JP6505040B2 - 体液内のリポ蛋白粒子レベルを決定する分析 - Google Patents
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Description
センブリ、方法、システム及び装置に関する。とくに、決定したレベルを使用して、リポ
蛋白粒子に関連する種々の疾病が発症するリスクを予測し、また生理学的変化、治療ルー
チン及び薬学的効果をモニタリングする。
ある。リポ蛋白粒子は、蛋白質及び脂質を含む。リポ蛋白粒子は、エステル化しかつ遊離
したコレステロール、トリアクリルグリコール(トリグリセリド)、リン脂質及びアポリ
ポ蛋白を含む。コレステロール(エステル化しかつ遊離した)及びトリグリセリドは、リ
ポ蛋白粒子内に見られる2つの主要成分である。コレステロールは、動物の細胞膜に使用
されるステロイド代謝物である。トリグリセリドは、グリセロール及び3分子脂肪酸より
なるエステルである。リン脂質は、細胞膜の主要成分である。アポリポ蛋白は、リポ蛋白
粒子の異なるタイプを認識するとともに、酵素的リガンドを生じて生化学的脂質バランス
及び細胞機能のプロセスを容易にするものである。リポ蛋白粒子の親水性成分がリポ蛋白
粒子の外側に見られる。親水性成分は、アポリポ蛋白、リン脂質及びコレステロールの少
なくとも一部分を含む。疎水性成分は、リポ蛋白粒子の内側に見られ、トリグリセリド及
びコレステロールエステルを含む。
重リポ蛋白粒子(LDL−P)、中間比重リポ蛋白粒子(IDL−P)超低比重リポ蛋白
粒子(VLDL−P)、カイロミクロン粒子(CM−P)、及びリポ蛋白(a)粒子(Lp
(a)−P)がある。加水分解されたVLDL−Pは、中間比重リポ蛋白粒子(IDL−P
)と称される。各粒子は、サイズ、比重、蛋白質及び脂質の成分が変化している。
−II、ApoA−IV、ApoA−V)、アポリポ蛋白B(ApoB−48及びApoB−
100)、アポリポ蛋白C(ApoC−I、ApoC−II、ApoC−III、ApoC−I
V)、アポリポ蛋白D、アポリポ蛋白E(ApoE−2、E−3及びE−4)、及びアポ
リポ蛋白Hがある。
ポ蛋白は、ApoA−I,A−II,A−IV,A−V,C−I,C−II,C−III,D,E
−2,E−3,及びE−4である。LDL−Pにおけるアポリポ蛋白は、VLDL−Pに
おけるアポリポ蛋白は、ApoB−100である。IDL−Pにおけるアポリポ蛋白は、
ApoB−100,C,E−2,E−3及びE−4である。VLDL−Pにおけるアポリ
ポ蛋白は、ApoA−V,B−100,C−I,C−II,C−III,C−IV,E−2、E
−3及びE−4である。カイロミクロンにおけるアポリポ蛋白は、ApoA−I,A−II
,A−IV,B−48,C−I,C−II,C−III,並びにE−2、E−3及びE−4であ
る。
蛋白Bに結合したアポリポ蛋白Aを有するLDL状粒子である。LP(a)−Pは、LDL
状粒子の表面におけるApoBを有する。LP(a)−Pがより高いレベルにあると、冠動
脈性心疾患のリスクが増大することにつながる。
蛋白粒子のレベルに関する情報を与える。種々の疾患の状態は、アポリポ蛋白及び/又は
リポ蛋白粒子のレベルに関連しており、疾患としては以下のものに限定しないが、心臓血
管疾患、アルツハイマー疾患、脂質異常症、無βリポタンパク血症、甲状腺機能低下、肝
臓疾患、糖尿病、及び腎障害がある。より高いレベルのアポリポ蛋白B及びLDL粒子は
、心臓血管疾患のリスクが増大することに関連していた。粒子におけるコレステロール量
の差が、心臓血管疾患のリスクに関与することも分かってきた。より多くのコレステロー
ルエステルを有する低比重のLDL−Pは、心臓血管疾患のリスクをより高くすることに
相関関係があることが分かっている。しかし、HDL−Pのレベルが向上すると、心臓血
管疾患のリスクが減少することに相関関係がある。
確に決定するには不十分であり、これはすなわち、リポ蛋白又はアポリポ蛋白の総量を決
定することは、どの成分に関連しているかを示すことができないからである。例えば、特
定リポ蛋白に結合したある特定アポリポ蛋白は、或る疾患を発症するリスクを示さず、異
なるリポ蛋白に結合したその特定アポリポ蛋白が、被検者にその疾患のリスクがあること
を示す場合があり得る。
関して、同一マトリクスに対して免疫学的検出及びリポ蛋白分離の組合せを同時に使用す
る測定は、種々の疾患状態のリスクのよりよい指標となる。被検者におけるリポ蛋白粒子
に関連する種々の疾患を発症するリスクを正確に予測する予測因子は、リサーチ、診断及
び治療目的にとって必要である。
あって、体液試料を収容するサブストレートと、リポ蛋白粒子又はリポ蛋白粒子の成分に
関連する免疫学的活性因子を検出するための抗体と、蛋白質又は脂質の存在を検出するよ
うサブストレートに塗布する試薬と、を備え、特定リポ蛋白粒子の存在を表す信号を発生
するようにした、該アセンブリである。本発明の一実施形態は、前記特定リポ蛋白粒子の
レベルを数量値化するのに使用する信号を検出する装置を備える。一実施形態においては
、サブストレートは、ゲル電気泳動分析に使用するゲルとする。一実施形態において、検
出される免疫学的活性因子は、アポリポ蛋白A、アポリポ蛋白B、アポリポ蛋白C、アポ
リポ蛋白D、アポリポ蛋白E、アポリポ蛋白H、リポ蛋白(a)、高比重リポ蛋白、中間比
重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、超低比重リポ蛋白、及びこれらの混合よりなるグループか
ら選択する。一実施形態において、アセンブリは、さらに、リポ蛋白粒子のレベルを数量
値化するプロセッサを備える。一実施形態において、アポリポ蛋白B及び低比重リポ蛋白
粒子のレベル上昇は、被検者の心臓血管疾患のリスクが増大したことを意味する。他の実
施形態においては、アポリポ蛋白B及びリポ蛋白(a)粒子のレベル上昇は、被検者の心臓
血管疾患のリスクが増大したことを意味する。他の実施形態においては、アポリポ蛋白B
及び低比重リポ蛋白粒子及びリポ蛋白(a)粒子のレベル上昇は、被検者の心臓血管疾患の
リスクが増大したことを意味する。
、サブストレート上の体液試料内に存在するリポ蛋白粒子を分離するステップと、リポ蛋
白粒子又はリポ蛋白粒子の成分に関連する免疫学的活性因子を検出するよう抗体に前記サ
ブストレートを曝すステップと、蛋白質又は脂質の存在を検出するための試薬に前記サブ
ストレートを曝すステップと、特定リポ蛋白粒子のレベルを決定するステップとを有する
該評価方法である。一実施形態において、分離は電気泳動法によって行い、またサブスト
レートはゲルとする。一実施形態において、さらに、特定リポ蛋白粒子のレベルを表すサ
ブストレート上の信号に関する光学的濃度を決定するステップを有する。他の実施形態に
