JP6519168B2 - Three-dimensional cell assembly, method for producing the same, and solution for forming the same - Google Patents
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Description
本発明は、三次元細胞集合体、並びにその製造方法及び形成用溶液に関する。 The present invention relates to three-dimensional cell aggregates, as well as methods for their preparation and solutions for formation.
近年、細胞培養技術の分野では、基体上に細胞を配し、生体外で作製した細胞シートを用いて損傷した生体組織の再生を誘導する方法が開発されている。 In recent years, in the field of cell culture technology, a method has been developed in which cells are placed on a substrate, and regeneration of damaged living tissue is induced using a cell sheet prepared in vitro.
前記細胞シートは、水に対する上限臨界溶解温度が０℃以上８０℃以下の範囲にあるポリマー又はオリゴマー、或いは水に対する下限臨界溶解温度が０℃以上８０℃以下の範囲にあるポリマー又はオリゴマーを基体の表面に被覆し、前記基体上で、細胞を培養し、上限臨界溶解温度以上又は下限臨界溶解温度以下の温度にすることで、ゾル状態とゲル状態との間の相変化により前記細胞を前記基体から剥離することができる。 The cell sheet may be a polymer or oligomer having an upper limit critical solution temperature to water in the range of 0 ° C. to 80 ° C., or a polymer or oligomer having a lower limit critical solution temperature to water in the range of 0 ° C. to 80 ° C. The cells are coated on the surface, the cells are cultured on the substrate, and the cells are subjected to the phase change between the sol state and the gel state by setting the temperature above the upper critical solution temperature or below the lower critical solution temperature. Can be peeled off.
しかし、前記細胞シートは、細胞が、その厚みが０．０１μｍ未満の単層であるため厚みが薄く強度が弱いため、生体組織を再現できるような三次元集合体からなる細胞シートを作製するには、前記単層の細胞シートを１層ずつ重ね合わせるという煩雑な作業が必要である。また、前記単層の細胞シートを１層ずつ重ね合わせるだけでは、心筋細胞や血管内皮細胞といった多種細胞の精密かつ複雑な立体配置ができないという問題がある。 However, since the cell sheet is a single layer having a thickness of less than 0.01 μm and is thin and weak in strength, a cell sheet composed of a three-dimensional aggregate capable of reproducing a living tissue can be prepared. Requires the complicated operation of superposing the monolayer cell sheets layer by layer. In addition, there is a problem that precise and complicated configuration of various cells such as cardiomyocytes and vascular endothelial cells can not be achieved only by stacking the monolayer cell sheets one by one.
そこで、三次元細胞集合体を作製することができる、体積変化可能な親水性ポリマーゲルの三次元成形体上で細胞を培養し、前記親水性ポリマーゲルを体積変化させることで三次元構造を付与された三次元細胞集合体の作製方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
また、ビーズ表面に０℃以上８０℃以下の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを用いた温度応答性細胞培養用ビーズが提案されている（例えば、特許文献２参照）。
Therefore, cells are cultured on a three-dimensional molded body of a volume-changeable hydrophilic polymer gel capable of producing a three-dimensional cell aggregate, and the volume change of the hydrophilic polymer gel is imparted with a three-dimensional structure. A method for producing a three-dimensional cell assembly has been proposed (see, for example, Patent Document 1).
Also, a temperature-responsive cell culture bead has been proposed that uses a polymer whose hydration power changes on the bead surface within a temperature range of 0 ° C. to 80 ° C. (see, for example, Patent Document 2).
しかしながら、前記特許文献１は、多種細胞の精密かつ複雑な立体配置ができないため、生体組織を再現できる三次元細胞集合体を得ることは困難であるという問題がある。
また、前記特許文献２は、温度応答性細胞培養用ビーズの平均粒径が細胞の平均粒径より大きいため、精密立体配置した状態で細胞に三次元構造を付与することは困難であるという問題がある。
さらに、細胞を取り扱う上で、細胞への毒性が低いことが望まれているが、従来技術においては細胞への毒性の点から十分な検討がなされているものはない。
However, Patent Document 1 has a problem in that it is difficult to obtain a three-dimensional cell assembly capable of reproducing a living tissue, because precise and complicated configuration of various cells can not be performed.
Further, in Patent Document 2 described above, since the average particle size of the temperature-responsive cell culture beads is larger than the average particle size of the cells, it is difficult to impart a three-dimensional structure to the cells in a state of precise configuration. There is.
Furthermore, in handling cells, it is desirable that the toxicity to cells be low, but none of the prior art has sufficiently been studied from the point of toxicity to cells.
したがって、本発明は、細胞への毒性が低く、細胞の精密かつ複雑な三次元立体配置を実現できる三次元細胞集合体の製造方法を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a method for producing a three-dimensional cell assembly which has low cell toxicity and can realize precise and complicated three-dimensional configuration of cells.
前記課題を解決するための手段としての本発明の三次元細胞集合体の製造方法は、基体上に、細胞と、温度変化により相変化するポリマー粒子を含む組成物とを配し、温度変化により前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させることを複数回繰り返し、三次元細胞集合体を製造する。 The method for producing a three-dimensional cell assembly of the present invention as a means for solving the above problems comprises disposing cells and a composition containing polymer particles phase-changed by temperature change on a substrate, and changing the temperature by temperature change. A phase change from the sol state to the gel state of the composition containing the polymer particles is repeated several times to produce a three-dimensional cell assembly.
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、細胞への毒性が低く、細胞の精密かつ複雑な三次元立体配置を実現できる三次元細胞集合体の製造方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to solve the above-mentioned various problems in the prior art and achieve the above object, to produce a three-dimensional cell assembly which can achieve precise and complex three-dimensional configuration of cells with low toxicity to cells. We can provide a way.
前記課題を解決するため、本発明者が鋭意検討を重ねた結果、以下の知見を得た。即ち、温度によりゾル状態とゲル状態との間を相変化するポリマー粒子を含む組成物を用いることにより、細胞への毒性が低く、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温させることで前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させ、細胞を所望の場所に固定させた状態で培養する。前記状態で培養させることで、細胞間が接着し、三次元細胞集合体を製造することができる。また、前記培養後に、ポリマーの下限温度溶解温度以下に降温させることで、前記ポリマー粒子を含む組成物がゲル状態からゾル状態に相変化されることで、前記ポリマー粒子の分散性が向上し、接着した細胞の隙間から除去することができるという知見である。本発明は、かかる知見に基づくものである。 In order to solve the above-mentioned subject, as a result of the present inventor repeating earnest examination, the following knowledge was acquired. That is, by using a composition containing polymer particles that cause a phase change between a sol state and a gel state depending on temperature, the toxicity to cells is low, and the temperature is raised to a temperature higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles. The composition containing the polymer particles is phase-changed from the sol state to the gel state, and the cells are cultured in a fixed state at a desired location. By culturing in the above state, the cells adhere to each other, and a three-dimensional cell assembly can be produced. In addition, by lowering the temperature below the lower limit solution temperature of the polymer after the culture, the composition containing the polymer particles is phase-changed from the gel state to the sol state, whereby the dispersibility of the polymer particles is improved. It is a finding that it can be removed from the gap of the adhered cells. The present invention is based on such findings.
（三次元細胞集合体の製造方法）
本発明の三次元細胞集合体の製造方法は、基体上に、細胞と、温度変化により相変化するポリマー粒子を含む組成物とを配する工程（以下、「細胞及びポリマー粒子付与工程」と称することがある）と、温度変化により前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させる（以下、「ゲル化」と称することがある）工程（以下、「ゲル化工程」と称することがある）と、必要に応じて選択したその他の工程を含む。なお、前記細胞及びポリマー粒子付与工程、及び前記ゲル化工程は、複数回繰り返される。
本発明の前記三次元細胞集合体の製造方法により得られた三次元細胞集合体は、本発明の三次元細胞集合体であり、前記細胞及びポリマー粒子付与工程において前記基体上に少なくとも前記ポリマー粒子を含む組成物を配するのに用いる溶液が、本発明の三次元細胞集合体形成用溶液である。
(Method for producing three-dimensional cell assembly)
In the method for producing a three-dimensional cell assembly of the present invention, a step of arranging cells and a composition containing polymer particles phase-changed by temperature change on a substrate (hereinafter referred to as "cell and polymer particle application step" In some cases, the composition containing the polymer particles may be phase-changed from a sol state to a gel state (hereinafter referred to as "gelation") due to temperature change (hereinafter referred to as "gelation step") And may include other steps selected as required. In addition, the said cell and polymer particle provision process and the said gelatinization process are repeated several times.
The three-dimensional cell assembly obtained by the method for producing the three-dimensional cell assembly according to the present invention is a three-dimensional cell assembly according to the present invention, and at least the polymer particles on the substrate in the cell and polymer particle application step. The solution used to arrange the composition containing the present invention is the solution for three-dimensional cell assembly formation of the present invention.
＜細胞及びポリマー粒子付与工程＞
前記細胞付与工程は、基体上に、細胞と、温度変化により相変化するポリマー粒子を含む組成物とを配する工程である。
<Cell and polymer particle application process>
The cell application step is a step of arranging cells and a composition containing polymer particles phase-changed by temperature change on a substrate.
＜＜基体＞＞
前記基体としては、細胞の活性や増殖を阻害しないものであれば、その大きさ、形状、構造、材質等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記形状としては、例えば、ディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサート等の立体形状；平膜状などが挙げられる。
前記構造としては、例えば、多孔質構造などが挙げられる。
前記基体の材質としては、例えば、有機材料、無機材料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記有機材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレートなどのアクリル系材料、セルロースなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記無機材料としては、例えば、ガラス、セラミックなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
<< substrate >>
The size, shape, structure, material and the like of the substrate are not particularly limited as long as they do not inhibit cell activity and proliferation, and can be appropriately selected according to the purpose.
Examples of the shape include a three-dimensional shape such as a dish, a multiplate, a flask, and a cell insert;
As said structure, a porous structure etc. are mentioned, for example.
As a material of the said base | substrate, an organic material, an inorganic material, etc. are mentioned, for example. These may be used alone or in combination of two or more.
Examples of the organic material include polyethylene terephthalate (PET), polystyrene (PS), polycarbonate (PC), TAC (triacetyl cellulose), polyimide (PI), nylon (Ny), low density polyethylene (LDPE), medium density Examples thereof include polyethylene (MDPE), vinyl chloride, vinylidene chloride, polyphenylene sulfide, polyether sulfone, polyethylene naphthalate, polypropylene, acrylic materials such as urethane acrylate, and cellulose. These may be used alone or in combination of two or more.
Examples of the inorganic material include glass and ceramics. These may be used alone or in combination of two or more.
＜＜細胞＞＞
前記細胞は、前記基体上に配されることができれば、その種類等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、分類学的に、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。
前記真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞が好ましく、前記細胞が三次元細胞集合体を形成する点から、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する細胞がより好ましい。
<< Cells >>
The type of cell or the like is not particularly limited as long as it can be disposed on the substrate, and may be appropriately selected depending on the purpose. Taxonomically, for example, eukaryotic cells, prokaryotic cells, etc. It can be used for all cells, whether multicellular or unicellular living cells.
Examples of the eukaryotic cells include animal cells, insect cells, plant cells, fungi and the like. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, animal cells are preferable. From the point that the cells form a three-dimensional cell aggregate, the cells adhere to each other, and the cell adhesion is such that it is not isolated unless it is subjected to physicochemical treatment. Cells having are more preferred.
前記接着性細胞としては、例えば、分化した細胞、分化前の細胞などが挙げられる。
前記分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。前記接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、又はそれらを何代か継代させたものでもよい。
前記分化前の細胞としては、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；分化が終了した細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
Examples of the adherent cells include differentiated cells, cells before differentiation, and the like.
The differentiated cells include, for example, hepatocytes that are parenchymal cells of the liver; stellate cells; Kupffer cells; vascular endothelial cells; endothelial cells such as endothelium and corneal endothelial cells; fibroblasts; Osteocytes; periodontal ligament-derived cells; epidermal cells such as epidermal keratinocytes; tracheal epithelial cells; gastrointestinal epithelial cells; cervical epithelial cells; epithelial cells such as corneal epithelial cells; breast cells; pericytes; smooth muscle cells, Muscle cells such as cardiac muscle cells; renal cells; pancreatic islet cells; nerve cells such as peripheral nerve cells and optic nerve cells; chondrocytes; bone cells and the like. These may be used alone or in combination of two or more. The adherent cells may be primary cells collected directly from tissues or organs, or they may be passaged several times.
As cells before differentiation, embryonic stem cells which are undifferentiated cells, pluripotent stem cells such as mesenchymal stem cells having pluripotency; unipotent stem cells such as vascular endothelial precursor cells having unipotency; differentiation Cells that have ended; and iPS cells and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
前記原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 Examples of the prokaryotic cells include eubacteria and archaebacteria. These may be used alone or in combination of two or more.
前記細胞の遊離状態での体積平均粒径（Ｄ５０）としては、１００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下が特に好ましい。前記体積平均粒径が、１００μｍ以下であれば、インクジェット法に好適に用いることができる。前記体積平均粒径としては、例えば、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。前記細胞は、遊離状態であると、略球状の形状をとるため、体積平均粒径（Ｄ５０）を測定することができる。 The volume average particle size (D50) of the cells in the free state is preferably 100 μm or less, more preferably 50 μm or less, and particularly preferably 20 μm or less. If the volume average particle diameter is 100 μm or less, it can be suitably used for the inkjet method. The volume average particle size can be measured, for example, using an automatic cell counter (trade name: Countess Automated Cell Counter, manufactured by Invitrogen). When the cells are in a free state, they have a substantially spherical shape, so that the volume average particle size (D50) can be measured.
なお、前記細胞の体積平均粒径（Ｄ５０）としては、下記の測定方法で測定することができる。
−体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法−
インキュベーター内（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ２環境）において、１％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｄ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、和光純薬工業株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬工業株式会社製、以下、「Ｄ−ＭＥＭ」と称することがある）で細胞を培養後、アスピレータ（商品名：ＶＡＣＵＳＩＰ、ＩＮＴＥＧＲＡ社製）で１００ｍｍディッシュ内の１０％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」と称することがある）、及び前記培地を除去する。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（和光純薬工業株式会社製、以下、「ＰＢＳ（−）」と称することがある）を３ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（−）を吸引除去し、表面を洗浄する。ＰＢＳ（−）による洗浄作業を３回繰り返した後、０．１％トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ， ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、和光純薬工業株式会社製）を３ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離する。位相差顕微鏡で細胞の剥離を確認後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを４ｍＬ加え、トリプシンを失活させる。遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５ｍｉｎ、５℃）を行い、アスピレータで上清を除去する。除去後、遠沈管に１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させる。その細胞懸濁液から１０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、０．４％トリパンブルー染色液１０μＬを加えてピペッティングを行って細胞を染色する。染色した細胞懸濁液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。なお、細胞数、細胞生存率も同様の測定方法により求めることができる。
The volume average particle diameter (D50) of the cells can be measured by the following measurement method.
