JP6519173B2 - Mutant PCNA derived from Thermococcus kodakaraensis - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡ複製因子に関し、より詳しくは、ＤＮＡ複製を補助する機能に優れたＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ（増殖核抗原）（本明細書では、ＰＣＮＡとも記載する。）に関する。 The present invention relates to a DNA replication factor, and more particularly to Proliferating Cell Nuclear Antigen (proliferating nuclear antigen) (also referred to herein as PCNA) which is excellent in the function of assisting DNA replication.

ＤＮＡ複製は、ＤＮＡヘリカーゼで複製起点の二本鎖構造が解かれることにより開始される。解かれたＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が結合して一本鎖が安定化され、さらに、それぞれの鎖上にプライマーを合成するためのプライマーゼが働く。次に複製因子Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｃ（本明細書では、ＲＦＣとも記載する。）がプライマーを認識して結合し、ＰＣＮＡをＤＮＡ鎖上に誘導する。ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ鎖上に留めておくためのクランプの役目をし、ＰＣＮＡと複合したＤＮＡポリメラーゼが新生鎖を合成する。 DNA replication is initiated by breaking the double stranded structure of the replication origin with DNA helicase. The single-stranded DNA binding protein binds to the unfolded DNA to stabilize the single strand, and further, a primer acts to synthesize a primer on each strand. The replication factor Replication Factor C (also referred to herein as RFC) then recognizes and binds the primers and induces PCNA on the DNA strand. PCNA serves as a clamp to keep DNA polymerase on the DNA strand, and DNA polymerase complexed with PCNA synthesizes nascent strand.

ここで挙げたＰＣＮＡは生体内での重要な複製因子であり、ＤＮＡ合成系においてもＰＣＮＡの添加は、ポリメラーゼのＤＮＡ伸長活性（プライマー伸長活性）および増幅増強活性を促進することが知られている。ＤＮＡ合成系で用いられるＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のもの（以下、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡとも表記する）、および、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ−１株由来のもの（以下、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ１とも表記する）が知られている。 PCNA listed here is an important replication factor in vivo, and it is known that addition of PCNA also promotes DNA extension activity (primer extension activity) and amplification enhancing activity of polymerase even in DNA synthesis system . As PCNA used in a DNA synthesis system, those derived from Pyrococcus furiosus (hereinafter also referred to as Pfu-PCNA) and those derived from Thermococcus kodakaraensis KOD-1 strain (hereinafter referred to also as KOD-PCNA1) are known. It is done.

真核細胞および古細菌において、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。特許文献１によれば、ＰＣＮＡの多量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合し形成される。野生型Ｐｆｕ−ＰＣＮＡでは、配列番号２に記載のアミノ酸配列における、１３９番目、第１４３番目および第１４７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８４番目、第１０９番目のアミノ酸残基群とが、接合し、相互に影響しあうネットワークを形成すると考えられている。 In eukaryotic cells and archaea, PCNA often forms trimers. According to Patent Document 1, a multimer of PCNA is formed by joining the N-terminal side region of one monomer and the C-terminal side region of the other monomer as an interface. In wild-type Pfu-PCNA, the 139th, 143rd and 147th amino acid residue groups and the 82nd, 84th and 109th amino acid residues in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 It is believed that the two join together to form a mutually affecting network.

また特許文献１では、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡの変異体についても検討されている。野生型のＰｆｕ−ＰＣＮＡにおいては、多量体形成に寄与する界面領域内で分子間相互作用を形成する部位が、単量体相互に、電荷的に引き合うようなアミノ酸残基で構成されている。これに対し、変異体では分子間相互作用を形成するアミノ酸残基どうしが電荷的に反発しあうようにアミノ酸残基が構成されており、単量体のまま又は多量体を形成して、野生型より優れた増幅増強活性を備えているとされている。これは変異を加えることで多量体形成能が弱まり、ＲＦＣなどのクランプローダーがなくても核酸にロードしやすくなったためと考えられる。 Patent Document 1 also discusses Pfu-PCNA variants. In wild-type Pfu-PCNA, the site that forms an intermolecular interaction in the interface region contributing to multimer formation is composed of amino acid residues that allow the monomers to mutually charge. On the other hand, in the mutant, amino acid residues are configured such that amino acid residues forming intermolecular interactions repel each other in a charge manner, and they remain as monomers or form multimers, resulting in a wild It is believed to have better amplification enhancing activity than type. This is considered to be due to the fact that the addition of mutation weakens the ability to form multimers, making it easier to load nucleic acids without using a clamp loader such as RFC.

また、我々はＫＯＤ−ＰＣＮＡ１についても上記、界面の部位に変異を入れた変異体を評価し、界面領域への変異が増幅増強活性に大きく関わることを示している（特許文献２、および３）。
これら特許文献１〜３のＰＣＮＡ変異体を用いればＤＮＡ合成における増幅量の改善につながることがわかっている。 Moreover, we evaluated the mutant which put the mutation in the site of the above-mentioned also about KOD-PCNA1, and showed that the mutation to the interface area is greatly concerned in amplification enhancement activity (patent documents 2 and 3). .
It is known that use of the PCNA variants of Patent Documents 1 to 3 leads to improvement of the amplification amount in DNA synthesis.

一方、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓは、上記に示したＫＯＤ−ＰＣＮＡ１のほかに、もうひとつのＰＣＮＡ（ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２）を持つことが知られている（非特許文献１）。このＫＯＤ−ＰＣＮＡ２はＫＯＤ−ＰＣＮＡ１とタンパク相同性が低く、上記に記載した界面とは異なるアミノ酸で多量体形成を行っていることが示されている。
構造解析の結果からは配列番号１に記載のアミノ酸における、第１４３番目、第１７７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８７番目、第１０７、第１０９番目のアミノ酸残基群とが、また第７５番目のアミノ酸と第１７２番目のアミノ酸とが接合し、相互に影響しあうネットワークを形成すると考えられている。 On the other hand, Thermococcus kodakaraensis is known to have another PCNA (KOD-PCNA2) in addition to KOD-PCNA1 shown above (Non-patent Document 1). This KOD-PCNA2 has low protein homology with KOD-PCNA1, and it has been shown that multimer formation is carried out with an amino acid different from the interface described above.
From the result of structural analysis, the 143rd amino acid residue group and the 177th amino acid residue group and the 82nd amino acid residue group, the 87th amino acid residue group, and the 109th amino acid residue group in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 are It is also believed that the 75th amino acid and the 172nd amino acid are joined to form a mutually affecting network.

しかしながら、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２について、多量体形成部位に変異を入れた例はなく、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２がＰＣＲで働くかは知られていなかった。また、Ｐｆｕ−ＰＣＮＡ、およびＫＯＤ−ＰＣＮＡ１のＰＣＮＡを用いても、ＰＣＲでうまく増幅しないことが散見されており、別のＰＣＮＡでの評価が求められていた。 However, for KOD-PCNA2, there was no example in which a mutation was added to the multimerization site, and it was not known whether KOD-PCNA2 works in PCR. Moreover, even if it used PCNA of Pfu-PCNA and KOD-PCNA1, it was scattered that it did not amplify well by PCR, and evaluation by another PCNA was called for.

ＷＯ２００７／００４６５４（国際公開、再公表）WO 2007/004654 (International Publication, Re-publication) 特願２０１３−１６２９９０Japanese Patent Application No. 2013-162990 特願２０１３−１６２９９１Japanese Patent Application No. 2013-162991

ＰＮＡＳ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １５，２０１１ ｖｏｌ. １０８ ｎｏ. ７ ２７１１-２７１６PNAS February 15, 2011 vol. 108 no. 7 2711-2716

本発明が解決しようとする課題は、ＤＮＡ複製において、増幅増強活性に優れたＰＣＮＡ変異体を得ることである。 The problem to be solved by the present invention is to obtain a PCNA mutant excellent in amplification enhancing activity in DNA replication.

本発明者らは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＰＣＮＡ（ＫＯＤ―ＰＣＮＡ２）の多量体形成に関わるアミノ酸残基（配列番号１）の第１０７番目に相当するアミノ酸を中性アミノ酸残基に改変した変異型ＰＣＮＡを作製することにより、ＤＮＡ複製において、増幅増強活性を示すという知見を得、本発明を完成した。代表的な本発明は、以下の通りである。 The present inventors have modified PCNA in which the amino acid corresponding to the 107th amino acid residue (SEQ ID NO: 1) involved in multimer formation of PCNA (KOD-PCNA2) derived from Thermococcus kodakaraensis is modified to a neutral amino acid residue. As a result, the present invention has been completed by obtaining the finding that it exhibits an amplification enhancing activity in DNA replication. The representative invention is as follows.