おいて、さらに、特定リポ蛋白粒子のレベルを表すサブストレート上の信号を視覚的に検
出するステップを有する。一実施形態において、免疫学的活性因子は、アポリポ蛋白A、
アポリポ蛋白B、アポリポ蛋白C、アポリポ蛋白D、アポリポ蛋白E、アポリポ蛋白H、
リポ蛋(a)白、高比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、超低比重リポ蛋白
、及びこれらの混合よりなるグループから選択する。一実施形態において、前記成分はア
ポリポ蛋白Bとする。
って、体液試料に存在するリポ蛋白粒子を分離する分離装置と、リポ蛋白粒子又はリポ蛋
白粒子の成分に関連する免疫学的活性因子を検出する抗体と、リポ蛋白粒子の存在を検出
するようサブストレートに適用する試薬とを備える、評価システムである。一実施形態に
おいて、分離装置は電気泳動装置とする。一実施形態において、体液試料の電気泳動パタ
ーンを視覚的に検出する。一実施形態は、さらに、特定リポ蛋白粒子のレベルを評価する
ため、体液試料の電気泳動パターンの光学的濃度を決定する濃度計を備える。一実施形態
において、さらに、リポ蛋白粒子のレベルを数量値化するプロセッサを備える。一実施形
態において、免疫学的活性因子は、アポリポ蛋白A、アポリポ蛋白B、アポリポ蛋白C、
アポリポ蛋白D、アポリポ蛋白E、アポリポ蛋白H、リポ蛋白(a)、高比重リポ蛋白、中
間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、超低比重リポ蛋白、及びこれらの混合よりなるグルー
プから選択する。一実施形態において、前記成分はアポリポ蛋白Bとする。
、ゲル上の体液試料に存在するリポ蛋白粒子を分離する分離装置と、特定リポ蛋白粒子の
レベルを評価するため、体液試料の電気泳動パターンの光学的濃度を決定する濃度計と、
特定リポ蛋白粒子のレベルを評価するため、体液試料の電気泳動パターンにおける光学的
濃度レベルを相関付けるプロセッサとを備える、該評価装置である。一実施形態において
分離装置は電気泳動装置とする。
細書に記載した特定実施形態のかんする詳細な説明とともにこれら図面を参照することに
よってよりよく理解できるであろう。
ポ蛋白、リポ蛋白粒子、蛋白質及び脂質のレベルを、リポ蛋白粒子数の指標として総合的
に決定するアセンブリ、方法、システム及び装置に関する。これらレベルはリポ蛋白粒子
数に関連する種々の疾患が発症するリスクの指標として使用することができる。さらに、
数々の詳細を示すことにより、本明細書に記載した例示的な実施形態を完全に理解できる
であろう。しかし、当業者であれば、本明細書に記載した例示的な実施形態は、特定の詳
細説明なしに実施できることは理解できるであろう。他の例では、方法、手順及び成分は
、本明細書に記載した実施形態が判りにくくならないよう、詳細には説明しない。
適用するとき無意味又はほぼ無意味な構成にならない限り、いかなる将来的な構成をも含
むことを意味しまた意図するものである。用語の構成が無意味又はほぼ無意味になる場合
、定義はウェブスター辞書、第3版から引いてくるべきである。定義及び/又は解釈は、
本明細書に特別に記載しない限り、又は取り込みが有効性を維持するのに必要な場合でな
い限り、関連する、しないに係わらず、他の特許出願、特許又は特許公報から取り込むべ
きではない。
て言及する。
について言及する。
る蛋白質について言及する。アポリポ蛋白のユニークな性質は、リポ蛋白粒子に対する化
学量論的関係性であり、リポ蛋白粒子数を見積もることができる。
書中(Lp(a)−P)とも称されるリポ蛋白粒子はジスルフィド結合によってアポリポ蛋
白Bに結合したアポリポ蛋白(a)を有するLDL状粒子について言及する。
ry artery disease)及び冠動脈性心疾患(CHD:coronary heat disease)は、本明細
書中互換的に使用される。
システムをも本明細書に開示する。このアセンブリ、方法、装置及びシステムを使用して
、種々のリポ蛋白粒子及びアポリポ蛋白よりなるリポ蛋白粒子のレベルによって、どの被
験者が所定病状に対するリスクがより高いかを決定する。所定のリポ蛋白粒子の一部とし
てのコレステロール、リン脂質及びトリグリセリドの存在をも検出可能である。
探査すべき、同時発生的で修正可能な、チャージ/サイズに関するリポ蛋白粒子分離を可
能にすることも開示する。このアセンブリ、方法、装置及びシステムは、リポ蛋白粒子を
直接測定する改良した方法を提供する。ApoB、Lp(a)−P、及びLDL−P粒子の
レベルが上昇することは、心臓血管疾患のリスクが上昇することに相関することが知られ
ている。
出の組合せによれば、これまでは入手できなかった、心臓血管疾患を含む疾患に関する臨
床情報、リスク評価を提供することができる。
の総合的検出、及び免疫学的認識を、同一ゲルにおいて同時に利用可能であり、どのアポ
リポ蛋白の、又はトリグリセリド、リン脂質、及びコレステロールに限定しない他の成分
の、どの位の量が、どの位の量の所定リポ蛋白粒子に結合しているかを識別する能力を提
供する点である。複数のゲル、複数の器具及び/又は複数の方法を使用してこの情報を検
出する必要がないことは有益である。この情報を同時に検出することができることの理由
は、複数のゲル、複数の器具及び/又は複数の方法を使用するときに変動を生ずることで
ある。同時検出はこの変動源を排除する。
脂肪酸、コレステロール、モノアシルグリセロール及び胆汁酸は、腸内で吸収される。
胆汁酸は腸内胆汁として見られ、脂肪を乳化するミセルの形成によって脂肪を消化するの
に役立つ。胆汁酸は、食後腸内に分泌されるまで胆嚢内に蓄えられる。腸の上皮細胞はト
リアシルグリセロールを合成する。コレステロールの一部はエステル化されて、コレステ
ロールエステルを形成する。腸内細胞は、トリアシルグリセロール、コレステロールエス
テル、リン脂質、遊離コレステロール及びアポリポ蛋白からカイロミクロンを形成する。
アポリポ蛋白は、リポ蛋白粒子の蛋白質成分である。アポリポ蛋白は、コレステロール
エステル及びトリアシルグリセリドを含むリポ蛋白粒子を被覆する。リポ蛋白粒子の被覆
は、非エステル化コレステロール、リン脂質、アポリポ蛋白よりなる。アポリポ蛋白のユ
ニークな性質は、リポ蛋白粒子に対する化学量論的関係性であり、リポ蛋白粒子数を見積
もることができる。これらリポ蛋白粒子は、疎水性成分を血流に乗って循環させる道を与
える。異なるリポ蛋白粒子としては、カイロミクロン−P,VLDL−P,IDL−P,
LDL−P,HDL−Pがある。リポ蛋白粒子は、サイズ、比重、アポリポ蛋白成分、及
び脂質成分が変動する。各分類内には異質性があり、各分類は類似の物理的特性を共有す
る。条件を変化させることにより、分類内で異なる粒子を可視化することができる。この
