 pg / mL), midkine protein (cut-off value: approximately 2,000 pg / mL), and concentrations of GDF-15 protein (approximately 300 pg / mL) are significant It was high.
本発明の子宮肉腫検出用血液マーカーは、子宮肉腫の特異的な検出が可能であるが故に、子宮肉腫検出用キット、および、子宮肉腫診断のためのデータの取得方法に利用可能である。したがって、本発明は、医薬、臨床検査薬、医療機器、および、研究用試薬の産業において利用可能である。 The blood marker for detecting uterine sarcoma of the present invention can be used as a kit for detecting uterine sarcoma and a method for acquiring data for diagnosing uterine sarcoma because specific detection of uterine sarcoma is possible. Thus, the present invention is available in the pharmaceutical, laboratory test, medical device, and research reagent industries.
Claims (7)
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、オステオポンチン蛋白質としての活性を有する蛋白質。 The osteopontin protein, the following (1) or wherein the protein Der Rukoto of (2), uterine sarcoma detecting blood marker of claim 1:
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(2) A protein having an amino acid sequence wherein no more than 10 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having activity as an osteopontin protein .
上記オステオポンチン蛋白質と特異的に相互作用する物質が、抗オステオポンチン抗体、またはインテグリンであることを特徴とする、子宮肉腫検出用キット。 Osteopontin has a protein that specifically interacts with those quality,
A kit for detecting uterine sarcoma, characterized in that the substance specifically interacting with the osteopontin protein is an anti-osteopontin antibody or integrin .
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、オステオポンチン蛋白質としての活性を有する蛋白質。 The osteopontin protein is characterized protein Der Rukoto the following (1) or (2), a kit for uterine sarcoma detection according to claim 3 or 4:
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(2) A protein having an amino acid sequence wherein no more than 10 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having activity as an osteopontin protein .
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１０個以下のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、オステオポンチン蛋白質としての活性を有する蛋白質。 The osteopontin protein, the following (1) or (2), characterized in protein der Rukoto the method of obtaining data for uterine sarcoma diagnosis according to claim 6:
(1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
(2) A protein having an amino acid sequence wherein no more than 10 amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having activity as an osteopontin protein .
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