［項１］
以下の（１）から（３）のうちいずれかで示されるＰＣＮＡ単量体。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の第１０７番目のアミノ酸残基を中性アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）（１）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における、１０７番目に相当するアミノ酸残基以外の、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
［項２］
項１に記載のＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
［項３］
項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
［項４］
項３に記載のベクターを含む形質転換体。
［項５］
項４に記載の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体または多量体を回収する工程を含む、ＰＣＮＡの製造方法。
［項６］
項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含むＤＮＡ複製用試薬。
［項７］
項６に記載の試薬を備えた、ＤＮＡ複製用キット。
［項８］
ＰＣＲ用の試薬を備えた、項７に記載のＤＮＡ複製用キット。
［項９］
項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体と、ＤＮＡポリメラーゼとの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法。
［項１０］
前記ＤＮＡの合成反応がＰＣＲである、項９に記載のＤＮＡの複製方法。 [Item 1]
The PCNA monomer shown by either of following (1) to (3).
(1) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which the 107th amino acid residue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is substituted with a neutral amino acid residue.
(2) In the PCNA monomer shown in (1), one or several amino acid residues other than the amino acid residue corresponding to position 107 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are further substituted or deleted A polypeptide comprising an amino acid sequence which has been deleted, inserted and / or added, and which has an amplification enhancing activity.
(3) A polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 80% or more with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, and having amplification enhancing activity.
[Section 2]
Item 2. A DNA encoding an amino acid sequence of the PCNA monomer according to Item 1.
[Section 3]
A vector into which the DNA according to item 2 is incorporated.
[Section 4]
Item 6. A transformant comprising the vector according to item 3.
[Section 5]
A transformant according to item 4 is cultured in a medium, and PCNA monomers and / or multimers composed of the monomers are accumulated in or in the transformants, A method of producing PCNA, comprising the step of recovering a mer or multimer.
[Section 6]
Item 6. A reagent for DNA replication, comprising the PCNA monomer according to Item 1 and / or a multimer composed of the monomer.
[Section 7]
A kit for DNA replication, comprising the reagent according to Item 6.
[Section 8]
Item 8. A kit for DNA replication according to item 7, comprising a PCR reagent.
[Section 9]
Item 2. A method for replicating DNA, which comprises carrying out a synthesis reaction of DNA in the presence of a DNA polymerase and the PCNA monomer according to Item 1 and / or a multimer composed of the monomer.
[Section 10]
Item 10. The method for replicating DNA according to Item 9, wherein the synthesis reaction of the DNA is PCR.

本発明により、ＤＮＡ複製における増幅増強活性に優れた汎用性の高いＤＮＡ複製促進因子が提供される。 The present invention provides a highly versatile DNA replication promoting factor excellent in amplification enhancing activity in DNA replication.

本発明のＰＣＮＡの増幅増強活性の確認Confirmation of the amplification enhancing activity of PCNA of the present invention

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列およびその個々の構成因子については、アルファベット表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。欠損はΔで表記する。
また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。たとえば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。三重変異体以上の多重変異体については、さらに「／」の記号のあとに「Ｐ３６Ｈ」などの変異箇所についての情報を追記する。
また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」という場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail while showing embodiments of the present invention.
In the present specification, a simplified symbol in alphabetic notation may be used for a base sequence, an amino acid sequence and individual components thereof, but all follow the practice in the field of molecular biology and genetic engineering. Moreover, in the present specification, in order to briefly show the mutation of the amino acid sequence, for example, a notation such as "D143A" is used. “D143A” indicates that the aspartic acid at position 143 is substituted with alanine, that is, the type of amino acid residue before substitution, the position thereof, and the type of amino acid residue after substitution. The defect is denoted by Δ.
Also, the SEQ ID NOs correspond to the SEQ ID NOs listed in the sequence listing, unless otherwise specified. Moreover, in the case of multiple mutants, the above-mentioned notation is expressed by connecting with "/". For example, "D143A / D147A" indicates that the 143rd aspartic acid was substituted by alanine, and the 147th aspartic acid was substituted by alanine. For multiple mutants of triple mutants or more, information on the mutation site such as "P36H" is additionally written after the symbol "/".
Further, in the present specification, "mutant" in the case of "mutant PCNA" means having an amino acid sequence different from conventionally known PCNA, and may be caused by artificial mutation or natural mutation. It does not distinguish.

（１）本発明のＰＣＮＡ
本発明の実施形態の一つは、以下の（１）から（３）のうちいずれかで示されるＰＣＮＡ単量体である。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１０７番目のアミノ酸残基を中性アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）（１）で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における、１０７番目に相当するアミノ酸残基以外の、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加（これらを纏めて「変異」とも表す。）されているアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、増幅増強活性を有するポリペプチド。 (1) PCNA of the present invention
One embodiment of the present invention is a PCNA monomer shown in any one of the following (1) to (3).
(1) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which the 107th amino acid residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with a neutral amino acid residue.
(2) In the PCNA monomer shown in (1), one or several amino acid residues other than the amino acid residue corresponding to position 107 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are further substituted or deleted A polypeptide comprising an amino acid sequence which has been deleted, inserted and / or added (these are also collectively referred to as "mutation") and which has an amplification enhancing activity.
(3) A polypeptide comprising an amino acid sequence having an identity of 80% or more with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1, and having amplification enhancing activity.

（１．１）アミノ酸配列
配列番号１は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のＰＣＮＡ（以下、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２とも記載する。）のアミノ酸配列である。 (1.1) Amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of PCNA derived from Thermococcus kodakaraensis (hereinafter, also described as KOD-PCNA2).

配列番号１において、１０７番目のアミノ酸残基はＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基のうちの１つである。ＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基は、構造解析により解明されており、配列番号１に記載のアミノ酸における、第１４３番目、第１７７番目のアミノ酸残基群と、第８２番目、第８７番目、第１０７、第１０９番目のアミノ酸残基群とが、また第７５番目のアミノ酸と第１７２番目のアミノ酸とが接合することにより形成される。真核細胞および古細菌においては、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。 In SEQ ID NO: 1, the amino acid residue at position 107 is one of the amino acid residues involved in multimer formation of PCNA. The amino acid residues involved in multimer formation of PCNA have been elucidated by structural analysis, and in the amino acids described in SEQ ID NO: 1, the 143rd and 177th amino acid residue groups, and the 82nd and 87th amino acids. The 107th, 109th amino acid residue groups are formed by the 75th amino acid being joined with the 172nd amino acid. In eukaryotic cells and archaea, PCNA often forms trimers.

上記（２）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のＰＣＮＡ単量体をコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＰＣＮＡ単量体を得ることができる。バリアントＰＣＮＡ単量体には、ＰＣＮＡを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。 In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, one or several amino acid residues may be substituted, deleted, inserted and / or added (below, as long as the polypeptide of (2) above retains amplification enhancing activity. These are collectively referred to as “mutated”.) A polypeptide consisting of the amino acid sequence.
One or several mutations may be treated with restriction enzymes, treatment with exonuclease or DNA ligase, position-directed mutagenesis or random mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New It is possible to implement by introduce | transducing a mutation into DNA which codes PCNA monomer of this invention mentioned later using well-known methods, such as York | yoke). In addition, the variant PCNA monomer can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation. Variant PCNA monomers also include naturally occurring variants (e.g., single nucleotide polymorphisms), such as based on individual differences in microorganisms carrying PCNA, differences in species and genera, and the like.

上記（３）のポリペプチドは、増幅増強活性を保持することを限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＰＣＮＡ単量体が有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。 The polypeptide of (3) above is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as long as the amplification enhancing activity is retained. Preferably, the identity of the amino acid sequence possessed by the PCNA monomer of the present invention and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 85% or more, more preferably 88% or more, still more preferably 90% or more, more preferably More preferably, it is 93% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more. A polypeptide consisting of an amino acid sequence having such a certain degree of identity or more can be prepared based on known genetic engineering techniques as described above.

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。 Various methods are known as methods for calculating the identity of amino acid sequences. For example, it can be calculated using a commercially available or analysis tool available through a telecommunication line (Internet).
Here, the National Local Biotechnological Information Center (NCBI) homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool) http: // www. ncbi. nlm. nih. Amino acid sequence identity is calculated by using default (default) parameters at gov / BLAST /.

上記の（２）または（３）に記載したようなＰＣＮＡとして、好ましくは、ＰＣＮＡの精製を簡便にすべくＮ末に挿入したＨｉｓタグなどが挙げられるが、これに限定されない。 Preferred examples of PCNA as described in (2) or (3) above include, but not limited to, a His tag inserted into the N-terminal to simplify purification of PCNA.

（１．２）中性アミノ酸残基
本発明のＰＣＮＡ単量体においては、配列番号１における１０７番目のアミノ酸残基が中性アミノ酸残基に置換されるが、置換する塩基性アミノ酸の種類は特に限定されない。本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響がもっとも小さいアラニンである。 (1.2) Neutral amino acid residue In the PCNA monomer of the present invention, the amino acid residue at position 107 in SEQ ID NO: 1 is substituted with a neutral amino acid residue, but the kind of basic amino acid to be substituted is particularly It is not limited. The neutral amino acids of the present invention include, if natural, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, proline, serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine and glutamine. Preferably, it is alanine which has the least influence on the three-dimensional structure of the peripheral site of the substitution site.

