JP6491097B2 - 質量分析法を使用する正確で干渉のない多重定量プロテオミクス - Google Patents

Description

関連出願
本願は、２０１２年１０月２２日に出願された「Ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−Ｆｒｅｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題された米国仮特許出願第６１／７１６，８０６号の利益を主張し、この米国仮特許出願はその全体が本明細書中に参考として援用される。

政府支援
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＧＭ０２６８７５、ＨＧ３４５６およびＧＭ６７９４５の下、政府支援により成された。政府は本発明に一定の権利を有する。

質量分析法（ＭＳ）は、分子の質量の正確な決定を可能にする技術である。これは、生命科学および他の科学における多数の用途で広く使用されており、今日ではこれは、タンパク質およびペプチドの特性化における最も適切な分析用プラットフォームの１つであると考えられており、この場合これは、細胞または組織内のほとんどすべてのタンパク質、すなわち、プロテオームの多くの性質の全体像を生成することを可能にする。生体試料中のすべてのタンパク質を包括的に研究する試みは、通常、包括的用語プロテオミクスを使用して記述される。

タンパク質を同定する、特性化する、または定量化するのにＭＳを使用するためのいくつかの手法があるが、最も広く適用されているストラテジーは、いわゆる「ボトムアップ」手法であり、この場合、特定の酵素が明確に定義された位置でタンパク質を切断するのに使用されてペプチドが生成され、次いでこれらがＭＳに供される。ＭＳは一般に、電荷を担持する分子（すなわち、イオン）の分析を可能にするだけであり、したがってペプチドは、質量分析計に供される前に、通常、いくつかのイオン化技法、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ：ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、または任意の他の適当な技術などのうちの１つを使用してイオン化される。

質量分析計でペプチドを処理する一般的な方法は、ＭＳ^１実験でインタクトなペプチドの質量、実際には質量対電荷比（ｍ／ｚ）を最初に決定し、次いでペプチドイオンをフラグメント化してより小さいイオンにすることによってＭＳ^２実験でペプチドイオンの構造に関する追加の情報を生成し、その後これらのいわゆるフラグメントイオンのｍ／ｚ値を測定することである。通常、試験される生物体のタンパク質配列データベースと組み合わせて使用される収集された情報は、分析されるペプチドのアミノ酸配列を得るのに十分であり、これにより、試験される試料のタンパク質についての情報を推定することが可能になる。

１回の実験で数万のペプチドを分析することが多いプロテオミクス実験が定量的情報を得るために実施される場合、実験により、２種以上の特定の試料を比較することによる相対定量データが最も頻繁にもたらされる。各試料に由来するペプチドをある特定の安定同位体（例えば、炭素−１３または窒素−１５）で誘導体化または標識することができ、その結果、試料をプールした後、同一の、しかし差次的に標識されたペプチドの対を質量分析計で区別することができ、測定されたペプチドイオン強度を使用して、試験される試料間のこのペプチドの濃度差についての正確な定量的情報を得ることができる。質量分析法ベースプロテオミクス実験の一つの欠点は、これらがかなり高価な質量分析計で相対的に長い取得時間を必要とすることである。したがって、多重定量的実験（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）、すなわちただ１つの実験でのいくつかの試料の並列の定量的比較を可能にする方法を開発する相当な取り組みがある。特別に設計された化学的タグの開発は、タンデム質量タグ（ＴＭＴ：ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｔａｇ）、ならびに相対および絶対定量化のための同重体タグ（ｉＴＲＡＱ：ｉｓｏｂａｒｉｃ ｔａｇｓ ｆｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｎｄ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）などは、同時に複数の試料の多重定量化を実施する能力をもたらした。多重定量化の実施により、試料間の特定のタンパク質またはペプチドの相対量を決定することが可能になる。例えば、多重定量化を使用して、数千のユニークなタンパク質を含みうる２つの組織試料間の差異を同定することができる。