ようにすることは臨床的メリットがあり、これはすなわち、例えば、ある1つの分類はア
テローム生成的であり、また他の1つの分類はアテローム防護的であり得るからである。
図1はリポ蛋白粒子代謝を示す図である。
むリポ蛋白粒子に見られる主要な蛋白質である。HDL−Pの一部としてのApoAは、
肝臓外の組織から遊離コレステロールを除去するのに関与し、またレシチン・アシル転移
酵素(アシルトランスフェラーゼ)を活性化させる役割も果たす。アポリポ蛋白Aは、コ
レステロール転移を組織からHDL−Pに向かわせる酵素を活性化し、またHDL−P認
識及び肝臓に結合する受容体にも関与する。
A−IIである。アポリポ蛋白A(A−I,A−II,A−IV)は、カイロミクロン及びHD
L−Pに見られる。ApoA−Iは、HDL−Pに付着する主要なアポリポ蛋白Aである
。ApoA−Iは、レシチン・コレステロール・アシル転移酵素を活性化させ、またAp
oA−IIはその活性化を調節する。レシチン・コレステロール・アシル転移酵素は、遊離
コレステロールをコレステロールエステルに転換させる。ApoA−IV分泌は、脂肪が腸
内に吸収されるとき増加する。ApoA−IV分泌は、さらに、レシチン・コレステロール
・アシル転移酵素を活性化させるよう機能する。
がより低いと、一般的に心臓血管疾患(CVD)及び抹消血管疾患の存在に相関する。A
poA−Iは、HDLコレステロール(HDL−C)よりもアテローム生成リスクに関す
るよりよい指標となり得る。若干の遺伝性障害者は、ApoA−I欠如を引き起し、HD
L粒子のレベルを低くする。これら障害者は、LDL粒子が増加する脂質異常症にかかる
傾向がある。このことは、アテローム性動脈硬化症になる速度を速める。ApoAのレベ
ルは、無αリポタンパク血症(家族性高比重リポ蛋白欠乏症としても知られている)。
アポリポ蛋白であるApoA−Iの役割は、広範囲にわたって研究されてきた。HDL−
PはApoA−I結合を競い合うが、ApoA−IはHDL−P結合を競い合うものでは
ない。この観察は、HDL−P及びApoA−Iは、独特な受容体によって少なくとも部
分的にマクロファージに結合していることを示唆する。例えば、前(pre-)β−HDL−P
及び無脂質(lipid-free)のApoA−Iはスカベンジャー受容体(SR−BI)に対し
ては劣ったリガンドであり、このことは、ApoA−IはHDL−P結合を競い合う性質
が欠如していることの証左である。逆に、ApoA−IはHDL−Pから解離し、したが
って、無脂質(lipid-free)のApoA−Iは、ApoA−I結合部位をHDLが競い合
うのに利用可能であることが分かった。(Lorenzi I, et al., BIJ Mol Med. 2008;171-1
83 参照。)HDLに対する他の競合相手であるApoA−IIは、動物モデルにおける前
駆的アテローム生成をする性質(pro-atherogenic)を有することが分かっている。(Mey
ers CD and Kashyap ML., Curr Opin Cardiol, 2004; 19(4):366-373 参照。)
である。ApoBの1つの分子は、各LDL−Pにおけるリン脂質内に存在する。LDL
粒子の90%以上はApoBよりなる。ApoBは、LDL−P複合体内でコレステロー
ルを可溶化するよう機能し、このことはLDL−Pの輸送能力を向上させ、後にLDL−
Pコレステロールを動脈壁に堆積させることになる。この堆積は心臓血管疾患につながる
。ApoBは、カイロミクロン、VLDL−P,IDL−P及びLp(a)−Pの蛋白質成
分でもある。ApoBは、大きな両親媒性の螺旋状をした糖タンパク質であり、2つのイ
ソ型、すなわちApoB−100(肝細胞内で合成される)、及びApoB−48(カイ
ロミクロンの構造的蛋白)を有する。カイロミクロンは、ApoB−48を含むとともに
、ApoBを含む他のリポ蛋白粒子はApoB−100を含む。
的一体性を維持し、また特定細胞の表面受容体に対するリガンドとして作用することによ
ってリポ蛋白粒子の摂取を容易にする。リポ蛋白粒子に作用する酵素としては、以下のも
のに限定しないが、リポ蛋白リパーゼ、レシチン・コレステロール・アシル転移酵素、肝
性トリグリセリドリパーゼ、及びコレステロールエステル輸送タンパク質がある。Apo
Bのレベル上昇は、高リポ蛋白血症に見られる。ApoB−100は、無βリポ蛋白血症
の病態では見られない。高レベルのApoB−100は、高リポ蛋白血症、重篤な狭心症
、及び心筋梗塞に存在する。
スク増大に関連する。ケースコントロール(症例対照)研究では、冠動脈性心疾患(CH
D)の患者を認識するのに、血漿ApoB濃度が、他の血漿脂質及びリポ蛋白粒子よりも
、一層識別力に優ることが分かった。(Eur Heart J. 2003; 24: 1601-10; Walldius G a
nd Jungner I. J Intern Med. 2004; 255/2: 188-205; Walldius G, et al., J Intern M
ed. 2006;259-66; Yusuf S, et al. Lancet. 2004; 364: 937-52 参照。)CHDリスク
を決定する上でのApoBの有用性は、将来に向けての研究で確かめられているが、リス
クを予測する上でどの程度ApoB濃度が血清脂質よりも優れているかは変動し得るもの
であった。ApoBは、すべてのアテローム生成粒子又は潜在的アテローム生成粒子の成
分であり、この成分としては、超低比重リポ蛋白粒子(VLDL−P)、中間比重リポ蛋
白粒子(IDL−P)、低比重リポ蛋白粒子(LDL−P)、及びリポ蛋白(a)粒子(L
p(a)−P)があり、各粒子は1個のApoB分子を含有する。CVDを発症する被検者
のリスクは、その被検者のリポ蛋白粒子の分布及びタイプに比例する。しかし、アテロー
ム生成をするApoB含有リポ蛋白粒子は、それぞれ異なるアテローム生成を行う。Ap
oBは、循環するアテローム生成をするリポ蛋白粒子の数の直接的評価をもたらすもので
あるが、最適な臨床上のメリットは、ApoB測定を使用して、存在するリポ蛋白粒子の
分布及びタイプを数量値化するときのみ得られる。総ApoBに対するCVDリスク測定
は、上述した種々の粒子における存在によって左右される。粒子を分離することなく総A
poBを測定することは、どの粒子が関連するかを示さない。
ール(LDL−C)よりも高い予測性を示すという明確なコンセンサスがあり、またアメ
リカ糖尿病協会(ADA)及びアメリカ心臓病学単科大学(ACC)からの最近の総意的
協議レポートでは、ApoBの測定が重要であると認識している。(Kannel WB, et al.,