（１．３）増幅増強活性
増幅増強活性はＰＣＲによって評価できる。鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、およびファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液に、評価するＰＣＮＡを添加し、ＰＣＮＡ添加なしのものと増幅量を比較することで、増幅増強活性を確認することができる。好ましくは、増幅量が少ないＰＣＲ反応系でＰＣＮＡの増幅増強活性は評価しやすく、さらに好ましくは、ｄＵＴＰを含む反応系や伸長時間が短い反応条件などでＰＣＮＡの増幅増強活性を評価することが望ましい。 (1.3) Amplification enhancing activity The amplification enhancing activity can be evaluated by PCR. PCNA to be evaluated is added to a PCR reaction solution containing DNA as a template, buffer, magnesium, dNTPs, primers, and DNA polymerase belonging to family B, and amplification amount is compared with that without addition of PCNA. Potentiating activity can be confirmed. Preferably, the amplification enhancing activity of PCNA can be easily evaluated in a PCR reaction system with a small amount of amplification, and more preferably, it is desirable to evaluate the amplification enhancing activity of PCNA in a reaction system containing dUTP or a reaction condition with short extension time. .

（１．３．１）増幅増強活性の測定方法
ＰＣＮＡの増幅増強活性を評価しやすくするため、伸長時間を短くし、増幅量を少なくした反応系でＰＣＮＡの増幅増強活性を比較する。
本明細書においては、増幅増強活性は以下の方法で評価する。
（ｉ）ＰＣＲ
ＫＯＤ Ｄａｓｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（反応に用いる濃度の１０倍に濃縮されている。）を用いて、
１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
１ｐｍｏｌのプライマー（配列番号３及び４）、
５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、
１Ｕの ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− ポリメラーゼ
を含むよう反応液を調製する。
５０μｌの前記反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、
９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。
（ｉｉ）ＰＣＲ産物の分析
反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片を、ＰＣＮＡを添加していないものと比較することで増幅増強活性を評価することができる。増幅増強活性の高いＰＣＮＡは添加によって増幅量が増加する。 (1.3.1) Method of measuring amplification enhancing activity In order to facilitate evaluation of the amplification enhancing activity of PCNA, the elongation enhancing activity of PCNA is compared in a reaction system in which the extension time is shortened and the amount of amplification is reduced.
In the present specification, amplification enhancing activity is evaluated by the following method.
(I) PCR
Using 10 × PCR Buffer (concentrated to 10 times the concentration used for the reaction) attached to KOD Dash (Toyobo Co., Ltd.)
1 × PCR Buffer,
0.2 mM dNTPs,
1 pmol of primer (SEQ ID NO: 3 and 4),
50 ng of human genomic DNA (from Roche),
The reaction is prepared to contain 1 U of KOD-Plus-polymerase.
Add 250 ng of PCNA to be evaluated to 50 μl of the reaction solution,
After pre-reaction at 94 ° C. for 2 minutes, PCR is performed with a schedule of repeating 98 ° C., 10 seconds → 68 ° C., 30 seconds for 30 cycles.
(Ii) Analysis of PCR product After completion of the reaction, 5 μl of the reaction solution is subjected to agarose electrophoresis, ethidium bromide staining is performed, and amplification of the amplified DNA fragment is performed under ultraviolet irradiation by comparison with that to which PCNA is not added. Activity can be assessed. Addition of PCNA having high amplification enhancing activity increases the amount of amplification.

増幅量の増加を定量的に評価する方法としては、Ｇｅｌ Ｐｒｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）などソフトを利用することが挙げられるが増幅量を数値化できるソフトであれば、これに限定されない。
このような方法で増幅量を比較したとき、ＰＣＮＡを添加した場合の増幅量が、ＰＣＮＡを添加しなかった場合の増幅量の１．０倍（好ましくは１．２倍、さらに好ましくは１．５倍、さらに好ましくは２倍、３倍）を超える。もしくは増幅していなかったターゲットが増幅すれば、そのＰＣＮＡが「増幅増強活性を有する」と判断する。 As a method of quantitatively evaluating the increase in amplification amount, use of software such as Gel Pro Analyzer (Media Cybernetics) may be mentioned, but it is not limited to this as long as the software can digitize the amplification amount.
When the amounts of amplification are compared by such a method, the amount of amplification when PCNA is added is 1.0 times (preferably 1.2 times, more preferably 1.) the amount of amplification when PCNA is not added. More than 5 times, more preferably 2 times and 3 times). Alternatively, if a target that has not been amplified is amplified, it is determined that the PCNA has "amplification enhancing activity".

（１．４）
ＰＣＲにおいては、プライマーと鋳型ＤＮＡを用いてＤＮＡ複製を繰り返し、幾何級数的にＤＮＡを増幅させる。そのため、ＰＣＮＡはＤＮＡポリメラーゼに対するクランプとしての機能を果たすと共に、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型上で安定した後または所定領域の増幅後には鋳型から速やかに外れることが望ましい。
本発明のＰＣＮＡ変異体が従来のＰＣＮＡ変異体よりＤＮＡの複製反応を促進し得る作用・機序は必ずしも明確ではないが、多量体により形成される環構造が温度上昇時に解除されるような構造を有することにより、ＤＮＡの複製反応の繰り返しが円滑に行われ、その結果、ＤＮＡ複製反応をより促進するということが推測される。 (1.4)
In PCR, DNA replication is repeated using primers and template DNA to amplify DNA geometrically. Therefore, it is desirable for PCNA to function as a clamp for DNA polymerase and to be quickly released from the template after the DNA polymerase is stabilized on the template or after amplification of a predetermined region.
Although the action and mechanism by which the PCNA variant of the present invention can promote the DNA replication reaction than the conventional PCNA variant is not always clear, the structure is such that the ring structure formed by the multimer is released when the temperature rises. It can be inferred that repetition of the DNA replication reaction is smoothly carried out, and as a result, the DNA replication reaction is further promoted.

（１．５）
本発明のＰＣＮＡ単量体は、単離されたもの又は精製されたものであることが好ましい。また、本発明のＰＣＮＡ単量体は、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明のＰＣＮＡ単量体に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない）状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離されたＰＣＮＡ単量体は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＰＣＮＡ単量体は、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。また、一部または全部が三量体などの多量体を形成していてもよい。 (1.5)
The PCNA monomers of the present invention are preferably isolated or purified. In addition, the PCNA monomer of the present invention may be present in a solution or in a freeze-dried state (for example, in the form of powder) in a solution suitable for the storage. The term "isolated" when used in connection with the PCNA monomer of the present invention substantially includes components other than the enzyme (for example, contaminating proteins derived from host cells, other components, culture fluid, etc.) Not) state. Specifically, for example, the isolated PCNA monomer of the present invention has a content of contaminating proteins of less than about 20%, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5% by weight of the total. Even more preferably, it is less than about 1%. On the other hand, the PCNA monomer of the present invention may be present in a solution (eg, buffer) suitable for storage or measurement of enzyme activity. In addition, some or all may form a multimer such as a trimer.

（２）本発明のＰＣＮＡの製造方法等
（２．１）本発明のＰＣＮＡをコードするＤＮＡ
ＰＣＮＡをコードする遺伝子は、ＰＣＮＡをもつ微生物からクローニングすることができる。またアミノ酸の配列情報や核酸の配列情報をもとに人工的に合成することもできる。
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである。具体的には以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の１０７番目のアミノ酸残基を中性アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列をコードする塩基配列を示すＤＮＡ
（Ｂ）配列番号５に記載の塩基配列において、第３１９〜３２１番目が中性アミノ酸残基をコードするトリプレットに対応するヌクレオチドで置き換えられたＤＮＡ
（Ｃ）前記（Ｂ）に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、第３１９〜３２１番目が中性アミノ酸残基をコードするトリプレットに対応するヌクレオチドで置き換えられ、かつ、増幅増強活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（Ｄ）配列番号５のポリヌクレオチドの有する塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下においてハイブリダイズし、
配列番号１における１０７番目に相当するアミノ酸残基が中性アミノ酸残基で置き換えられたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、かつ、増幅増強活性を有するＰＣＮＡをコードするポリヌクレオチド (2) The method for producing PCNA of the present invention, etc. (2.1) DNA encoding PCNA of the present invention
The gene encoding PCNA can be cloned from a microorganism having PCNA. In addition, they can be artificially synthesized based on the amino acid sequence information and the nucleic acid sequence information.
One of the embodiments of the present invention is a DNA encoding the amino acid sequence of the mutant PCNA monomer of the present invention described above. Specifically, it is any of the following (A) to (D).
(A) A DNA showing a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which the 107th amino acid residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with a neutral amino acid residue
(B) DNA in which the 319st to 321st nucleotides in the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5 have been replaced with nucleotides corresponding to triplets encoding neutral amino acid residues
(C) A nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence shown in (B) above, and the 319th to 321st nucleotides replaced with nucleotides corresponding to triplets encoding neutral amino acid residues And a DNA encoding a polypeptide having amplification enhancing activity
(D) hybridizing under stringent conditions with a polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of the polynucleotide of SEQ ID NO: 5;
A polynucleotide having a base sequence encoding an amino acid sequence in which the amino acid residue corresponding to position 107 in SEQ ID NO: 1 is replaced with a neutral amino acid residue, and a polynucleotide encoding PCNA having an amplification enhancing activity

本明細書において「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。 As used herein, the term "DNA encoding a protein" refers to DNA from which the protein is obtained when it is expressed, ie, DNA having a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the protein. Therefore, DNAs that differ due to codon degeneracy are also included.

