JP6514849B2 - 低温における酵素活性を向上させた好熱菌由来酵素の改変体の取得方法、及び低温における酵素活性が向上しているサーマス・サーモフィラス由来3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の改変体 - Google Patents
低温における酵素活性を向上させた好熱菌由来酵素の改変体の取得方法、及び低温における酵素活性が向上しているサーマス・サーモフィラス由来3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の改変体 Download PDFInfo
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Description
工程1:好熱菌由来の被改変酵素の立体構造を分析し、該被改変酵素の基質結合部位及び/又は補酵素結合部位から8Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程2:前記被変異酵素のアミノ酸配列と、前記被変異酵素と同種で常温菌由来の参照酵素のアミノ酸配列とをペアワイズアライメントにより分析し、前記工程1で特定されたアミノ酸配列部位と、前記参照酵素のアミノ酸配列においてペアワイズアライメント上で対応するアミノ酸配列部位を対比して、両者間でアミノ酸残基が一致していないアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程3:前記被変異酵素に対して、前記工程2で特定されたアミノ酸配列部位の少なくとも1つにおいてアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行い、変異体を得る工程、及び
工程4:前記工程3で得られた変異体の中から、被変異酵素よりも低温での酵素活性が向上している変異体を選定する工程。
項1. 好熱菌由来の被改変酵素を変異させることにより、低温での酵素活性が向上した改変体を取得する方法であって、
工程1:好熱菌由来の被改変酵素の立体構造を分析し、該被改変酵素の基質結合部位及び/又は補酵素結合部位から8Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程2:前記被変異酵素のアミノ酸配列と、前記被変異酵素と同種で常温菌由来の参照酵素のアミノ酸配列とをペアワイズアライメントにより分析し、前記工程1で特定されたアミノ酸配列部位と、前記参照酵素のアミノ酸配列においてペアワイズアライメント上で対応するアミノ酸配列部位を対比して、両者間でアミノ酸残基が一致していないアミノ酸配列部位を特定する工程、
工程3:前記被変異酵素に対して、前記工程2で特定されたアミノ酸配列部位の少なくとも1つにおいてアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行い、変異体を得る工程、及び
工程4:前記工程3で得られた変異体の中から、被変異酵素よりも低温での酵素活性が向上している変異体を選定する工程、
を含むことを特徴とする、改変体の取得方法。
項2. 前記工程3におけるアミノ酸の置換、欠失、又は挿入が、前記参照酵素のアミノ酸配列において対応する部位のアミノ酸残基と同一となるように行われる、項1に記載の改変体の取得方法。
項3. 好熱菌由来の被改変酵素が、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素である、項1又は2に記載の改変体の取得方法。
項4. 下記(A)〜(O)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号1に示すアミノ酸配列における78番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号1に示すアミノ酸配列における214番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、216番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、218番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、219番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、222番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、225番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ229番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(C)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(D)配列番号1に示すアミノ酸配列における324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(E)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(F)配列番号1に示すアミノ酸配列における78番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、78番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(G)配列番号1に示すアミノ酸配列における214番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、216番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、218番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、219番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、222番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、225番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ229番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、214番目、216番目、218番目、219番目、222番目、225番目、及び229番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(H)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、272番目及び273番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(I)配列番号1に示すアミノ酸配列における324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(J)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、272番目、273番目、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(K)配列番号1に示すアミノ酸配列における78番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、78番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(L)配列番号1に示すアミノ酸配列における214番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、216番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、218番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、219番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、222番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、225番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ229番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、214番目、216番目、218番目、219番目、222番目、225番目、及び229番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(M)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、272番目及び273番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(N)配列番号1に示すアミノ酸配列における324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(O)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、272番目、273番目、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド。