-Method of measuring volume average particle diameter (D50)-
1% antibiotics (Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution (100x), Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in an incubator (trade name: KM-CC17RU2, manufactured by Panasonic Corporation, 37 ° C., 5% CO 2 environment) After culturing the cells in Dulbecco's modified Eagle medium (including Wako Pure Chemical Industries, Ltd., sometimes referred to as "D-MEM" below) containing them, inside a 100 mm dish with an aspirator (trade name: VACUSIP, manufactured by INTEGRA) Remove 10% fetal bovine serum (hereinafter sometimes referred to as "FBS") and the medium. Add 3 mL of phosphate buffered saline (sometimes referred to as "PBS (-)" by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to a dish, aspirate and remove PBS (-) with an aspirator, and wash the surface . The washing operation with PBS (-) is repeated three times, 3 mL of 0.1% trypsin solution (Trypsin, from Porcine Pancreas, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added, and the mixture is heated for 5 minutes in an incubator. Detach the cells from the After confirming detachment of the cells with a phase contrast microscope, 4 mL of D-MEM containing 10% FBS and 1% antibiotic is added to inactivate the trypsin. Transfer to a centrifuge tube, centrifugation (trade name: H-19FM, manufactured by KOKUSAN, 1.2 × 10 3 rpm (234 G), 5 min, 5 ° C.), and remove the supernatant with an aspirator. After removal, 1 mL of D-MEM containing 10% FBS and 1% antibiotic is added to a centrifuge tube, and pipetting is performed gently to disperse the cells. 10 μL of the cell suspension is removed into an eppendorf tube, 10 μL of 0.4% trypan blue staining solution is added, and the cells are stained by pipetting. 10 μL of the stained cell suspension can be taken out, placed on a PMMA plastic slide, and measured using an automatic cell counter (trade name: Countess Automated Cell Counter, manufactured by Invitrogen). The number of cells and the cell viability can also be determined by the same measurement method.
前記細胞、及び前記ポリマー粒子を含む組成物を前記基体上に配させる前に、前記基体及び前記ポリマー粒子の表面に、細胞接着を促す有機物を公知の方法に従い塗布することが好ましい。前記有機物を塗布することにより、前記細胞の接着を促すことができる。
前記有機物としては、特に制限はなく、細胞同士、又は細胞と細胞外マトリックスとの接着に関与する物質であり、例えば、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン等の生物由来のペプチド；前記細胞由来のペプチドと同様の構造を有するタンパク質；アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）等のペプチドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
Before arranging the composition containing the cells and the polymer particles on the substrate, it is preferable to apply an organic substance that promotes cell adhesion to the surface of the substrate and the polymer particles according to a known method. By applying the organic substance, adhesion of the cells can be promoted.
The organic substance is not particularly limited, and is a substance involved in adhesion between cells or between cells and extracellular matrix, for example, peptides derived from organisms such as laminin, collagen, fibronectin, gelatin, etc .; peptides derived from the cells And proteins such as arginine-glycine-aspartic acid (RGD) and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
前記細胞の基体上に配する前の溶液中での細胞数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。前記細胞数が、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができ、細胞の精密配置に好適である。
前記細胞数の測定装置としては、前記体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが挙げられる。
There is no restriction | limiting in particular as a cell number in the solution before arrange | positioning on the base | substrate of the said cell, According to the objective, it can select suitably, 5 x 10 5 cells / mL or more 5 x 10 8 cells / mL Or less is preferable, and 5 × 10 5 cells / mL to 5 × 10 7 cells / mL are more preferable. When the number of cells is 5 × 10 5 cells / mL or more and 5 × 10 8 cells / mL or less, cells can be reliably included in the discharged droplets, which is suitable for precise placement of cells.
As an apparatus for measuring the number of cells, an automatic cell counter (trade name: Countess Automated Cell Counter, manufactured by Invitrogen) and the like may be mentioned in the same manner as the method of measuring the volume average particle size (D50).
前記細胞を基体上に配した後の細胞生存率は、細胞を基体上に配する前の溶媒中の生存率に対して、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が特に好ましい。前記細胞生存率が、９０％以上であると、細胞を基体上に配することによる負荷を少なく、三次元細胞集合体を形成させることができる。
前記細胞生存率の測定装置としては、前記体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などが挙げられる。
The cell viability after placing the cells on the substrate is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more to the viability in the solvent before placing the cells on the substrate. Particularly preferred. When the cell viability is 90% or more, a load due to placing cells on a substrate can be reduced to form a three-dimensional cell assembly.
As a measuring device of the said cell viability, it is the same as the measuring method of the said volume average particle diameter (D50), An automatic cell counter (brand name: Countess Automated Cell Counter, product made in Invitrogen) etc. is mentioned.
＜＜ポリマー粒子＞＞
前記ポリマー粒子としては、ポリマー粒子を含む組成物が、温度変化により相変化するものである限り、その大きさ、形状、構造、材質等について特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<< Polymer particles >>
As the polymer particles, as long as the composition containing the polymer particles undergoes phase change due to temperature change, there is no particular limitation on the size, shape, structure, material and the like, and it may be appropriately selected according to the purpose. it can.
ここで、前記ポリマー粒子を含む組成物の相変化について下記に説明する。
前記ポリマー粒子の物性としては、体積平均粒径が１００μｍ以下のポリマー粒子を含む組成物を、温度変化により一の成分がコロイドなどの粒子の状態で組成物中に分散して流動性があるゾル状態と、せん断粘度が５００ｍＰａ・ｓ以上であり、流動性がないゲル状態との間を、ゾル状態からゲル状態又はゲル状態からゾル状態へと相変化させることができる。
前記ポリマー粒子を含む組成物の状態を、前記ゾル状態から前記ゲル状態に相変化させることで細胞を固定させることができる。また、前記ポリマー粒子を含む組成物の状態を、ゲル状態からゾル状態に相変化させることで三次元細胞集合体から前記ポリマー粒子を除去することが容易となる。
Here, the phase change of the composition containing the polymer particles will be described below.
As the physical properties of the polymer particles, a composition containing a polymer particle having a volume average particle diameter of 100 μm or less is dispersed in the composition in the form of particles such as colloid by dispersing one component by temperature change. The state and the gel state having a shear viscosity of 500 mPa · s or more and having no fluidity can be phase-changed from the sol state to the gel state or from the gel state to the sol state.
Cells can be fixed by changing the state of the composition containing the polymer particles from the sol state to the gel state. Moreover, it becomes easy to remove the said polymer particle from a three-dimensional cell assembly by phase-changing the state of the composition containing the said polymer particle from a gel state to a sol state.
前記ゾル状態と前記ゲル状態との間の相変化の変化点としては、例えば、前記ゾル状態から前記ゲル状態に相変化させた場合に、前記ポリマー粒子が収縮又は前記ポリマー粒子間で凝集体ネットワークを形成することでせん断粘度が急激に上昇し、前記ポリマー粒子の流動性が消失する点；前記ゲル状態から前記ゾル状態に相変化させた場合に、前記ポリマー粒子が膨潤し、分散することでせん断粘度が急激に降下し、前記ポリマー粒子が流動性を得る点などが挙げられる。 As a change point of the phase change between the sol state and the gel state, for example, when the phase change from the sol state to the gel state, the polymer particles shrink or an aggregate network between the polymer particles The point at which the shear viscosity rapidly increases and the fluidity of the polymer particles disappears by forming a; the polymer particles swell and disperse when phase change from the gel state to the sol state The shear viscosity drops sharply, and the polymer particles obtain fluidity.
前記ポリマー粒子の形状としては、ポリマー粒子が細胞に過剰に吸着することを抑え、細胞への毒性を低くすることができる点から、例えば、真球状、半真球状等の球状；不定形状などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 The shape of the polymer particle is, for example, a spherical shape such as a spherical shape or a semispherical shape, from the viewpoint of suppressing excessive adsorption of the polymer particles to cells and reducing toxicity to the cells; It can be mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
温度により相変化するポリマー粒子を含む組成物は、臨界溶解温度を有する。
前記臨界溶解温度を有するポリマー粒子としては、例えば、上限臨界溶解温度を有するポリマー粒子、下限臨界溶解温度を有するポリマー粒子などが挙げられる。これらの中でも、細胞に負荷がかからない点から、その温度より高い温度では水溶液に溶解せず、水溶液と接触しても溶解せず二層に分かれるが、その温度以下では水溶液に溶解する下限臨界溶解温度を有するポリマー粒子が好ましい。
Compositions comprising polymer particles that undergo a phase change with temperature have a critical solution temperature.
Examples of the polymer particles having the critical solution temperature include polymer particles having an upper critical solution temperature and polymer particles having a lower critical solution temperature. Among these, the cells are not dissolved in an aqueous solution at a temperature higher than the temperature because they are not loaded with cells, they do not dissolve even if they come in contact with an aqueous solution, and they divide into two layers, but the lower limit critical dissolution that dissolves in an aqueous solution below that temperature Polymeric particles having a temperature are preferred.
図１は、ポリマー粒子を含む組成物のゾル状態からゲル状態に相変化させた模式図である。図１に示すように、例えば、基体１に付与される組成物Ｄ中に含まれるポリマー粒子２は、ポリマー粒子２の下限臨界溶解温度以下の温度においてはゾル状態にあり、粘度も低く凝集せず、溶液中に流動的に存在している。基体１上に配されたポリマー粒子２を含む組成物に対し、基体１をポリマー粒子２の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温すると、ゾル状態のポリマー粒子２を含む組成物がゲル化し、流動性がなくなり、ゲル状態のポリマー粒子３を含む組成物となり、擬集体ネットワークが形成され、前記ゲル状態のポリマー粒子３を含む組成物を含有する層が形成される。前記層上に、さらに前記ゾル状態のポリマー粒子２を含む組成物が配され、上記同様にゲル化させてゲル状態のポリマー粒子３を含む組成物に相変化させた層が積層される。これを複数回繰り返すことで、ゲル状態のポリマー粒子３を含む組成物を含有する層が複数層積層された三次元積層体を形成させることができる。なお、前記組成物Ｄ中に、前記細胞を含有させることで、上記同様に三次元積層体を形成させることで、三次元細胞集合体を形成させることができる。 FIG. 1 is a schematic view showing a phase change from a sol state to a gel state of a composition containing polymer particles. As shown in FIG. 1, for example, the polymer particles 2 contained in the composition D applied to the substrate 1 are in a sol state at a temperature lower than the lower critical solution temperature of the polymer particles 2 and have a low viscosity and aggregate. It is fluidly present in the solution. When the substrate 1 is heated to a temperature higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles 2 with respect to the composition containing the polymer particles 2 disposed on the substrate 1, the composition including the polymer particles 2 in the sol state is gelated. The composition becomes non-flowable and contains the polymer particles 3 in gel state, a quasi-aggregate network is formed, and a layer containing the composition containing the polymer particles 3 in gel state is formed. A composition containing the polymer particle 2 in the sol state is further disposed on the layer, and a layer which is gelated in the same manner as described above and phase-changed to the composition containing the polymer particle 3 in the gel state is laminated. By repeating this a plurality of times, it is possible to form a three-dimensional laminate in which a plurality of layers containing a composition containing polymer particles 3 in a gel state are laminated. By containing the cells in the composition D, a three-dimensional cell aggregate can be formed by forming a three-dimensional laminate in the same manner as described above.
前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度としては、細胞の至適培養温度が３７℃である点から、０℃以上５０℃以下が好ましく、３７℃で細胞を培養する場合は、０℃以上３５℃以下がより好ましい。前記下限臨界溶解温度が、０℃以上であると、細胞が過度に冷却されることがなく細胞に負荷がかからず、５０℃以下であると、細胞が過度に熱せられることがなく、細胞に負荷がかからない。
前記下限臨界溶解温度は、前記ポリマー粒子の曇点を、ＪＩＳ Ｋ ７１０５法に準拠した全光線透過率測定方法に従い測定することで算出することができる。
The lower limit critical solution temperature of the polymer particles is preferably 0 ° C. or more and 50 ° C. or less from the viewpoint that the optimal culture temperature of the cells is 37 ° C., and when culturing cells at 37 ° C., 0 ° C. or more and 35 ° C. or less Is more preferred. When the lower limit critical solution temperature is 0 ° C. or more, the cells are not excessively cooled and no load is applied to the cells, and when the temperature is 50 ° C. or less, the cells are not excessively heated; There is no load on the
The lower limit critical solution temperature can be calculated by measuring the cloud point of the polymer particles according to the total light transmittance measurement method based on the JIS K 7105 method.
前記ポリマー粒子のゾル状態の組成物中における体積平均粒径（Ｄ５０）としては、細胞の遊離状態における体積平均粒径より小さいことが好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。前記体積平均粒径が、細胞の遊離状態における体積平均粒径よりも小さいと、細胞への毒性が低くすることができ、また、粘度を下げることができ、液滴サイズを小さくすることができるため、インクジェット法に好適に用いることができ、また、前記培養後、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温させ、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させた時に、三次元細胞集合体から、前記ゾル状態の組成物に含まれるポリマー粒子を除去することが容易になる。
前記ポリマー粒子のゲル状態の組成物中における体積平均粒径（Ｄ５０）としては、５０μｍ以下が好ましく、０．０５μｍ以上５μｍ以下がより好ましい。前記体積平均粒径が、５０μｍ以下であると、細胞への毒性が低くすることができ、また、前記細胞と前記ポリマー粒子とからなる積層体を作製し、細胞を培養した場合に、細胞間の距離を近くすることができ、細胞間の接着を阻害することがない。
The volume average particle size (D50) in the composition in the sol state of the polymer particles is preferably smaller than the volume average particle size in the free state of the cells, more preferably 50 μm or less, and particularly preferably 10 μm or less. When the volume average particle size is smaller than the volume average particle size in the free state of the cells, the toxicity to the cells can be lowered, the viscosity can be lowered, and the droplet size can be reduced. Therefore, it can be suitably used in the ink jet method, and when the composition containing the polymer particles is phase-changed from the gel state to the sol state by lowering the temperature below the lower critical solution temperature of the polymer particles after the culture. It becomes easy to remove polymer particles contained in the composition in the sol state from three-dimensional cell aggregates.
As a volume average particle diameter (D50) in the composition in the gel state of the said polymer particle, 50 micrometers or less are preferable, and 0.05 micrometer or more and 5 micrometers or less are more preferable. When the volume average particle size is 50 μm or less, the toxicity to the cells can be lowered, and when a laminate comprising the cells and the polymer particles is prepared and the cells are cultured, The distance between the two can be close and it does not inhibit the adhesion between cells.
前記ポリマー粒子のゾル状態の組成物中におけるキュムラント粒径としては、細胞の遊離状態におけるキュムラント粒径より小さいことが好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、１０μｍ以下が特に好ましい。前記キュムラント粒径が、細胞の遊離状態におけるキュムラント粒径よりも小さいと、細胞への毒性が低くすることができ、また、粘度を下げることができ、液滴サイズを小さくすることができるため、インクジェット法に好適に用いることができ、また、前記培養後、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温させ、前記ポリマー粒子をゲル状態からゾル状態に相変化させた時に、三次元細胞集合体から、前記ゾル状態の組成物中のポリマー粒子を除去することが容易になる。
前記ポリマー粒子のゲル状態の組成物中におけるキュムラント粒径としては、５０μｍ以下が好ましく、０．０５μｍ以上５μｍ以下がより好ましい。前記キュムラント粒径が、５０μｍ以下であると、細胞への毒性が低くすることができ、また、前記細胞と前記ポリマー粒子とからなる積層体を作製し、細胞を培養した場合に、細胞間の距離を近くすることができ、細胞間の接着を阻害することがない。
The cumulant particle size in the composition in the sol state of the polymer particles is preferably smaller than the cumulant particle size in the free state of the cells, more preferably 50 μm or less, and particularly preferably 10 μm or less. If the cumulant particle size is smaller than the cumulant particle size in the free state of the cells, the toxicity to the cells can be lowered, the viscosity can be lowered, and the droplet size can be reduced, It can be suitably used for the inkjet method, and when the polymer particles are phase-changed from the gel state to the sol state after being cultured and cooled to the lower critical solution temperature of the polymer particles, three-dimensional cell aggregates This facilitates removal of polymer particles in the composition in the sol state.
The cumulant particle size in the composition in the gel state of the polymer particles is preferably 50 μm or less, and more preferably 0.05 μm or more and 5 μm or less. When the cumulant particle size is 50 μm or less, the toxicity to cells can be lowered, and when a laminate comprising the cells and the polymer particles is prepared and the cells are cultured, the cells The distance can be reduced and the adhesion between cells is not inhibited.
