JP6491097B2 - 質量分析法を使用する正確で干渉のない多重定量プロテオミクス - Google Patents
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Description
本願は、2012年10月22日に出願された「Accurate and Interference−Free Multiplexed Quantitative Proteomics Using Mass Spectrometry」と題された米国仮特許出願第61/716,806号の利益を主張し、この米国仮特許出願はその全体が本明細書中に参考として援用される。
本発明は、国立衛生研究所により授与されたGM026875、HG3456およびGM67945の下、政府支援により成された。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
質量分析法による分析を実施する方法であって、
複数の試料の混合物を作製するステップであって、該複数の試料のそれぞれは、複数の化学的タグから選択される少なくとも1つのタイプの化学的タグで標識された少なくとも1つのタイプの前駆体イオンを含み、該複数の試料のそれぞれは、該少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの複数の前駆体イオンを含む、ステップと、
該標識された前駆体イオンをフラグメント化してイオンの第1のサブセットおよびイオンの第2のサブセットを含む複数のイオンを形成するステップであって、
イオンの該第1のサブセットの各イオンは、該それぞれの化学的タグの少なくとも一部を含むが、該それぞれの分子は含まず、
イオンの該第2のサブセットの各イオンは、該それぞれの化学的タグの少なくとも一部および該それぞれの分子を含む、ステップと
イオンの該第2のサブセットの各タイプのイオンの存在量を測定するステップと、
イオンの該第2のサブセットの各タイプのイオンの該存在量を分析することによって、該複数の試料のそれぞれにおける少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの相対存在量を決定するステップと
を含む、方法。
(項目2)
前記複数の試料の前記混合物を作製するステップが、
複数の試料のそれぞれの少なくとも1つのタイプの分子をそれぞれの化学的タグで標識することであって、該複数の試料のそれぞれは、該少なくとも1つのタイプの分子の複数の分子を含む、ことと、
該複数の試料のそれぞれに由来する該標識された分子を一緒に混合することと、
該標識された分子をイオン化して、前記標識された前駆体イオンを形成することと、
該標識された前駆体イオンを質量分析計内に注入することと、
分析のために該標識された前駆体イオンを選択することと
を含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記少なくとも1つのタイプの分子が、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、脂質、RNA、DNA、および代謝産物からなる群から選択される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記複数の化学的タグのそれぞれが、名目上同じ質量を有する、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記少なくとも1つのタイプの前駆体イオンが、複数のタイプの前駆体イオンを含む、項目1に記載の方法。
(項目6)
分析のために前記標識された前駆体イオンを選択することが、連続的なウィンドウを使用する、項目5に記載の方法。
(項目7)
分析のために前記標識された前駆体イオンを選択することが、複数の別個のウィンドウを使用する、項目5に記載の方法。
(項目8)
前記標識された分子をイオン化することが、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、ナノエレクトロスプレーイオン化(nESI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)、大気化学イオン化(APCI)、大気光イオン化(APPI)、およびソニックスプレーイオン化(SSI)からなる群から選択される行為を含む、項目2に記載の方法。
(項目9)
前記標識された前駆体イオンを選択することが、四重極イオントラップ(QIT)、四重極マスフィルター(QMF)、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計(FT−ICR)、Orbitrap、および飛行時間分析器(TOF)からなる群から選択されるデバイスによって実施される、項目2に記載の方法。
(項目10)
前記標識された前駆体イオンをフラグメント化するステップが、高エネルギー衝突解離(HCD)、衝突誘起解離(CID)、パルス化−q解離(PQD)、赤外多光子解離(IRMPD)、紫外光子解離(UVPD)、表面誘起解離(SID)、インソース解離、電子移動解離(ETD)、および電子捕獲解離(ECD)からなる群から選択される行為を含む、項目1に記載の方法。
(項目11)
前記標識された前駆体イオンをフラグメント化するステップにより、少なくとも1つの電荷の喪失を伴って、または伴わないで少なくとも1つのそれぞれのタグが破断する、項目1に記載の方法。