本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、増幅増強活性を備える限り、配列番号５に示される塩基配列との相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を有する。 The DNA of the present invention has a homology of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, as long as the protein having the amino acid sequence encoded by it has amplification enhancing activity. It has a base sequence of 88% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 93% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, most preferably 99% or more.

塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＡｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴ ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（％）を算出する。 Various methods are known as methods for calculating the identity of base sequences. For example, it can be calculated using a commercially available or analysis tool available through a telecommunication line (Internet).
In this specification, nucleotide sequence homology is obtained by performing a search using blastn as a program and setting various parameters as default values in the homology algorithm Advanced BLAST 2.1 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Calculate the value (%) of

本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質が増幅増強活性を有する限り、配列番号５に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。 The DNA of the present invention is a DNA which hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, as long as the protein encoded by it has amplification enhancing activity. good.

「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。
本明細書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。
ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ， １５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ， ｐＨ ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍＬの変性サケ***ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる。 "Stringent conditions" generally refer to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Such stringent conditions are known to those skilled in the art and can be set, for example, with reference to Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
As used herein, "stringent conditions" refer to the conditions shown below.
50% formamide, 5 × SSC (0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0) as a hybridization solution, 1 × Denhardt's solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 μg / mL denatured salmon sperm DNA, Use 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)).

（２．２）ベクター
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだベクターである。 (2.2) Vector One of the embodiments of the present invention is a vector into which a DNA encoding the amino acid sequence of the above-mentioned mutant PCNA of the present invention is incorporated.

本発明のベクターは、上記（２．１）で説明する本発明の変異型ＰＣＮＡをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。
ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。 The vector of the present invention is a vector into which the DNA encoding the mutant PCNA of the present invention described in (2.1) above is incorporated. Here, a "vector" is a nucleic acid molecule (carrier) capable of transporting a nucleic acid molecule inserted therein into a target such as a cell, and is capable of replicating the DNA of the present invention in an appropriate host cell. As long as it is present and its expression is possible, its type and structure are not particularly limited. That is, the vector of the present invention is an expression vector. As the type of vector, an appropriate vector is selected in consideration of the type of host cell.
Specific examples of vectors include plasmid vectors, cosmid vectors, phage vectors, viral vectors (adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, herpes virus vectors, etc.) and the like. Moreover, it is also possible to use a vector suitable for using filamentous fungi as a host or a vector suitable for self cloning.

大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。 When E. coli is used as a host, for example, using M13 phage or its variant, λ phage or its variant, pBlueScript or its variant, pBR322 or its variant (such as pB325, pAT153, pUC8 etc.) etc. it can. When yeast is used as a host, pYepSec1, pMFa, pYES2 and the like can be used. When an insect cell is used as a host, for example, pAc, pVL, etc. can be used. When an mammalian cell is used as a host, for example, pCDM8, pMT2PC, etc. can be used, but it is not limited thereto. .

発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １．８４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。 The expression vector usually contains a promoter sequence necessary for expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence for promoting expression, and the like. Expression vectors containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence or absence (and its extent) of introduction of the expression vector can be confirmed using a selection marker. Insertion of the DNA of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. can be performed using standard recombinant DNA techniques (eg, Molecular Cloning, Third Edition, 1.84). , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, which can be referred to, using known methods using restriction enzymes and DNA ligase).

（２．３）形質転換体
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明の変異型ＰＣＮＡが備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを組み込んだベクターを含む形質転換体である。
ＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記（２．２）で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現して変異型ＰＣＮＡを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。 (2.3) Transformant One of the embodiments of the present invention is a transformant comprising a vector into which a DNA encoding the amino acid sequence of the above-mentioned mutant PCNA of the present invention is incorporated.
The means for introducing DNA into the host is not particularly limited, and for example, it is introduced into the host in the state of being incorporated into the vector described in (2.2) above. The host cell is not particularly limited as long as it is possible to express the DNA of the present invention to produce mutant PCNA. Specifically, prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as yeast, mold, insect cells, cultured cells of plants, mammalian cells and the like can be used.

宿主が原核細胞の場合は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｃ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などが例として挙げられる。また、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。 When the host is a prokaryotic cell, Escherichia, Bacillus, Brevibacillus, Corynebacterium, etc. may be mentioned by way of example, and each of Escherichia coli (Escherichia coli) Examples include C600, Escherichia coli HB101, Escherichia coli DH5α, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis, Brevibacillus choshinensis, Corynebacterium glutamicum and the like. Moreover, as a vector, pBR322, pUC19, pBlueScript etc. are mentioned as an example.

宿主が酵母の場合は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属などが例として挙げられ、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、キャンデイダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリプトコッカス・エスピー（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）などが例として挙げられる。ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。 When the host is yeast, Saccharomyces (Saccharomyces), Schizosaccharomyces (Shizosaccharomyces), Candida (Candida), Pichia (Pichia), Cryptococcus (Cryptococcus), etc. are mentioned as examples, respectively. (Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis, Pichia pastoris, Cryptococcus sp., And the like. Examples of vectors include pAUR101, pAUR224 and pYE32.

宿主が糸状菌細胞である場合は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、コレトトリカム・ヒエマリス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｅｍａｌｉｓ）等を例示することができる。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。 When the host is a filamentous fungal cell, examples include Aspergillus, Trichoderma, Colletotrichum, and the like, and examples thereof include Aspergillus oryzae and Aspergillus niger (Aspergillus niger). , Trichoderma reesei, Colletotrichum hiemalis etc. can be exemplified. That is, although transformant DNA usually contains foreign DNA in a host cell, a transformant obtained by so-called self cloning using a microorganism from which DNA is derived as a host is also a preferred embodiment.

本発明の形質転換体は、好ましくは、上記（２．２）に示される発現ベクターを用いたトランスフェクションまたはトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎの方法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法、等を利用して実施することができる。 The transformant of the present invention is preferably prepared by transfection or transformation using the expression vector shown in (2.2) above. Transformation may be transient or stable transformation. Transfection and transformation can be carried out using calcium phosphate coprecipitation method, electroporation, lipofection, microinjection, Hanahan's method, lithium acetate method, protoplast-polyethylene glycol method, and the like.

形質転換体に生成させた本発明のＰＣＮＡは、必要に応じて、タンパク質精製の定法により、精製、単離することができる。 The PCNA of the present invention produced in the transformant can be purified and isolated by a conventional method of protein purification, if necessary.

（２．４）ＰＣＮＡの製造方法
本発明の実施形態の一つは、前記の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ＰＣＮＡ単量体または前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体または多量体を回収する工程を含む、変異型ＰＣＮＡの製造方法である。 (2.4) Method for Producing PCNA In one of the embodiments of the present invention, the transformant is cultured in a medium, and the PCNA monomer or the monomer is used in the transformant or in the medium. A method for producing mutant PCNA, which comprises the steps of accumulating the constructed multimer and recovering the accumulated monomer or multimer of PCNA.

上記改変ＰＣＮＡ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２〜２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、遠心することで宿主由来のタンパクを除去し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供することで、目的タンパクの発現を確認することができる。 The modified PCNA gene is transferred to an expression vector as required, and, for example, E. coli as a host is transformed with the expression vector, and then coated on an agar medium containing a drug such as ampicillin to form colonies. The colony is inoculated into a nutrient medium such as LB medium or 2 × YT medium and cultured at 37 ° C. for 12 to 20 hours, and then the cells are disrupted to extract a crude enzyme solution. As the vector, one derived from pBlueScript is preferred. Although any known method may be used as a method of disrupting the cells, for example, physical treatment such as ultrasonication, French press or glass bead disruption, or a lytic enzyme such as lysozyme can be used. The crude enzyme solution is heat-treated at 80 ° C. for 30 minutes, and centrifuged to remove host-derived proteins, and subjected to SDS-PAGE to confirm the expression of the target protein.

上記方法により選抜された菌株から精製ＰＣＮＡを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的または物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＰＣＮＡ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ−２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロースカラムクロマトグラフィーに供することで、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。 Although any method may be used to obtain purified PCNA from the strain selected by the above method, for example, the following methods are available. The cells obtained by culturing in a nutrient medium are collected and then disrupted and extracted by an enzymatic or physical disruption method to obtain a crude enzyme solution. The obtained crude enzyme extract is treated with heat, for example, at 80 ° C. for 30 minutes, and then the PCNA fraction is recovered by ammonium sulfate precipitation. This crude enzyme solution can be desalted by a method such as gel filtration using Sephadex G-25 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). After this operation, the product can be purified by Q Sepharose column chromatography to obtain a purified enzyme preparation. The purified enzyme preparation is purified by SDS-PAGE to an almost single band.