前記体積平均粒径（Ｄ５０）、及びキュムラント粒径としては、濃厚系粒径アナライザー（商品名：ＦＰＡＲ−１０００、大塚電子株式会社製）を用いて、下記のサンプル液の調製例により得られたサンプル液を用いて、以下の測定条件により測定することができる。
−サンプル液の調製例−
純水製造装置（商品名：ＧＳＨ−２０００、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて得られた純水に、合成した粉末状ポリマー粒子を濃度０．５質量％で分散させる。測定用の液量は５ｃｃ、分散は２０ｍｍ回転子をスターラーを用いて２００ｒｐｍ、約一日攪拌することでサンプル液を調製することができる。
−測定条件−
・溶媒：水（屈折率：１．３３１４、２５℃における粘度：０．８８４ｃＰ、ＮＤフィルターにより最適光量調製は適宜設定）
・測定プローブ：濃厚用プローブ
・測定ルーチン：測定：２５℃で１８０秒間→測定：２５℃で６００秒間（本体側を３５℃に変更すると次第に液温が２５℃から３５℃になる。その間の粒子径変化をモニタ）→測定：３５℃で１８０秒間
The volume average particle diameter (D50) and the cumulant particle diameter were obtained by the following preparation examples of the sample liquid using a concentrated particle diameter analyzer (trade name: FPAR-1000, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.) It can measure on the following measurement conditions using a sample solution.
-Preparation example of sample solution-
The synthesized powdery polymer particles are dispersed at a concentration of 0.5 mass% in pure water obtained using a pure water production apparatus (trade name: GSH-2000, manufactured by ADVANTEC). The amount of liquid for measurement is 5 cc, and a sample liquid can be prepared by stirring a 20 mm rotor with a stirrer at 200 rpm for about one day.
-Measurement conditions-
Solvent: water (refractive index: 1.3314, viscosity at 25 ° C .: 0.884 cP, optimum light amount adjustment is appropriately set by the ND filter)
Measurement probe: Thickening probe Measurement routine: Measurement: 180 seconds at 25 ° C. Measurement: 600 seconds at 25 ° C. (When the body side is changed to 35 ° C., the liquid temperature gradually becomes 25 ° C. to 35 ° C. Particles in the meantime) Monitor diameter change) → Measurement: 180 seconds at 35 ° C
前記ゾル状態のポリマー粒子を含む組成物のせん断粘度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０．１Ｐａ・ｓ以下が好ましく、０．０１Ｐａ・ｓ以下がより好ましい。前記せん断粘度が、０．０１Ｐａ・ｓ以下であると、細胞を含む組成物の粘度を低くすることができるため、インクジェット法に好適に用いることができる。
前記ゲル状態のポリマー粒子を含む組成物のせん断粘度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、０．２Ｐａ・ｓ以上が好ましく、１Ｐａ・ｓ以上がより好ましく、１０Ｐａ・ｓ以上が特に好ましい。前記せん断粘度が、０．２Ｐａ・ｓ以上であると、細胞を含む組成物の粘度を高くすることができるので、細胞固定化が可能となる。
There is no restriction | limiting in particular as a shear viscosity of the composition containing the polymer particle of the said sol state, According to the objective, it can select suitably, 0.1 Pa.s or less is preferable and 0.01 Pa.s or less is more preferable. . Since the viscosity of the composition containing cells can be lowered when the shear viscosity is 0.01 Pa · s or less, the composition can be suitably used in the inkjet method.
There is no restriction | limiting in particular as a shear viscosity of the composition containing the polymer particle of the said gel state, According to the objective, it can select suitably, 0.2 Pa.s or more is preferable, 1 Pa.s or more is more preferable, 10 Pa S or more is particularly preferable. Since the viscosity of the composition containing cells can be increased when the shear viscosity is 0.2 Pa · s or more, cell immobilization is possible.
前記せん断粘度としては、下記の測定方法により求めることができる。
−せん断粘度の測定方法−
ポリマー粒子を濃度１０質量％で純水に分散させ、１２１℃、２０分の高圧蒸気滅菌（商品名：ＭＬＳ−３０３０、パナソニック株式会社製）を行う。その後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社製）、１％抗生物質（商品名：Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｄ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、和光純薬工業株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬工業株式会社製）にて、滅菌した前記ポリマー粒子を１質量％に希釈し、スターラー（商品名：ＲｅｘｉｍＲＳ−４Ａ、ＡｓＯｎｅ社製）を用いて分散させる。前記分散を確認後、レオメーター（商品名：ＭＣＲ３０１、ＡｎｔｏｎＰａａｒ社製）にて液粘度の測定を行う。レオメーターでの測定は、２５℃でせん断速度１０（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定後、３７℃に昇温しながら、せん断速度０．１（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定することで求めることができる。
The shear viscosity can be determined by the following measurement method.
-Method of measuring shear viscosity-
The polymer particles are dispersed in pure water at a concentration of 10% by mass, and high-pressure steam sterilization (trade name: MLS-3030, manufactured by Panasonic Corporation) at 121 ° C. for 20 minutes is performed. Thereafter, Dulbecco's modified Eagle's medium (Japanese sum) containing 10% fetal bovine serum (FBS, manufactured by Gibco), 1% antibiotic (trade name: Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution (100x), manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) The sterilized polymer particles are diluted to 1% by mass with Optical Pure Chemical Industries, Ltd., and dispersed using a stirrer (trade name: Rexim RS-4A, manufactured by AsOne). After confirming the dispersion, the liquid viscosity is measured with a rheometer (trade name: MCR301, manufactured by Anton Paar). Measurement with a rheometer is shear rate 0.1 (1 / s) while raising temperature to 37 ° C after measuring for 100 seconds (10 points every 10 seconds) at shear rate 10 (1 / s) at 25 ° C. Can be obtained by measuring for 100 seconds (10 points every 10 seconds).
前記ポリマー粒子は、組成物中に均一に分散されていることが好ましい。前記ポリマー粒子が、均一に分散されることで、インクジェット法に好適に用いることができる。 The polymer particles are preferably uniformly dispersed in the composition. The polymer particles can be suitably used in the inkjet method by being uniformly dispersed.
前記ポリマー粒子を含む組成物は、前記相変化をするため、一般に、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度を有するポリマー粒子の下限臨界溶解温度前後の温度において体積変化を伴う。前記体積変化としては、例えば、ポリマー粒子が液体（分散媒）を吸収して体積を増加する現象である膨潤などが挙げられる。この体積変化の程度は、膨潤度で表すことができ、前記膨潤度としては、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下でのポリマー粒子の体積が、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度でのポリマー粒子の体積に対して、３０以下が好ましく、８以下がより好ましい。前記膨潤度が、３０以下であると、ゾル化によるポリマー粒子の除去がし易くなる。 The composition containing the polymer particles generally involves a volume change at a temperature around the lower critical solution temperature of the polymer particles having the lower critical solution temperature of the polymer particles in order to cause the phase change. Examples of the volume change include swelling, which is a phenomenon in which polymer particles absorb a liquid (dispersion medium) to increase the volume. The degree of this volume change can be expressed by the degree of swelling, and as the degree of swelling, the volume of the polymer particles below the lower critical solution temperature of the polymer particles is higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles 30 or less is preferable with respect to the volume of particle | grains, and 8 or less is more preferable. When the degree of swelling is 30 or less, removal of polymer particles by solification is facilitated.
なお、下限臨界溶解温度よりも高い温度Ａから下限臨界溶解温度以下の温度Ｂに温度を下げた場合、前記膨潤度は以下の式で表すことができる。
膨潤度＝（温度Ｂにおけるゾル状態のポリマー粒子の質量／温度Ａにおけるゲル状態のポリマー粒子の質量）
ここで、温度Ａ＞温度Ｂである。
When the temperature is lowered from the temperature A higher than the lower limit critical solution temperature to the temperature B lower than the lower limit critical solution temperature, the swelling degree can be expressed by the following equation.
Degree of swelling = (mass of polymer particles in sol state at temperature B / mass of polymer particles in gel state at temperature A)
Here, temperature A> temperature B.
前記体積変化の際、前記ポリマー粒子を含む組成物は、異方的に変形するものであれば、等方的に変化するものもある。これらの中でも、剥離時に細胞が破損しやすくなることを防止する点から、前記体積変化の際に前記ポリマー粒子を含む組成物が特定方向のみに変形するものが好ましい。 At the time of the volume change, the composition containing the polymer particles may be isotropically changed as long as it is anisotropically deformed. Among these, from the viewpoint of preventing the cells from being easily damaged at the time of peeling, it is preferable that the composition containing the polymer particles is deformed only in a specific direction at the time of the volume change.
前記ポリマー粒子の光透過率としては、７０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましい。前記光透過率が、７０％以上であると、細胞培養期間における細胞の状態を確認しやすくなる。なお、架橋剤濃度を高くすると、光透過率は低くなる。前記光透過率としては、ＪＩＳ Ｋ ７１０５法に準拠した全光線透過率測定方法に従い測定することができる。 The light transmittance of the polymer particles is preferably 70% or more, and more preferably 90% or more. It becomes easy to confirm the state of the cell in a cell culture period as the said light transmittance is 70% or more. When the concentration of the crosslinking agent is increased, the light transmittance is lowered. The light transmittance can be measured according to the total light transmittance measurement method based on JIS K 7105 method.
前記ポリマー粒子としては、例えば、単一モノマーから形成されたホモポリマー、複数モノマーから形成されたランダムコポリマー、ブロックコポリマー、マクロモノマー、これらを重合したブラシ状ポリマー、分岐したグラフトポリマー、多分岐したハイパーブランチポリマーなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 Examples of the polymer particles include homopolymers formed from a single monomer, random copolymers formed from a plurality of monomers, block copolymers, macromonomers, brush-like polymers obtained by polymerizing them, branched graft polymers, hyperbranched hyper Branch polymer etc. are mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
前記ポリマー粒子の構造としては、例えば、ポリマー単体の構造、複数の前記ポリマー単体が凝集した複合体構造などが挙げられる。
前記複数の前記ポリマー単体が凝集した複合体構造としては、例えば、前記ポリマー粒子と、前記ポリマー粒子以外の親水性ポリマーとの併用などが挙げられる。この場合、温度変化による相変化される点から、前記ポリマー粒子の表面は、温度変化による体積変化されるポリマー粒子で形成されていることが好ましい。
Examples of the structure of the polymer particle include the structure of a single polymer, and a composite structure in which a plurality of single polymers are aggregated.
Examples of the composite structure in which the plurality of the polymer single bodies are aggregated include a combination use of the polymer particles and a hydrophilic polymer other than the polymer particles. In this case, from the viewpoint of phase change due to temperature change, the surface of the polymer particles is preferably formed of polymer particles whose volume change is due to temperature change.
前記ポリマー粒子以外の親水性ポリマーの重量平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１，０００以上５０，０００以下が好ましく、２，０００以上５０，０００以下がより好ましく、５，０００以上５０，０００以下が特に好ましい。前記重量平均分子量が、１，０００以上であると、親水性を向上させることができ、５０，０００以下であると、ポリマー粒子自体が嵩高くなることを防止し、温度変化による相変化させることが容易になる。
前記重量平均分子量は、例えば、ゲルパーミエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）を用いてテトラヒドロフラン可溶分を測定することにより求めることができる。
There is no restriction | limiting in particular as a weight average molecular weight of hydrophilic polymers other than the said polymer particle, According to the objective, it can select suitably, 1,000 or more and 50,000 or less are preferable, and 2,000 or more and 50,000 or less Is more preferable, and 5,000 or more and 50,000 or less is particularly preferable. The hydrophilicity can be improved when the weight average molecular weight is 1,000 or more, and the polymer particles themselves are prevented from becoming bulky when the weight average molecular weight is 50,000 or less, and phase change due to temperature change Becomes easier.
The weight average molecular weight can be determined, for example, by measuring the tetrahydrofuran solubles using gel permeation chromatography (GPC).
前記ポリマー粒子としては、例えば、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリジエチルアクリルアミド等のアルキルアクリルアミド重合体；ポリビニルメチルエーテル、オキシエチレンを側鎖に持つポリビニルエーテル；メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 Examples of the polymer particles include alkyl acrylamide polymers such as polyisopropyl acrylamide and polydiethyl acrylamide; polyvinyl methyl ether; polyvinyl ether having oxyethylene in a side chain; methyl cellulose, carboxymethyl cellulose and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
前記ポリマー粒子以外の親水性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコール；ポリビニルピロリドン；ポリアクリル酸塩；ポリアクリルアミド；エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；メチルデンプン、エチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；アルギン酸プロピレングリコール等のアルギン酸誘導体；ゼラチン、カゼイン、アルブミン、コラーゲン等の動物系ポリマーの誘導体；グアーガム、ローカストビーンガム、クインスシードガム、カラギーナン等の植物系ポリマーの誘導体；キサンタンガム、デキストラン、ヒアルロン酸、プルラン、カードランなどの微生物系ポリマーの誘導体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 Examples of hydrophilic polymers other than the above polymer particles include polyvinyl alcohol; polyvinyl pyrrolidone; polyacrylate; polyacrylamide; cellulose derivatives such as ethyl cellulose and hydroxyethyl cellulose; methyl starch, ethyl starch, hydroxyethyl starch, carboxymethyl starch etc. Starch derivatives; alginic acid derivatives such as propylene glycol alginate; derivatives of animal polymers such as gelatin, casein, albumin, collagen etc; derivatives of plant polymers such as guar gum, locust bean gum, quince seed gum, carrageenan; xanthan gum, dextran, Derivatives of microbial polymers such as hyaluronic acid, pullulan, curdlan and the like can be mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
複数の前記ポリマー粒子が凝集した複合体としては、前記ポリマー粒子が架橋剤により架橋されていることが好ましい。
前記架橋剤としては、例えば、二官能性架橋剤、三官能性架橋剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記二官能性架橋剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−プロピレンビス（メタ）アクリルアミド等の二官能性アクリルアミド；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート；ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート；ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミドが好ましく、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドがより好ましい。
前記三官能性架橋剤としては、例えば、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレートなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記架橋剤の種類と濃度を変えることにより、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度、透明性、及び膨潤性を調製することができる。
前記架橋剤濃度を高くすることで、下限臨界溶解温度を低くすることができる。
As a composite in which a plurality of the polymer particles are aggregated, it is preferable that the polymer particles are crosslinked by a crosslinking agent.
As said crosslinking agent, a bifunctional crosslinking agent, a trifunctional crosslinking agent etc. are mentioned, for example. These may be used alone or in combination of two or more.
Examples of the difunctional crosslinking agent include difunctional acrylamides such as N, N′-methylenebis (meth) acrylamide and N, N-propylenebis (meth) acrylamide; ethylene glycol di (meth) acrylates; Meta) acrylate; polyethylene glycol di (meth) acrylate etc. are mentioned. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, N, N'-methylenebis (meth) acrylamide is preferable, and N, N'-methylenebisacrylamide is more preferable.
Examples of the trifunctional crosslinking agent include triallyl cyanurate, triallyl isocyanurate and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
By changing the type and concentration of the crosslinking agent, it is possible to adjust the lower critical solution temperature, the transparency and the swelling of the polymer particles.
The lower critical solution temperature can be lowered by increasing the concentration of the crosslinking agent.
前記ポリマー粒子としては、細胞に対して毒性が少ないことが好ましい。 It is preferable that the polymer particles have low toxicity to cells.
前記ゾル状のポリマー粒子を含む組成物をゲル状に相変化させる装置としては、公知の昇温装置を用いることができる。前記昇温装置としては、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温させることができれば、特に制限はなく、例えば、公知の培養プレート、インキュベーターなどが挙げられる。 A well-known temperature rising apparatus can be used as an apparatus which carries out the phase change of the composition containing the said polymer particle of sol-form to gel-like. The temperature raising device is not particularly limited as long as it can be raised to a temperature higher than the lower limit critical solution temperature of the polymer particles, and examples thereof include known culture plates, incubators, and the like.