(項目12)
前記標識された前駆体イオンが、選択された後であるが、フラグメント化される前に操作される、項目2に記載の方法。
(項目13)
前記標識された前駆体イオンを操作することが、プロトン移動反応を含む、項目11に記載の方法。
(項目14)
少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの前記相対存在量を決定するステップが、同定のために実施されるいずれの分析とも独立して行われる、項目1に記載の方法。
(項目15)
前記複数の試料のそれぞれにおける少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの相対存在量を決定するステップが、イオンの前記第1および第2のサブセットにおける同位体変動を補正することを含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
イオンの前記第2のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記化学的タグの同位体不純物を補正することを含む、項目1に記載の方法。
(項目17)
イオンの前記第2のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記同位体変動の場所を考慮することを含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
イオンの前記第2のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの同位体組成に関する情報、および前記複数の化学的タグのそれぞれの同位体組成に関する情報を使用することを含み、該情報が、理論的に導出され、または質量分析計で測定される、項目15に記載の方法。
(項目19)
前記化学的タグの同位体不純物を補正することが、
イオンの前記第2のサブセットの各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することと、
イオンの該第2のサブセットの測定された相対存在量をイオンの該第2のサブセットの該理論相対存在量と比較することと
を含む、項目16に記載の方法。
(項目20)
イオンの前記第2のサブセットの各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することが、前記複数の試料の第1の試料の同位体エンベロープを、前記それぞれの化学的タグに関連した不純物行列でコンボリューションすることを含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記複数の試料のそれぞれの少なくとも1つのタイプの分子を標識することが、該複数の試料のそれぞれの複数のタイプの分子を標識することを含む、項目2に記載の方法。
(項目22)
イオンが前記質量分析計内に注入される継続時間が、前記前駆体イオンの少なくとも1つの特性に基づいて決定される、項目2に記載の方法。
(項目23)
前記少なくとも1つの特性が、前記前駆体イオンの荷電状態、該前駆体イオンの質量対電荷比、該前駆体イオンの強度、または該前駆体イオンの分子のタイプからなる群から選択される、項目22に記載の方法。
(項目24)
イオンが前記質量分析計内に注入される継続時間が、以前の質量分析法による分析の結果に基づいて決定される、項目2に記載の方法。
(項目25)
実行されると一方法を実施する命令でコード化された少なくとも1つのコンピューター可読媒体であって、該方法は、
複数の化学的タグから選択されるそれぞれの化学的タグで複数の試料のそれぞれの少なくとも1つのタイプの分子を標識するステップであって、該複数の試料のそれぞれは、複数の分子を含む、ステップと
該標識された分子のそれぞれをフラグメント化して少なくとも第1の部分および第2の部分を作製するステップであって、該第1の部分は、該第2の部分より低い質量を有する、ステップと、
各第2の部分の相対存在量を測定するステップと、
該標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することによって該複数の試料のそれぞれにおける該少なくとも1つのタイプの標識された分子の相対存在量を決定するステップと
を含む、少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
(項目26)
前記標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することが、前記少なくとも1つのタイプの分子の同位体エンベロープを補正することを含む、項目25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
(項目27)
前記標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することが、前記複数の化学的タグのそれぞれの同位体不純物を補正することを含む、項目26に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
(項目28)
前記化学的タグの同位体不純物を補正することが、
前記第2の部分の各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することと、