組換えタンパク質として本ＰＣＮＡを得る場合は、精製を容易にするため、配列番号１のＮ末もしくはＣ末にＨｉｓタグを挿入しても良い。 When the present PCNA is obtained as a recombinant protein, a His tag may be inserted at the N- or C-terminus of SEQ ID NO: 1 to facilitate purification.

組換えタンパク質として本ＰＣＮＡを得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本ＰＣＮＡをコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本ＰＣＮＡを得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出・精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。 Various modifications are possible if the present PCNA is obtained as a recombinant protein. For example, if the DNA encoding the present PCNA and other appropriate DNAs are inserted into the same vector and recombinant proteins are produced using the vector, any peptide or protein can be composed of recombinant proteins linked to each other. This PCNA can be obtained. In addition, modifications may be made such that addition of sugar chains and / or lipids or processing at the N-terminus or C-terminus occurs. By the above modifications, it is possible to simplify extraction / purification of a recombinant protein or to add a biological function.

なお、ＰＣＮＡの単量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合し多量体を形成する。その接合は可逆的であるため、ＰＣＮＡ単量体として発現させたものの少なくとも一部が多量体を形成することがある。 In addition, the monomer of PCNA forms a multimer by joining the N terminal side region of one monomer and the C terminal side region of the other monomer as an interface. Because the conjugation is reversible, at least a portion of what is expressed as a PCNA monomer may form multimers.

（３）本発明の変異型ＰＣＮＡの利用法等
（３．１）ＤＮＡの複製方法
本発明の実施形態の一つは、上記の本発明のＰＣＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法である。前記方法において、ＰＣＮＡは単量体であっても前記単量体で構成された多量体のいずれであってもかまわないし、その両方の形態が混在していても良い。 (3) Method of Using Mutant PCNA of the Present Invention, etc. (3.1) Method of Duplicating DNA One of the embodiments of the present invention is a method for synthesizing DNA in the presence of the above-mentioned PCNA and DNA polymerase of the present invention It is a method of replicating DNA. In the above method, PCNA may be either a monomer or a multimer composed of the above monomers, or both forms may be mixed.

ＤＮＡの複製方法は特に限定されない。ＰＣＲ、プライマーエクステンション、ニックトランスレーション、逆転写酵素によるＦｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成、などが挙げられるが、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が好適な形態として挙げられる。 The method of DNA replication is not particularly limited. Although PCR, primer extension, nick translation, First strand cDNA synthesis by reverse transcriptase, and the like can be mentioned, DNA amplification by PCR can be mentioned as a preferable form.

ＤＮＡの複製方法の条件も特に限定されない。たとえばＰＣＲの場合の代表的な条件を以下に示す。
増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＰＣＮＡ
（ｃ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｄ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、および、
（ｅ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含むバッファー溶液
を、混合し、
サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を以下の（Ｉ）から（ＩＶ）で示されるサイクルで上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
（Ｉ）反応液を９４°Ｃ程度に加熱し、３０秒から１分間温度を保ち、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分かれさせる。
（ＩＩ）６０°Ｃ程度（プライマーによって若干異なる）にまで急速冷却し、その１本鎖ＤＮＡとプライマーをアニーリングさせる。
（ＩＩＩ）プライマーの分離がおきずＤＮＡポリメラーゼの活性に至適な温度帯まで、再び加熱する。実験目的により、その温度は６０−７２℃程度に設定される。ＤＮＡが合成されるのに必要な時間、増幅する長さによるが通常１分から２分、この温度を保つ。
（ＩＶ）ここまでが１つのサイクルで、以後、（Ｉ）から（ＩＩＩ）までの手順を繰り返していく事で特定のＤＮＡ断片を増幅させる。 The conditions for the DNA replication method are also not particularly limited. For example, representative conditions in the case of PCR are shown below.
For amplification target DNA,
(A) DNA polymerase (b) PCNA
(C) a pair of primers (d) a DNA synthesis substrate (deoxynucleotide triphosphate (dNTP)) in which one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer;
(E) mixing a buffer solution containing magnesium ion, ammonium ion and / or potassium ion;
(1) DNA denaturation, (2) primer annealing, (3) primer extension by raising and lowering the temperature of the reaction solution in cycles as shown in (I) to (IV) below using a thermal cycler or the like. The thermal cycle is repeated to amplify a specific DNA fragment.
(I) The reaction solution is heated to about 94 ° C., and the temperature is maintained for 30 seconds to 1 minute to separate the double stranded DNA into single strands.
(II) Rapidly cool to about 60 ° C. (slightly different depending on the primer), and anneal the single-stranded DNA with the primer.
(III) Reheat the primer to a temperature zone optimum for the activity of DNA polymerase because separation of primers does not occur. The temperature is set to about 60-72 ° C. depending on the experimental purpose. The time required for DNA synthesis is maintained at this temperature, usually 1 to 2 minutes, depending on the length of amplification.
(IV) Up to this is one cycle, and the procedure from (I) to (III) is repeated thereafter to amplify a specific DNA fragment.

上記ＰＣＲ方法においては、必要に応じて、さらに、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤を用いてもよい。また、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異増幅の軽減に特に有効である。 In the PCR method, if necessary, BSA and a nonionic surfactant may be further used. Furthermore, an antibody having an activity of suppressing the polymerase activity and / or the 3'-5 'exonuclease activity of a thermostable DNA polymerase may be used. Examples of the antibody include monoclonal antibodies and polyclonal antibodies. The present reaction composition is particularly effective in increasing the sensitivity of PCR and reducing nonspecific amplification.

本発明のＰＣＮＡは、様々なＤＮＡポリメラーゼと相性がよく、汎用性が高い。ＤＮＡポリメラーゼは、通常、伸長性または忠実性のいずれか一方に優れ、一長一短があるのが一般的である。しかし、本発明のＰＣＮＡと組み合わせることにより、忠実性を低下させずに、伸長性を向上し得るため、ＤＮＡポリメラーゼの短所を補強しつつＤＮＡ複製活性が増強され得る。 The PCNA of the present invention is compatible with various DNA polymerases and is highly versatile. The DNA polymerase is usually excellent in either extensibility or fidelity, and generally has advantages and disadvantages. However, in combination with the PCNA of the present invention, the extensibility can be improved without reducing the fidelity, and thus the DNA replication activity can be enhanced while reinforcing the disadvantages of the DNA polymerase.

（３．１．１）α型ポリメラーゼとの組み合わせ
本発明のＰＣＮＡは特に伸長性向上に有効であり、忠実性には優れるが伸長性に劣るタイプのα型ポリメラーゼとの組み合わせにおいて特に有用である。典型的なα型ポリメラーゼとしては、ファミリーＢに属するものが挙げられる。なかでもＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓやＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓなど古細菌に由来するものが好ましい。
例えば、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）、ＴａＫａＲａ ＥＸ Ｔａｑ（タカラバイオ社）、Ｖｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ストラタジーン社）、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）、およびＰｗｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）など、現在主要に用いられているＤＮＡポリメラーゼのほとんどに適用し得るが、これらに限定されるものではない。 (3.1.1) Combination with α-type polymerase The PCNA of the present invention is particularly effective in improving extensibility, and is particularly useful in combination with α-type polymerase of excellent fidelity but inferior in extensibility. . Exemplary α-type polymerases include those belonging to Family B. Among them, those derived from archaebacteria such as Pyrococcus and Thermococcus are preferable.
For example, Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio), TaKaRa EX Taq (Takara Bio), Vent DNA Polymerase (NEW ENGLAND Bio Labs), Deep Vent® DNA Polymerase (New England Biolabs), Pfu Turbo DNA Polymerase (Stratagene) And KOD DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) and Pwo DNA Polymerase (Roche Diagnostics), which can be applied to most of the DNA polymerases mainly used at present, but is not limited thereto. .

（３．１．２）
上記のα型ポリメラーゼは、さらに、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体であっても良い。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
このような変異体は、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加えることにより作製できる。具体的には、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号６）の１〜４０番目、および７８〜１３０番目によって形成されるウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較してウラシルやイノシンへの結合能力を低下させたＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示される。 (3.1.2)
The above-mentioned α-type polymerase may further be a mutant having reduced base analog detection activity. Base analogues indicate bases other than adenine, cytosine, guanine and thymine, and include uracil and inosine. Usually, DNA polymerases belonging to family B bind strongly upon detection of the base analogues uracil and inosine, and inhibit the polymerase function. The base analog detection activity strongly binds to a base analog and shows an activity to inhibit the polymerase function. The DNA polymerase mutant belonging to family B having reduced base analog detection activity is a DNA polymerase mutant belonging to family B characterized by having a low ability to bind to uracil and inosine.
Such variants can be generated by modifying at least one of the amino acid sequences (uracil binding pocket) for uracil binding. Specifically, at least one of the amino acid sequences (uracil binding pocket) related to the binding of uracil formed by the 1st to 40th and 78th to 130th amino acids of the DNA polymerase (The sequence No. 6) from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain Examples are DNA polymerase mutants that have been modified in place and have reduced ability to bind to uracil and inosine compared to wild-type DNA polymerase.