前記ポリマー粒子の含有量としては、基体上に配する前の組成物全量に対して、０．１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．５質量％以上３質量％以下がより好ましい。前記含有量が、０．１質量％以上であると、好適にゲル化ができ、１０質量％以下であると、細胞への毒性を低くすることができる。
なお、培養後、三次元細胞集合体からポリマー粒子を除去した際の前記ポリマー粒子の残存量としては、三次元細胞集合体全量に対して、３質量％以下が好ましく、１質量％以下がより好ましい。前記含有量が、１質量％以下であると、細胞への毒性を低くすることができる。
The content of the polymer particles is preferably 0.1% by mass to 10% by mass, and more preferably 0.5% by mass to 3% by mass, with respect to the total amount of the composition before being disposed on the substrate. When the content is 0.1% by mass or more, gelation can be suitably performed, and when the content is 10% by mass or less, toxicity to cells can be reduced.
The remaining amount of the polymer particles when removing the polymer particles from the three-dimensional cell assembly after culture is preferably 3% by mass or less, more preferably 1% by mass or less based on the total amount of the three-dimensional cell assembly. preferable. When the content is 1% by mass or less, the toxicity to cells can be reduced.
＜＜配し方法＞＞
前記細胞及びポリマー粒子付与工程において、前記細胞及び前記ポリマー粒子を含む組成物の配し方法としては、例えば、細胞と、ポリマー粒子を含む組成物とが同時に基体上に配させる方法（細胞及びポリマー粒子同時付与工程）；前記細胞が基体上に配された後（以下、「細胞付与工程」と称することがある）に、前記細胞上にポリマー粒子を含む組成物が配される（以下、「ポリマー粒子付与工程」と称することがある）方法などが挙げられる。
前記細胞及びポリマー粒子同時付与工程においては、例えば、前記細胞を含有する分散液と、前記ポリマー粒子を含む組成物とを作製し、同時に基体上に配する方法；前記細胞と、前記ポリマー粒子とを混合した混合分散液を事前に調製し、前記混合分散液を基体上に配する方法などが挙げられる。
前記混合分散液を基体上に配する方法において、前記ポリマー粒子が、前記細胞の前記混合分散液中での凝集を防止し、細胞の分散性を向上させることができる。
<< How to distribute >>
In the cell and polymer particle application step, as a method of arranging the composition containing the cells and the polymer particles, for example, a method of simultaneously arranging cells and a composition containing polymer particles on a substrate (cells and polymers Particle simultaneous application step); after the cells are disposed on the substrate (hereinafter sometimes referred to as "cell application step"), a composition containing polymer particles is disposed on the cells (hereinafter referred to as " And the like) may be mentioned.
In the step of simultaneously applying the cells and the polymer particles, for example, a method of preparing a dispersion containing the cells and a composition containing the polymer particles, and simultaneously arranging on a substrate; the cells, the polymer particles and And the like are prepared in advance, and the mixed dispersion may be disposed on a substrate.
In the method of disposing the mixed dispersion on a substrate, the polymer particles can prevent aggregation of the cells in the mixed dispersion and improve the dispersibility of the cells.
前記細胞を含有する分散液、前記ポリマー粒子を含む組成物、及び前記混合分散液のせん断粘度としては、ポリマー粒子が含有される場合に前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下の温度において、０．１Ｐａ・ｓ以下が好ましく、０．０１Ｐａ・ｓ以下がより好ましい。前記せん断粘度が、０．１Ｐａ・ｓ以下であると、インクジェット法に好適に用いることができる。
前記細胞を含有する分散液、前記ポリマー粒子を含む組成物、及び前記混合分散液のせん断粘度としては、ポリマー粒子が含有される場合に前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度において、１Ｐａ・ｓ以上が好ましく、１０Ｐａ・ｓ以上がより好ましい。前記せん断粘度が、１０Ｐａ・ｓ以上であると、細胞の固定化が可能になる。前記せん断粘度は、レオメーター（商品名：ＭＣＲ３０１、ＡｎｔｏｎＰａａｒ社製）を用いて、せん断速度１０（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定後、４０℃に昇温し、せん断速度０．１（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定することで求めることができる。
The shear viscosity of the dispersion containing cells, the composition containing the polymer particles, and the mixed dispersion, when the polymer particles are contained, is 0. 0 at a temperature not higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles. 1 Pa · s or less is preferable, and 0.01 Pa · s or less is more preferable. It can use suitably for an inkjet method as the said shear viscosity is 0.1 Pa * s or less.
As the shear viscosity of the dispersion containing cells, the composition containing the polymer particles, and the mixed dispersion, when the polymer particles are contained, it is 1 Pa · at a temperature higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles. s or more is preferable, and 10 Pa · s or more is more preferable. When the shear viscosity is 10 Pa · s or more, the cells can be immobilized. The shear viscosity is measured for 100 seconds (10 points every 10 seconds) at a shear rate of 10 (1 / s) using a rheometer (trade name: MCR301, manufactured by Anton Paar), and then heated to 40 ° C. It can be determined by measuring for 100 seconds (10 points every 10 seconds) at a shear rate of 0.1 (1 / s).
前記細胞を含有する分散液中の細胞の数、及び細胞とポリマー粒子とを混合した混合溶液中の細胞の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下が好ましい。前記細胞数が、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができ、細胞の精密配置に好適である。前記細胞数としては、前記体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。 The number of cells in the dispersion containing cells and the number of cells in the mixed solution in which the cells and the polymer particles are mixed are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, 5 × 10 5 cells / mL or more and 5 × 10 8 cells / mL or less are preferable, and 5 × 10 5 cells / mL or more and 5 × 10 7 cells / mL or less are preferable. When the number of cells is 5 × 10 5 cells / mL or more and 5 × 10 8 cells / mL or less, cells can be reliably included in the discharged droplets, which is suitable for precise placement of cells. The number of cells can be measured using an automatic cell counter (trade name: Countess Automated Cell Counter, manufactured by Invitrogen) in the same manner as the method for measuring the volume average particle diameter (D50).
前記細胞及び前記ポリマー粒子を含む組成物の配し方法としては、例えば、インクジェット法、ディスペンサー法、ピペット法、アスピレータ法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、一細胞レベルで精密かつ複雑な細胞配置できる点から、インクジェット法が好ましい。 Examples of the method of arranging the composition containing the cells and the polymer particles include an inkjet method, a dispenser method, a pipetting method, and an aspirator method. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, the inkjet method is preferable in that precise and complicated cell placement can be performed at the single cell level.
前記インクジョット法は、特に制限はなく、公知の方法を用いることができる。なお、前記インクジェット法を実施するには公知のインクジェット吐出装置を、細胞及びポリマー粒子飛翔手段として好適に使用することができる。 The ink jet method is not particularly limited, and known methods can be used. In addition, in order to implement the said inkjet method, a well-known inkjet discharge apparatus can be used suitably as a cell and a polymer particle flight means.
＜＜インクジェット吐出装置＞＞
前記インクジェット吐出装置としては、基体上に、細胞及びポリマー粒子を含む組成物を配させることができれば、特に制限はなく、細胞及びポリマー粒子飛翔手段と、細胞及びポリマー収容部とを有し、更に必要に応じてその他の手段を有してなる。
前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段としては、例えば、細胞及びポリマー粒子を含む組成物を、基体上に配させる手段であり、細胞とポリマー粒子を含む組成物とが同時に基体上に配させる手段；前記細胞が基体上に配された後に、前記細胞上にポリマー粒子を含む組成物が配される手段などが挙げられる。
<< Ink jet discharge device >>
The ink jet discharge device is not particularly limited as long as a composition containing cells and polymer particles can be disposed on a substrate, and includes cells and polymer particle flying means, and cells and polymer containing parts. It has other means as needed.
The cell and polymer particle flight means are, for example, means for arranging a composition containing cells and polymer particles on a substrate, and means for simultaneously arranging cells and compositions containing polymer particles on a substrate; After the cells are disposed on the substrate, there may be mentioned means by which a composition containing polymer particles is disposed on the cells.
前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段は、インクジェット法により細胞及びポリマー粒子を含む組成物を前記基体上に飛翔可能なノズルを有する。なお、前記ノズルとしては、公知のインクジェットプリンターにおけるノズル（吐出ヘッド）を好適に使用することができ、また、前記インクジェットプリンターを前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段として好適に使用することができる。なお、前記インクジェットプリンターとしては、例えば、株式会社リコー製のＳＧ７１００、などが好適に挙げられる。前記インクジェットプリンターは、ヘッド部から一度に滴下できる細胞及びポリマー粒子量が多く、塗布面積が広いため、塗布の高速化を図ることができる点で好ましい。 The cell and polymer particle flying means have a nozzle capable of flying a composition containing cells and polymer particles onto the substrate by an inkjet method. In addition, as the nozzle, a nozzle (ejection head) in a known inkjet printer can be suitably used, and the inkjet printer can be suitably used as the cell and polymer particle flying means. In addition, as said inkjet printer, SG7100 made from Ricoh Co., Ltd. etc. are mentioned suitably, for example. The ink jet printer is preferable in that the amount of cells and polymer particles that can be dropped from the head at one time is large, and the application area is wide, so that the speed of application can be increased.
前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段は、本発明の前記細胞及びポリマー粒子を含む組成物に、刺激を印加し、前記細胞及びポリマー粒子を含む組成物を飛翔させて画像を形成する手段であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、続噴射型、オンデマンド型などが挙げられる。前記オンデマンド型としては、ピエゾ方式、サーマル方式、静電方式などが挙げられる。これらの中でも、ピエゾ方式が特に好ましい。 The cell and polymer particle flighting means is a means for applying a stimulus to the composition containing the cell and polymer particles of the present invention, and flying the composition containing the cells and polymer particles to form an image, There is no restriction in particular, and it can choose suitably according to the object, and a subsequent injection type, an on-demand type, etc. are mentioned. Examples of the on-demand type include a piezo type, a thermal type, and an electrostatic type. Among these, the piezo method is particularly preferable.
前記細胞及びポリマー粒子飛翔手段は、具体的には、液室部、流体抵抗部、振動板、及びノズル部材などを有することが好ましく、前記液室部、流体抵抗部、振動板、及びノズル部材の少なくとも一部は、シリコーン及びニッケルの少なくともいずれかを含む材料から形成されることが好ましい。
また、前記ノズルのノズル径としては、特に制限はなく、細胞がノズル部に詰まることを避けるため、細胞の大きさに対して、２倍以上が好ましい。動物細胞、特にヒトの細胞の大きさは一般的に５μｍ以上３０μｍ以下であるため、ノズル径としては使用する細胞に合わせて１０μｍ以上２００μｍ以下が好ましい。一方、液滴が大きくなりすぎると微小液滴を形成するという本来の目的を達成することが困難となる点から、６０μｍ以下がより好ましい。これらの中でも、１０μｍ以上だと細胞を含有する分散体を好適に吐出することができため、インクジェット法に好適に用いることができる点から、１０μｍ以上６０μｍ以下が特に好ましい。
Specifically, the cell and polymer particle flight means preferably includes a liquid chamber, a fluid resistance unit, a diaphragm, and a nozzle member, and the liquid chamber, fluid resistance unit, diaphragm, and nozzle member. Preferably, at least a part of is formed of a material containing at least one of silicone and nickel.
The nozzle diameter of the nozzle is not particularly limited, and is preferably twice or more the size of the cells in order to prevent the cells from clogging the nozzle portion. Since the size of animal cells, particularly human cells, is generally 5 μm to 30 μm, the nozzle diameter is preferably 10 μm to 200 μm according to the cells used. On the other hand, 60 μm or less is more preferable because it becomes difficult to achieve the original purpose of forming microdroplets if the droplets become too large. Among these, when it is 10 μm or more, the dispersion containing cells can be suitably discharged, and from the point of being suitably used for the inkjet method, 10 μm or more and 60 μm or less is particularly preferable.
本発明においては、前記細胞及びポリマー粒子を精度良くしかも高効率に付与可能な前記インクジェットプリンターを用いた場合においても、前記ノズル乃至そのヘッドにおいて目詰り等が発生せず、腐食等を生じさせることもなく、寸法精度の良い三次元細胞集合体が容易にかつ短時間で効率よく得られる点で有利である。 In the present invention, even when the ink jet printer capable of providing the cells and the polymer particles accurately and efficiently is used, clogging or the like does not occur in the nozzle or the head thereof to cause corrosion or the like. It is advantageous in that three-dimensional cell aggregates with high dimensional accuracy can be obtained easily and efficiently in a short time.
前記細胞及びポリマー粒子収容部は、前記細胞及び前記ポリマー粒子が収容された部材であり、その大きさ、形状、材質などについては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、貯留槽、袋、カートリッジ、タンクなどが挙げられる。
前記細胞と前記ポリマー粒子を含む組成物とが同時に基体上に配させる手段を用いる場合は、細胞とポリマー粒子とを混合した混合分散液を前記部材に収容することが好ましい。
前記細胞が基体上に配された後に、前記細胞上にポリマー粒子を含む組成物が配される手段を用いる場合は、前記細胞を含有する分散液と、前記ポリマー粒子を含む組成物とを収容する部材は、別々であることが好ましい。
The cell and polymer particle storage unit is a member in which the cell and the polymer particle are stored, and the size, shape, material, and the like thereof are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose. Storage tanks, bags, cartridges, tanks, etc.
In the case of using means for simultaneously arranging the cells and the composition containing the polymer particles on a substrate, it is preferable to accommodate a mixed dispersion of cells and polymer particles in the member.
In the case of using means in which a composition containing polymer particles is disposed on the cells after the cells are disposed on a substrate, the dispersion containing the cells and the composition containing the polymer particles are accommodated. Preferably, the members to be separated are separate.
ここで、図２にインクジェット吐出装置の一例を示す。このインクジェット吐出装置は、インクジェットヘッド４０を有する。 Here, FIG. 2 shows an example of the ink jet discharge apparatus. The inkjet discharge device has an inkjet head 40.
前記インクジェット吐出装置は、インクジェットヘッド４０を用いて、基体１０上に、細胞とポリマー粒子とを混合した混合分散液２０を配させる。この際、温度調節装置５０を用いて、前記基体１０を前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温させる。なお、前記昇温は、基体１０上に前記混合分散液を配させる前に、基体１０を温めて、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に保温しておくことが好ましい。これにより、前記基体１０に配された前記混合分散液中のポリマー粒子を含む組成物がゾル状態からゲル状態に相変化され、細胞を固定させ、細胞集合体６０が形成される。前記細胞集合体６０上に、上記と同様に、前記混合分散液を配させ、前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化され、細胞集合体６０を形成させることを複数回繰り返すことで、三次元細胞集合体を得ることができる。 The inkjet discharge device uses the inkjet head 40 to distribute the mixed dispersion liquid 20 in which cells and polymer particles are mixed on the substrate 10. At this time, the temperature control device 50 is used to raise the temperature of the substrate 10 to a temperature higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles. Preferably, the temperature is raised before the mixed dispersion is placed on the substrate 10, and the substrate 10 is warmed and kept at a temperature higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles. As a result, the composition containing the polymer particles in the mixed dispersion disposed on the substrate 10 is phase-changed from the sol state to the gel state to fix the cells, and the cell aggregate 60 is formed. The mixed dispersion is disposed on the cell aggregate 60 in the same manner as described above, and the composition containing the polymer particles is phase-changed from the sol state to the gel state to form the cell aggregate 60 a plurality of times. A three-dimensional cell assembly can be obtained by repeating.