Ann Intern Med 1979;90:85-91 and Jeyarajah, EJ, et al., Clin Lab Med 2006; 26:8
47-70参照。)実施形態においては、ApoB及びLDL−Pのレベル上昇は、被検者の
心臓血管疾患のリスクが高いことを意味するものとする。実施形態においては、ApoB
、LDL−P及びLp(a)−Pのレベル上昇は、被検者の心臓血管疾患のリスクが高いこ
とを意味するものとする。
L粒子、IDL粒子及びHDL粒子の成分である。ApoC−IIは、リポ蛋白リパーゼの
活性化因子であり、その欠損症は、カイロミクロン及びトリアシルグリセロールの蓄積を
招く。高いレベルのApoC−IIは、狭心症及び心筋梗塞の指標となる。アポリポ蛋白C
−II(ApoC−II)は、胃腸管から吸収された大きな粒子に見られる特別なタイプの蛋
白質である。さらに、それは、ほとんどコレステロールで構成される超低比重リポ蛋白粒
子(VLDL−P)にも見られる。ApoC−IIは、毛細血管内でリポ蛋白リパーゼ(L
PL)を活性化する役目を担うアポリポ蛋白であり、したがって、カイロミクロン粒子及
びVLDL−Pの異化作用を開始する。それは、またHDL−Pにも見られる。このAp
oC−IIの欠損症は、絶食中の深刻な高トリグリセリド血症及び高乳糜血症に存在する。
役立てることができる。家族性リポ蛋白リパーゼ欠損症の人はApoC−IIの量が多いこ
とがあり得る。ApoC−IIレベルが高いことに関連する他の疾患としては、狭心症及び
心臓麻痺がある。低レベルのApoC−IIは、家族性ApoC−II欠損症と称されるまれ
な症状を有する人に見られる。
は、リポ蛋白リパーゼ及び肝性リパーゼを抑制し、またトリグリセリド高含有粒子の肝取
り込みを抑制すると考えられる。
ムに密接に関連している。ApoA−I及びApoA−IV遺伝子は同一らせん構造(スト
ランド)から転写されるとともに、ApoA−I及びApoC−III遺伝子は収斂的に転
写される。ApoC−IIIレベルの上昇は、高トリグリセリド血症の発症を誘発する。
例えば肉眼的乳腺嚢胞症及びアルツハイマー病に関連する。
Pに見られる。ApoEは、肝細胞及び体皮細胞における受容体に結合する。ApoEは
、トリグリセリド高含有粒子の構成成分の標準的な異化作用に必須である。ApoEは、
リポ蛋白粒子代謝及び心臓血管疾患に重要であると当初は認識されていた。それは、脂質
を組織に輸送し、コレステロールを器官から肝臓に輸送し、VLDL−P及びカイロミク
ロンを除去することによりリポ蛋白粒子を代謝させ、またアテローム性動脈硬化症を形成
する。リポ蛋白粒子におけるApoEの部分は、ApoEリポ蛋白粒子をLDL−P受容
体に結合する仲立ちをする。HDL−Pに結合したApoEは、作用薬(アゴニスト)で
誘発された血小板凝集を血小板における部位に結合することによって抑制する。ApoE
遺伝子の異なる3種のアレル(対立遺伝子)、すなわちApoE e2, e3及びe4がある。
ApoEe4は、晩期発症型アルツハイマー病のリスクが増大することに関連する。
、梅毒、硬化症及び狼瘡(ループス)に見られ、また、幾つかの疾患において、抗体は、
活性化すべきApoHを必要とし、血小板によるセロトニン放出を抑制し、また血小板の
凝集を防止する。ApoHも、血小板によるセロトニン放出を抑制し、また血小板の凝集
を防止する。
リポ蛋白粒子の輪郭は、異なる被検者毎に異なり、また同一の被検者でも異なる時間毎
に異なる。カイロミクロンは、腸内で生成され、消化された脂肪を組織に輸送する。リポ
蛋白リパーゼは、トリアシルグリセロールを加水分解して脂肪酸を形成する。カイロミク
ロンは最も大きな浮遊性粒子の一つである。VLDL−Pは、肝臓内でのカイロミクロン
代謝の際に遊離脂肪酸から形成される。リポ蛋白リパーゼは、トリアシルグリセロールを
加水分解して脂肪酸を形成する。IDL−Pは、VLDL−Pの加水分解されていないト
リアシルグリセロールである。IDL−Pは、肝性リパーゼによりLDL−Pになる。H
DL−Pは、末梢組織からコレステロールを肝臓に輸送する役割を行う。HDL−Pは肝
臓及び腸内で合成される。
ら除去される。細胞はLDL−P内のコレステロールを使用して細胞膜形成及びホルモン
合成を行う。LDL−PはLDLコレステロールを動脈壁に堆積させ、このことが心臓血
管疾患に関与する。図1に示すように、LDL−Pは、動脈壁の内側に溜まると炎症を引
き起こす。マクロファージがこの炎症部位に付着し、マクロファージがLDL−Pを取り
込むとき、細胞を泡立て、さらに炎症させることになる。比重がより低いLDL−Pは、
より大きい浮遊性LDL−Pよりも、コレステロールエステルを含む。
ポリポ蛋白Bに結合したアポリポ蛋白Aを有するLDL状粒子の構造である。リポ蛋白(
a)粒子は凝固の役割を担うものであり、また動脈壁にコレステロールを堆積させるよう
免疫細胞を刺激する。アポリポ蛋白Bに対する抗体は、Lp(a)−Pが泳動している(mi
grate)領域における2つのバンドを認識する。1つのバンドは、先にHDL−Pととも
に泳動し、上述したように、リポ蛋白粒子分離及び免疫学的検出を同時に行う方法を使用
して検出した。泳動差は、Lp(a)−Pのイソ型における荷電/サイズの分化に関連し得
る。高いリポ蛋白(a)粒子レベルは心臓血管疾患のリスクがより高いことを示す。とくに
、2つのバンドのうちより緩慢に泳動し、またより陰極性が高いバンドが高レベルである
ことは、心臓血管疾患が高いリスクにあることを示す指標である。したがって、Lp(a)
−Pは診断に関する統計学的リスク評価に有用である。Lp(a)−Pは、LDL−Pプラ
ーク堆積を促進するよう作用する。Lp(a)−Pのレベルは、アテローム生成事象で増大
する。陽極性のLp(a)−Pは、以前は認識されていなかった。
カスケード反応におけるプラスミノーゲン機能を阻害する。多くの研究から、種々の心臓
血管障害、例えば末梢血管疾患、脳血管障害及び若年性冠動脈疾患に高いLp(a)−P濃
度が関係していることが立証されている。老齢のアメリカ人に対する1つの大きな研究は
、とくに、Lp(a)−Pのレベル上昇が、血管障害からの発作、死のリスク増大、また人
々におけるあらゆる病気原因からの死のリスク増大を予見することを立証した。(Fried
LP, et al. Ann Epidemiol 1991;3:263-76参照。)
に使用されてきた。しかし、HDL−Cの変動性に起因して、ApoBが循環するLDL
粒子(LDL−P)の数に関するよりよい測定対象であり、したがって、リスク指標に関
して慣行的LDL−Cよりも信頼性の高い指標である。なぜなら、ApoB及びLDL−
Pの化学量論が1:1であるからである。総ApoBの合計は、LDL−P(大きな浮遊
性粒子及び低比重粒子)+VLDL+IDL+Lp(a)+カイロミクロンにおけるApo