ウラシルの結合に関するアミノ酸配列はパイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）においては、上述の通り、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号７）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号８）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号９）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄ（配列番号１０）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３（配列番号１１）のおいては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７（配列番号１２）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ−１（配列番号１３）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号１４）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１５）においては、アミノ酸１〜４０、およびアミノ酸７８〜１３０によって形成される。 The amino acid sequence for uracil binding is highly conserved in DNA polymerases derived from Pyrococcus and DNA polymerases derived from Thermococcus. In the DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaraensis (SEQ ID NO: 6), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130 as described above. In Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 7), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130. In Thermococcus golgonarius (SEQ ID NO: 8), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130. In Thermococcus litoralis (SEQ ID NO: 9), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130. In Pyrococcus sp. GB-D (SEQ ID NO: 10), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130. In Thermococcus sp. JDF-3 (SEQ ID NO: 11), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130. In Thermococcus sp. 9 ° N-7 (SEQ ID NO: 12), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130. In Thermococcus sp. KS-1 (SEQ ID NO: 13), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130. In Thermococcus cellar (SEQ ID NO: 14), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130. In Thermococcus cyclis (SEQ ID NO: 15), it is formed by amino acids 1-40 and amino acids 78-130.

（３．１．３）
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている、配列番号６または配列番号７で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目のうち少なくとも１つに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体、たとえば、
（ａ１）配列番号６または配列番号７で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
である。 (3.1.3)
More preferably, as a DNA polymerase mutant having a reduced base analog detection activity to be used in the nucleic acid amplification method of the present invention, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: assumed to be directly related to interaction with uracil 7. An archaebacterial DNA polymerase mutant modified at least one of positions 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 of the amino acid sequence shown in 7, for example,
(A1) A poly consisting of an amino acid sequence having a modification of at least one amino acid among the amino acids corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97 and 112 to 119 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 It is a peptide.

（３．１．４）
上記のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ａ２）で示されるものであってもよい。
（ａ２）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号６との同一性またはそのアミノ酸配列と配列番号７との同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。 (3.1.4)
The above-mentioned DNA polymerase mutant may be represented by the following (a2).
(A2) In the DNA polymerase mutant shown in (a1), at least one amino acid is further modified at sites other than 7, 36, 37, 90 to 97 and 112 to 119, and the amino acid sequence and sequence thereof 80% or more (preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more) of the identity to No. 6 or the identity of its amino acid sequence and SEQ ID NO: 7 More preferably, the polypeptide is 99% or more) and has a reduced base analog detection activity.

アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。 Various methods are known as methods for calculating the identity of amino acid sequences. For example, it can be calculated using a commercially available or analysis tool available through a telecommunication line (Internet).
Here, the National Local Biotechnological Information Center (NCBI) homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool) http: // www. ncbi. nlm. nih. Amino acid sequence identity is calculated by using default (default) parameters at gov / BLAST /.

（３．１．５）
上記のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ａ３）で示されるものであってもよい。
（ａ３）（ａ１）で示されるＤＮＡポリメラーゼ変異体において、さらに、７、３６、３７、９０〜９７および１１２〜１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するポリペプチド。 (3.1.5)
The above-mentioned DNA polymerase mutant may be one shown by the following (a3).
(A3) In the DNA polymerase mutant shown in (a1), one or more amino acids are further deleted, substituted or added at sites other than 7, 36, 37, 90 to 97 and 112 to 119 And a polypeptide having reduced base analog detection activity.

ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２〜１６０個、好ましくは２〜１２０個、より好ましくは２〜８０個、更に好ましくは２〜４０個であり、より更に好ましくは２〜５個である。 Here, “several” is not limited as long as “reduced base analog detection activity” is maintained, but is, for example, a number corresponding to less than about 20% of all amino acids, preferably less than about 15%. A corresponding number, more preferably a number corresponding to less than about 10%, even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%. More specifically, the number of amino acid residues to be mutated is, for example, 2 to 160, preferably 2 to 120, more preferably 2 to 80, and still more preferably 2 to 40. Preferably it is 2-5.

なお、「配列番号６に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号６に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号６の７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「相当する」の意味は、前記の例示と同じである。 The “amino acids corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6” is an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 The DNA polymerase of the present invention is an expression comprising the amino acid sequence for uracil binding corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 of SEQ ID NO: 6. In the present specification, the meaning of “corresponding” in the notation of the same form as the above is the same as the above illustration.

本願明細書において、配列番号６に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号６上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号６の当該位置と対応する位置とする。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「対応する位置」の意味は、前記の例示と同じである。 In the present specification, when an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, certain positions (orders) on SEQ ID NO: 6 and corresponding positions are compared (aligned) with the primary structure of the sequences. , Position corresponding to the position of SEQ ID NO: 6. In the present specification, the meaning of the "corresponding position" in the notation of the same form as the above is the same as the above illustration.

配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。 Various methods are known as methods for comparing primary structures of sequences. For example, it can be calculated using a commercially available or analysis tool available through a telecommunication line (Internet).
In this specification, by using default (initial setting) parameters in ClustalW (http://lustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja) of DNA Databank of Japan (DDBJ), Compare the primary structure of the array.

なお、特許４３９５３７７号または特表２００６−５０７０１２号には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０〜９７、および１１２〜１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体がいくつか例示されているが、その全ての改変体が本願の課題にかなう良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。 In addition, any one of amino acids 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119, which are assumed to be directly related to the interaction with uracil, is disclosed in Patent 4395377 or JP 2006-507012. Some archaeal DNA polymerase mutants have been modified, but not all of the variants have good properties for the task of the present application, and some of them have lost activity. You can see what you have.

（３．１．６）
本発明の核酸増幅法に用いる減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、より好ましくは、配列番号６または配列番号７で示されるアミノ酸配列の７、３６、または９３番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。 (3.1.6)
More preferably, the archaeal DNA polymerase mutant having a reduced base analog detection activity used in the nucleic acid amplification method of the present invention is preferably at position 7, 36 or 93 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 Among the corresponding amino acids, it is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a modification of at least one amino acid.

前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が１か所である場合、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換が例示される。別の例としては、３６番目のアミノ酸であるプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、またはＰ３６Ｒのアミノ酸置換が例示される。別の例としては、９３番目のアミノ酸であるバリン（Ｖ）が正電荷をもつ極性アミン酸に置換されていることが好ましく、具体的にはＶ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、またはＶ９３Ｒのアミノ酸置換が例示される。 In the above polypeptide, when the amino acid modification is in one place, it is preferable that the seventh amino acid tyrosine (Y) is substituted with a nonpolar amino acid, specifically, Y7A, Y7G, Y7V, Y7L. Examples are amino acid substitutions selected from the group consisting of Y7I, Y7P, Y7F, Y7M, Y7W, and Y7C. As another example, it is preferable that the 36th amino acid proline (P) is substituted with a positively charged polar amino acid, and specifically exemplified is an amino acid substitution of P36H, P36K or P36R. As another example, it is preferable that valine (V) which is the 93rd amino acid is substituted by a positively charged polar amine acid, and specifically, amino acid substitution of V93Q, V93K or V93R is exemplified. .

より好ましくは、Ｙ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれるいずれかである。さらに好ましくはＰ３６Ｋ、Ｐ３６ＲまたはＰ３６Ｈである。さらに好ましくはＰ３６Ｈである。 More preferably, it is any one selected from the group consisting of Y7A, P36H, P36K, P36R, V93Q, V93K, and V93R. More preferably, they are P36K, P36R or P36H. More preferably, it is P36H.

前記ポリペプチドにおいて、アミノ酸の改変が２か所である場合、好ましい変異体として、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３ＱまたはＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられる。好ましくは、Ｙ７Ａ／Ｐ３６ＨまたはＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 In the above polypeptide, when there are two amino acid modifications, preferred variants include Y7A / V93K, Y7A / P36H, Y7A / P36R, Y7A / V93R, Y7A / V93Q or P36H / V93K. Preferred examples include Y7A / P36H and Y7A / V93K, but are not limited thereto.

