JP6529090B2 - in situティッシュ・エンジニアリング - Google Patents
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Description
− Aは、コポリマー反応において使用される最初のポリエチレングリコール(PEG)の(平均)分子量を指し、200〜400の間であり、275〜325の間であるのが好ましく、290〜310であるのがより好ましく;
− Bは、コポリマー中のポリ(エチレンオキシドテレフタレート)の重量%を指し、40〜70であり、50〜60であるのが好ましく、53〜57であるのがより好ましく;
− Cは、コポリマー中のポリ(ブチレンテレフタレート)の重量%を指し、30〜60であり、40〜50であるのが好ましく、43〜47であるのがより好ましい。
最も好ましいPEOT/PBTブロックコポリマーは、300/55/45である(フローニンゲン、オランダのPolyVation B.V.から得られる)。さらに、材料がシリコーンおよび/または(ポリ)アクリレートを含まないのが好ましい。
− 孔密度は、100μm2あたりの孔が10〜80であり、20〜60であるのが好ましく、25〜50であるのがより好ましく、100μm2あたりの孔が35〜45であるのがさらに好ましく;
− 平均孔直径は、0.4〜1.8μmであり、0.6〜1.3μmであるのが好ましく、0.8〜1.0μmであるのがより好ましく、0.85〜0.95μmであるのがさらに好ましい。
a)直径3〜20mmの少なくとも部分的に少なくとも1つのロッドの形であるモールドキャビティであって、ロッドの形は、少なくとも2つのモールド部分(のU形状の内側表面)によって画成される、モールドキャビティ
を含む成形装置を提供するステップと;
b)任意にプレス手段を用いて、流体(例えば溶融、液体)ポリ(エチレンオキシドテレフタレート)−ポリ(ブチレンテレフタレート)コポリマー(単数または複数)をモールドキャビティの少なくとも1つのロッドの形の少なくとも一部に満たすステップと;
c)コポリマーを固化させるステップと;
d)少なくとも2つのモールド部分を固化したコポリマーから分離して、直径3〜20mmのロッドの形の少なくとも1つのデバイスを得る、ステップと;
e)少なくとも1つの得られたデバイスをクロロホルムおよび/またはジクロロメタンに5〜15秒さらして、直径3〜20mmのロッドの形の少なくとも1つのデバイスを得る、ステップであって、デバイスは、ポリ(エチレンオキシドテレフタレート)−ポリ(ブチレンテレフタレート)コポリマーを含み、デバイスの外側表面は、二乗平均平方根粗さ(Rq)が少なくとも100nmであり、少なくとも150nmであるのが好ましく、少なくとも175nmであるのがさらに好ましく、少なくとも180nmであるのが最も好ましい、ステップと
を含む。
− Aは、コポリマー反応において使用される最初のポリエチレングリコール(PEG)の(平均)分子量を指し、200〜400の間であり、275〜325の間であるのが好ましく、290〜310であるのがより好ましく;
− Bは、コポリマー中のポリ(エチレンオキシドテレフタレート)の重量%を指し、40〜70、50〜60であるのが好ましく、53〜57であるのがより好ましく;
− Cは、コポリマー中のポリ(ブチレンテレフタレート)の重量%を指し、30〜60であり、40〜50であるのが好ましく、43〜47であるのがより好ましい。
最も好ましいPEOT/PBTブロックコポリマーは、300/55/45である(フローニンゲン、オランダのPolyVation B.V.から得られる)。
a)本開示によるデバイスをヒトまたは動物の体の皮下スペースに1〜6週間、好ましくは2〜4週間の期間挿入して、デバイス上に組織構造体を形成させるステップと;
b)好ましくはデバイスと、任意にその上に形成された組織構造体とを皮下スペースから除去するステップであって、デバイスと組織構造体とは、皮下スペースからの除去の前または後に分離されうる、ステップと;
c)好ましくは、組織構造体を生分解性シートで覆うステップと;
d)好ましくは、組織構造体を静脈、動脈および/または人工腎臓に接続するステップ(このステップは、ステップc)の前に行っても後に行ってもよい)と
を含む。
a)物質をヒトまたは動物の体の皮下スペースに1〜6週間、好ましくは2〜4週間の期間挿入して、物質上に組織構造体を形成させるステップと;
b)好ましくは物質と、任意にその上に形成された組織構造体とを皮下スペースから除去するステップであって、物質と組織構造体とは、皮下スペースからの除去の前または後に分離されうる、ステップと
を含む。さらに、上述のステップc)および/またはd)がここでも適用されてもよい。
− α−SMAに対する抗体(Dako、オランダから得られる;1:1000)を視覚化することによって測定される、総面積に対して15〜25%のα平滑筋アクチン(α−SMA)陽性面積;
− ピクロシリウスレッド染色(例えばPolysciences Incキット)によって測定される、総面積に対して90〜100%のコラーゲン陽性面積;
ならびに、好ましくは:
− CD45に対する抗体(Immunologic、オランダ、1:50、熱誘導0.1%トリプシン抗原回復)を視覚化することによって測定される、総面積に対して0〜10%のCD45陽性面積;および/または