項5. 項1に記載のポリペプチドをコードしているDNA。
項6. 項5に記載のDNAを含む組換えベクター。
項7. 項6に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項8. 項7に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項1に記載のポリペプチドの製造方法。
本発明の改変体の取得方法は、好熱菌由来の酵素(被改変酵素)を変異させることにより、低温での酵素活性が向上した改変体を取得する方法である。以下、本発明の改変体の取得方法において、変異を導入する対象となる被改変酵素、変異導入部位を特定するために参照される参照酵素、各工程1〜4について詳述する。
本発明の改変体の取得方法において、被改変酵素は、変異を導入される対象となる酵素であり、好熱菌由来の酵素が使用される。
本発明の改変体の取得方法において、参照酵素は、前記被改変酵素に変異を導入させる部位、導入する変異の種類等を決定する上で参照される酵素である。
工程1では、好熱菌由来の被改変酵素の立体構造を分析し、該被改変酵素の基質結合部位及び/又は補酵素結合部位から8Åの距離に存在するアミノ酸配列部位を特定する。
工程2では、前記被変異酵素のアミノ酸配列と、前記被変異酵素と同種で常温菌由来の参照酵素のアミノ酸配列とをペアワイズアライメントにより分析し、前記工程1で特定されたアミノ酸配列部位と、前記参照酵素のアミノ酸配列においてペアワイズアライメント上で対応するアミノ酸配列部位を対比して、両者間でアミノ酸残基が一致していないアミノ酸配列部位を特定する。
工程3では、前記被改変酵素に対して、変異候補部位の少なくとも1つにおいてアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を行い、改変体を得る。
工程4では、前記工程3で得られた改変体の中から、被改変酵素よりも低温での酵素活性が向上している改変体を選定する。
本発明は、前記改変体の取得方法によって得られたポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、TthIPMDHの改変体であり、低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性がTthIPMDHよりも向上している3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素である。3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素とは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、NAD+とも記述する)を補酵素とする酸化還元酵素であり、3−イソプロピルリンゴ酸とNAD+を基質とし、2−イソピル−3−オキソコハク酸とNADH、およびH+を生成する反応を触媒する、EC番号が1.1.1.85に分類される酵素である。
(A)配列番号1に示すアミノ酸配列における78番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号1に示すアミノ酸配列における214番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、216番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、218番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、219番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、222番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、225番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ229番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(C)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(D)配列番号1に示すアミノ酸配列における324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(E)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(F)配列番号1に示すアミノ酸配列における78番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、78番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(G)配列番号1に示すアミノ酸配列における214番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、216番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、218番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、219番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、222番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、225番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ229番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、214番目、216番目、218番目、219番目、222番目、225番目、及び229番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(H)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、272番目及び273番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(I)配列番号1に示すアミノ酸配列における324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(J)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、272番目、273番目、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(K)配列番号1に示すアミノ酸配列における78番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(L)配列番号1に示すアミノ酸配列における214番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、216番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、218番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、219番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