本発明における塩基類似体検出活性の評価は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｖｅｒ．２（Ｔｏｙｏｂｏ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、またはＰｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）添付の１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、および１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１６及び１７に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にてＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液についてアガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することで塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価できる。 Evaluation of the base analog detection activity in the present invention follows the following method.
KOD-Plus-Ver. 2 (Toyobo) attached 10 × PCR Buffer, or Pfu DNA Polymerase (Agilent) attached 10 × PCR Buffer, 1 × PCR Buffer, 1.5 mM MgSO ₄ , 0.2 mM dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 pmol of the primers of SEQ ID NOs: 16 and 17 which amplify about 1.3 kb, 10 ng of human genomic DNA (Roche), dUTP (50 μl) containing 1 U of each enzyme Roche) is added to a final concentration of 0.5, 5, 50, 100, 200 μM. After pre-reaction at 94 ° C. for 30 seconds, PCR is performed using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) on a schedule repeating 30 cycles of 98 ° C., 10 seconds → 65 ° C., 30 seconds → 68 ° C., 1 minute 30 seconds. After completion of the reaction, 5 μl of the reaction solution is subjected to agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide, and confirmed with an about 1.3 kb amplified DNA fragment under ultraviolet irradiation to evaluate whether or not the base analog detection activity is reduced. .

（３．１．７）
本発明の核酸増幅法に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも１つのアミノ酸の改変を含んでいてもよい。
３‘−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、パイロコッカス・エスピーＧＢ−Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ−３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１１）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ−７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１２）、サーモコッカス・エスピーＫＳ−１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１３）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１４）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１５）においては、１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸である。
本発明は具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号６〜１５に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号６の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目のアミノ酸からなる３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。 (3.1.7)
The modified DNA polymerase used in the nucleic acid amplification method of the present invention may contain at least one amino acid modification in any of the amino acid sequences of the 3'-5 'exonuclease active region.
The 3'-5 'exonuclease activity refers to the ability to remove incorporated nucleotides from the 3' end of the DNA polymer, and the 3'-5 'exonuclease region described above is a DNA polymerase belonging to family B. A highly conserved site, a DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaraensis (SEQ ID NO: 6), a DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 7), derived from Thermococcus gogonalius DNA polymerase (SEQ ID NO: 8), DNA polymerase derived from Thermococcus litoralis (SEQ ID NO: 9), DNA polymerase derived from Pyrococcus sp. GB-D (SEQ ID NO: 10), derived from Thermococcus sp. JDF-3 DNA polymerase (SEQ ID NO: 11) DNA polymerase derived from Thermococcus sp. 9 ° N-7 (SEQ ID NO: 12), DNA polymerase derived from Thermococcus sp. KS-1 (SEQ ID NO: 13), DNA polymerase derived from Thermococcus cellar (SEQ ID NO: 14) or amino acids 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 in the DNA polymerase (SEQ ID NO: 15) derived from Thermococcus cyclis.
The invention applies in particular to DNA polymerases other than the DNA polymerase which has presented a sequence. In the archaea-derived DNA polymerase belonging to Family B other than the DNA polymerases shown in SEQ ID NOs: 6 to 15, the 3'- consisting of amino acids 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 in SEQ ID NO: 6 The region corresponding to the 5 'exonuclease region is shown.

なお、「配列番号６に示される１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号６に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号６の１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。 The “amino acids corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 shown in SEQ ID NO: 6” is a DNA polymerase having an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 And the amino acid sequence corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 of SEQ ID NO: 6.

上記の３‘−５’エキソヌクレアーゼ領域への改変とは、置換、欠失、または付加からなり得る。配列番号６における１３７〜１４７、２０６〜２２２、および３０８〜３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。 Modifications to the above 3 '-5' exonuclease region may consist of substitutions, deletions or additions. 7 shows modifications to amino acids corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 in SEQ ID NO: 6.

前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとしては、配列番号６または配列番号７における１４１、１４２、１４３、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものが好ましい。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している。
より好ましくは、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、またはＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つである、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＤＮＡポリメラーゼである。
なお、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（−））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、または最大でも５０％以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。 The DNA polymerase in which the 3'-5 'exonuclease active region has been modified is preferably one in which at least one of the amino acids corresponding to positions 141, 142, 143, 210, 311 in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 is modified . These modified DNA polymerases are deficient in 3'-5 'exonuclease activity.
More preferably, it is a DNA polymerase which is deficient in 3'-5 'exonuclease activity, which is any one selected from D141A, E143A, D141A / E143A, I142R, N210D, or Y311F as the amino acid modification.
In addition, the 3'-5 'exonuclease activity-deficient (exo (-)) DNA polymerase includes a complete lack of activity, for example, 0.03%, 0.05% as compared with the parent enzyme 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, or at most 50% or less of the modified DNA polymerase having exonuclease activity or less.

前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとして、別の好ましい形態は、配列番号６または配列番号７における１４７番目に対応するアミノ酸を改変したものである。より好ましくは、Ｈ１４７Ｅ、またはＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つである。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率が向上している。 Another preferred embodiment of the DNA polymerase in which the 3'-5 'exonuclease active region has been modified is one in which the amino acid corresponding to position 147 in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 is modified. More preferably, it is any one selected from H147E or H147D. These modified DNA polymerases have improved PCR efficiency while maintaining exonuclease activity.

（３．１．８）
本発明のＤＮＡ複製方法においては，本発明のＰＣＮＡがＲＦＣを必要としないことから、反応系にＲＦＣを添加しなくてよい。ＲＦＣ標品は一般には市販されておらず、その調製は手間を要する。ＲＦＣ標品が利用できるとしても、添加して使用する場合には、ＲＦＣ以外のＤＮＡ複製系の諸因子との適切な量比等の条件設定が必要であるが、本発明においてはこれらを考慮しなくてよいというメリットがある。また、特にＰＣＲでの使用の場合には、本発明のＰＣＮＡはＲＦＣを併用しなくとも、野生型ＰＣＮＡとＲＦＣの併用時よりも優れた促進活性を発揮する。 (3.1.8)
In the DNA replication method of the present invention, since PCNA of the present invention does not require RFC, it is not necessary to add RFC to the reaction system. RFC preparations are not generally commercially available, and their preparation is laborious. Even if an RFC preparation can be used, it is necessary to set conditions such as appropriate quantitative ratio with various factors of DNA replication system other than RFC when adding and using it, but in the present invention, these are considered There is a merit that you do not have to. In addition, particularly in the case of use in PCR, the PCNA of the present invention exhibits a promoting activity superior to that in the combination of wild-type PCNA and RFC, even without the combined use of RFC.

また、ＰＣＲの具体的な条件に関しては、既に多くの解説書が発行されており、本発明の方法においてもそれらの文献を参考にして適宜反応条件等を調整してよい。ＰＣＲの条件としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの添加量、ＰＣＲの反応時間、反応溶液の温度の設定、反応溶液の成分、反応溶液のｐＨ、投入する鋳型ポリヌクレオチドの量などの種々の条件が調整される。 In addition, as to the specific conditions of PCR, many explanations have already been issued, and in the method of the present invention, reaction conditions and the like may be appropriately adjusted with reference to those documents. As conditions for PCR, various conditions such as the amount of DNA polymerase added, reaction time of PCR, setting of temperature of reaction solution, components of reaction solution, pH of reaction solution, amount of template polynucleotide to be added, etc. are adjusted Be done.

（３．２）ＤＮＡ複製用試薬、ＤＮＡ複製用キット
本発明の試薬キットは、上記本発明のＰＣＮＡおよび必要に応じその他の試薬類を含むＤＮＡ複製用の試薬キットである。本発明のＰＣＮＡは、単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含む形態で、ＤＮＡ複製用試薬の一成分として好適に用い得る。本発明の試薬キットは、本発明のＰＣＮＡがＰＣＲにおいて特に好適に用い得るため、ＰＣＲ用の試薬キットとして特に好適である。 (3.2) Reagent for DNA Replication, Kit for DNA Replication The reagent kit of the present invention is a reagent kit for DNA replication including the above-mentioned PCNA of the present invention and, if necessary, other reagents. The PCNA of the present invention can be suitably used as a component of a DNA replication reagent in a form containing a monomer and / or a multimer composed of the above-mentioned monomers. The reagent kit of the present invention is particularly suitable as a reagent kit for PCR since the PCNA of the present invention can be particularly suitably used in PCR.

本発明の試薬キットに備えられるＰＣＮＡはどのような形態であってもよく、精製タンパク質、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えポリヌクレオチド、あるいはこの組換えポリヌクレオチドが導入された形質転換体などの形態が例示される。組換えポリヌクレオチドや形質転換体の好ましい形態については、上記で説明したとおりである。また、本発明のＰＣＮＡと他のＰＣＮＡを組み合わせてもよい。また、本発明のＰＣＮＡが、組換えＤＮＡまたは形質転換体の形態で提供される場合には、本発明のＰＣＮＡを発現させるために用いられる試薬類等を備えてもよい。また、本発明のＰＣＮＡを含む試薬には、必要に応じてバイオテクノロジー試薬として一般に用いられる他の成分や媒体を配合してもよい。 The PCNA provided in the reagent kit of the present invention may be in any form, and the purified protein, a recombinant polynucleotide into which a protein-encoding polynucleotide is incorporated, or a transformation into which the recombinant polynucleotide has been introduced. The form such as the body is exemplified. Preferred forms of the recombinant polynucleotide and transformant are as described above. Also, the PCNA of the present invention may be combined with another PCNA. In addition, when the PCNA of the present invention is provided in the form of recombinant DNA or transformant, it may be provided with reagents and the like used to express the PCNA of the present invention. In addition, other components and media generally used as biotechnological reagents may be added to the reagent containing PCNA of the present invention, if necessary.