図３に、インクジェット吐出装置の他の一例を示す。図３のインクジェット吐出装置は、原理的には図２と同じであるが、細胞及びポリマー粒子飛翔手段が異なる。即ち、インクジェットヘッド１４０を用いて、細胞１２０が基体１００上に配された後に、細胞１２０上にポリマー粒子を含む組成物１３０が配される。図２と同じように、温度調節装置１５０により前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に温められたポリマー粒子を含む組成物がゾル状態からゲル状態に相変化されることで、細胞集合体１６０が形成される。前記細胞集合体１６０上に、上記と同様の操作により細胞１２０を配させ、前記細胞１２０上に、ポリマー粒子を含む組成物１３０を配させ、前記ポリマー粒子を含む組成物がゾル状からゲル状に相変化され、細胞集合体１６０が形成されることを複数回繰り返すことで、三次元細胞集合体が得られる。 FIG. 3 shows another example of the ink jet discharge apparatus. The ink jet discharge device of FIG. 3 is basically the same as FIG. 2, but the cell and polymer particle flight means are different. That is, after the cells 120 are disposed on the substrate 100 using the inkjet head 140, the composition 130 including the polymer particles is disposed on the cells 120. Similar to FIG. 2, the composition containing the polymer particles warmed to a temperature higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles by the temperature control device 150 is phase-changed from the sol state to the gel state to form a cell aggregate. 160 are formed. The cells 120 are arranged on the cell aggregate 160 by the same operation as described above, the composition 130 containing polymer particles is arranged on the cells 120, and the composition containing the polymer particles is in the form of sol to gel. The three-dimensional cell assembly can be obtained by repeating the phase change to form the cell assembly 160 multiple times.
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、前記細胞と、前記ポリマー粒子を含む組成物とを基体上に配させた後に、ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度で細胞を培養させる工程（以下、「培養工程」と称することがある）、前記細胞を培養した後に、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温し、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させる（以下、「ゾル化」と称することがある）工程（以下、「ゾル化工程」と称することがある）、前記細胞を培養し、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子を除去する工程（以下、「除去工程」と称することがある）を有することが好ましい。
<Other process>
In the other steps, after arranging the cells and the composition containing the polymer particles on a substrate, the composition containing the polymer particles is phase-changed from the sol state to the gel state, A step of culturing cells at a temperature higher than the lower limit critical solution temperature (hereinafter sometimes referred to as "culturing step"), after culturing the cells, the temperature is lowered below the lower limit critical solution temperature of the polymer particles, A step of phase-converting a composition containing a gel from a gel state to a sol state (hereinafter sometimes referred to as "solization") (hereinafter sometimes referred to as "solization step"), culturing the cells, It is preferable to have a step of removing polymer particles (hereinafter sometimes referred to as “removing step”) after phase-changing the composition containing polymer particles from the gel state to the sol state.
＜＜培養工程＞＞
前記培養工程は、ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度で細胞を培養させる工程である。前記培養させることで、細胞が増殖、及び伸展し、細胞間で接着することで、三次元細胞集合体を形成させることができる。
<< Culturing process >>
The culture step is a step of culturing the cells at a temperature higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles after phase-changing the composition containing the polymer particles from the sol state to the gel state. By the culture, cells grow, spread, and adhere to each other to form a three-dimensional cell assembly.
前記培養としては、特に制限はなく、培養温度、培養装置、培養時間、培地、培地中の二酸化炭素濃度、培地の供給方法、培地の供給量、ｐＨなどの条件を目的に応じて適宜選択することができる。 The culture is not particularly limited, and conditions such as culture temperature, culture apparatus, culture time, culture medium, carbon dioxide concentration in culture medium, culture medium supply method, culture medium supply amount, pH and the like are appropriately selected according to the purpose. be able to.
前記培養温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、培養温度は２５℃以上４５℃以下が好ましく、３３℃以上４０℃以下がより好ましく、３６℃以上３８℃以下が特に好ましい。前記培養温度が、２５℃以上４５℃以下であると、細胞を好適に培養させることができる。 The culture temperature is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose. The culture temperature is preferably 25 ° C to 45 ° C, more preferably 33 ° C to 40 ° C, and 36 ° C to 38 ° C. Is particularly preferred. A cell can be suitably cultured as the said culture temperature is 25 degreeC or more and 45 degrees C or less.
前記培養装置としては、細胞を至適培養温度に保温し培養することができれば、特に制限はなく、例えば、公知の培養プレート、インキュベーターなどが挙げられる。 The culture apparatus is not particularly limited as long as the cells can be kept warm and cultured at the optimum culture temperature, and examples thereof include known culture plates and incubators.
前記培養時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１２時間以上６０時間以下が好ましく、１５時間以上５０時間以下が好ましい。前記培養時間が、１２時間以上６０時間以下であると、細胞を好適に培養させることができる。
また、細胞が増殖、及び伸展し、細胞間で接着することで、三次元細胞集合体を形成しているかを確認するには、組織体をヘマトキシリン・エオジン法（ＨＥ）染色し、例えば、ＮＨＤＦの手技による組織体断面観察像により断面を観察することで、組織体中の空隙割合や細胞の進展度合いで確認することができる。
There is no restriction | limiting in particular as said culture | cultivation time, According to the objective, it can select suitably, 12 to 60 hours are preferable, and 15 to 50 hours are preferable. Cells can be suitably cultured when the culture time is 12 hours or more and 60 hours or less.
In addition, in order to confirm whether cells form three-dimensional cell aggregates by proliferating, spreading, and adhering between cells, hematoxylin-eosin method (HE) staining of tissue bodies, for example, NHDF By observing the cross section according to the tissue body cross-sectional observation image by the procedure described above, it is possible to confirm the void ratio in the tissue body and the degree of cell development.
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、天然培地、半合成培地、合成培地等の組成で分類される培地；半固形培地、液体培地、粉末培地（以下、粉培地という場合もある）等の形状により分類される培地などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。細胞が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。 There is no restriction | limiting in particular as said culture medium, According to the objective, it can select suitably, For example, the culture medium classified by composition, such as a natural culture medium, a semi-synthetic culture medium, and a synthetic culture medium; The culture media classified by the shape of (It may be said that a powder culture medium may be hereafter mentioned) etc. are mentioned. These may be used alone or in combination of two or more. When cells are of animal origin, any medium can be used as long as it is a medium used for culturing animal cells.
前記動物細胞の培養に用いられる培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｄ−ＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ‘ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 Examples of media used for culturing the animal cells include Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM), Ham's Nutrient Mixture F12, and D-MEM / F12. Medium, McCoy's 5A medium (McCoy's 5A medium), Eagle's MEM medium (Eagles's Minimum Essential Medium; EMEM), αMEM medium (alpha Modified Eagles's Minimum Essential Medium; αMEM), MEM medium (Minimum Essential Medium), RPMI 1640 medium, Iscove's modified Dulbecco's medium (Iscove's Mod) fied Dulbecco's Medium; IMDM), MCDB 131 medium, William medium E, IPL 41 medium, Fischer's medium, StemPro 34 (manufactured by Invitrogen), X-VIVO 10 (manufactured by Kenbrex), X-VIVO 15 (Kenbrex) ), HPGM (manufactured by Kenbrex), StemSpan H3000 (manufactured by Stemcell Technology), StemSpanSFEM (manufactured by Stemcell Technology), Stemline II (manufactured by Sigma Aldrich), QBSF-60 (manufactured by Quality Biological), StemProhESCSFM (Invitrogen) , Essential 8 (registered trademark) medium (Gibco), mTeSR 1 or 2 medium (Stemcell Technology) ReproFF or ReproFF2 (Reprocell), PSGro hESC / iPSC Medium (System Biosciences), NutriStem® Medium (Biological Industries), CSTI-7 Medium (Cell Science Laboratories) MesenPRO RS medium (Gibco), MF-Medium (registered trademark) mesenchymal stem cell growth medium (Toyobo Co., Ltd.), Sf-900 II (Invitrogen), Opti-Pro (Invitrogen), etc. Be These may be used alone or in combination of two or more.
前記培地中の二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、２％以上５％以下が好ましく、３％以上４％以下がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、２％以上５％以下であると、細胞を好適に培養させることができる。 There is no restriction | limiting in particular as a carbon dioxide density | concentration in the said culture medium, According to the objective, it can select suitably, 2% or more and 5% or less are preferable, and 3% or more and 4% or less are more preferable. A cell can be suitably cultured as the said carbon dioxide concentration is 2% or more and 5% or less.
前記培地の供給方法としては、特に制限はなく、例えば、目的に応じて適宜選択することができ、インクジェット法、ディスペンサー法、ピペット法、アスピレータ法などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 There is no restriction | limiting in particular as a supply method of the said culture medium, For example, it can select suitably according to the objective, An inkjet method, a dispenser method, a pipetting method, an aspirator method etc. are mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
前記培地の供給量としては、１ｍＬの培地に対して細胞数が、５×１０５個以上５×１０８個以下となるように供給することが好ましく、５×１０５個以上５×１０７個以下となるように供給することが好ましい。１ｍＬの培地に対して前記細胞数が、５×１０５個以上５×１０８個以下であると、細胞の増殖、及び伸展に好適である。前記細胞数としては、前記体積平均粒径（Ｄ５０）の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。 The supply amount of the medium, the cell number to a medium 1mL is, it is preferable to supply such that of 5 × 10 5 cells or more 5 × 10 8 or less, of 5 × 10 5 cells or more 5 × 10 7 It is preferable to supply so that it may become less than one. The cell number of 5 × 10 5 or more and 5 × 10 8 or less per 1 mL of medium is suitable for cell growth and spreading. The number of cells can be measured using an automatic cell counter (trade name: Countess Automated Cell Counter, manufactured by Invitrogen) in the same manner as the method for measuring the volume average particle diameter (D50).
前記ｐＨとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、４以上７以下が好ましく、５以上６以下がより好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as said pH, According to the objective, it can select suitably, 4 or more and 7 or less are preferable, and 5 or more and 6 or less are more preferable.
なお、培養工程において、使用する試薬は、滅菌処理されたものを用いることが好ましく、培養操作、及び培養装置は、無菌処理されたものを用いることが好ましい。 In the culture step, it is preferable to use a reagent that has been sterilized, and it is preferable to use a culture operation and culture apparatus that have been subjected to aseptic treatment.
＜＜ゾル化工程＞＞
前記ゾル化工程は、前記細胞を培養した後に、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温し、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させる工程である。前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させることで、前記三次元細胞集合体を取り出すことができる。
<< Solization process >>
The solation step is a step of cooling the temperature below the lower limit critical solution temperature of the polymer particles after culturing the cells to change the phase of the composition containing the polymer particles from the gel state to the sol state. The phase change from the gel state to the sol state of the composition containing the polymer particles makes it possible to take out the three-dimensional cell assembly.
前記降温の温度としては、特に制限はなく、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下であればよく、０℃以上５０℃以下が好ましく、０℃以上３２℃以下がより好ましい。前記降温には、公知の装置を用いることができる。前記装置としては、前記ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温させることができれば、特に制限はなく、例えば、公知の培養プレート、インキュベーターなどが挙げられる。 There is no restriction | limiting in particular as temperature of said temperature drop, What is necessary is just below the lower limit critical solution temperature of the said polymer particle, 0 to 50 degreeC is preferable, and 0 to 32 degreeC is more preferable. A well-known apparatus can be used for the said temperature-fall. The device is not particularly limited as long as the temperature can be lowered to the lower critical solution temperature or lower of the polymer particles, and examples thereof include known culture plates and incubators.
＜＜除去工程＞＞
前記除去工程は、前記細胞を培養し、前記ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子を除去する工程である。前記ゾル状態の組成物中のポリマー粒子を三次元細胞集合体から除去することで、三次元細胞集合体のみを得ることができる。なお、前記三次元細胞集合体においては、すべてのポリマー粒子が除去されておらず、全部又は一部に前記ポリマー粒子が残存していても問題なく使用することができる。
<< Removal process >>
The removing step is a step of culturing the cells, removing the polymer particles after phase-changing the composition containing the polymer particles from the gel state to the sol state. By removing the polymer particles in the composition in the sol state from the three-dimensional cell assembly, only the three-dimensional cell assembly can be obtained. In the three-dimensional cell assembly, all the polymer particles may not be removed, and the polymer particles may be used without problems even if the polymer particles remain in whole or in part.
前記除去としては、細胞間の接着を壊さない穏和な条件であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、洗浄液で洗浄することなどが挙げられる。
前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝液（以下、「ＰＢＳ」と称することがある）、トリス塩酸緩衝液などが挙げられる。前記除去方法を下記に詳細に示す。
The removal is not particularly limited as long as it is a mild condition that does not break the adhesion between cells, and can be appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include washing with a washing solution.
Examples of the washing solution include phosphate buffer (hereinafter sometimes referred to as "PBS"), Tris-HCl buffer and the like. The removal method is described in detail below.
−除去方法−
作製された得られた三次元細胞集合体から細胞を単離するために培養した組織体の培地を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後に、コラゲナーゼ溶液（商品名：ＮＢ ４Ｇ／０．２６ ＰＺ Ｕ／ｍｌ、コスモバイオ株式会社製）を添加し、インキュベーター内（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ２環境）に２時間放置し、細胞間、およびＥＣＭ（細胞外マトリックス）／細胞間との結合から細胞を単離させる。次に、前記溶液をφ２０μｍのメッシュフィルター（商品名：ＣｅｌｌＴｒｉｃｓ Ｆｉｌｌｔｅｒ、株式会社池田理化製）にて分離し、ろ過した溶液を遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、株式会社コクサン製、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５ｍｉｎ、５℃）を行い、アスピレータで上清を除去する。除去後、遠沈管に１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むダルベッコ変法イーグル培地を１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させる。上記の遠心分離、上清除去を３回繰り替えし、前記ポリマー粒子を除去することできる。
-Removal method-
After removing the culture medium of the cultured tissue body in order to isolate the cells from the produced three-dimensional cell assembly and washing with PBS, collagenase solution (trade name: NB 4G / 0.26 PZ U) / Ml, manufactured by Cosmo Bio Inc., and left for 2 hours in an incubator (trade name: KM-CC17RU2, manufactured by Panasonic Corp., 37 ° C., 5% CO 2 environment) for 2 hours, between cells, and ECM (cells) Cells are isolated from external matrix) / intercellular binding. Next, the solution is separated by a mesh filter (trade name: CellTrics Fillter, Ikeda Rika Co., Ltd.) with a diameter of 20 μm, and the filtered solution is transferred to a centrifuge tube and centrifuged (trade name: H-19FM, KOKUSAN CO., LTD.) , 1.2 × 10 3 rpm (234 G), 5 min, 5 ° C.), and remove the supernatant with an aspirator. After removal, 1 mL of Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% FBS and 1% antibiotic is added to a centrifuge tube, and pipetting is performed gently to disperse the cells. The above-mentioned centrifugation and supernatant removal can be repeated three times to remove the polymer particles.
（三次元細胞集合体）
本発明の三次元細胞集合体は、細胞の遊離状態における体積平均粒径よりもゾル状態の組成物中における体積平均粒径が小さいポリマー粒子を含み、温度変化によりゾル状態とゲル状態との間で相変化する組成物を含有し、更に必要に応じてその他の部材を有してなる。
本発明の三次元細胞集合体は、本発明の三次元細胞集合体の製造方法により好適に製造することができる。
前記前記ポリマー粒子は、本発明の三次元細胞集合体の製造方法と同様のものを用いることができる。
(Three-dimensional cell assembly)
The three-dimensional cell assembly of the present invention comprises polymer particles having a volume average particle size smaller in the composition in the sol state than the volume average particle size in the free state of the cells, and changes in temperature between the sol state and the gel state The composition contains a phase-changeable composition, and further comprises other components as required.
The three-dimensional cell assembly of the present invention can be suitably produced by the method for producing a three-dimensional cell assembly of the present invention.
The said polymer particle can use the thing similar to the manufacturing method of the three-dimensional cell assembly of this invention.