− CD68に対する抗体(例えばAbD、Serotec、clone MAC387、1:10)を視覚化することによって測定される、総面積に対して0〜5%のCD68陽性面積;および/または
− ビメンチンに対する抗体(Immunologic、オランダ;1:300、熱誘導プロテイナーゼK抗原回復)を視覚化することによって測定される、総面積に対して50〜70%のビメンチン陽性面積。
本実施例は、自己由来の、完全に生物学的なティッシュ・エンジニアリング血管(TEBV;tissue engineered blood vessel)を生成するin situ血管ティッシュ・エンジニアリングアプローチを説明する。移植時に管形状の線維細胞性組織カプセルによる被包化を生じる炎症反応を引き起こすポリマーロッドを開発し、これがTEBVの基礎を形成することができる。インプラント材料特性を調節することによって、組織カプセル形成を最適化するように組織反応を調整することができる。ポリ(エチレンオキシドテレフタレート)−ポリ(ブチレンテレフタレート)(PEOT/PBT)とポリエチレングリコール(PCL)とからなるロッド、およびガスプラズマ処理、化学エッチング、および成長因子被覆を施したロッドをラットに皮下移植し、組織反応を改変する能力をテストした。3週後に、組織カプセルがまわりに形成されたカプセルを採取して分析した。組織カプセルは、円周方向に並んだコラーゲンおよび筋繊維芽細胞から主になっていた。異なるインプラント材料は、組織カプセルの形成に実に明白な違いをもたらした。インプラント材料特性を変化させることによって、組織カプセル組成、細胞分布および組織配置を調整することができ、TEBVに適切な基礎が生成された。
ロッドの製作
直径1.75mmおよび長さ最低2cmの弾性コポリマー、ポリ(エチレンオキシドテレフタレート)−ポリ(ブチレンテレフタレート)(PEOT/PBT、IsoTis Orthopedics S.A.、オランダ)からなる固体の円筒形状のロッドを、溶融押出機として使用される高速プロトタイピングユニット(Moroni他、2006年 Biomaterials Mar;27(7):974−85)(Envisiontec,GmbH,ドイツ)により製作した。このコポリマーの製作の間に、PEOT/PBT比および使用される最初のPEGの分子量を変更して、濡れ性(Deschamps他、2002年 J Control Release Jan 17;78(1−3):175−86)およびタンパク質吸着(Mahmood他 2004年 Exp Cell Res Dec 10;301(2):179−88)等の材料の性質を調節することができる。簡潔にいえば、シリンジに充填したPEOT/PBT顆粒を、180〜200℃に加熱した。4〜5バールの窒素ガスを印加して溶融ポリマーを押出した。2つの異なるPEOT/PBTの組成を用い、PEOT/PBTの重量%を55/45(Polyactive 300(登録商標)/Pa300)、および70/30(Polyactive(登録商標)1000/Pa1000)とし、コポリマー反応のために使用する最初のポリエチレングリコール(PEG)の分子量をそれぞれ300g/molおよび1000g/molとした。対照として、生体適合性で周知のポリ−ε−カプロラクトン(PCL)を用いて、溶融押出(Axon小型押出機、Axon AB Plastmaskiner、スウェーデン)を用いて類似の寸法のロッドを製作した。PCLペレット(Purasorb PC 12、Purac Biomaterials、オランダ)を170℃に加熱し、PCLが完全に溶融するまで撹拌した(0.6cc/回転)。その後これを、キャピラリを通じて25バールの圧力下で押出して円筒状ロッドを製作した。
クロロホルムエッチングでは、非改質Pa300ロッドをクロロホルム(Merck Millipore、オランダ)に10秒間浸漬し、激しく空気乾燥させて残留クロロホルムを蒸発させた。それからロッドを超純水で洗浄し、42kHzで15分間2回超音波処理してクロロホルムの完全な除去を確保し、その後空気乾燥させた。酸素ガスプラズマ処理では、非改質Pa300ロッドを、100mTorrの酸素ガスで、30Wまたは100Wで5分間処理した(反応性イオンエッチング、テスキ、トゥウェンテ大学、オランダ)。すべての改質および非改質ロッドを、ガンマ放射線(Isotron、オランダ)により25kGyを上回る線量で滅菌した。加えて、滅菌100W酸素処理Pa300ロッドを、フローキャビネットにおいて滅菌状態でTGF−β溶液に1分間浸した。TGF−β溶液は、滅菌I型ラットコラーゲン(5mg/mL、Culturex、英国)に混合してコラーゲン1mLあたり10ngのTGF−β濃度とした活性化TGF−β3(R&D Systems、英国)からなった。対照として、類似の酸素処理Pa300ロッドを、TGF−βを含まないI型ラット尾コラーゲンにおいて1分間ディップコートした。ロッドを空気乾燥させ、移植に直接使用した。