（４）
（４．１）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法
酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，５０％ グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５
ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ (4)
(4.1) DNA polymerase activity measurement method When the enzyme activity is strong, storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Perform measurement by diluting the sample with Nonidet P40, 50% glycerin). (1) Add 25 μl of solution A, 5 μl of solution B, 5 μl of solution C, 10 μl of sterile water, and 5 μl of enzyme solution to the microtube and react at 75 ° C. for 10 minutes. (2) Thereafter, the mixture is ice-cooled, 50 μl of solution E and 100 μl of solution D are added, and after stirring, the mixture is ice-cooled for further 10 minutes. (3) This solution is filtered through a glass filter (Whatman GF / C filter) and thoroughly washed with 0.1 N hydrochloric acid and ethanol. (4) The radioactivity of the filter is measured with a liquid scintillation counter (manufactured by Packard) to measure the incorporation of nucleotides in the template DNA. One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme in which 10 nmol of nucleotide per 30 minutes is taken up in the acid insoluble fraction (ie, the fraction which is insolubilized when liquid D is added) under these conditions.
A: 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) 16 mM magnesium chloride 15
mM dithiothreitol 100 μg / mL BSA (bovine serum albumin)
B: 1.5 μg / μl activated calf thymus DNA
C: 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP)
D: 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate)
E: 1 mg / mL calf thymus DNA

以下実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体のプラスミド作製
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。
変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ２（配列番号５）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ２）を参考にし、人工合成にて作成した。人工合成した核酸を、ｐＥＴ２３ｂにクローニングし、変異導入のＤＮＡ鋳型（ｐＭｊａＰＣＮＡ）として利用した。変異導入にはＫＯＤ −Ｐｌｕｓ− Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素調製に用いた。
実施例１で作製したプラスミドを表１に示す。 Example 1
Plasmid Preparation of KOD-PCNA2 Mutant A plasmid containing a modified thermostable PCNA gene derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain was prepared.
The DNA template used for mutagenesis was artificially synthesized with reference to PCNA2 (SEQ ID NO: 5) (pKODPCNA2) derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain cloned in pBluescript. The artificially synthesized nucleic acid was cloned into pET23b and used as a mutagenized DNA template (pMjaPCNA). For mutagenesis, KOD-Plus-Mutagenesis Kit (manufactured by Toyobo) was used, and the method was performed according to the instruction manual. In addition, confirmation of the mutant was performed by decoding of the base sequence. E. coli DH5α was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
The plasmids prepared in Example 1 are shown in Table 1.

（実施例２）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体の作製
実施例１で得られた菌体の培養は以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化カリウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ノニデットＰ４０、５０％グリセリン）に置換し、ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体を得た。 (Example 2)
Preparation of KOD-PCNA2 Mutant Culture of the cells obtained in Example 1 was performed as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A. 2) containing 100 μg / mL of sterilized ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. E. coli cultured at 37 ° C. for 16 hours in 3 mL of LB medium (1% Bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco) containing 100 μg / mL of ampicillin in this medium in advance E. coli DH5α (plasmid transformant) (using test tube) was inoculated, and aeration culture was performed at 37 ° C. for 16 hours. The cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then treated with a sonication treatment. The cells were disrupted to obtain a disrupted cell solution. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Furthermore, nucleic acid removal treatment with polyethylenimine, ammonium sulfate precipitation, Q sepharose chromatography, and finally storage buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 It replaced by 1% Tween20, 0.1% nonidet P40, 50% glycerol), and obtained KOD-PCNA2 mutant.

（実施例３）
ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２のスクリーニング
ＰＣＲで増幅増強活性がある変異体を取得するため、上記で作製したＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体を用いて、上記（１．３．１）で示した増幅増強活性の測定方法に従い、ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＨｕｍａｎ β−グロビンの３．６ｋｂを増幅することで比較した。ＰＣＮＡは２５、５０、１００、２００、４００、８００ｎｇを反応系に添加した。 (Example 3)
In order to obtain a mutant having an amplification enhancing activity by screening PCR for KOD-PCNA2, using the KOD-PCNA2 mutant prepared above, according to the method of measuring the amplification enhancing activity described above in (1.3.1) It compared by amplifying 3.6 kb of Human (beta)-globin using PCR system GeneAmp9700 (Applied Biosystem). PCNA added 25, 50, 100, 200, 400, 800 ng to the reaction system.

表２は各ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体の増幅増強活性を調べた結果になる。縦軸は各ＫＯＤ−ＰＣＮＡ２の変異箇所を示し、横軸が添加したＰＣＮＡ量を示す。
増幅量を以下の０〜２の３段階で示した。
０：増幅なし（増幅増強活性なし）
１：薄く増幅している（微弱な増幅増強活性あり）
２：増幅している（増幅増強活性あり） Table 2 shows the results of examining the amplification enhancing activity of each KOD-PCNA2 mutant. The vertical axis indicates the mutation site of each KOD-PCNA2, and the horizontal axis indicates the amount of added PCNA.
The amount of amplification was shown in the following three stages of 0-2.
0: No amplification (no amplification enhancing activity)
1: Thin amplification (with weak amplification enhancing activity)
2: Amplified (with amplification enhancing activity)

結果、Ｅ１０７位をＡ、Ｇ、Ｗに置換した変異体で増幅増強活性が確認された。図１は、増幅増強活性のあったＥ１０７Ａ、およびコントロールとして増幅増強活性のなかったＤ８７Ａの電気泳動結果である。 As a result, amplification enhancing activity was confirmed in a mutant in which position E107 was replaced with A, G, W. FIG. 1 shows the results of electrophoresis of E107A, which had amplification enhancing activity, and D87A, which had no amplification enhancing activity as a control.

今回用いたＫＯＤ−ＰＣＮＡ２ではＥ１０７位以外のアミノ酸の置換ではＰＣＲでの増幅増強活性は確認できなかった。構造解析で知られている部位に単純に変異を入れるだけでは増幅増強活性のあるものが得られるわけではないことがわかる。このＫＯＤ−ＰＣＮＡ２変異体を用いれば、ＰＣＲの伸長時間を大幅に短縮でき、診断などの遺伝子増幅において非常に有用だと考えられる。 In KOD-PCNA2 used this time, the amplification enhancement activity in PCR was not confirmed by substitution of amino acids other than E107. It can be seen that simply having a mutation at a site known for structural analysis does not yield an amplification enhancing activity. Using this KOD-PCNA2 variant can greatly shorten the extension time of PCR, and is considered to be very useful in gene amplification such as diagnosis.

本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、特にＤＮＡ合成に関わる技術関連において有用である。 The present invention is useful in the biotechnology related industry, particularly in the technical related to DNA synthesis.

Claims (10)

以下の（１）で示されるＰＣＮＡ単量体。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列の第１０７番目のアミノ酸残基を中性アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド。 PCNA monomer shown in the following (1 ) .
(1) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which the 107th amino acid residue of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is substituted with a neutral amino acid residue . 請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体が備えるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。   A DNA encoding an amino acid sequence which the PCNA monomer according to claim 1 comprises. 請求項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。   A vector into which the DNA according to claim 2 has been incorporated. 請求項３に記載のベクターを含む形質転換体。   A transformant comprising the vector according to claim 3. 請求項４に記載の形質転換体を培地で培養し、前記形質転換体中または培地中に、ＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を蓄積させ、蓄積したＰＣＮＡの単量体または多量体を回収する工程を含む、ＰＣＮＡの製造方法。   The transformant according to claim 4 is cultured in a medium, and PCNA monomer and / or multimers composed of the monomer are accumulated in or in the transformant, and the accumulated PCNA is obtained. A method of producing PCNA, comprising the step of recovering monomers or multimers. 請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体を含むＤＮＡ複製用試薬。   A reagent for DNA replication, comprising the PCNA monomer according to claim 1 and / or a multimer composed of the monomer. 請求項６に記載の試薬を備えた、ＤＮＡ複製用キット。   A kit for DNA replication, comprising the reagent according to claim 6. ＰＣＲ用の試薬を備えた、請求項７に記載のＤＮＡ複製用キット。   The DNA replication kit according to claim 7, comprising a PCR reagent. 請求項１に記載のＰＣＮＡ単量体および／または前記単量体で構成された多量体と、ＤＮＡポリメラーゼとの存在下でＤＮＡの合成反応を行う、ＤＮＡの複製方法。   A method for replicating DNA, which comprises carrying out a synthesis reaction of DNA in the presence of a DNA polymerase and the PCNA monomer according to claim 1 and / or a multimer composed of the monomer. 前記ＤＮＡの合成反応がＰＣＲである、請求項９に記載のＤＮＡの複製方法。   The method for replicating DNA according to claim 9, wherein the synthesis reaction of DNA is PCR.