該第2の部分の前記測定された相対存在量を該第2の部分の該理論相対存在量と比較することと、
を含む、項目27に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
(項目29)
前記第2の部分の各タイプの理論相対存在量を生成することが、前記複数の試料の第1の試料の同位体エンベロープを、前記それぞれの化学的タグに関連した不純物行列でコンボリューションすることを含む、項目28に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
(項目30)
前記複数の試料のそれぞれの前記少なくとも1つのタイプの分子を標識することが、該複数の試料のそれぞれの複数のタイプの分子を標識することを含む、項目25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
(項目31)
前記第2の部分が少なくとも前記少なくとも1つのタイプの分子を含む、項目25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
(項目32)
前記少なくとも1つのタイプの分子が、タンパク質またはペプチドを含む、項目25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
(項目33)
前記複数の化学的タグのそれぞれが、名目上同じ質量を有する、項目25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
(項目34)
前記標識された分子をフラグメント化するステップが、高エネルギー衝突解離(HCD)、衝突誘起解離(CID)、パルス化−q解離(PQD)、赤外多光子解離(IRMPD)、紫外光子解離(UVPD)、表面誘起解離(SID)、インソース解離、電子移動解離(ETD)、および電子捕獲解離(ECD)からなる群から選択される行為を含む、項目25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
本発明の少なくとも1つの実施形態のいくつかの態様をこうして記載して、以下は、一部の実施形態で記載した技法の具体例である。
質量分析法(MS)ベースプロテオミクスは、過去数年にわたって注目すべき改善が行われ、単一実験で哺乳動物試料からの10,000超のタンパク質の同定を今日ではもたらしている。タンパク質同定は、現在では成熟しているが、複数の条件の中での正確な定量化は、いまだ課題である。予測不可能なイオン化効率により、ハイスループット実験におけるタンパク質存在量の絶対定量化が現在妨げられている。この制限を回避するために、異なる条件に由来するペプチドを、これらの化学構造は同一であるが、これらの同位体組成が異なるように同位体標識することができる方法が開発された。MSによって分析されるとき、タンパク質存在量の相対的変化は、調査される異なる条件にとってユニークであるイオンの相対存在量から推測することができる。
相補体TMTイオンクラスター
6種の異なるTMTチャネルのいずれか1つで標識されたペプチドは、MS1スペクトルで区別不能であるが、これらの低m/zレポーターイオン(レポーターイオン)に基づいてフラグメント化すると定量化することができる。TMT標識ペプチドからのMS2スペクトルをより詳しく検査すると、本発明者らは、本発明者らがTMTタグ内の一結合においてもっぱらフラグメント化されたペプチドイオンに割り当てた別のイオンクラスターを観察した(図4、5B)。これらのイオンは、TMT標識のカルボニル炭素と二級アミンとの間の結合の切断によって生成される(図2A)。脱離基は一般に一電荷を取得し、したがってTMTCプロダクトイオンは、前駆体より1つ少ない電荷を有する。本発明者らは、これらのフラグメントイオンを相補体TMT(TMTC)イオンと呼んだ。
TMTCクラスターを使用する定量化の正確さを評価するために、特に、干渉に対するその感度を試験するために、本発明者らは、本発明者らが共溶出ペプチドの干渉を同定および定量化することができる既知の混合比の試料を作製した。本発明者らは、それぞれチャネル126、127、128、130、および131内で、TMTで標識された1μg:4μg:10μg:4μg:1μgのLys−C消化酵母ペプチドを組み合わせた。干渉をシミュレートするために、本発明者らは、それぞれTMT−126およびTMT−127で標識された10μg:10μgのヒトLys−C消化ペプチドの混合物を添加した(図5A)。TMTC−129イオンおよびTMTC−130イオンは区別不能であるので、本発明者らはTMT−129チャネルを省略した(図2A)。本発明者らが従来のTMTレポーターイオンを使用して干渉試料を分析したとき、本発明者らは、酵母だけに限定されているペプチドは、無干渉チャネル(128、130、および131)内で正確に定量化されたが、ヒト干渉を有するチャネル(126および127)内の相対存在量は、ヒト起源の夾雑レポーターイオンに起因して重くゆがめられることを見出した(図5D)。混合比が未知である現実の生体試料では、本発明者らは、レポーターイオンのどの画分が対象のペプチドに由来し、どの画分が干渉共溶出ペプチドに由来するかを区別することができないはずである。