B捕集合を含むが、これに限定するものではない。リポ蛋白粒子の数量的指標としてのA
poBレベルの測定は、個別測定又は慣行的なLDL−C分析によるリスク情報を越えて
、アテローム硬化性心疾患のリスクに関する付加的な情報を提供する。空腹時血漿インス
リンレベル及びLDL粒子サイズの測定も、有用な情報を提供する。
本発明によるシステム、方法、装置及びアセンブリを使用して、体液、例えば血清、血
漿、滑液又は腹水における成分レベルの濃度を決定することができ、これら濃度は特定疾
患を発症するリスクの指標である。相関性を同定した後、診断検査を設計し、この設計は
、疾患発症のリスクを決定し、疾患を診断し、又は疾患処置をモニタリングする効率的で
コスト的に有効な方法を得るように行う。診断検査は、これに限定するものではないが、
酵素結合による免疫吸着法(ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay)を含む
方法又は従来既知である他の方法を使用することができる。
疾患のリスクが増大していることを意味する。実施形態において、ApoB及びLp(a)
−Pのレベル上昇は、被検者における心臓血管疾患のリスクが増大していることを意味す
る。本発明によるシステム、方法、装置及びアセンブリによれば、ApoB及びLDL−
Pによる、又はApoB及びLp(a)−Pによるアテローム形成を決定することができる
。本発明によるシステム、方法、装置及びアセンブリによれば、種々の画分、例えばLp
(a)−Pを分離する能力が得られる。
蛋白及びアジュバント(免疫賦活剤)をラビット又は類似のホスト動物に注入することに
よって生ずる。追加的免疫付与は定期的に行うことができる。血液を定期的に採取して抗
体タイター(力価)を決定する。抗体は、血液を凝固させ、上澄み血清を取り出すことに
よって血液から精製する。代案として、抗体は、商業的供給源から購入する、又は当業者
に既知の任意な他の方法によって製造することができる。
アポリポ蛋白の関連するレベルを決定する。電気泳動の処理中、電界をマトリクス(架橋
ポリマー)に加える。マトリクス又は媒体は、ポリアクリルアミド、アガロース、セルロ
ースアセテート、又は他の適当な導電性マトリクス状物質とすることができる。
態において、ゲル電気泳動は二次元的なものとすることができる。実施形態において、分
画電気泳動を行うことができる。一実施形態において、ゲル電気泳動はアガロース又はポ
リアクリルアミドを使用する。SDS−PAGE(ポリアクリルアミド)ゲルは、サイズ
に基づいて蛋白質を分離し、これはすなわち、SDSが負の荷電で蛋白質を被覆するから
である。アガロースゲルにおける蛋白質の分離は荷電により行う。一実施形態において、
従来既知の任意の適当なタイプである電気泳動法を使用することができる。
電気泳動法は、蛋白質をその荷電に基づいて分離する。電気泳動によりリポ蛋白粒子を分
離した後、マトリクスを着色し、脂質着色剤、例えばファット・レッド(Fat Red)7B
、スダンブラック(Sudan Black)B、クソール・ファースト・ブルー(Luxol fast blue
)、又は四酸化オスミウムを使用して脂質を検出することができる。コレステロールは酵
素反応試薬を使用して視覚化することができる。アミドブラック10Bを使用して血清蛋
白を着色することができる。他の実施形態において、特定のリポ蛋白粒子を、着色以外の
他の方法により検出することができる。若干の実施形態において、関心のあるリポ蛋白粒
子用の抗体又は他の物性を使用することができる。コレステロールは、コレステロール検
出に関して既知の技術における任意の試薬を使用して現像することができる。一実施形態
において、フォルマザン(formazan)を使用してコレステロールを検出する。
薄膜に転写し、所望の検出方法に曝すことができる。ゲル又は薄膜は、試薬を含む洗槽内
で定温放置することにより、又は試薬を含有するフィルムにゲル又は薄膜を曝すことによ
り、又は従来既知の他の方法に曝すことにより、着色剤又は抗体に曝すことができる。一
実施形態において、試薬を含有するフィルムは、透明であり、迅速に溶解し、支持でき、
またシステムに必要な感度を補完するものとすべきである。フィルム上における、探索す
べきゲルの特定レーンに対応する、異なる位置に、異なる試薬を設けることができる。一
実施形態において、薄膜は、リポ蛋白粒子に対する抗体で探索し、これに続いてラベル付
けした二次的抗体による検出を行う。二次的抗体は、放射能ラベル付け又は酵素的ラベル
付けしたものとすることができる。各バンドにおける光学的濃度を、デンシトメトリー法
で決定することができる。一実施形態において、プロセッサを使用して光学的濃度を相関
付けることができる。
者用の血清(又は血漿、滑液又は腹水のような他の体液)を探査して、複数の成分を同定
する及び/又は複数の被検者からの血清を検査することができる。一実施形態において、
異なるサイズのゲルを走査するプロトコル(手順)は、そのサイズのゲルにおける分離を
最適化するように行う変更を除いて、類似のものとする。
、1:1の化学量関連に起因するリポ蛋白粒子数を与える、或るアポリポ蛋白の量を検出
することができる。一実施形態において、抗原(リポ蛋白粒子内のアポリポ蛋白)をゲル
において分離する。アガロースゲル電気泳動において、リポ蛋白は、そのサイズ及び荷電
に基づいて泳動する。或る適切な状況下では、抗原及び抗体の結合により、その複合体を
ゲルから沈殿させる
すべき液体をその支持体に添加することができる。抗原が抗体に結合することにより、或
るリポ蛋白粒子に関連し、したがって、リポ蛋白粒子数を得ることができる或るアポリポ
蛋白の量を決定する。
定することは、或る疾患に関連する特定ターゲットを検出する診断的分析として使用する
。他の実施形態において、診断的分析は、多くのリポ蛋白粒子、アポリポ蛋白及び体液、
例えば血清、血漿、滑液及び腹水に存在する他の物質を検出する。若干の実施形態におい
ては、種々の形式の酵素結合による免疫吸着法(ELISA)を分析に使用することがで
きる。
Apo−Bに関して分離し、また着色した。図3は、複数の患者からの試料を含み、Ap
o−Bの存在用に探索したゲルを示す。レーンに付けたラベルは患者番号を示す。図4〜
図8は、図3における種々の患者試料に対するレーンに存在するバンドの濃度測定走査を
示す。画分値は、ピーク領域のパーセンテージを表す。図4は、患者1(ラベル1)のレ
ーンに対する濃度測定走査を示す。図5は、患者2(ラベル2)のレーンに対する濃度測
定走査を示す。図6は、患者10(ラベル10)のレーンに対する濃度測定走査を示す。
図7は、患者12(ラベル12)のレーンに対する濃度測定走査を示す。図8は、患者7
4(ラベル74)のレーンに対する濃度測定走査を示す。