前記三次元細胞集合体の大きさ、形状、構造等としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 There is no restriction | limiting in particular as a size, a shape, a structure, etc. of the said three-dimensional cell assembly, According to the objective, it can select suitably.
前記三次元細胞集合体の平均厚みとしては、特に制限はなく、０．０１ｍｍ以上２０ｍｍ以下が好ましく、０．０５ｍｍ以上２０ｍｍ以下がより好ましく、０．１ｍｍ以上２０ｍｍ以下が特に好ましい。前記厚みが、０．０５ｍｍ以上２０ｍｍ以下であると、人体の損傷部位への移植用、及び薬剤スクリーニング材料用に好適に使用することができる。前記厚みとしては、組織体をＨＥ染色し、断面観察を用いるか、非破壊手段の場合、光干渉断層計（ＯＣＴ：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、光干渉断層撮影、商品名：ＧａｎｙｍｅｄｅＩＩ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社製）を用いて測定することができる。 There is no restriction | limiting in particular as an average thickness of the said three-dimensional cell assembly, 0.01 mm or more and 20 mm or less are preferable, 0.05 mm or more and 20 mm or less are more preferable, 0.1 mm or more and 20 mm or less are especially preferable. When the thickness is 0.05 mm or more and 20 mm or less, it can be suitably used for transplantation to a damaged site of the human body and for a drug screening material. As the thickness, the tissue body is HE-stained and cross-sectional observation is used, or in the case of nondestructive means, optical coherence tomography (OCT: Optical Coherence Tomography, optical coherence tomography, trade name: Ganymede II, Thorlabs). It can be used to measure.
前記三次元細胞集合体の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィルム状、シート状等の平面状；柱状；球状；血管の形状；複雑な臓器の形状などが挙げられる。
前記複雑な臓器としては、例えば、心臓、肝臓、腎臓、肺、小腸、大腸などが挙げられる。
There is no restriction | limiting in particular as a shape of the said three-dimensional cell assembly, According to the objective, it can select suitably, For example, planar shapes, such as a film shape and a sheet shape; Columnar; Spherical shape; Blood vessel shape; Complex organ And the like.
Examples of the complex organs include heart, liver, kidney, lung, small intestine, large intestine and the like.
前記ポリマー粒子の含有量としては、基体上に配する前の組成物全量に対して、０．１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．５質量％以上３質量％以下がより好ましい。前記含有量が、０．１質量％以上であると、好適にゲル化ができ、１０質量％以下であると、細胞への毒性を低くすることができる。
なお、培養後、三次元細胞集合体からポリマー粒子を除去した際の前記ポリマー粒子の残存量としては、三次元細胞集合体全量に対して、３質量％以下が好ましく、１質量％以下がより好ましい。前記含有量が、１質量％以下であると、細胞への毒性を低くすることができる。
The content of the polymer particles is preferably 0.1% by mass to 10% by mass, and more preferably 0.5% by mass to 3% by mass, with respect to the total amount of the composition before being disposed on the substrate. When the content is 0.1% by mass or more, gelation can be suitably performed, and when the content is 10% by mass or less, toxicity to cells can be reduced.
The remaining amount of the polymer particles when removing the polymer particles from the three-dimensional cell assembly after culture is preferably 3% by mass or less, more preferably 1% by mass or less based on the total amount of the three-dimensional cell assembly. preferable. When the content is 1% by mass or less, the toxicity to cells can be reduced.
なお、三次元細胞集合体中のポリマー粒子を単離するには、以下の工程を行う。つまり、培養した組織体の培地を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後に、コラゲナーゼ溶液（商品名：ＮＢ ４Ｇ／０．２６ ＰＺ Ｕ／ｍｌ、コスモバイオ株式会社製）を添加し、インキュベーター内（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）に２時間放置し、細胞間、およびＥＣＭ（細胞外マトリックス）／細胞間との結合から細胞を単離させる。次に、前記溶液をφ２０μｍのメッシュフィルターにて分離し、ろ過した溶液を遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５分間、５℃）を行い、ピペットでポリマー粒子を含んだ上清を回収した。回収後、遠沈管にＰＢＳを１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞と残存ポリマー粒子を分散させた。上記の遠心分離、上清回収を３回繰り替えし、上清を集めることで三次元積層体を構成していたポリマー粒子の分散液を得ることができる。前記ポリマー粒子を含んだ分散液を濃厚系粒径アナライザー（商品名：ＦＰＡＲ−１０００、大塚電子株式会社製）を用いて、ポリマー粒子の残存量、粒度分布を測定することができる。 In order to isolate polymer particles in a three-dimensional cell assembly, the following steps are performed. That is, after removing the culture medium of the cultured tissue and washing with PBS, collagenase solution (trade name: NB 4G / 0.26 PZ U / ml, manufactured by Cosmo Bio Inc.) is added, and the inside of the incubator (product is sold) Name: KM-CC17RU2, manufactured by Panasonic Corporation (37 ° C., 5% CO 2 atmosphere) for 2 hours to isolate cells from intercellular and ECM (extracellular matrix) / intercellular binding. Next, the solution is separated with a mesh filter of φ 20 μm, and the filtered solution is transferred to a centrifuge tube and centrifuged (trade name: H-19FM, 1.2 × 10 3 rpm (234 G), 5 minutes, 5 ° C. ) Was performed, and the supernatant containing polymer particles was collected with a pipette. After recovery, 1 mL of PBS was added to a centrifuge tube and pipetting was performed gently to disperse cells and residual polymer particles. The dispersion of polymer particles constituting the three-dimensional laminate can be obtained by repeating the above-mentioned centrifugation and supernatant collection three times and collecting the supernatant. The remaining amount of the polymer particles and the particle size distribution can be measured using the dispersion containing the polymer particles using a concentrated particle size analyzer (trade name: FPAR-1000, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.).
−用途−
本発明の三次元細胞集合体は、人体の損傷部位への移植、組織再生を誘導する組織再生用移植材料、組織形態形成過程のｉｎ ｖｉｔｒｏでの検討用材料、薬剤スクリーニング材料などに好適に用いることができる。
-Application-
The three-dimensional cell assembly of the present invention is suitably used for transplantation to a damaged site of the human body, a graft material for tissue regeneration inducing tissue regeneration, a material for in vitro examination of tissue morphogenesis process, a drug screening material, etc. be able to.
（三次元細胞集合体形成用溶液）
本発明の三次元細胞集合体形成用溶液は、本発明の三次元細胞集合体の製造方法において用いる、前記ポリマー粒子を含む組成物、又は前記細胞及び前記ポリマー粒子を混合した混合分散液を含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
(Solution for three-dimensional cell assembly)
The solution for three-dimensional cell assembly formation of the present invention contains a composition containing the polymer particles, or a mixed dispersion of the cells and the polymer particles, which is used in the method for producing a three-dimensional cell assembly of the present invention. And, if necessary, further contain other ingredients.
前記ポリマー粒子を含む組成物、及び前記混合分散液に含まれるその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脱イオン水；超純水；生理食塩水；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；前記培地；５％デキストロース水溶液；電解質；懸濁剤；無痛化剤；アルブミン、Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標、ペンタファームジャパン社）の安定剤（アルブミンやＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標、ペンタファームジャパン）等）；保存剤；防腐剤、天然多糖類をはじめとした生態適合を有した天然、又は構造を模倣した高分子材料などが挙げられる。前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 There is no restriction | limiting in particular as a composition containing the said polymer particle, and the other component contained in the said mixed dispersion liquid, According to the objective, it can select suitably, For example, deionized water; ultrapure water; physiological salt Water; phosphate buffered saline (PBS); the above medium; 5% dextrose aqueous solution; electrolyte; suspension agent; soothing agent; albumin, a stabilizer of Prionex (registered trademark, Pentafarm Japan) (albumin or Prionex ( (Registered trademark, Pentafarm Japan) and the like) preservatives, preservatives, natural compatible materials having ecological compatibility including natural polysaccharides, or polymeric materials mimicking a structure. There is no restriction | limiting in particular as content of the said other component, According to the objective, it can select suitably.
以下に、本発明の実施例及び比較例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、実施例及び比較例において示す「部」及び「％」は、特に明示しない限り、「質量部」及び「質量％」を示す。なお、以下に示す実施例及び比較例において、各成分の含有量は、純分換算値を示す。 EXAMPLES The present invention will be described below by way of Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited to these Examples. Moreover, unless otherwise indicated, "part" and "%" shown in an Example and a comparative example show a "mass part" and "mass%." In addition, in the Example and comparative example which are shown below, content of each component shows a pure part conversion value.
＜ポリマー粒子の作製例＞
＜＜ポリマー粒子Ａの作製例１＞＞
１００ｍＬの２口フラスコ（柴田科学株式会社製）に、モノマーとしてＮ−イソプロピルアクリルアミド（下限臨界溶解温度：３２℃、東京化成工業株式会社製）２．５ｇ、架橋剤としてＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（東京化成工業株式会社製）２５ｍｇ、界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（関東化学株式会社製）１２．５ｍｇを、溶媒である水４５ｇ添加した。
水全量に対して、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが５質量％（０．４７ｍｏｌ／Ｌ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド全量に対してＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドが１質量％（０．７３ｍｏｌ％）、水全量に対してドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが表１に示す値になるように調製し、２ｍｍ回転子により、撹拌して完全に溶解させ水溶液を得た。
<Example of preparation of polymer particles>
<< Preparation Example 1 of Polymer Particle A >>
In a 100 mL two-necked flask (manufactured by Shibata Scientific Co., Ltd.), N-isopropylacrylamide (lower limit critical solution temperature: 32 ° C., manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 2.5 g as a monomer, N, N'-methylene bis as a crosslinking agent 25 mg of acrylamide (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) and 12.5 mg of sodium dodecylbenzenesulfonate (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) as a surfactant were added to 45 g of water as a solvent.
5% by mass (0.47 mol / L) of N-isopropylacrylamide relative to the total amount of water, 1% by mass (0.73 mol%) of N, N'-methylenebisacrylamide relative to the total amount of N-isopropylacrylamide, water The sodium dodecylbenzene sulfonate was adjusted to the value shown in Table 1 with respect to the total amount, and was completely dissolved by stirring with a 2 mm rotor to obtain an aqueous solution.
次に、室温（２５℃）、流量１００ｍＬ／分間で１５秒間、前記水溶液をアルゴンガスでパージした。前記アルゴンパージ後、７０℃で、水２．５ｇに重合開始剤として２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（和光純薬工業株式会社製）１０ｍｇ溶かし、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド全量に対して２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩が０．４質量％（０．１７ｍｏｌ％）になるように調製した溶液を添加し、１時間重合させた。前記重合により得られたＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマー粒子を含む重合液約４８ｇを１００ｃｃビーカーに入れ、メタノール２８ｇで凝集させ、自然ろ過して凝集物を分離させた。次に、分離した凝集物を水３０ｇ、及びメタノール１８ｇの混合溶液で洗浄後、８０℃恒温槽で５時間乾燥させ水分を十分に除去しポリマー粒子の塊を得た。 Next, the aqueous solution was purged with argon gas at room temperature (25 ° C.) at a flow rate of 100 mL / min for 15 seconds. After the argon purge, 10 mg of 2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a polymerization initiator is dissolved in 2.5 g of water at 70 ° C., N-isopropylacrylamide A solution of 0.4% by mass (0.17 mol%) of 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride with respect to the total amount was added and polymerized for 1 hour. About 48 g of a polymerization solution containing N-isopropylacrylamide polymer particles obtained by the above polymerization was placed in a 100 cc beaker, coagulated with 28 g of methanol, and spontaneously filtered to separate aggregates. Next, the separated aggregate was washed with a mixed solution of 30 g of water and 18 g of methanol, and then dried in a thermostat at 80 ° C. for 5 hours to remove water sufficiently to obtain a mass of polymer particles.
次に、前記ポリマー粒子の塊を１５０ｍＬねじ口管びん（商品名：ＳＶ−１５０、日電理化硝子株式会社製）入れ、アセトン２５ｇを添加し、４０ｍｍ回転子で均一に分散させた後、ヘキサン５０ｃｃを添加し再沈殿させた。再沈殿させた沈殿物をガラス棒で潰し小粒にさせた。次に、デカンテーションでヘキサンを除去し、同様にして、５０ｃｃヘキサンを添加し、再沈殿させた。この操作を３回繰り返した。次に５０℃で３時間ホットプレートでプレ乾燥させた後、５０℃で減圧乾燥させ、粉末状のポリマー粒子Ａを調製した。収量は、２．２５ｇで、収率は約９０％であり、２５℃における体積平均粒径（Ｄ５０）は２．４１μｍ、２５℃におけるキュムラント粒径は２．２４でり、５質量％分散液でのせん断粘度は、２５℃では０．０１ｍＰａ・ｓ、３７℃では２，７４０ｍＰａ・ｓであった。前記ポリマー粒子の体積平均粒径（Ｄ５０）及びキュムラント粒径は以下の測定方法により測定した。また、ポリマー粒子のせん断粘度は以下の測定条件により測定した。 Next, a mass of the polymer particles is put into a 150 mL screw cap tube (trade name: SV-150, manufactured by Nichiden-Rika Glass Co., Ltd.), 25 g of acetone is added, and uniformly dispersed by a 40 mm rotor. Was added to reprecipitate. The reprecipitated precipitate was crushed with a glass rod and made into granules. Next, the hexane was decanted, and similarly, 50 cc hexane was added to reprecipitate. This operation was repeated three times. Next, after predrying on a hot plate at 50 ° C. for 3 hours, it was dried under reduced pressure at 50 ° C. to prepare powdery polymer particles A. The yield is 2.25 g, the yield is about 90%, the volume average particle size (D50) at 25 ° C. is 2.41 μm, the cumulant particle size at 25 ° C. is 2.24, and 5% by mass dispersion The shear viscosity at 25 ° C. was 0.01 mPa · s, and at 37 ° C. was 2,740 mPa · s. The volume average particle size (D50) and the cumulant particle size of the polymer particles were measured by the following measurement methods. The shear viscosity of the polymer particles was measured under the following measurement conditions.
−ポリマー粒子の体積平均粒径（Ｄ５０）及びキュムラント粒径の測定方法−
前記体積平均粒径（Ｄ５０）及び前記キュムラント粒径としては、濃厚系粒径アナライザー（商品名：ＦＰＡＲ−１０００、大塚電子株式会社製）を用いて、下記のようにサンプル液を調製し、得られたサンプル液を以下の測定条件により測定することができる。
−サンプル液の調製−
純水製造装置（商品名：ＧＳＨ−２０００、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて得られた純水に、０．５質量％になるように合成した粉末状のポリマー粒子Ａを膨潤、分散させる。測定用の液量は５ｃｃ、分散は２０ｍｍ回転子をスターラーを用いて２００ｒｐｍ、約一日攪拌することでサンプル液を調製した。
−測定条件−
・溶媒：水（屈折率：１．３３１４、２５℃における粘度：０．８８４ｃＰ、ＮＤフィルターにより最適光量調製は適宜設定）
・測定プローブ：濃厚用プローブ
・測定ルーチン：測定：２５℃で１８０秒間→測定：２５℃で６００秒間（本体側を３５℃に変更すると次第に液温が２５℃から３５℃になる。その間の粒子径変化をモニタ）→測定：３５℃で１８０秒間
-Method of measuring volume average particle size (D50) of polymer particles and cumulant particle size-
The volume average particle diameter (D50) and the cumulant particle diameter can be obtained by preparing a sample liquid as described below using a concentrated particle diameter analyzer (trade name: FPAR-1000, manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.) The sample solution obtained can be measured under the following measurement conditions.