15匹の生後13週間目の雄ウィスターラット(Charles Rivers、フランス)を標準の研究用ケージに収容し、餌および水を自由に摂取させた。すべての手術を、イソフルラン吸入麻酔下で行った。ラットあたり4つのロッドを腹部の皮下スペースに移植した。対照として働く非改質PCLロッドを5回移植し、すべてのPa300およびPa1000非改質ロッド、ならびにすべてのPA300改質および被覆ロッドを、9回移植した。およそ1cmの小さな水平切開後に縦方向皮下ポケットを形成し、このポケットにロッドを挿入した。その後、4−0vicryl縫合糸(Johnson & Johnson、オランダ)を使用して切開部を閉じた。ラットに、手術毎のperfalgan(200mg/kg)注入により術後鎮痛を直接与えた。加えて、手術1日後までperfalgan(2.7mg/mL)を飲料水に加えた。3週間後に、組織カプセルがまわりに形成されたロッドを採取し、動物を屠殺した。
組織カプセルを、4%パラホルムアルデヒドに固定し、処理し、パラフィンに包埋した。組織学的、免疫組織化学的および形態計測学的分析のために、各組織カプセルの2つの部分の5μmの連続横断切片を作製した。すべてのサンプルを、ヘマトキシリン−フロキシン−サフラン(HPS)を用いてルーチン的に染色した。細胞外マトリックスを特徴づけるために、各組織カプセルの連続切片を、コラーゲンにピクロシリウスレッド、グリコサミノグリカンにアルシアンブルー(pH 2.5)で、エラスチンにweighert’sエラスチンを用いて染色した。潜在的石灰化を評価するために、切片をアリザリンレッドで染色した。自家蛍光を用い、青色光で励起し、スペクトル顕微鏡法(Nuance Fx、米国)で分離してエラスチンを視覚化した。ピクロシリウスレッドで染色した切片を、明視野顕微鏡法と偏光を用いてI型およびIII型コラーゲンを区別して分析した。組織カプセルのすべての切片を、天然ラット大動脈の中間層の類似の切片と比較した。筋繊維芽細胞にα平滑筋アクチンに対する抗体(α−SMA、Dako、オランダ;1:1000)、繊維芽細胞にビメンチンに対する抗体(Immunologic、オランダ;1:300、熱誘導プロテイナーゼK抗原回復)、収縮平滑筋細胞にデスミンに対する抗体(Immunologic、オランダ;1:250、熱誘導0.1%トリプシン抗原回復)、白血球にCD45に対する抗体(Immunologic、オランダ、1:50、熱誘導0.1%トリプシン抗原回復)、および血管内皮細胞にフォン・ヴィレブランド因子に対する抗体(Dako、オランダ、1:300、熱誘導0.1%トリプシン抗原回復)を用いて免疫組織化学法により組織カプセルの細胞構成を特徴づけ、3,3’−ジアミノベンザジン(DAB)により視覚化した。他所に記載されているように、繊維芽細胞、筋繊維芽細胞および収縮平滑筋細胞を区別した(Roy−Chaudhury他 2007年 Am J Kidney Dis Nov;50(5):782−90)。アイソタイプ抗体を用いて陰性対照を得た。加えて、組織カプセルからの押出後にロッドをメチレンブルーで染色して、組織がロッドに付着したか否かを判定した。
パノラマスライドスキャナ(3D Histec、ハンガリー)を用いて、染色した切片の明視野画像を得た。ImageJを用いて定量化を行った。ピクロシリウスレッドおよびα−SMA染色切片を用いて、コラーゲンの総面積および筋繊維芽細胞の総面積をそれぞれμm2で定量化した。5μm2横断切片スライドの組織カプセルの総面積で割ったα−SMA染色切片のμm2でのDAB発色面積を用いて、α−SMA陽性面積の割合を測定した。
データは、平均+/−SEMとして表す。すべてのデータを、SPSSを用いて一元配置ANOVAテストにより分析した。Tukeyポストホック分析を行って、すべての異なるロッドの表面粗さグレイ値およびすべての非改質ロッドの組織形態計測結果を互いに比較した。Dunettポストホック分析を行って、すべての改質および被覆Pa300ロッドの組織形態計測結果を非改質Pa300ロッドと比較した。0.05未満のp値を統計的に有意とみなした。
インプラント材料
SEM画像により、すべての非改質ロッドが完全に滑らかな表面を有する一方で、酸素ガスプラズマ処理およびクロロホルムエッチングによる表面改質が実際に表面トポグラフィの顕著な変化をもたらし、はっきりとした均質なパターンの表面が作製されたことが確認された。クロロホルムエッチングでは0.5〜5μmの孔およびまれに10〜20μのいくつかの比較的大きな孔の形成が生じたのに対し、酸素処理では鋭い山が生じ、30Wの酸素ガスプラズマ処理と比較して100Wでは深さが大きかった。ガンマ放射線は、表面トポグラフィに影響しなかった(データは図示せず)。組織カプセルからの押出後のロッドのメチレンブルー染色から、非改質ロッド上に組織が全く残っておらず、表面改質および被覆ロッド上に組織がほとんど残っていないことが示された(データは図示せず)。
1つのPa1000ロッドは、採取時にもはやin situになかった。他の全てのケースでは、すべてのロッドを皮下移植から3週間後にうまく採取した。ロッドのリムのより顕著な組織反応については、ロッドは、血管に富んだ組織カプセルによって完全に被包化されており、ロッドのリム部の組織反応がより顕著だった。組織カプセルは、周囲の皮下組織に一体化していたが、容易に採取し、その後ロッドから円滑に押出することができた。組織学により、異なるタイプのロッドのまわりに形成された組織カプセルは、特にコラーゲンおよび筋繊維芽細胞含有量の相対的比率が目に見えて異なることが明らかになった。全体で、組織カプセルのマトリックスは、天然ラット動脈に匹敵する組成で、円周方向に並んだI型およびIII型コラーゲンならびにグリコサミノグリカン(GAG)から主になった。