て、不連続なNaCl/スクロース勾配を使用して超遠心分離法の分離を行う。一実施形
態において、体液、例えば血清、血漿、滑液及び腹水を、脂質に対するバンドを視覚化す
るファット・レッド7Bで、又は蛋白質を視覚化するアシッド・バイオレットで予め着色
することができる。画分は、管の底に対する穿刺によって分離することができる。一実施
形態において、個別のリポ蛋白粒子における画分は、或るアポリポ蛋白の量に対して探索
することができる。
ポ蛋白粒子は、カラムクロマトグラフィによって分離することができる。一実施形態にお
いて、カラムクロマトグラフィはHPLCにおいて行うことができる。HPLC画分を収
集し、また或るアポリポ蛋白の存在に関して探索する。一実施形態において、分離は、E
LISA又は沈殿によって行うことができる。代案として、従来既知である任意の適当な
タイプの分離プロトコルを使用することができる。
のレベルを数量値化する。バンドの光学的濃度は、バンドを露光させ、また透明ゲルを透
過する光量の減少を測定することにより決定する。他の方法を使用してバンドに存在する
リポ蛋白粒子及びアポリポ蛋白のレベルを数量値化することができる。プロセッサを濃度
計に接続し、各リポ蛋白粒子及びアポリポ蛋白に関するバンドの光学的濃度を決定及び分
析することができる。濃度計によって決定した値は、実際の値と陽性対照との比として得
る。バンドの数量値化にデンシトメトリー法を使用することは、従来周知である。(例え
ば、米国特許第4,572,671号、及び同第7,682,795号参照。)
クローナル抗体との結合の際の沈殿によって検出する。一実施形態において、リポ蛋白粒
子又はアポリポ蛋白の有無は、視覚的に検出することができる。他の実施形態において、
蛋白質着色剤を使用して、アポリポ蛋白と抗体との結合を検出する。一実施形態において
、ラベル付けした二次的抗体を使用してアポリポ蛋白と抗体との結合を検出する。
よって決定することができる。異なる分離又は検出方法は、比又は実際レベルを使用する
ことができる。例えば、比は、ゲル電気泳動を使用する場合のリスクを検出するのに好適
であり、また実際レベルは、ELISAを使用する場合に好ましい。しかし、任意の検出
方法において、いずれも使用することができる。
ターゲットを同定した後、種々の組合せを調査して、どの組合せが最良の指標かを決定す
る。例えば、リポ蛋白粒子レベルは、特定疾患リスクのよい指標であり得るが、付加的な
成分のレベルを分析することが被検者におけるその疾患発症リスクを予測する能力を向上
させる場合がある。大量収集した試料におけるターゲットとするリポ蛋白粒子及びアポリ
ポ蛋白のレベルを分析し、またこれら試料に関して入手可能な疾患データと比較し、どれ
が特定疾患リスクの最良指標かを決定する。実施形態において、診断的分析は、この情報
を使用して準備する。
LDLは動脈壁にLDLコレステロールを堆積させ、このことは心臓血管疾患に関与す
る。コレステロールが動脈壁の内側に溜まると炎症を引き起こす。この炎症に基づいてマ
クロファージが出現する。マクロファージは、LDLを取り込むとき泡沫細胞となり、さ
らなる炎症を引き起こす。炎症は心臓血管疾患のリスクを示す。
に存在するかを決定する。この分析によれば、被検者におけるリポ蛋白粒子及びアポリポ
蛋白によるアテローム形成の評価を可能にする。これら測定は、被検者が心臓血管疾患を
発症するリスク決定の分析を行うことができ、また治療をモニタリングする方法を与える
ことができる。高レベルのApoB及びLDL粒子は、心臓血管疾患リスクが増大したこ
とを示す。一実施形態において、この方法は、番号固有リポ蛋白粒子を評価する方法を与
える。この方法によれば、種々のアポリポ蛋白に関して免疫学的に探索すべき、荷電/サ
イズ的に修正可能なリポ蛋白粒子分離を同時に行うことができる。この方法は、リポ蛋白
粒子の直接測定を行う。さらに、この方法は、特定リポ蛋白粒子のどの位のレベルが所定
疾患に関するリスク増大を示すかを決定するメカニズムを与える。
合わせて特定リポ蛋白粒子レベルを決定する。ApoBが成分となっている各リポ蛋白粒
子タイプにおけるApoB含有量の化学量論的比率は1:1である。例えば、ゲル電気泳
動法による血清リポ蛋白粒子分離により、ApoBの画分を得る。その検出方法は、臨床
的情報を与え、この情報を利用して簡単で使い易くまた迅速な診断的分析を行うことがで
き、この分析によって特定疾患に関与するリポ蛋白粒子を検出することができる。従来既
知の他の方法を、適所に又はゲル電気泳動に付加して使用することができる。この分析は
、蛋白質着色剤又は脂質着色剤を有するリポ蛋白粒子及びアポリポ蛋白を抗体で検出する
。(図2参照。)従来既知の他の検出方法を使用することができる。ゲルの内容物をニト
ロセルロースのような薄膜に転写することができる。ゲル若しくは薄膜を薬剤含有洗槽内
で定温放置することにより、又はゲル若しくは薄膜を試薬含有フィルムに曝すことにより
、又は従来既知の方法に曝すことにより、着色剤又は抗体に曝すことができる。一実施形
態においてゲルは、アシッド・バイオレットで着色する。一実施形態において、ゲルをオ
イルレッドOで着色する。試薬を含有するフィルムは、透明であり、迅速に溶解し、支持
でき、またシステムに必要な感度を補完するものとすべきである。フィルム上における、
探索すべきゲルの特定レーンに対応する、異なる位置に、異なる試薬を設けることができ
る。他の実施形態において、液体試薬を使用した。各バンドにおける光学的濃度を、デン
シトメトリー法で決定することができる。一実施形態において、プロセッサ、例えばコン
ピュータ、又は手動計算、又は従来既知の他の任意な方法を使用して光学的濃度を相関付
けることができる。
認識する。1つのバンドは、先にHDL−Pとともに泳動しており、上述したように、リ
ポ蛋白粒子分離及び免疫学的検出を同時に行う方法を使用して検出した。より緩慢に泳動
しているバンドはアテローム形成的である。したがって、そのバンドが高レベルであるこ
とは、心臓血管疾患のリスクが高いことを示す。体液、例えば血清、血漿、滑液又は腹水
に存在するリポ蛋白粒子を分離し、またリポ蛋白粒子及びアポリポ蛋白を検出する試薬に
曝す。ApoB−100は、Lp(a)の一部として存在し、したがって、ApoB−10
0抗体で探索することによりLp(a)を検出する。適当な蛋白質着色剤の例としては、ア
シッド・バイオレットがあり、適当な脂質着色剤としてはオイルレッドOがある、従来既
知の任意な他の適当な着色剤を使用することができる。
ApoEは、晩期発症型アルツハイマー病のリスクに関連していた。ApoE遺伝子に
は3つの異なる対立遺伝子(allele)、すなわち、ApoE e2,e3,e4が存在する。対