-Preparation of sample solution-
Powdered polymer particles A synthesized so as to be 0.5% by mass are swollen and dispersed in pure water obtained using a pure water production apparatus (trade name: GSH-2000, manufactured by ADVANTEC). The amount of liquid for measurement was 5 cc, and a sample liquid was prepared by stirring a 20 mm rotor with a stirrer at 200 rpm for about one day for dispersion.
-Measurement conditions-
Solvent: water (refractive index: 1.3314, viscosity at 25 ° C .: 0.884 cP, optimum light amount adjustment is appropriately set by the ND filter)
Measurement probe: Thickening probe Measurement routine: Measurement: 180 seconds at 25 ° C. Measurement: 600 seconds at 25 ° C. (When the body side is changed to 35 ° C., the liquid temperature gradually becomes 25 ° C. to 35 ° C. Particles in the meantime) Monitor diameter change) → Measurement: 180 seconds at 35 ° C
−せん断粘度の測定方法−
０．４質量％の塩化カルシウム（和光純薬工業株式会社製）水溶液にて、滅菌した前記ポリマー粒子Ａを５質量％に希釈し、スターラー（商品名：ＲｅｘｉｍＲＳ−４Ａ、ＡｓＯｎｅ社製）を用いて分散させた。前記分散を確認後、レオメーター（ＡｎｔｏｎＰａａｒ製／ＭＣＲ３０１）にてせん断粘度の測定を行った。レオメーターでの測定は、２５℃でせん断速度１０（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定後、３７℃に昇温しながら、せん断速度０．１（１／ｓ）で１００秒間（１０秒毎に１０点）測定することで求めた。
-Method of measuring shear viscosity-
The sterilized polymer particles A were diluted to 5% by mass with a 0.4% by mass aqueous solution of calcium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and a stirrer (trade name: Rexim RS-4A, manufactured by AsOne) was used. Dispersed. After confirming the dispersion, shear viscosity was measured with a rheometer (manufactured by Anton Paar / MCR301). Measurement with a rheometer is shear rate 0.1 (1 / s) while raising temperature to 37 ° C after measuring for 100 seconds (10 points every 10 seconds) at shear rate 10 (1 / s) at 25 ° C. It asked by measuring for 100 seconds (10 points every 10 seconds) with.
＜＜ポリマー粒子Ｂ〜Ｆの作製例２〜６＞＞
架橋剤の含有量、及び界面活性剤の含有量を表１に記載の含有量に変更した以外は、ポリマー粒子Ａの作製例１と同様にして、ポリマー粒子Ｂ〜Ｆを作製した。表１に、架橋剤の含有量、界面活性剤の含有量、並びに液温２５℃における体積平均粒径、液温２５℃におけるキュムラント粒径、液温３７℃における体積平均粒径、液温３７℃におけるキュムラント粒径、並びに２５℃及び３７℃におけるせん断粘度を示す。また、図６〜１４に、各温度における前記ポリマー粒子の粒度分布を示す。なお、ポリマー粒子Ｂ〜Ｆの体積平均粒径（Ｄ５０）キュムラント粒径、及びせん断粘度は、ポリマー粒子Ａと同様にして測定した。
<< Production Examples 2 to 6 of Polymer Particles B to F >>
Polymer particles B to F were produced in the same manner as in Production Example 1 of polymer particle A, except that the content of the crosslinking agent and the content of the surfactant were changed to the content described in Table 1. In Table 1, the content of the crosslinking agent, the content of the surfactant, the volume average particle diameter at a liquid temperature of 25 ° C., the cumulant particle diameter at a liquid temperature of 25 ° C., the volume average particle diameter at a liquid temperature of 37 ° C., the liquid temperature 37 The cumulant particle size in ° C. and the shear viscosity at 25 ° C. and 37 ° C. are shown. Moreover, the particle size distribution of the said polymer particle in each temperature is shown to FIGS. The volume average particle diameter (D50) of the polymer particles B to F, the cumulant particle diameter, and the shear viscosity were measured in the same manner as the polymer particles A.
＜ポリマー粒子分散液Ａ〜Ｆの作製例１＞
前記ポリマー粒子Ａ〜Ｆを純水にて１０質量％で分散させ、１２１℃、２０分の高圧蒸気滅菌（商品名：ＭＬＳ−３０３０、パナソニック株式会社製）した。その後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ社製）、１％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｄ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、和光純薬工業株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ：和光純薬工業株式会社製）にて、滅菌したポリマー粒子を０．４質量％に希釈し、スターラー（商品名：ＲｅｘｉｍＲＳ−４Ａ、ＡｓＯｎｅ社製）を用いて分散させ、ポリマー粒子分散液Ａ〜Ｆを得た。
Preparation Example 1 of Polymer Particle Dispersions A to F
The polymer particles A to F were dispersed in pure water at 10% by mass, and high-pressure steam sterilization (trade name: MLS-3030, manufactured by Panasonic Corporation) at 121 ° C. for 20 minutes. Then, Dulbecco's modified Eagle's medium (D-MEM: 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco), 1% antibiotic (Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution (100x), Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) The sterilized polymer particles are diluted to 0.4% by mass with Wako Pure Chemical Industries, Ltd., dispersed using a stirrer (trade name: Rexim RS-4A, manufactured by AsOne), and polymer particle dispersion solution A to I got F.
＜ポリマー粒子Ａを含有するポリマー粒子分散液Ａの温度変化による相変化に伴う相状態の確認＞
前記ポリマー粒子分散液Ａを、前記ポリマー粒子Ａの下限臨界溶解温度（３２℃）より高い温度である３７℃、及び前記ポリマー粒子Ａの下限臨界溶解温度以下である２５℃に静置し、ポリマー粒子分散液Ａの相状態を目視で確認した。図４Ａは、下限臨界溶解温度が３２℃である前記ポリマー粒子分散液Ａの２５℃における状態を示す写真である。図４Ｂは、下限臨界溶解温度が３２℃である前記ポリマー粒子分散液Ａの３７℃における状態を示す写真である。
<Confirmation of Phase State Associated with Phase Change Due to Temperature Change of Polymer Particle Dispersion A Containing Polymer Particle A>
The polymer particle dispersion A is allowed to stand at 37 ° C., which is a temperature higher than the lower critical solution temperature (32 ° C.) of the polymer particles A, and 25 ° C., which is lower than the lower critical solution temperature of the polymer particles A, The phase state of the particle dispersion A was visually confirmed. FIG. 4A is a photograph showing the state of the polymer particle dispersion A at 25 ° C., which has a lower critical solution temperature of 32 ° C. FIG. 4B is a photograph showing the polymer particle dispersion A at 37 ° C., which has a lower critical solution temperature of 32 ° C.
図４Ａに示すように、下限臨界溶解温度が３２℃以下である２５℃においては、前記ポリマー粒子分散液Ａはゾル状態で存在することが確認できる。一方、図４Ｂに示すように、下限臨界溶解温度が３２℃よりも高い温度である３７℃においては、前記ポリマー粒子分散液Ａは、ゲル状態で存在することが確認できる。 As shown in FIG. 4A, it can be confirmed that the polymer particle dispersion A exists in a sol state at 25 ° C. where the lower limit critical solution temperature is 32 ° C. or less. On the other hand, as shown in FIG. 4B, at 37 ° C. where the lower critical solution temperature is higher than 32 ° C., it can be confirmed that the polymer particle dispersion A exists in a gel state.
＜ポリマー粒子Ｂを含む組成物のせん断粘度と温度との関係の確認＞
前記ポリマー粒子Ｂを含む組成物のせん断粘度と、温度との関係を下記のように測定し確認した。
下限臨界溶解温度が３２℃であるポリマー粒子Ｂ（体積平均粒径：２．４１μｍ）１質量％を、２０℃において、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に分散させ、せん断粘度を２０℃で１００秒間測定後、３７℃に昇温しながら、さらに１００秒間測定した。図５は、ポリマー粒子Ｂを含む組成物のせん断粘度と、温度との関係を示すグラフである。図５に示すように、下限臨界溶解温度以下である２０℃から下限臨界溶解温度を超える３７℃に昇温した場合のポリマー粒子Ｂを含む組成物のせん断粘度は、９０秒で約２，８６０倍に上昇し、前記ゾル状態と前記ゲル状態との間の相変化に係る温度応答速度が早いことが確認できる。
<Confirmation of relationship between shear viscosity and temperature of composition containing polymer particles B>
The relationship between the shear viscosity of the composition containing the polymer particles B and the temperature was measured and confirmed as follows.
1% by mass of polymer particles B (volume average particle diameter: 2.41 μm) having a lower critical solution temperature of 32 ° C. is dispersed at 20 ° C. in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum, After measuring the shear viscosity at 20 ° C. for 100 seconds, the temperature was further raised to 37 ° C. for 100 seconds. FIG. 5 is a graph showing the relationship between the shear viscosity of the composition containing polymer particles B and the temperature. As shown in FIG. 5, the shear viscosity of the composition containing the polymer particle B when the temperature is raised from 20 ° C., which is lower than the lower critical solution temperature, to 37 ° C., which exceeds the lower critical solution temperature, is about 2,860 in 90 seconds. It can be confirmed that the temperature response speed related to the phase change between the sol state and the gel state is fast.
（実施例１）
＜細胞の調製例＞
−細胞の調製例１−
冷凍保存された緑色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を室温まで解凍し、１０ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と称することがある）へ溶解させ、無血清培地と混合して、１０μＭの溶液を５ｍＬ／ディッシュの緑色蛍光染料含有無血清培地を調製した。次に、３５ｍｍディッシュにて培養しておいたヒト皮膚線維芽細胞（商品名：ＣＣ２５０７、Ｌｏｎｚａ社製、以下、「ＮＨＤＦ」と称することがある）をアスピレータで回収し、前記緑色蛍光染料含有無血清培地に２ｍＬ添加し、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２環境）で３０分間培養した。なお、緑色蛍光染料含有無血清培地に添加する前のＮＨＤＦの遊離状態における体積平均粒径は１５μｍであった。なお、ＮＨＤＦの遊離状態における体積平均粒径は、下記の測定条件に従って測定した。次に、ディッシュの培地をアスピレータで回収し、血清入りの培地を２ｍＬ添加し、アスピレータで回収し細胞を洗浄することで、過剰な緑色蛍光染料、及びＤＭＳＯを洗い流した。さらに、血清入りの培地を３ｍＬ添加し、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２環境）で３０分間以上培養し、細胞を観察できるように緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦを得た。
Example 1
<Example of cell preparation>
-Preparation Example of Cell 1-
A cryopreserved green fluorescent dye (trade name: Cell Tracker Green, manufactured by LifeTechnology) is thawed to room temperature, dissolved in dimethyl sulfoxide (hereinafter sometimes referred to as "DMSO") at a concentration of 10 mM, and serum-free medium And mixed with it to prepare a 10 .mu.M solution in 5 mL / dish of a serum-free medium containing green fluorescent dye. Next, human skin fibroblasts (trade name: CC2507, manufactured by Lonza, hereinafter sometimes referred to as "NHDF") cultured in a 35 mm dish are recovered with an aspirator, and the green fluorescent dye-containing non-containing 2 mL of serum medium was added and cultured for 30 minutes in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 environment). In addition, the volume average particle diameter in the free state of NHDF before adding to the green fluorescent dye-containing serum-free medium was 15 μm. In addition, the volume average particle diameter in the free state of NHDF was measured according to the following measurement conditions. Next, the culture medium of the dish was collected with an aspirator, 2 mL of a medium containing serum was added, the collection was carried out with an aspirator, and the cells were washed to wash away excess green fluorescent dye and DMSO. Furthermore, 3 mL of serum-containing medium was added and cultured in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 environment) for 30 minutes or more to obtain NHDF stained with a green fluorescent dye so that cells could be observed.
−細胞の遊離状態における体積平均粒径（Ｄ５０）の測定条件−
インキュベーター内（商品名：ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５％ＣＯ２環境）において、１％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｄ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、和光純薬工業株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（和光純薬工業株式会社製、以下、「Ｄ−ＭＥＭ」と称することがある）でＮＨＤＦ（商品名：ＣＣ−２５０９、Ｌｏｎｚａ社製）を培養後、アスピレータ（商品名：ＶＡＣＵＳＩＰ、ＩＮＴＥＧＲＡ社製）で１００ｍｍディッシュ内の１０％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」と称することがある）、及び前記培地を除去した。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（和光純薬工業株式会社製、以下、「ＰＢＳ（−）」と称することがある）を３ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（−）を吸引除去し、表面を洗浄した。ＰＢＳ（−）による洗浄作業を３回繰り返した後、０．１％トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ， ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、和光純薬工業株式会社製）を３ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡で細胞の剥離を確認後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを４ｍＬ加え、トリプシンを失活させた。遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５分間、５℃）を行い、アスピレータで上清を除去した。除去後、遠沈管に１０％ＦＢＳ、及び１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させた。その細胞懸濁液から１０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、０．４％トリパンブルー染色液１０μＬを加えてピペッティングを行った。染色した細胞懸濁液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて細胞の体積平均粒径（Ｄ５０）を測定した。
-Measurement conditions of volume average particle size (D50) in free state of cells-
1% antibiotics (Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution (100x), Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in an incubator (trade name: KM-CC17RU2, manufactured by Panasonic Corporation, 37 ° C., 5% CO 2 environment) After culturing NHDF (trade name: CC-2509, manufactured by Lonza) in Dulbecco's modified Eagle medium (including Wako Pure Chemical Industries, Ltd., sometimes referred to as "D-MEM"), aspirator (trade name) : 10% fetal bovine serum (hereinafter sometimes referred to as "FBS") in a 100 mm dish with VACUSIP (manufactured by INTEGRA), and the medium was removed. To the dish, 3 mL of phosphate buffered saline (made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter sometimes referred to as "PBS (-)") was added, the PBS (-) was removed by aspiration with an aspirator, and the surface was washed . The washing operation with PBS (-) is repeated three times, 3 mL of 0.1% trypsin solution (Trypsin, from Porcine Pancreas, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added, and the mixture is heated for 5 minutes in an incubator. The cells were detached from the After confirming detachment of the cells with a phase contrast microscope, 4 mL of D-MEM containing 10% FBS and 1% antibiotics was added to inactivate the trypsin. The mixture was transferred to a centrifuge tube, centrifuged (trade name: H-19FM, manufactured by KOKUSAN, 1.2 × 10 3 rpm (234 G), 5 minutes, 5 ° C.), and the supernatant was removed with an aspirator. After removal, 1 mL of D-MEM containing 10% FBS and 1% antibiotic was added to a centrifuge tube, and pipetting was performed gently to disperse the cells. 10 μL of the cell suspension was removed into an eppendorf tube, and 10 μL of 0.4% trypan blue staining solution was added to perform pipetting. 10 μL of the stained cell suspension was taken out and placed on a PMMA plastic slide, and the volume average particle size (D50) of the cells was measured using a trade name: Countess Automated Cell Counter (manufactured by Invitrogen).
−細胞の調製例２−
前記細胞の調製例１における緑色蛍光染料に代えて赤色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた以外は、前記細胞の調製例１と同様にして、細胞を観察できるように赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦを得た。
-Preparation Example of Cell 2-
Cells can be observed in the same manner as in the preparation example 1 of the cells except that a red fluorescent dye (trade name: Cell Tracker Orange, manufactured by Life Technology) is used instead of the green fluorescent dye in the preparation example 1 of the cells. Thus, an NHDF stained with a red fluorescent dye was obtained.