完全な実験にわたるTMTC定量化(試料が図5A〜Eのものである)を図14に示す。方法を評価するために、相対的な酵母ペプチドTMTチャネル強度を、TMTCイオンクラスターをデコンボリューションすることによって計算し、干渉を伴った、および伴わない1:10および4:10のチャネルについての絶対偏差の中央値を、本発明者らがTMTCクラスター内で観察することができたイオンの数に対してプロットした(図13A)。測定をヒトペプチドによる干渉の非存在下およびこの干渉の影響下で行った。さらなる分析のために、本発明者らは、自信のある定量化のカットオフポイントである、TMTCクラスターにおける1000イオン未満のペプチドを除外した。品質の追加の尺度として、本発明者らは、観察されたTMTCクラスターがいかに良く理論分布にフィットするかを評価した(図13B)。予測されたTMTCイオンクラスターと観察されたTMTCイオンクラスターとの間の二乗差の合計(Diff)を第2のフィルター基準として使用した。測定されたTMTチャネル比と予測されたTMTチャネル比との間で0.02未満のコサイン距離を有するペプチドを、十分に定量化されたペプチドとして定義した。グラフは、十分に定量化されたペプチドおよび他のペプチドを、TMTCクラスターにおけるイオンのこれらの合計および観察されたTMTCクラスターと計算されたTMTCクラスターとの間の二乗差の合計について示す。図13Cは、フィルター基準(filer criteria)(Diff=0.0017)を満たさなかったペプチドの予測および観察されたTMTCクラスターを表し、図13Dは、フィルター基準(Diff=0.002)を確かに満たしたペプチドの予測および観察されたTMTCクラスターを表す。図14Aは、20に正規化された比を有するフィルタリングされた酵母ペプチドのボックスプロットを示す。ウィスカーは、5〜95パーセンタイルに到達する。図14Bは、図14Aに示した比についての対応する頻度分布を表す。干渉は、系統的な誤差を引き起こさないが、干渉イオンを伴ったチャネルの比の分布は、干渉を伴わないチャネルのものより広い。また、図14Aで分かるように、126チャネルおよび127チャネルは、130チャネルおよび131チャネルより広い比の分布を示すが、干渉を伴った、および伴わない等価なチャネルの中央値は、注目すべきことに同様であり、既知の混合比に非常に近い。異常値は、干渉を伴った、および伴わないチャネルの中で事実上同様に分布しているようである。本発明者らは、以下の干渉を伴ったチャネルのより広い分布に対処する。総合すると、ボックスプロットおよびヒストグラムは、TMTCイオンクラスターをデコンボリューションすると、異なる混合比を有する共溶出ヒトペプチドにもかかわらず、MS2スペクトル内の同重体標識ペプチドが忠実に定量化されることを実証する。
本発明者らは、実際の実験とモンテカルロシミュレーションとの間の明らかな照応を利用し(図14A、B、図14E、F)、TMTC定量化の精度がTMTチャネル間のより大きい質量分離によって改善されうるかを試験した。この目的を達成するために、本発明者らは、アミノ酸配列および図14A、Bに記載の実験で観察されたイオンの数に基づいて10:10:10:10:10の比をシミュレートした。次いで本発明者らは、実際の実験のために本発明者らが使用した同じ方法によって、シミュレートされたTMTCクラスターを分析した。図10Aは、得られた比のボックスプロットを示す。中間チャネル(127〜130)の精度は、縁部のチャネルの精度より著しく悪い。本発明者らが128チャネルを取り除いたとき、すべてのチャネルの精度は増大する(図10B)。対照的に、131チャネルのみを取り除いたとき、精度の利得はより小さかった(図10C)。これは、精度の改善が1チャネル当たりのイオンのより大きい数ではなく、TMTCクラスターにおけるイオンのより広い間隔に主に起因することを示唆する。精度のより大きい利得は、各チャネルが少なくとも2ダルトン離れている場合実現されうる(図10D〜H)。本発明者らは、複数のTMTレポーターイオンの除去に由来するイオンクラスターは、5重試料に対してこの所望の性質を有するはずであることに言及したい(データを示さず)。
図15Aは、異なるMS2分解能設定:18k、35k、および70kを使用する相補イオンベース定量化を比較するものである。最大イオン注入時間は、異なる分解能設定:それぞれ60ms、120ms、および240msでのOrbitrapスキャン時間に従って設定した。垂直線は、1:10(破線)および4:10(実線)の既知の混合比を示す。図15Aは、18kという低分解能設定でさえ、干渉に起因する系統的な誤差は軽微であることを例示する。しかし、18kの分解能に関連してイオン注入時間がより短いことにより、そしてその結果として、蓄積されるイオンの数が低いことにより、図13A〜Fに関して記載したデータフィルタリング基準を満たさなかったTMTCクラスターイオンが増大した。35kの分解能において、ほとんどのペプチドはフィルタリング基準に合格し、より狭い比の分布は、これらの設定により、取得される定量的データの精度が増大することを示す。