、222番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、225番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ229番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、214番目、216番目、218番目、219番目、222番目、225番目、及び229番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(M)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、272番目及び273番目のアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(N)配列番号1に示すアミノ酸配列における324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(O)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、272番目、273番目、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が80%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、TthIPMDHと比較して低温での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド。
3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性は下記試薬を用い、下記測定条件で測定する。
50mM HEPES−KOH緩衝液(pH8.0)、5mM 塩化マグネシウム、100mM 塩化カリウム、400μM 3−イソプロピルリンゴ酸、5mM NAD+を含有する水溶液
試薬0.9mLを分光光度計用セルに入れ、25℃で5分間以上プレインキュベートする。測定対象となるポリペプチドを所定濃度に希釈した酵素溶液0.005mLを添加してよく混合し、分光光度計で340nmの吸光度変化を60秒間記録し、その間の吸光度変化(ΔOD)を測定する。ブランクは、酵素溶液の代わりに水を試薬に混合して上記のように吸光度変化(ΔODblank)を測定する。これらの値から、下記の計算式に従って活性値を求める。
3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の比活性は、下記測定条件で測定する。上記方法に従い酵素溶液の活性(U/mL)を求め、更に測定に使用した酵素溶液のポリペプチド濃度(mg/ml)を求める。これらの値から、以下の計算式に従って、比活性を求める。
本発明のポリペプチドをコードしているDNA(以下、「本発明のDNA」と表記することもある)は、例えば、TthIPMDH(配列番号1)をコードしているDNAに前記アミノ酸変異を導入することにより得ることができる。また、本発明のDNAは、遺伝子の全合成法によって人工合成することもできる。
F:フェニルアラニン(ttt)、L:ロイシン(ctg)、I:イソロイシン(att)、M:メチオニン(atg)、V:バリン(gtg)、Y:チロシン(tat)、終止コドン(taa)、H:ヒスチジン(cat)、Q:グルタミン(cag)、N:アスパラギン(aat)、K:リジン(aaa)、D:アスパラギン酸(gat)、E:グルタミン酸(gaa)、S:セリン(agc)、P:プロリン(ccg)、T:スレオニン(acc)、A:アラニン(gcg)、C:システイン(tgc)、W:トリプトファン(tgg)、R:アルギニン(cgc)、G:グリシン(ggc)。
本発明のペプチドをコードするDNAを含む組換えベクター(以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある)は、発現ベクターに本発明のDNAを挿入することにより得ることができる。
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体(以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある)が得られる。
本発明のポリペプチドは、本発明の形質転換体を培養することによって製造することができる。
を産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはpH5.0〜9.0程度の範囲である。
本実施例では、被改変酵素としてTthIPMDを使用し、参照酵素として大腸菌由来のIPMDH(以下、EcoIPMDHとも表記する)を使用した。
サーマス・サーモフィラス HB8株を培養し定法により抽出したゲノムDNAを鋳型に、配列番号4と配列番号5のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより野生型TthIPMDHのDNAを増幅させた。エタノール沈殿により精製した該DNAとプラスミドpET21cを夫々制限酵素NdeIとHindIIIで切断し、切断された夫々のDNA断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルからDNAを精製した。精製されたTthIPMDHのDNA断片とpET21c断片を混合してLigation High(東洋紡製)を使用してライゲーションさせ、大腸菌JM109を形質転換して培養し、単一コロニーからプラスミドを精製し、DNAシーケンスにより配列番号2に示す塩基配列からなるDNAをクローニングされたことが確認された。該塩基配列から、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるTthIPMDHをコードしていることも確認された。
補酵素NAD+及び基質3−イソプロピルリンゴ酸と複合体を形成したTthIPMDHの立体構造情報(PDB ID:4F7I)をPDBホームページより取得し、該構造をSwiss−PdbViewerにより可視化した。補酵素NAD+及び基質3−イソプロピルリンゴ酸と結合するアミノ酸残基から8Å内に存在するアミノ酸残基を抽出した。同時に、配列番号1に示されるTthIPMDHのアミノ酸配列と、配列番号3に示されるEcoIPMDHのアミノ酸配列を用いてClustalWによりペアワイズアライメント図を作成し、前記8Å内に存在するアミノ酸残基をマークした。結果を図1に示す。図1においては、TthIPMDHのアミノ酸配列における前記8Å内に存在するアミノ酸残基にアンダーバーを付している。この中で、TthIPMDHとEcoIPMDHの間でアミノ酸残基が異なる部分を白抜き四角でマークした。
TthIPMDH遺伝子への部位特異的変異導入は、前記表1に併記した配列番号6〜27に示す変異導入用オリゴヌクレオチドと、配列番号28及び配列番号29に示す増幅用オリゴヌクレオチド、前記TthIPMDH遺伝子をクローニングしたpET21cベクター(以下、pET21c−TthIPMDHとも記述する)を利用した。
図2におけるプライマーaは、pET21c配列上に設計されたT7 promoter primerであり、配列番号28に示されるオリゴヌクレオチドである。プライマーdは、配列表の配列番号7に示されるオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、F41Vの変異を導入するように設計されている。表2に示すPCR反応溶液を準備し、98℃:30秒、53℃:30秒、72℃:120秒の反応を25サイクル実施した。増幅されたプライマーa〜d間のDNA断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから該DNA断片を精製した。
図2におけるプライマーbは、pET21c配列上に設計されたT7 terminator primerであり、配列番号29に示されるオリゴヌクレオチドである。プライマーcは、配列番号6に示されるオリゴヌクレオチドである。該オリゴヌクレオチドは、F41Vの変異を導入するように設計されている。表3に示すPCR反応溶液を準備し、98℃:30秒、53℃:30秒、72℃:120秒の反応を25サイクル実施した。増幅されたプライマーc〜b間のDNA断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから該DNA断片を精製した。