しかし、天然血管と比較して、エラスチンは局所的にごくわずかな量でしか存在しなかった。細胞構成に関しては、組織カプセルは、円周方向に並んだα−SMA陽性、デスミン陰性筋繊維芽細胞が多数を占めた。残りの細胞は、主に円周方向に並んだビメンチン陽性、α−SMA陰性繊維芽細胞であった。繊維芽細胞/筋繊維芽細胞の比率は、異なるタイプのロッド間で異なった。すべての組織カプセルにおいて、デスミン陽性平滑筋細胞はわずかしか存在しなかった。CD45陽性白血球はほとんど存在せず(1%未満)、接触表面に異物巨細胞形成はなかった。アリザリンレッド染色で、組織カプセルのいずれにおいても石灰化の徴候はみられなかった(データは図示せず)。組織カプセルを囲む皮下スペースのコラーゲンは、部分的に組織カプセルと一緒に並び、疎に配置されたコラーゲン、いくつかの繊維芽細胞および小血管を含む外膜層のようなものを形成した。
最初に、3つのタイプの非改質ロッドを、移植時に組織反応に影響する能力につき評価し、組織カプセル組成の有意な差が得られた(p<0.05)。生体適合性PCLロッドは、薄壁の、筋繊維芽細胞をほとんど含まない比較的無細胞の組織カプセルによって被包化されたのに対して、Pa1000およびPa300ロッドはいずれもより厚い、筋繊維芽細胞から主になる細胞豊富な組織カプセルによって被包化された。筋繊維芽細胞の絶対面積も筋繊維芽細胞の割合も、PCLと比較してPa300(それぞれp=0.048およびp=0.006)およびPa1000(それぞれp=0.010およびp=0.013)ロッドのまわりに形成された組織カプセルのほうが有意に大きかった。Pa300およびPa1000のまわりに形成した組織カプセルには組織構造および組織形態計測において明らかな違いがなかった。しかし、Pa300ロッドは移植の間により壊れにくく、したがって組織カプセルを損傷しうる組織カプセルの採取の間に破損しにくいという利点があった(Pa1000ロッドと比較したPa300)。したがってPa300からなるロッドに表面改質を行った。
組織形態計測により、すべての改質ロッドのまわりに形成された組織カプセルが、非改質Pa300ロッドと比較して壁厚がより大きく、したがってコラーゲンおよび筋繊維芽細胞の含有量がより大きいことが明らかになった。図7に示すように、これらの量は、Pa300ロッドの改質のタイプごとに異なった。コラーゲン被覆ロッドは、組織カプセル中のコラーゲンの最も大きな増加を生成し(p<0.05)、一方でTGF−β被覆ロッドは、コラーゲン量の増加に向かう傾向を示した(p=0.07)。改質ロッドのまわりに形成された組織カプセルにおけるα−SMAすなわち筋繊維芽細胞の絶対量は増加したが、α−SMAすなわち筋繊維芽細胞の割合は、コラーゲン被覆ロッドおよびTGF−β被覆ロッドでも酸素処理ロッドでも、それらの非改質の対応物と比較してより低かった。対照的に、クロロホルムエッチングしたロッドは、α−SMAすなわち筋繊維芽細胞の割合が増加した組織カプセルを生成した(図7)。これらの定量化は組織カプセルの不均質性および形態を考慮しないため、組織カプセルをその全体的外観および含有量の分布についても評価した。異なるタイプのロッド間の形態の顕著な違いが観察された。酸素処理したロッドは、壁がかなり厚いが、より疎に配置された組織カプセルを生じた。非改質ロッドと比較して、コラーゲン被覆ロッドおよびTGF−β被覆ロッドはいずれも、厚く密集した組織カプセルを生じた。しかし、筋繊維芽細胞の相対的比率は非改質ロッドと比較して低く、筋繊維芽細胞が組織カプセル壁全体に相対的にランダムに分布していた。一方でクロロホルム処理したロッドは、かなり厚い組織カプセルを生じ、壁厚が均一に分布していた。加えて、組織カプセルは、密集し均質に分散した筋繊維芽細胞からほぼ完全になった。
生成された組織カプセルは、GAG、円周方向に並んだコラーゲンおよび筋繊維芽細胞から主になった。引き起こされる反応は基本的に炎症反応であるが、組織カプセルに白血球または異物巨細胞はほとんど存在しなかった。これは移植期間の長さに依存する可能性が高い。異物反応は動的であり、好中球およびマクロファージが中心となる急性炎症の段階から始まり、数週間で(筋)繊維芽細胞の流入およびマトリックス形成を伴うより線維性の反応に収束する。やがて、かなり無細胞のコラーゲン性組織カプセルが残る。後者に基づき、本発明者らの結果に対応して、ラットでマトリックスおよび細胞豊富な非炎症性組織カプセルを得るためには3週間の移植期間が最適であると思われる。
本研究は、インプラントの性質が形態および組成に関して組織反応に好ましい影響を与えることができることを明らかに示す。従来のPCLと比較して、Pa300およびPa1000ロッドのまわりに形成された組織カプセルは、組成が有意に異なった。表面処理および生物活性被覆によって組織の組成および形態のさらに顕著な違いが得られた。本発明者らは、非改質の対応物と比較して、クロロホルムエッチングした表面および酸素プラズマ処理した表面から、組織カプセルの筋繊維芽細胞およびコラーゲンの含有量の増加が生じたことを示した。クロロホルム処理により、粗さが有意に増加したパターン化された表面が作製された。その後のインプラント表面特性およびトポグラフィの差は、インプラント材料のまわりに形成される組織の組成および形態を左右した。興味深いことに、クロロホルムエッチングした表面とプラズマ処理した表面との間のトポグラフィ構造および粗さのはっきりとした違いは、組織配置の顕著な相違を誘発した。酸素処理したロッドは厚い組織カプセルを生じたが、疎な配置は血管構築物に好ましくない。対照的に、クロロホルムエッチングしたロッドの移植は、最も均質に分布した、強い壁の、コラーゲンおよび筋繊維芽細胞の豊富な組織カプセルを生じた。したがって、本発明者らの見解では、これらのロッドがTEBVの適切な基礎を生成するために最も好ましい。