MS3またはPTRのような代替の定量化法に対する相補体レポーターイオン手法の一利点は、定量的なシグナルが前駆体特性に依存することである。本質的に、これは、干渉を除去するだけでなく、共単離ペプチドの並列の定量化を可能にすることができる。図9では、単一MS2スペクトルで複数のペプチドを並列定量化するための原理の証明が示されている。2種のペプチドを、±3m/zの単離幅でヒト−酵母干渉試料の分析中のフラグメンテーションのために単離した(図9A)。デコイを含むヒト−酵母ペプチドデータベースに対してSequestで2つの前駆体を検索すると、+2前駆体について酵母ペプチドYTTLGK、および+3前駆体についてヒトペプチドLDEREAGITEKが同定された。レポーターイオンは、酵母起源およびヒト起源の両方から生じた(図9B)。対照的に、TMTCクラスターは、各ペプチドにユニークであり、これらの前駆体特異的フラグメントイオンから、2種のペプチドが独立して定量化された。ヒトペプチドは、10.5:9.3:0.1:0.0:0.0で定量化され、酵母ペプチドは、1.5:4.6:9.6:2.1:1.1で定量化された(20に正規化された比)。本発明者らは、酵母ペプチドの定量化が、単離ウィンドウの縁部に近いペプチド前駆体の局在化を被ったと考える(ヒトペプチドの疑似モノアイソトピックピークがMS2スペクトルについて計測器によって選択される標的であった)。したがって、酵母同位体エンベロープのより低いm/z側のピークは、あまり効率的に単離されず、TMT−126チャネルおよびTMT−127チャネルの過大評価をもたらした。この警告があっても、両ペプチドの定量化は、既知の異なる混合比に合理的に近く、相補体レポーターイオン定量化が、複数の前駆体がSWATH MSのように意図的に単離およびフラグメント化される方法にユニークに適用可能であることを実証した。多重プロテオミクス実験におけるデータ取得速度は、定量化のためにMSnスペクトル内に十分な(相補体)レポーターイオンを蓄積するのに必要とされるイオン注入時間によって主に制限される。これらのイオン注入時間と比較して、同定のためのMS2スペクトルの全取得時間は短く、同定および定量化のためのMS2スペクトルは、分離されうる。相補体レポーターイオン手法は、相補体レポーターイオンを蓄積するためのイオン注入を並列化することを可能にし、それによって所与の時間枠内で定量化されうるペプチドの数を増やす機会を広げる。
試料調製およびデータ取得:
別段の注記のない限り、干渉試料は、以前に記載された通り調製した。HeLa S3細胞を、懸濁液中で増殖させて1×106細胞/mLにした。酵母細胞は、1.0のODまで増殖させた。細胞を6Mチオシアン酸グアニジウム、50mM Hepes pH8.5(HCl)中に溶解した。タンパク質含量は、BCAアッセイ(Thermo Scientific)を使用して測定し、ジスルフィド結合をジチオトレイトール(DTT)で還元し、システイン残基を、以前に記載された通りヨードアセトアミドでアルキル化した。タンパク質溶解産物をメタノール−クロロホルム沈殿によって浄化した。試料を6M チオシアン酸グアニジウム、50mM Hepes pH8.5中に取り込み、希釈して1.5Mチオシアン酸グアニジウム、50mM Hepes、pH8.5にした。両溶解産物を、1:50の酵素:タンパク質比の消化(digest)で、Lys−C(Wako)を用いて一晩消化させた。消化後、試料を三フッ素酸(tri−fluoric−acid)でpH<2まで酸性化し、C18固相抽出(SPE:solid−phase extraction)(Sep−Pak、Waters)に供した。アミノ反応性TMT試薬(126〜131、Thermo Scientific、ロット番号MJ164415、0.8mg)をアセトニトリル40μl中に溶解させ、溶液10μlを50mM HEPES(pH8.5)100μl中に溶解したペプチド100μgに添加した。室温(22℃)で1時間後、5%ヒドロキシルアミン8μlを添加することによって反応をクエンチした。標識した後、試料を所望の比(例えば、1:4:10:4:1)で組み合わせた。標識酵母試料の画分を標識ヒト試料から別個に保持し、その試料を無干渉分析のために用意した。試料をC18固相抽出(SPE)(Sep−Pak、Waters)に供した。
ひと揃いの組織内開発ソフトウェアツールを使用してRAWファイルからmzXMLフォーマットに質量分析データを変換し、かつペプチドイオン荷電状態およびモノアイソトピックm/zの誤った割り当てを補正した。本発明者らは、ReAdW.exeを改良してmzXMLファイルフォーマットへの変換中の各ピークのシグナル対ノイズ比(S/N)を含めた(http://sashimi.svn.sourceforge.net/viewvc/sashimi/)。MS2スペクトルの割り当ては、ヒト国際タンパク質指標データベース(バージョン3.6)からのすべてのエントリーを含むタンパク質配列データベース、その後すべての公知のS.cerevisiae ORFによってコードされるタンパク質の配列、およびヒトケラチンなどの公知の夾雑物に対してデータを検索することによってSequestアルゴリズムを使用して実施した。この順方向(標的)データベースコンポーネントの後に、逆の順序ですべての列挙されたタンパク質配列を含むデコイコンポーネントが続いた。ヒトデータベースからのタンパク質配列は、酵母からのものの前に列挙され、その結果、両データベース内に含まれるペプチドは、ヒトタンパク質に常に割り当てられ、干渉効果の測定を邪魔しなかった。検索は、20ppmの前駆体イオントレランスを使用して実施し、この場合、両ペプチド末端は、Lys−C特異性と一致することが必要とされた一方、最大2つの逸した切断を許した。リシン残基およびペプチドN末端上のTMTタグ(+229.162932Da)、ならびにシステイン残基のカルバミドメチル化(+57.02146Da)を静的修飾として設定し、メチオニン残基の酸化(+15.99492Da)を可変修飾として設定した。