立遺伝子は、1つ又は2つの基本対(base pair)に関して互いに異なる。ApoE e4は
晩期発症型アルツハイマー病のリスク増大に相関する。人はそれぞれApoE遺伝子の対
を有し、この対は、e2,e3,e4の組合せである。ApoE e3/e3は、最も一般的な遺伝子
型(ジェノタイプ)である。ApoE e4/e4及びe4/e3は、アテローム性動脈硬化症のリ
スクを示す。ApoE e4は、晩期発症型アルツハイマー病のリスク増大にも関連し、e4/
e4ではリスクが最も高い。本発明によるシステム、方法、装置、及びアセンブリの利点は
、どのApoEがどのリポ蛋白粒子とともに存在し、またどのくらいのレベルで存在する
かを検出する能力にある。ApoE e2,e3,e4に固有の抗血清(antisera)を使用して
どのタイプかを決定する。総ApoEを測定することだけでは十分ではなく、これはすな
わち総ApoE測定ではどのリポ蛋白粒子にApoEが存在するかの情報が得られないか
らである。
以下の実験例を挙げて本発明の好適な実施形態を示す。当業者には本明細書に記載した
特定実施形態に対して多くの変更を加えることができ、これら変更でも本発明の精神又は
範囲から逸脱することなく、同じ又は類似の結果が得られることを理解できるであろう。
以下の実験例は単なる例示であり、本発明はこれらに限定するものではない。
アポリポ蛋白に対するポリクローナル(多クローン性)抗体を、適当なホスト動物、例
えばラビットに関心のあるアポリポ蛋白及びアジュバントを注入することによって製造す
る。約0.02ミリリットル注入し、この注入を21日毎に行い、最終的にピークの抗体
タイター(力価)が得られるまで続ける。抗体タイターは耳採血によって検査する。Ap
oB−100又は他のアポリポ蛋白に対する抗体は同様にして製造することができる。代
案として、ApoB−100又は他のアポリポ蛋白に対する抗体は、市販のものから購入
することもできる。
ヘレナ・ラボラトリーズ社(Helena Laboratories Corporation)によるSPIFE電
気泳動システムを使用して種々の患者からの血清試料を分析した。使い捨て深底カップス
トリップを試料カップトレイにおける列2,3,4及び5内に配置した。ブレードを塗布
アセンブリにおける番号A,9,13,16が付いた垂直スロット内に配置した。50マ
イクロリットルの患者試料又は対照試料を適切な試料カップ内にピペット注入した。他の
実施形態では、異なる量の患者試料を使用した。一実施形態において、75マイクロリッ
トルの患者試料又は対照試料を適切な試料カップ内にピペット注入した。
トル、電気泳動チャンバの左側に分注した。REPは、Rapid ElectroPhoresisの略語で
ある。ゲルをREPの準備液上に配置し、くずが出ないティッシュでゲル端縁の周りを拭
き取り、過剰なREPにおける準備液を除去した。電極ポストに隣接する部分の拭き取り
には特別に注意を払った。ゲルから保護用のゲルオーバーレイを取り外した。ブロッタC
(Blotter C)を使用して、表面全体をそっと吸い取った。この後、ブロッタを外した。
た。ステンレス鋼電極を磁気ポスト外側における陽極ゲルブロック(右側)の外側棚部に
配置した。電極ブロッタを、カーボン電極がゲルブロック端部に接触するカーボン電極端
部の下側に配置した。電気泳動用の作動パラメータは以下の通りとし、すなわち、試料を
30秒以内で装填し、試料を60秒以内で塗布し、また16゜C及び400ボルトで20
分間電気泳動させた。
抗血清を生理食塩水で1:4に希釈した(血清を1パート、生理食塩水を3パート)。他
の実施形態において、異なる濃度の抗血清を使用した。抗血清テンプレートをゲル表面上
にそっと配置した。250マイクロリットルの希釈した抗血清をテンプレートにおける各
抗血清チャネルの右端における楕円形のスロットにピペット注入した。抗血清は20゜C
にして10分間で吸収される。
配置し、くしの先端がゲルに触れるようにする。抗血清テンプレート及びくし形ブロッタ
は3分後に取り出した。ゲル表面を、ブロッタCで吸い取り、このブロッタCを取り出し
て廃棄した。
ッタDを2個のブロッタCの頂面に配置した。抗血清テンプレートをその頂部に配置し、
2分間吸い取った。抗血清テンプレート及びブロッタを取り出し、廃棄した。2個のブロ
ッタCをゲル上に配置して濡らし、4個のブロッタDをブロッタC上に配置し、また血清
テンプレートをその頂部に配置し、さらに2分間吸い取った。
るのを確実にする。ゲルは、50゜Cにして8分間乾燥した。
きゲルがユニットの背面に対面するように取り付ける。ゲルホルダ及びゲルを着色ユニッ
ト内に配置する。ゲルをTBS内で10分間洗浄し、アシッド・バイオレット着色剤で4
分間着色し、クエン酸脱色剤で2回脱色し、各回の脱色は1分間行い、63゜Cにして8
分間乾燥した。つぎに、ゲルをクエン酸脱色剤で1分間脱色し、そして63゜Cで5分間
乾燥した。
心臓血管疾患リスクに関して検査すべき被検者から血清を採取する。リポ蛋白粒子は、
サイズ/荷電に基づいて泳動する。ゲルの一部はファット・レッド7Bで現像し、脂質を
検出する。コレステロールは、従来既知の任意なコレステロール試薬で検出する。一実施
形態において、コレステロール試薬はフォルマザンとする。ゲルの他の部分は、免疫固定
法を使用して、ApoB−100に対するポリクローナル抗体で現像する。抗体が、抗原
であるApoB−100に結合するとき、沈殿を生ずる。一実施形態において、抗体と抗
原の結合は、ラベル付けした抗体を使用して、またラベル付けした二次抗体を使用して検
出することができる。
行う。さらに、ApoB−100に対する抗体で認識されるバンドにもデンシトメトリー
法を行う。マトリクス又は媒体をアシッド・バイオレットで着色し、これに続いて抗体に
よる検出を行う。ApoB−100及びLDLが高レベルであることは、心臓血管疾患の
リスク増大に相関する。本発明方法によれば、リポ蛋白粒子コレステロールのレベル及び
リポ蛋白トリグリセリドのレベルを決定する方法に加えて、特定リポ蛋白粒子を決定する
方法も提供する。
ゲルの一部を蛋白質検出のためのアシッド・バイオレットで現像する、又は脂質を検出
するためのファット・レッド7Bで現像する。ゲルは、ApoB−100に対するポリク
ローナル抗体で現像する。一実施形態において、抗体と抗原との結合は、ラベル付けした
抗体を使用して、又はラベル付けした二次抗体を使用して検出することができる。アポリ
ポ蛋白Bに対する抗体は、Lp(a)が泳動している領域における2つのバンドを認識する
。この抗体は、Lp(a)の「対」だけでなく、アポリポ蛋白Bを含むすべてのリポ蛋白粒
子におけるApoBを認識する。1つのバンドは、予めHDLとともに泳動しており、こ
のバンドは、上述したように、リポ蛋白粒子分離及び免疫学的検出を同時に行う方法を使