ただの表面改質に加えて、改質ロッドをコラーゲンおよびコラーゲン/TGF−βで被覆した。TGF−βは、繊維芽細胞を筋繊維芽細胞分化に誘導する。コラーゲンのみとコラーゲン/TGF−βとでのロッドの被覆はいずれも、非改質ロッドと比較してコラーゲン形成および壁厚の最大の増加をもたらした。しかし、コラーゲン/TGF−β被覆はコラーゲン被覆のみと比較して有意に異なる組織カプセルを生じることはなく、結果がコラーゲンに起因するにすぎないことが示唆された。コラーゲン被覆ロッドおよびコラーゲン/TGF−β被覆ロッドから最大の壁厚が生じた事実にもかかわらず、筋繊維芽細胞のより低い割合およびランダムな分布が、本発明者らの見解では、例えば筋繊維芽細胞豊富な、均質に分布した組織カプセルを生じたクロロホルム処理したPa300ロッドと比較してこれらの被覆を血管ティッシュ・エンジニアリングのための生物活性モールドとしてより好ましくないものとする。
本発明者らの生成した組織カプセルは、血管系内にグラフトされた後さらにリモデルしうるTEBVの基礎を形成する。実際に、組織カプセルに存在する主な細胞型である筋繊維芽細胞は、収縮機構を有し、刺激されると細胞外マトリックスを合成できる可塑性の細胞である。重要なことに、流れおよび周期的緊張は、マトリックス合成さらには筋繊維芽細胞の平滑筋細胞分化への強力な刺激でもある。したがって、血管系内にグラフトされ、大きな流れにさらされると、これらの組織カプセルはやがて分化し、より血管様の表現型に発達する可能性がある。
Pa300、Pa1000およびPCLロッドを製作した。簡潔にいえば、ポリマー顆粒をステンレススチールシリンジに充填し、装置の移動X軸アーム上に固定したサーモセットカートリッジユニットにより温度T=180〜200℃で加熱した。溶融相で、加圧キャップを介して4〜5バールの窒素ガスをシリンジに印加した。繊維配列モデルを、Bioplotterコンピュータ援用製造ソフトウェア(CAM、PrimCAM、スイス)にロードした。1.75mmのロッドを達成するために、2.2mmの針外径(OD)を選択した。ロッドを、窒素ガスで洗浄した。ガスプラズマロッドを、真空チャンバでインキュベートした。アルゴンプラズマ処理には、Harrick Plasma Cleaner(PDC−002;Harrick Plasma Ithaca、ニューヨーク州、米国)を、0.133mbarおよび高設定(740V DC、40mA DC、29.6W)で30、45および60分間それぞれ使用した。酸素およびトリフルオロメタン処理は、反応イオンエッチ(RIE)システム(Etch RIE Tetske、Nanolab、トゥウェンテ大学)により、100mTorrおよび30Wで5、10および15分間行った。水酸化ナトリウムエッチングは、1Mおよび4Mの濃度で5、10および15分間行った。ジクロロメタンまたはクロロホルムでエッチングしたロッドは、1、5または10秒間さらした(ディッピング)。無機および有機エッチングの後、ロッドをMilliQ水で1回すすぎ、さらに2回それぞれ15分間超音波処理して残留物を除去した。
AFM分析を行うため、サンプルを両面接着テープによって磁気ディスク上に固定した。AFMを通して、超鋭利TESPカンチレバーによるタッピング1モード(PicoScan Controller 2500、Molecular Imaging、米国)を用いて、表面粗さ分析を行った:42N/m、320kHz、2〜5nm ROC、No Coatings(Bruker AFM Probes)。Scanning Probe Image Processor、SPIPTM、バージョン4.2.2.0ソフトウェアを使用して、粗さ測定値(Ra、RqおよびRmax)を決定した。ナノスケール構造体(X、Ar、O2、CF3およびNaOH)につき1μm2およびマイクロスケール構造体(CHCl3)上では10μm2の表面積によってRq測定を行った。ポリマー表面の三次元(3D)の高品質画像を記録し、ランダムに異なる表面箇所で3回繰り返して観察された特性の再現性を確認し、平均値をとった。
捕捉気泡法を用いた静的水接触角の測定によって濡れ性の測定を行った。ビデオベースの光学式接触角メータOCA15(DataPhysics Instruments GmbH、フィルダーシュタット、ドイツ)を用いて測定を行った。電子的に制御されたHamiltonシリンジおよびニードルを用いてフィルム上に水滴(2μL)を適用することによって、水接触角を決定した。SCA20ソフトウェア(DataPhysics Instruments GmbH、フィルダーシュタット、ドイツ)を用いて接触角を計算した。その後、ロッドをXPSチャンバへ移した。XPSチャンバ(Omicron Nanotechnology GmbH)は、ベース圧力が1×10−10mbar未満であった。モノクロAl Kα(XM1000)X線源およびEA125電子エネルギーアナライザを用いて測定を行った。すべてのスペクトルを、Constant Analyzer Energy(CAE)モードで得た。電子が放出された殻によってXPSスペクトル線が特定される(1s、2s、2pなど)。