1%未満のMS2スペクトル割り当て偽発見率が、標的−デコイデータベースサーチストラテジーを適用することによって達成された。フィルタリングは、以下のペプチドイオンおよびMS2スペクトルの性質:SequestパラメータXCorrおよびΔCn、絶対ペプチドイオン質量正確さ、ならびに荷電状態から1つの組み合わされたフィルターパラメータを作製するのに線形判別分析法を使用して実施した。前駆体の理論的m/zの3標準偏差内の順方向ペプチドを正のトレーニングセットとして使用した。すべての逆ペプチドを負のトレーニングセットとして使用した。線形判別スコアを使用して、少なくとも6残基を有するペプチドを分類し、デコイデータベースに基づいて1%の偽発見率のカットオフでフィルタリングした。
TMT−試薬のTMT同位体不純物を測定するために、本発明者らは、各アミノ反応性TMTを炭酸アンモニウムと別個に組み合わせ、MS1内の得られたTMT−NH2から同位体エンベロープを測定した(本発明者らは、エンベロープ全体が1に正規化されるとき+1のピークについて約0.4%であるNH2同位体エンベロープを無視した)。本発明者らは、エンベロープ全体が1に正規化されるとき1%超の存在量で約246、247、および248m/zにおける3つのピークで構成された同位体エンベロープを観察した。これらの同位体エンベロープから、本発明者らは、各ピークを個々に選択し、HCDでそれをフラグメント化し、得られたレポーターイオンを測定した(約126Da〜約132Da)。これらのスペクトルから、本発明者らは、図3A〜Bで、グラフで表されている6つのTMT−不純物行列
これは、
Orbitrapで取得されるスペクトルについて、本発明者らは、ピークにおけるイオンの数は、電荷に対するシグナル対ノイズに比例すると仮定する。本発明者らは、ノイズ帯域は、過渡現象(transient)が30msの長さであり、D20 Orbitrapで収集されるとき5電荷におよそ等しいという仮定を使用して、所与のフラグメントイオンピークにおける分子の数を見積もる。この数は、Orbitrapにおける電荷の、Orbitrap Eliteにおけるイオントラップとの比較に基づいて見積もった。これは、以前の公開された結果と十分相関する。EliteのD20 Orbitrapは、QExactiveのD30 Orbitrapと比較したとき、同じイオンの所与の数についての同じシグナル対ノイズを半分の時間で取得する。異なる分解能(より長い取得時間)について、ノイズは、取得時間の平方根とともに減少する一方、シグナルはおよそ一定に留まる。結果として、本発明者らは、QExactiveでのMS2スペクトルのノイズ帯域は、以下のような電荷(e)に等価であると仮定する:18kの名目上の分解能で5e、35kで3.5e、および70kで2.5e。同様に、Orbitrap Eliteについてのノイズ帯域は、21kで5e、および42kで3.5eであると見積もられる(すべての名目上の分解能は、200m/zに対して表現されている)。
ここで本発明者らは、相補体レポーターイオンクラスター(TMTC)がMS2レベルで同重体標識ペプチドの正確な定量化に使用されうることを示す。本明細書に示した例を生成するのに使用されたインプリメンテーションでは、ペプチドのおよそ半分が好結果の定量化を可能にするのに十分なTMTCイオンを形成しなかった。それでもやはり、本方法は、現存する方法に対して依然として競争力があり、取得データは、干渉ペプチドイオンによってほとんど完全に無影響であることが判明した。本発明者らは、相補体レポーターイオン生成効率を改善し、より大きい数のペプチドをより高い精度で定量化するのを可能にするルートを示す。最後に、本発明者らは、相補体レポーターイオン手法が単一MS2スペクトルにおいて複数の別個のペプチドを定量化するのに使用されうることを実証した。これは、多重プロテオミクスでの取得速度を実質的に増大させる潜在性を有する。
本発明の少なくとも1つの実施形態のいくつかの態様をこうして記載してきたが、様々な変更、改変、および改善は、当業者が容易に思いつくことが十分に理解されるべきである。
Claims (34)
- 質量分析法による分析を実施する方法であって、
複数の試料の混合物を作製するステップであって、該複数の試料のそれぞれは、複数の化学的タグから選択される少なくとも1つのタイプの化学的タグで標識された少なくとも1つのタイプの前駆体イオンを含み、該複数の試料のそれぞれは、該少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの複数の前駆体イオンを含む、ステップと、
該標識された前駆体イオンをフラグメント化してイオンの第1のサブセットおよびイオンの第2のサブセットを含む複数のイオンを形成するステップであって、
イオンの該第1のサブセットの各イオンは、該それぞれの化学的タグの少なくとも一部を含むが、該それぞれの分子は含まず、
イオンの該第2のサブセットの各イオンは、該それぞれの化学的タグの少なくとも一部および該それぞれの分子を含む、ステップと
イオンの該第2のサブセットの各タイプのイオンの存在量を測定するステップと、
イオンの該第2のサブセットの各タイプのイオンの該存在量を分析することによって、該複数の試料のそれぞれにおける少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの相対存在量を決定するステップと