用して検出する。所要に応じ、コレステロールを従来既知の任意なコレステロール試薬で
検出する。一実施形態において、コレステロール試薬は、検出用のフォルマザン染料を製
造する。
ール試薬及びApoB−100抗体を使用して検出した、種々のリポ蛋白粒子に関するバ
ンドに対して行い(デンシトメトリー法は、適当な可視化手順なしにはApoB抗体に対
して使用できず、この場合、適切な検出可能リガンド又は共役体のない抗体−抗原結合に
固有の視認可能であり光学的な活性色は存在しない)、リポ蛋白粒子レベルを決定する。
Lp(a)を含むリポ蛋白粒子のレベル上昇は、心臓血管疾患のリスク増大を示す。
晩期発症型アルツハイマー病リスクに関して検査すべき被検者から血清を採取する。ゲ
ル電気泳動法を血清に対して行う。リポ蛋白粒子は、そのサイズ/荷電に基づいて泳動す
る。ゲルをアシッド・バイオレット又はファット・レッド7Bで現像し、リポ蛋白粒子を
検出する。コレステロールは従来既知の任意なコレステロール試薬で検出することができ
る。一実施形態において、コレステロール試薬は、検出用のフォルマザン染料を製造する
。ゲルの他の部分は、対立遺伝子e2,e3,及びe4に対するポリクローナル抗体で現像する
。一実施形態において、抗体と抗原の結合は、ラベル付けした抗体を使用して、またラベ
ル付けした二次抗体を使用して検出することができる。
粒子に関するバンドに対して行う。さらに、対立遺伝子e2,e3,及びe4に対する抗体で認
識されるバンドにもデンシトメトリー法を行う。抗血清で探索した複合体を現像すること
は、適切な蛋白質/脂質用の着色剤及び/又は視認可能な活性共役体/リガンドを必要と
する。対立遺伝子e4の存在は心臓血管疾患のリスク増大に相関し、とくに2種類の対立遺
伝子e4を有している被験者の場合リスクが高い。
ゲル電気泳動法を、血清試料における大きい番号のレーン(例えば、80番)を使用し
て行う(図3参照)。血清試料はApoBに関して探索した。各レーンは、患者試料を表
す。患者1,2,3及び9に関するレーンにおけるバンドのデンシトメトリー法の出力ト
レーシングはそれぞれ図4〜7に示す。
体液、例えば血清における特定リポ蛋白粒子の存在及び/又はレベルを検出して特定疾
患のリスクを同定することを目的とする診断的分析を、一般的用語としては電気泳動支持
体又はプラットホーム、「薄膜」又は試薬含有フィルム、及び濃度計、又はこれらのうち
の一つ又は複数のものの等価物に対して利用する。薄膜は、電気泳動処理中の支持体とし
て2重の機能し、また試薬を含有する。「薄膜」又は「試薬含有フィルム」は、抗体を含
むことができる。アポリポ蛋白A、アポリポ蛋白B、アポリポ蛋白C、アポリポ蛋白D、
アポリポ蛋白E又はアポリポ蛋白Hに対する抗体は、薄膜における1つのレーンにおける
スボットとして存在する。高比重リポ蛋白粒子、中間比重リポ蛋白粒子、低比重リポ蛋白
粒子、超低比重リポ蛋白粒子、又はリポ蛋白(a)粒子に対する抗体は、薄膜における他の
レーンにおけるスポットとして存在する。薄膜は遮断して、薄膜に対する抗原の非特異的
結合を防止する。所定疾患、例えば心臓血管疾患に関して検査すべき血清試料で薄膜を培
養した後、分析を利用者に対して行う。血清における抗原は薄膜に存在する抗体に結合す
る。つぎに、抗原に固有の染料又は抗体で培養し、また検出可能ラベルを含ませる。バン
ドは、薄膜上で抗体が抗原に結合する箇所において視認可能となる。濃度計を使用して血
清内に存在する抗原量を決定する。
らかであろう。このような改変及び変更は発明の範囲から逸脱することなく、また得られ
る利点を減ずることなく行うことができる。用語「デンシトメトリー法」は、通常視覚的
に検出可能/測定可能な色変化に関連する。しかし、関心のある検体に関連した任意な電
磁的スペクトル放射を、補完的検出器とともに使用して、リポ蛋白粒子を「濃度測定化」
可能にすることができる。
実験を行うことなく実施及び実行することができる。本明細書に記載した構成及び方法は
、好適な実施形態として記載したが、当業者には、これら構成及び方法、並びに本明細書
に記載した方法におけるステップ又はステップシーケンスに対して、発明の概念、精神及
び範囲から逸脱することなく改変を加えることができること、明らかであろう。とくに、
化学的及び生理学的の双方で関連する幾つかの作用因子を本明細書に記載した作用因子に
置換することができ、しかも同一の又は類似の結果が得られる。このような類似する置換
及び変更のすべては、当業者にとって、特許請求の範囲に記載した本発明の概念、精神及
び範囲内にあると見なせること、明らかである。さらに、本明細書に述べた刊行文献、特
許及び出願のすべては、参照により本明細書にその全体が組み込まれるものとする。
Claims (6)
- 体液内に存在する特定リポ蛋白粒子のレベルを評価するアセンブリであって、
体液試料を収容する、たった一つのゲル電気泳動サブストレートと、
リポ蛋白粒子又はリポ蛋白粒子の成分に関連して免疫学的活性因子を検出する抗体と、
蛋白質の存在の検出用に前記サブストレートに適用する試薬と、及び
特定リポ蛋白粒子の存在レベルを示すラベル付けした抗体又は2次抗体と
を備え、
前記免疫学的に活性な因子を検出する抗体は、前記サブストレートに適用され、
体液試料の電気泳動は、たった一つのサブストレート上での体液試料分離後に、リポ蛋白/抗体複合体の沈殿を生じさせ、それにより前記複合体をゲル中に固定し、免疫学的に活性な因子を抗体検出するものである、アセンブリ。 - 請求項1記載のアセンブリにおいて、さらに、前記特定リポ蛋白粒子のレベルを数量化するのに使用する信号を検出するデバイスを備えた、アセンブリ。
- 請求項1記載のアセンブリにおいて、前記リポ蛋白粒子又はリポ蛋白粒子の成分と関連する前記免疫学的活性因子は、アポリポ蛋白A、アポリポ蛋白B、アポリポ蛋白C、アポリポ蛋白D、アポリポ蛋白E、アポリポ蛋白H、リポ蛋白(a)、高比重リポ蛋白、中間比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、超低比重リポ蛋白、及びそれらを混合したものからなるグループから選択する、アセンブリ。
- 請求項1記載のアセンブリにおいて、さらに、リポ蛋白粒子のレベルを数量化するプロセッサを備えた、アセンブリ。
- 請求項1記載のアセンブリにおいて、アポリポ蛋白B及び低比重リポ蛋白粒子のレベル上昇は、被検者の心臓血管疾患リスクが増大していることを意味するものとした、アセンブリ。
- 請求項1記載のアセンブリにおいて、アポリポ蛋白B及びリポ蛋白(a)粒子のレベル上昇は、被検者の心臓血管疾患リスクが増大していることを意味するものとした、アセンブリ。
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