PCR#1およびPCR#2で得られたDNA断片を鋳型に、プライマーaとプライマーbを用いて表4に示すPCR反応溶液を準備し、98℃:30秒、53℃:30秒、72℃:120秒の反応を25サイクル実施した。増幅されたプライマーc〜b間のDNA断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから該DNA断片を精製した。
実施例1で取得した野生型TthIPMDH及びmut1〜mut11のプラスミドを用いて大腸菌Rosetta2(DE3)を形質転換し、LB寒天培地上(1.0%トリプトン、0.5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、1.5%寒天、0.1g/mlアンピシリン)で、37℃、16時間培養して形質転換体のコロニーを出現させた。
TthIPMDHの改変体の低温活性を、変異を導入していないTthIPMDHと比較するため、25℃における活性測定を行った。測定条件は、前述する通りである。
25℃における活性が大幅に向上したmut9とmut11の変異を組み合わせたmut9/11改変体酵素を、実施例1〜2に記載の方法により作製し、実施例3と同様に25℃における比活性を、TthIPMDH(野生型)、mut9、およびmut11と比較した。
Claims (5)
- 下記(A)〜(O)のいずれかに示すポリペプチド:
(A)配列番号1に示すアミノ酸配列における78番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号1に示すアミノ酸配列における214番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、216番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、218番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、219番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、222番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、225番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ229番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(C)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(D)配列番号1に示すアミノ酸配列における324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(E)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(F)配列番号1に示すアミノ酸配列における78番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、78番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(G)配列番号1に示すアミノ酸配列における214番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、216番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、218番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、219番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、222番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、225番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ229番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、214番目、216番目、218番目、219番目、222番目、225番目、及び229番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(H)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、272番目及び273番目以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(I)配列番号1に示すアミノ酸配列における324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(J)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、272番目、273番目、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸以外のアミノ酸の1個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(K)配列番号1に示すアミノ酸配列における78番目がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列において、78番目のアミノ酸を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(L)配列番号1に示すアミノ酸配列における214番目がメチオニン、グリシン又はアラニンに置換、216番目がイソロイシン、ロイシン又はバリンに置換、218番目がアスパラギン、セリン又はグルタミンに置換、219番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、222番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換、225番目がリジン又はヒスチジンに置換、且つ229番目がグルタミン、アスパラギン又はセリンに置換されたアミノ酸配列において、214番目、216番目、218番目、219番目、222番目、225番目、及び229番目のアミノ酸を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(M)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、且つ273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換されたアミノ酸配列において、272番目及び273番目のアミノ酸を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(N)配列番号1に示すアミノ酸配列における324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド、
(O)配列番号1に示すアミノ酸配列における272番目がアラニン、メチオニン又はグリシンに置換、273番目がグリシン、アラニン又はメチオニンに置換、324番目がアルギニン、リジン又はヒスチジンに置換、325番目がスレオニン、グルタミン又はアスパラギンに置換、且つ325番目と326番目の間にグリシン、アラニン又はメチオニンが挿入されてなるアミノ酸配列において、272番目、273番目、324番目及び325番目のアミノ酸並びに325番目と326番目の間に挿入されるアミノ酸を除いた配列同一性が90%以上であり、且つ、3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性を有し、配列番号1に示すアミノ酸配列からなる3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素と比較して25℃での3−イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素活性が向上しているポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードしているDNA。
- 請求項2に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項1に記載のポリペプチドの製造方法。
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