を含む、方法。 - 前記複数の試料の前記混合物を作製するステップが、
複数の試料のそれぞれの少なくとも1つのタイプの分子をそれぞれの化学的タグで標識することであって、該複数の試料のそれぞれは、該少なくとも1つのタイプの分子の複数の分子を含む、ことと、
該複数の試料のそれぞれに由来する該標識された分子を一緒に混合することと、
該標識された分子をイオン化して、前記標識された前駆体イオンを形成することと、
該標識された前駆体イオンを質量分析計内に注入することと、
分析のために該標識された前駆体イオンを選択することと
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記少なくとも1つのタイプの分子が、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、脂質、RNA、DNA、および代謝産物からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記複数の化学的タグのそれぞれが、名目上同じ質量を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのタイプの前駆体イオンが、複数のタイプの前駆体イオンを含む、請求項1に記載の方法。
- 分析のために前記標識された前駆体イオンを選択することが、連続的なウィンドウを使用する、請求項5に記載の方法。
- 分析のために前記標識された前駆体イオンを選択することが、複数の別個のウィンドウを使用する、請求項5に記載の方法。
- 前記標識された分子をイオン化することが、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、ナノエレクトロスプレーイオン化(nESI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)、大気化学イオン化(APCI)、大気光イオン化(APPI)、およびソニックスプレーイオン化(SSI)からなる群から選択される行為を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記標識された前駆体イオンを選択することが、四重極イオントラップ(QIT)、四重極マスフィルター(QMF)、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計(FT−ICR)、Orbitrap、および飛行時間分析器(TOF)からなる群から選択されるデバイスによって実施される、請求項2に記載の方法。
- 前記標識された前駆体イオンをフラグメント化するステップが、高エネルギー衝突解離(HCD)、衝突誘起解離(CID)、パルス化−q解離(PQD)、赤外多光子解離(IRMPD)、紫外光子解離(UVPD)、表面誘起解離(SID)、インソース解離、電子移動解離(ETD)、および電子捕獲解離(ECD)からなる群から選択される行為を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標識された前駆体イオンをフラグメント化するステップにより、少なくとも1つの電荷の喪失を伴って、または伴わないで少なくとも1つのそれぞれのタグが破断する、請求項1に記載の方法。
- 前記標識された前駆体イオンに対する追加の操作を実施するステップを、前記前駆体イオンが選択された後であるが、前記前駆体イオンがフラグメント化される前に、さらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記標識された前駆体イオンに対する追加の操作が、プロトン移動反応を含む、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの前記相対存在量を決定するステップが、同定のために実施されるいずれの分析とも独立して行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記複数の試料のそれぞれにおける少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの相対存在量を決定するステップが、イオンの前記第1および第2のサブセットにおける同位体変動を補正することを含む、請求項1に記載の方法。
- イオンの前記第2のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記化学的タグの同位体不純物を補正することを含む、請求項1に記載の方法。
- イオンの前記第2のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記同位体変動の場所を考慮することを含む、請求項16に記載の方法。
- イオンの前記第2のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記少なくとも1つのタイプの前駆体イオンの同位体組成に関する情報、および前記複数の化学的タグのそれぞれの同位体組成に関する情報を使用することを含み、該情報が、理論的に導出され、または質量分析計で測定される、請求項15に記載の方法。
- 前記化学的タグの同位体不純物を補正することが、
イオンの前記第2のサブセットの各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することと、