Tebu−bio(R106−05n、Cell Application,Inc.)から購入した新生仔ラット皮膚繊維芽細胞(RDF)を、α−MEM(Gibco)、10%ウシ胎仔血清(Lonza)、2mM L−グルタミン(Gibco)、100U/mlペニシリンおよび100mg/mlストレプトマイシン(Gibco)を含む基礎培地で培養した。基礎培地に3000細胞/cm2の初期播種密度でRDFを増幅し、2〜3日毎にリフレッシュした。細胞を、細胞播種のためにトリプシン処理する前に80〜90%のコンフルエンシーで採取した。ラット肺胞マクロファージ細胞株NR8383を米国菌培養収集所(ATCC)から得、フェノールレッドを含まないL−グルタミンを加えたα−MEM(Gibco)、15%ウシ胎仔血清(Lonza)、100U/mlペニシリンおよび100mg/mlストレプトマイシン(Gibco)を含むマクロファージ培地で、200,000生存細胞/mlの最適細胞播種密度で維持した。培地を別のフラスコに移して継代培養を行った。Corning(登録商標)細胞スクレーパ(Sigma−Aldrich、ドイツ)でこすることによって細胞の収集を行った。すべての細胞実験を、5%CO2多湿雰囲気において37℃で実施した。
改質および非改質ロッドを、サンプルごとに1cmのロッドに切り、70%エタノールで滅菌した。フェノールレッドを含まないL−グルタミンを加えたα−MEM(Gibco)、10%ウシ胎仔血清(Lonza)、100U/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシン(Gibco)を含む培地でロッドを4時間プレインキュベートした。48ウェルプレートへの細胞付着を防ぐため、および最適な静的細胞播種のために、アガロースモールド(3%wt/v)をロッドの下に配置した。500μlの体積にRDFは50,000細胞、マクロファージは100,000細胞の細胞播種密度を播種した。DNAアッセイ、およびメチレンブルー(MB)と走査型電子顕微鏡法(SEM)による画像化のため、1日目および3日目にサンプルをリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Invitrogen Life Technologies)ですすぎ収集した。
細胞接着および増殖にアクセスするために、CyQuant Cell Proliferation Assay kit(Molecular Probe)で全DNAを測定した。簡潔にいえば、培地を吸引し、サンプルをPBSで穏やかに洗浄した。それからサンプルを500μlのエッペンドルフ管に収集し、−80℃で凍結した。3回の凍結融解後、250μlの溶解バッファ(1:20溶解バッファ20×)をサンプルに室温(RT)で少なくとも1時間、および溶解バッファRNaseを用いてさらに1時間加えた。その後、細胞溶解物およびCyQuant GRダイ(1×)を1:1で白色96ウェルプレートにおいて混合し、暗所で15分間インキュベートした。分光光度計(The VICTOR3 Multilabel Plate Reader Perkin Elmer Corporation)を用いて、蛍光を480および520nmの励起波長および発光波長でそれぞれ測定した。
細胞培養サンプル(n=4)から培地を吸引し、細胞をPBSで洗浄し、新たに調製したPBS中10%のホルムアルデヒドによりRTで30分間固定した。PBSですすいだ後、サンプル(n=2)を、PBS中1%のメチレンブルー溶液で1〜2分間インキュベートし、PBSでさらにすすいで非特異的染色を除去した。Olympus SZ−III−Stereo Microscopesでサンプルを観察してサンプルの細胞分布を見た。他の固定サンプル(n=2)については、PBSですすいだ後、細胞をPBS中0.1%のトリトンX−100により4℃で15分間透過処理し、1%ウシ血清アルブミン(BSA)により室温で1時間ブロックした。細胞を、Vincullin−FITC(1:400)、Phalloidin−Texas Red(1:100)およびDapi(1:100)で、合間に3回の洗浄ステップを入れて染色した。蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse E600)で画像を得た。その後、すべての染色サンプル(n=4)に、ステップあたりのインキュベーション時間を30分として、70−80−90−100%の脱水ステップを行った。100%の後、サンプルを、100%エタノールに沈めた組織バッグに保存し、臨界点乾燥機チャンバ(CPD 030 Critical Point Dryer、Leica)へ移した。4℃で100%メタノールを液体二酸化炭素と交換し、液体二酸化炭素を40℃で気体状態に変えた。二酸化炭素ガスを1mbarで外へ排出した。すべてのガスを除去したあと、サンプルは、40mAの電流および100mTorrの分圧での30秒間の金スパッタリングの用意ができた。Philips XL30 ESEM−FEG走査型電子顕微鏡(SEM)を10kVおよび10mmの作動距離で用いて細胞の形態を研究した。