−細胞分散液の作製例１−
前記細胞の調製例２で得た赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦを３５ｍｍディッシュにおいて、アスピレータ（商品名：ＶＡＣＵＳＩＰ、ＩＮＴＥＧＲＡ社製）で３５ｍｍディッシュ内の１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを除去した。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−）、和光純薬工業株式会社製）を３ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（−）を吸引除去し、表面を洗浄した。ＰＢＳ（−）による洗浄作業を３回繰り返した後、０．１％トリプシン溶液（Ｔｒｙｐｓｉｎ， ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｓ、和光純薬工業株式会社製）を３ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡で細胞の剥離を確認後、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを４ｍＬ加え、トリプシンを失活させた。遠沈管に移し、遠心分離（商品名：Ｈ−１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ（２３４Ｇ）、５分間、５℃）を行い、アスピレータで上清を除去した。除去後、遠沈管に１０％ＦＢＳ、１％抗生物質を含むＤ−ＭＥＭを１００μＬ添加し、次に、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ、細胞分散液１を得た。前記細胞分散液１における細胞の遊離状態における体積平均粒径の測定条件に従い測定した細胞の遊離状態における体積平均粒径は、１３μｍであり、細胞数は、５×１０５個であり、細胞生存率は９１％であった。
前記細胞数、及び細胞生存数は、細胞の遊離状態における体積平均粒径の測定条件と同様にして、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定した。
Preparation Example of Cell Dispersion
D-containing NHDF stained with the red fluorescent dye obtained in Preparation Example 2 of cells in a 35 mm dish with 10% FBS, 1% antibiotic in a 35 mm dish with an aspirator (trade name: VACUSIP, manufactured by INTEGRA) Removed MEM. To the dish was added 3 mL of phosphate buffered saline (PBS (-), manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the aspirator was used to aspirate and remove PBS (-) to wash the surface. The washing operation with PBS (-) is repeated three times, 3 mL of 0.1% trypsin solution (Trypsin, from Porcine Pancreas, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added, and the mixture is heated for 5 minutes in an incubator. The cells were detached from the After confirming detachment of the cells with a phase contrast microscope, 4 mL of D-MEM containing 10% FBS and 1% antibiotics was added to inactivate the trypsin. The mixture was transferred to a centrifuge tube, centrifuged (trade name: H-19FM, manufactured by KOKUSAN, 1.2 × 10 3 rpm (234 G), 5 minutes, 5 ° C.), and the supernatant was removed with an aspirator. After removal, 100 μL of D-MEM containing 10% FBS and 1% antibiotic was added to a centrifuge tube, and then pipetting was performed gently to disperse the cells, whereby a cell dispersion 1 was obtained. The volume average particle diameter in the free state of the cells measured according to the measurement condition of volume average particle diameter in the free state of the cells in the cell dispersion 1 is 13 μm, and the number of cells is 5 × 10 5 , cell survival The rate was 91%.
The cell number and the cell survival number were measured using the trade name: Countess Automated Cell Counter (manufactured by Invitrogen) under the same conditions as the measurement conditions of the volume average particle size in the free state of the cells.
＜三次元細胞集合体の作製＞
図１５Ａに示すように、前記細胞の調製例１で得た緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３１０の３５ｍｍディッシュ３００から、培地をアスピレータで除去し、ピペットを用いて前記ポリマー粒子分散液Ｂ３５０を緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３１０上に１ｍＬ添加した。さらに、３５ｍｍディッシュを共焦点蛍光顕微鏡（ライカ社製）に設置した前記ポリマー粒子Ｂの限界臨界溶解温度（３２℃）より高い温度に設定したインキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２環境）で５分間放置し、細胞上に配したポリマー粒子分散液Ｂをゲル化させることにより層を形成させた。次に、ピペットを用いて前記細胞分散液１を前記層の上に静かに０．１ｍＬ（細胞数：５×１０６個）播種し、図１５Ｂに示すような緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３１０、ポリマー粒子分散液Ｂ３５０、赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３２０をこの順に積層した積層体１を得た。
<Preparation of three-dimensional cell assembly>
As shown in FIG. 15A, the medium is removed from the 35 mm dish 300 of NHDF 310 stained with the green fluorescent dye obtained in Preparation Example 1 of the cells with an aspirator, and the polymer particle dispersion B 350 is subjected to green fluorescence using a pipette. 1 mL was added onto the dye-stained NHDF 310. Furthermore, in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 environment) set to a temperature higher than the critical critical dissolution temperature (32 ° C.) of the polymer particles B in which a 35 mm dish is placed in a confocal fluorescence microscope (manufactured by Leica) After standing for a minute, a layer was formed by gelling the polymer particle dispersion B disposed on the cells. Next, gently pipette 0.1 mL (cell number: 5 × 10 6 ) of the cell dispersion 1 onto the layer using a pipette, and stain it with a green fluorescent dye as shown in FIG. 15B. Polymer particle dispersion B350 and NHDF 320 dyed with a red fluorescent dye were laminated in this order to obtain a laminate 1.
次に、ディッシュの温度を３７℃から前記ポリマー粒子Ｂの下限臨界溶解温度（３２℃）以下である２５℃まで降温させ、１０分間放置し、前記ポリマー粒子分散液Ｂをゾル化させ、赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦを沈降させることで、図１５Ｃに示すような緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３１０、及び赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ３２０が積層された三次元細胞集合体１を得た。前記三次元細胞積層体１を蛍光顕微鏡にて観察した結果が図１６である。図１６に示すように、緑色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ（図では灰色）上に、赤色蛍光染料で染色されたＮＨＤＦ（図では黒色）が観察できており、細胞の伸展が確認でき、細胞間の接着、及び自己組織化が起きていることが確認できた。 Next, the temperature of the dish is lowered to 37 ° C. to 25 ° C. which is equal to or lower than the lower critical solution temperature (32 ° C.) of the polymer particles B, and left for 10 minutes to sol the polymer particle dispersion B to red fluorescent light By precipitating the dye-stained NHDF, a three-dimensional cell aggregate 1 was obtained in which the green fluorescent dye-stained NHDF 310 and the red fluorescent dye-stained NHDF 320 were stacked as shown in FIG. 15C. The result of observing the three-dimensional cell laminate 1 with a fluorescence microscope is FIG. As shown in FIG. 16, on the NHDF stained with the green fluorescent dye (gray in the figure), the NHDF stained with the red fluorescent dye (black in the figure) can be observed, and the spreading of the cells can be confirmed. It was confirmed that adhesion between itself and self-organization had occurred.
前記三次元細胞集合体の平均厚みは、三次元細胞集合体１をヘマトキシリン・エオジン法（ＨＥ）染色し、断面を確認し、実体顕微鏡を用いて測定した。その結果、前記三次元細胞集合体１の平均厚みは、０．０１ｍｍ以上０．０３ｍｍ以下であった。実体顕微鏡を用いて測定した三次元細胞集合体１の断面観察像の結果を図１７に示す。組織体中の空隙割合や細胞の進展度合いから、細胞が増殖、進展していることが分かる。 The average thickness of the three-dimensional cell assembly was obtained by staining the three-dimensional cell assembly 1 with hematoxylin-eosin method (HE), confirming the cross section, and measuring it using a stereomicroscope. As a result, the average thickness of the three-dimensional cell assembly 1 was 0.01 mm or more and 0.03 mm or less. The result of the cross-sectional observation image of the three-dimensional cell assembly 1 measured using a stereomicroscope is shown in FIG. The percentage of voids in the tissue and the degree of cell development indicate that the cells are proliferating and developing.
（実施例２〜６）
ポリマー粒子分散液Ｂをポリマー粒子分散液Ａ、及びＣ〜Ｆに変更した以外は、実施例１と同様にして、三次元細胞集合体２〜６を得た。三次元細胞集合体２〜６を蛍光顕微鏡にて観察した結果、三次元細胞集合体１と同様に、細胞の伸展が確認でき、細胞間の接着、及び自己組織化が起きていることが確認できた。前記三次元細胞集合体２〜６の平均厚みは０．０１ｍｍ以上であった。
(Examples 2 to 6)
Three-dimensional cell aggregates 2 to 6 were obtained in the same manner as in Example 1 except that the polymer particle dispersion B was changed to polymer particle dispersions A and C to F. As a result of observing the three-dimensional cell assemblies 2 to 6 with a fluorescence microscope, it is possible to confirm cell spreading as in the three-dimensional cell assembly 1 and confirm that adhesion between cells and self-organization occur. did it. The average thickness of the three-dimensional cell assembly 2 to 6 was 0.01 mm or more.
（比較例１）
ポリマー粒子分散液Ｂを使用しなかった以外は、実施例１と同様にして、細胞集合体１を得た。細胞集合体１を共焦点蛍光顕微鏡にて観察した結果、細胞が三次元積層体を形成しておらず、前記細胞集合体１の厚さが０．０１ｍｍ未満と薄い細胞シート状態であった。
(Comparative example 1)
A cell aggregate 1 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the polymer particle dispersion B was not used. As a result of observing the cell assembly 1 with a confocal fluorescence microscope, the cells did not form a three-dimensional laminate, and the thickness of the cell assembly 1 was a thin cell sheet of less than 0.01 mm.
（ポリマー粒子の細胞毒性の評価）
前記実施例１で作製した三次元細胞集合体１を位相差顕微鏡で観察した。結果を図１８Ａに示す。また、前記比較例１で作製した細胞集合体１を位相差顕微鏡で観察した。結果を図１８Ｂに示す。
(Evaluation of cytotoxicity of polymer particles)
The three-dimensional cell assembly 1 prepared in Example 1 was observed with a phase contrast microscope. The results are shown in FIG. 18A. Moreover, the cell assembly 1 produced in the said comparative example 1 was observed with the phase-contrast microscope. The results are shown in FIG. 18B.
図１８Ａ及び図１８Ｂの結果から、図１８Ｂの比較例１の培養後のＮＨＤＦと比較して、図１８Ａの実施例１の培養後の三次元細胞集合体１は、細胞の増殖及び伸展が確認でき、ポリマー粒子は細胞への毒性がないことが分かる。なお、図には示していないが、前記ポリマー粒子分散液Ｂに代えて前記ポリマー粒子分散液Ａ、及びＣ〜Ｆを用いた場合も、細胞の増殖及び伸展が確認でき、細胞への毒性がないことが確認できた。 From the results of FIGS. 18A and 18B, compared to the NHDF after culture of Comparative Example 1 of FIG. 18B, the three-dimensional cell assembly 1 after culture of Example 1 of FIG. It can be seen that the polymer particles are not toxic to cells. Although not shown in the figure, even when the polymer particle dispersions A and C to F are used instead of the polymer particle dispersion B, cell proliferation and spreading can be confirmed, and toxicity to the cells is It has been confirmed that there is no.
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞ 基体上に、細胞と、温度変化により相変化するポリマー粒子を含む組成物とを配し、温度変化により前記ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させることを複数回繰り返し、三次元細胞集合体を製造することを特徴とする三次元細胞集合体の製造方法。
＜２＞ 温度変化が、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度に昇温させることにより行われる前記＜１＞に記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜３＞ ポリマー粒子のゾル状態の組成物中における体積平均粒径が、細胞の遊離状態における体積平均粒径より小さい前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜４＞ ポリマー粒子を含む組成物をゾル状態からゲル状態に相変化させた後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度より高い温度で細胞を培養する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜５＞ ポリマー粒子のゾル状態の組成物中における体積平均粒径が、５０μｍ以下である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜６＞ 細胞が、接着性細胞である前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜７＞ ポリマー粒子が、組成物中に均一に分散する前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜８＞ 細胞と、ポリマー粒子を含む組成物とが同時に基体上に配される前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜９＞ 細胞が基体上に配された後に、前記細胞上にポリマー粒子を含む組成物が配される前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜１０＞ 少なくともポリマー粒子を含む組成物が、インクジェット法、ディスペンサー法、及びピペット法から選択される少なくとも一種により基体上に配される前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜１１＞ 細胞を培養した後に、ポリマー粒子の下限臨界溶解温度以下に降温し、ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させる前記＜４＞から＜１０＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜１２＞ 細胞を培養し、ポリマー粒子を含む組成物をゲル状態からゾル状態に相変化させた後に、前記ポリマー粒子を除去する前記＜１１＞に記載の三次元細胞集合体の製造方法である。
＜１３＞ 細胞の遊離状態における体積平均粒径よりもゾル状態における体積平均粒径が小さいポリマー粒子を含み、温度変化によりゾル状態とゲル状態との間で相変化する組成物を含有することを特徴とする三次元細胞集合体である。
＜１４＞ 平均厚みが、０．０１ｍｍ以上２０ｍｍ以下である前記＜１３＞に記載の三次元細胞集合体である。
＜１５＞ 前記ポリマー粒子のゲル状態における体積平均粒径が、５０μｍ以下である前記＜１３＞から＜１４＞のいずれかに記載の三次元細胞集合体である。
＜１６＞ 温度変化によりゾル状態とゲル状態との間で相変化するポリマー粒子を含む組成物を含有することを特徴とする三次元細胞集合体形成用溶液。
As an aspect of this invention, it is as follows, for example.
<1> A plurality of cells and a composition containing polymer particles phase-changed by temperature change are disposed on a substrate, and the composition containing the polymer particles is phase-changed from sol state to gel state by temperature change. A method for producing a three-dimensional cell assembly, characterized in that three-dimensional cell assemblies are produced repeatedly.
<2> The method for producing a three-dimensional cell assembly according to <1>, wherein the temperature change is performed by raising the temperature to a temperature higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles.
<3> The three-dimensional cell assembly according to any one of <1> to <2>, wherein the volume average particle size in the composition in the sol state of the polymer particles is smaller than the volume average particle size in the free state of cells. It is a manufacturing method.
<4> The phase according to any one of <1> to <3>, wherein the cells are cultured at a temperature higher than the lower critical solution temperature of the polymer particles after phase-changing the composition containing the polymer particles from the sol state to the gel state. A method of producing a three-dimensional cell assembly of
It is a manufacturing method of the three-dimensional cell assembly in any one of said <1> to <4> whose volume average particle diameter in the composition of the sol state of <5> polymer particle is 50 micrometers or less.
<6> The method for producing a three-dimensional cell assembly according to any one of <1> to <5>, wherein the cells are adherent cells.
<7> The method for producing a three-dimensional cell aggregate according to any one of <1> to <6>, wherein the polymer particles are uniformly dispersed in the composition.
It is a manufacturing method of the three-dimensional cell assembly in any one of said <1> to <7> in which a <8> cell and the composition containing a polymer particle are simultaneously arrange | positioned on a base | substrate.
<9> The method for producing a three-dimensional cell assembly according to any one of <1> to <7>, wherein the composition containing the polymer particles is disposed on the cells after the cells are disposed on the substrate. is there.
<10> The three-dimensional structure according to any one of <1> to <9>, wherein the composition containing at least the polymer particles is disposed on the substrate by at least one selected from an inkjet method, a dispenser method, and a pipette method. It is a manufacturing method of a cell assembly.
<11> After culturing the cells, the temperature is lowered below the lower critical solution temperature of the polymer particles, and the composition containing the polymer particles is phase-changed from the gel state to the sol state according to any one of the above <4> to <10> A method of producing a three-dimensional cell assembly of
<12> The method for producing a three-dimensional cell assembly according to <11>, wherein the polymer particles are removed after culturing the cells and changing the composition including the polymer particles from the gel state to the sol state. .
<13> A composition containing polymer particles having a volume average particle size smaller in the sol state than a volume average particle size in the free state of cells, and containing a phase change between the sol state and the gel state by temperature change It is a feature of three-dimensional cell assembly.
<14> The three-dimensional cell assembly according to <13>, wherein the average thickness is 0.01 mm or more and 20 mm or less.
<15> The three-dimensional cell assembly according to any one of <13> to <14>, wherein a volume average particle diameter of the polymer particles in a gel state is 50 μm or less.
<16> A solution for forming a three-dimensional cell aggregate, comprising a composition comprising polymer particles that undergo a phase change between a sol state and a gel state due to a temperature change.
１、１０、１００：基体
２、１３０：ゾル状態のポリマー粒子を含む組成物
３：ゲル状態のポリマー粒子を含む組成物
1, 10, 100: substrate 2, 130: composition containing polymer particles in sol state 3: composition containing polymer particles in gel state
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