イオンの該第2のサブセットの測定された相対存在量をイオンの該第2のサブセットの該理論相対存在量と比較することと
を含む、請求項16に記載の方法。 - イオンの前記第2のサブセットの各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することが、前記複数の試料の第1の試料の同位体エンベロープを、前記それぞれの化学的タグに関連した不純物行列でコンボリューションすることを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記複数の試料のそれぞれの少なくとも1つのタイプの分子を標識することが、該複数の試料のそれぞれの複数のタイプの分子を標識することを含む、請求項2に記載の方法。
- イオンが前記質量分析計内に注入される継続時間が、前記前駆体イオンの少なくとも1つの特性に基づいて決定される、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの特性が、前記前駆体イオンの荷電状態、該前駆体イオンの質量対電荷比、該前駆体イオンの強度、または該前駆体イオンの分子のタイプからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- イオンが前記質量分析計内に注入される継続時間が、以前の質量分析法による分析の結果に基づいて決定される、請求項2に記載の方法。
- 実行されると一方法を実施する命令でコード化された少なくとも1つのコンピューター可読媒体であって、該方法は、
複数の化学的タグから選択されるそれぞれの化学的タグで複数の試料のそれぞれの少なくとも1つのタイプの分子を標識するステップであって、該複数の試料のそれぞれは、複数の分子を含む、ステップと
該標識された分子のそれぞれをフラグメント化して少なくとも第1の部分および第2の部分を作製するステップであって、該第1の部分は、該第2の部分より低い質量を有する、ステップと、
各第2の部分の相対存在量を測定するステップと、
該標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することによって該複数の試料のそれぞれにおける該少なくとも1つのタイプの標識された分子の相対存在量を決定するステップと
を含む、少なくとも1つのコンピューター可読媒体。 - 前記標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することが、前記少なくとも1つのタイプの分子の同位体エンベロープを補正することを含む、請求項25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
- 前記標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することが、前記複数の化学的タグのそれぞれの同位体不純物を補正することを含む、請求項26に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
- 前記化学的タグの同位体不純物を補正することが、
前記第2の部分の各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することと、
該第2の部分の前記測定された相対存在量を該第2の部分の該理論相対存在量と比較することと、
を含む、請求項27に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。 - 前記第2の部分の各タイプの理論相対存在量を生成することが、前記複数の試料の第1の試料の同位体エンベロープを、前記それぞれの化学的タグに関連した不純物行列でコンボリューションすることを含む、請求項28に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
- 前記複数の試料のそれぞれの前記少なくとも1つのタイプの分子を標識することが、該複数の試料のそれぞれの複数のタイプの分子を標識することを含む、請求項25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
- 前記第2の部分が少なくとも前記少なくとも1つのタイプの分子を含む、請求項25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
- 前記少なくとも1つのタイプの分子が、タンパク質またはペプチドを含む、請求項25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
- 前記複数の化学的タグのそれぞれが、名目上同じ質量を有する、請求項25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
- 前記標識された分子をフラグメント化するステップが、高エネルギー衝突解離(HCD)、衝突誘起解離(CID)、パルス化−q解離(PQD)、赤外多光子解離(IRMPD)、紫外光子解離(UVPD)、表面誘起解離(SID)、インソース解離、電子移動解離(ETD)、および電子捕獲解離(ECD)からなる群から選択される行為を含む、請求項25に記載の少なくとも1つのコンピューター可読媒体。
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