異なるポイントで細胞培地を集め、TGF−β1、IL−1β、IL−6およびIL−10のサイトカイン分泌を、ELISAアッセイを用い、製造者の指示にしたがって定量化した(DuoSet ELISA development kit、R&D Systems Europe Ltd.)。簡潔にいうと、96ウェルマイクロプレートを、ウェルあたり100μLの捕捉抗体で被覆し、室温で一晩インキュベートした。各ウェルを、洗浄バッファで3回洗浄し、ブロッキングバッファで最低1時間ブロックした。100μLサンプルの標準または対照を、室温で2時間インキュベートした。標準曲線を、製造標準にしたがって準備した。それからプレートを洗浄し、100μLの検出抗体を加え、室温で2時間インキュベートした。すすいだ後、100μLのストレプトアビジン−HRPを加え、室温で20分間インキュベートした。プレートをさらに洗浄し、100μLの基質溶液を室温で20分間加えた。最後に、50μLの停止溶液を各ウェルに加えた。マイクロプレートリーダにより450nmおよび540nmの波長で測定を行った。
培養から4日後および7日後に合成されロッドに堆積したエラスチンおよびコラーゲンの量を、コラーゲンおよびエラスチン染色アッセイで測定した。サンプル(n=4)を、冷酸ペプシン(0.1mg/0.5M酢酸1ml)を用いてコラーゲン抽出し、一晩4℃で置いた。Sircol Dye Reagentを加える前にさらなるコラーゲン単離および濃縮を行った。ピクロシリウス(picosirius)レッドベースの比色SirCol(商標)コラーゲン染料結合アッセイキット(Biocolor Ltd.)にしたがってアッセイを行い、マイクロプレートリーダにより540nmで測定した。エラスチン定量化のためのロッド(n=4)は、まず0.25Mシュウ酸で、100℃で1時間加熱してα−エラスチンを抽出した。さらに、Fastinエラスチンアッセイキット(Biocolor Ltd.)を用いてエラスチン定量化を行い、マイクロプレートリーダにより513nmで測定した。
すべての生化学アッセイを、トリプリケートの生物サンプルで行った。図の説明に別段の指示がない限り、Tukeyの多重比較試験を用いた二元配置分散分析(ANOVA)によって統計分析を行った(p<0.05)。エラーバーは標準偏差を示す。すべての図に以下が当てはまる:*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001。
見て取れるように、図3は、異なる表面処理および暴露時間の前および後のPA300、PA1000およびPCLの3D AFM画像である(走査サイズ1μm2、但しHCl3は25μm2)。図5は、PA300上に付着したラット皮膚繊維芽細胞(RDF、左)およびマクロファージ(右)のDNAアッセイ分析である。非改質(X)ロッドに、アルゴンプラズマ処理を30、45および60分間(左から右のバーに向かってAr30−45−60)、酸素またはトリフルオロメタンプラズマ処理を2.5、5、10分間(左から右のバーに向かってO22.5−5−10、CHF32.5−5−10)のいずれかを行った。他の非改質ロッドは、水酸化ナトリウムを1Mまたは4Mの濃度で5〜10分間(左から右のバーに向かってNaOH1M:5−10、NaOH4M:5−10)、クロロホルムまたはジクロロメタンを1、5または10秒間(左から右のバーに向かってCHCl3:1−5−10秒、CH2Cl2−10秒)のいずれかで用いてウェットエッチングで処理した。3日目の倍増数が各バーの上に見られる。RDF付着は、CHF35−10サンプルを除くすべての処理で統計的に増加した。マクロファージ付着は、Ar、OxおよびCHCl3処理の後に統計的に増加した。星印(*、P<0.05)は、処理タイプごとの最善のパラメータを示す。このように、すべての表面改質ロッドで細胞接着の増加が観察され、Pa300が他のポリマータイプと比較して最も有意な増加を示した。
ブタモデルには、大きな直径のPEOT/PBT 300ロッド(4.2mm)が必要である。残念ながら、これらの大きな直径のロッドの生産は、(Bioplotterデバイス、Envisiontec GmbH等による)ラピッドプロトタイピングを用いては不可能である。溶融押出も、望ましくない巨視的な表面粗さが生じるため好ましくない。ポリマーのペレットをモールドキャビティ内に置き、その後キャビティを上型によって閉じ、モールドをポリマーの融点より高温に加熱する圧縮成形が、最善の製造方法であるように思われた。それからモールドの冷却後に製品を除去することができる。
ポリ−ε−カプロラクトンからなる外部電界紡糸シート(PCL、Purac Biomaterials、オランダ)を、10±2μmの繊維厚、90±3%の多孔率、および約400μmの全厚で製作した。440μm厚のガンマ滅菌シート(n=3)の引張強度を、50Nロードセルを備えた一軸引張ステージ(Mecmesin、MultiTest 1−i)を用いて測定した。サンプルを10mm/分で伸長し、時間、変位および力を記録した。応力−ひずみ曲線の線形部分からヤング係数を決定した。参照として、羊肺動脈のサンプルを測定した(n=18)。25kGyを上回るガンマ放射線を用いてロッドおよびシートを滅菌した(Synergy Health、オランダ)。クロロホルムエッチングしたロッドおよびPCLシートの表面に対するガンマ放射線の効果を、SEMを用いて評価した。PCLシート(n=3)の引張強度は、肺動脈の1MPaと比較して、9MPaであると分かった。組織構造体をシートで覆うこと、すなわちシートを組織構造体のまわりに固定することにより、本開示による組織構造体を支持するためにシートを用いることができる。
Claims (10)
- 異物反応を誘発することによって組織構造体を提供するように構成された、直径2〜100mmの少なくとも部分的にロッドの形のデバイスであって、前記デバイスは、異物反応を誘発できる材料を含み、前記材料は、ヒトまたは動物の体の皮下スペースに6週間の期間にわたり存在するときに、その10重量%未満が分解する材料であり、前記デバイスの表面は、二乗平均平方根粗さ(Rq)が原子間力顕微鏡法(AFM;Atomic Force Microscopy)により、前記デバイスの表面の100μm2あたり測定されたときに、100nm〜5000nmである、デバイス。
- 異物反応を誘発できる前記材料は、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ(オルトエステル)、ポリホスホエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンフマレート、ポリテレフタレートからなる群もしくは前記群の1つ以上のコポリマー、または式A/B/Cによって表されるのが好ましいポリ(エチレンオキシドテレフタレート)−ポリ(ブチレンテレフタレート)コポリマーより選択され、式中、
Aは、コポリマー反応において使用される最初のポリエチレングリコール(PEG)の分子量を指し、200〜400の間であり、275〜325の間であるのが好ましく;
Bは、コポリマー中のポリ(エチレンオキシドテレフタレート)の重量%を指し、40〜70であり、50〜60であるのが好ましく;
Cは、コポリマー中のポリ(ブチレンテレフタレート)の重量%を指し、30〜60であり、40〜50であるのが好ましい、
請求項1記載のデバイス。 - 前記デバイスの外側表面は孔を有し、
孔密度は、100μm2あたりの孔が10〜100であり;および/または
平均孔直径は、0.3〜2.0μmであるのが好ましい、
請求項1〜2のいずれか一項に記載のデバイス。 - 前記デバイスの外側表面は、捕捉気泡法により測定して少なくとも75°の接触角によって特徴づけられる濡れ性をもつ、請求項1〜3のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、一方もしくは両方の長手方向端から30mm以内、好ましくは10mm以内に凹部を含み、および/または、前記デバイスの一方もしくは両方の長手方向端の縁に丸みがつけられる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、一方または両方の長手方向端から50mm以内、または好ましくは30mm以内で曲げられ、前記デバイスはS形状を有するのが好ましい、請求項1〜5のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、細胞外マトリックスタンパク質および/または成長因子で少なくとも部分的に被覆される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、長さ30〜800mmおよび/または直径3〜20もしくは4〜15mmであり、長さ50〜150mmおよび/または直径6〜10mmであるのが好ましい、請求項1〜7のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記デバイスは、皮下移植に適し、および/または前記デバイスは、ヒトまたは動物の体に皮下挿入されたときに異物反応を誘発することができる、請求項1〜8のいずれか一項に記載のデバイス。
- 請求項1に記載の異物反応を誘発することによって組織構造体を提供するように構成されたデバイスを生産する方法であって、
a)直径3〜20mmの少なくとも部分的に少なくとも1つのロッドの形であるモールドキャビティであって、前記ロッドの形は、少なくとも2つのモールド部分のU形状の内側表面によって画成される、モールドキャビティ
を含む装置を提供するステップと;
b)任意にプレス手段を用いて、流体ポリ(エチレンオキシドテレフタレート)−ポリ(ブチレンテレフタレート)コポリマーを前記モールドキャビティの前記少なくとも1つのロッドの形の少なくとも一部に満たすステップと;
c)前記コポリマーを固化させるステップと;
d)前記少なくとも2つのモールド部分を前記固化したコポリマーから分離して、直径3〜20mmのロッドの形の少なくとも1つのデバイスを得る、ステップと;
e)前記少なくとも1つの得られたデバイスをクロロホルムおよび/またはジクロロメタンに5〜15秒さらして、直径3〜20mmのロッドの形の少なくとも1つのデバイスを得る、ステップであって、前記デバイスは、ポリ(エチレンオキシドテレフタレート)−ポリ(ブチレンテレフタレート)コポリマーを含み、前記デバイスの表面は、二乗平均平方根粗さ(Rq)が原子間力顕微鏡法(AFM;Atomic Force Microscopy)により、前記デバイスの表面の100μm2あたり測定されたときに、100nm〜5000nmである、ステップと
を含む、方法。
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