化学的タグは、試料処理の一部としてペプチドを処理するのに使用される試薬中に含められる。異なるタグを使用して各別個の試料を標識することができる。複数のタグのそれぞれは、タグのタイプのそれぞれが名目上同じ質量を有し、したがってＭＳ^１スペクトルで区別不能であることを意味する同重体であってもよい。これは、タグを作製する際に同じ元素の異なる同位体を使用することによって実現される。例えば、第１のタグは、分子の特定の場所で炭素−１２原子を使用することができ、一方、第２のタグは、炭素−１３原子を使用することができ、その特定の場所でおよそ１ダルトンの重量差異をもたらす。特定の同位体のこの目的のある選択は、複数の元素について複数の場所で行うことができる。全体として、各タグの各同位体は、異なるタイプのタグが同じ全質量を有し、異なるタイプのタグで標識されているにもかかわらず名目上同じ質量を有するタグ付き前駆体イオンをもたらすように選択される。異なる同位体は、タグ分子内に戦略的に分布されており、その結果、タグがフラグメント化されるとき、タグの各タイプについての低質量レポーターイオンとなるタグ分子の部分は、異なる重量を有する。したがって、異なるタイプのタグがＭＳ^２分析技法中にフラグメント化される場合、各タイプのタグは、区別可能な質量対電荷（ｍ／ｚ）比を有するレポーターイオンを生じる。所与のタグについてのレポーターイオンシグナルの強度は、試料内のタグ付きタンパク質またはペプチドの量を示す。したがって、複数の試料を異なるタグでタグ付けし、同時に分析して各試料中の特定のタンパク質、ペプチド、または分子の量の差異を直接比較することができる。

一部の実施形態は、質量分析法による分析を実施する方法を対象とする。本方法は、複数の試料の混合物を作製するステップであって、複数の試料のそれぞれは、複数の化学的タグから選択される少なくとも１つのタイプの化学的タグで標識された少なくとも１つのタイプの前駆体イオンを含み、少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの複数の前駆体イオンを含む、ステップと、標識された前駆体イオンをフラグメント化してイオンの第１のサブセットおよびイオンの第２のサブセットを含む複数のイオンを形成するステップであって、イオンの第１のサブセットの各イオンは、それぞれの化学的タグの少なくとも一部を含むが、それぞれの分子の一部は含まず、イオンの第２のサブセットの各イオンは、それぞれの化学的タグおよびそれぞれの分子の少なくとも一部を含む、ステップとを含む。本方法は、イオンの第２のサブセットの各タイプのイオンの存在量を測定するステップと、イオンの第２のサブセットの各タイプのイオンの存在量を分析することによって、複数の試料のそれぞれにおける少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの相対存在量を決定するステップとをさらに含む。

一部の実施形態は、実行されるとき、一方法を実施する命令でコード化された少なくとも１つのコンピューター可読媒体を対象とする。本方法は、複数の化学的タグから選択されるそれぞれの化学的タグで複数の試料のそれぞれの少なくとも１つのタイプの分子を標識するステップであって、複数の試料のそれぞれは、複数の分子を含む、ステップと、標識された分子のそれぞれをフラグメント化して少なくとも第１の部分および第２の部分を作製するステップであって、第１の部分は、第２の部分より低い質量を有する、ステップと、各第２の部分の相対存在量を測定するステップと、標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することによって複数の試料のそれぞれにおける少なくとも１つのタイプの標識された分子の相対存在量を決定するステップとを含む。

添付の図面は、縮尺に合わせて描くように意図されていない。図面では、様々な図で例示されている各同一またはほぼ同一のコンポーネントは、同様の数字によって表されている。明確さの目的で、あらゆるコンポーネントがあらゆる図面で標識されていない場合がある。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
質量分析法による分析を実施する方法であって、
複数の試料の混合物を作製するステップであって、該複数の試料のそれぞれは、複数の化学的タグから選択される少なくとも１つのタイプの化学的タグで標識された少なくとも１つのタイプの前駆体イオンを含み、該複数の試料のそれぞれは、該少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの複数の前駆体イオンを含む、ステップと、
該標識された前駆体イオンをフラグメント化してイオンの第１のサブセットおよびイオンの第２のサブセットを含む複数のイオンを形成するステップであって、
イオンの該第１のサブセットの各イオンは、該それぞれの化学的タグの少なくとも一部を含むが、該それぞれの分子は含まず、
イオンの該第２のサブセットの各イオンは、該それぞれの化学的タグの少なくとも一部および該それぞれの分子を含む、ステップと
イオンの該第２のサブセットの各タイプのイオンの存在量を測定するステップと、
イオンの該第２のサブセットの各タイプのイオンの該存在量を分析することによって、該複数の試料のそれぞれにおける少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの相対存在量を決定するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記複数の試料の前記混合物を作製するステップが、
複数の試料のそれぞれの少なくとも１つのタイプの分子をそれぞれの化学的タグで標識することであって、該複数の試料のそれぞれは、該少なくとも１つのタイプの分子の複数の分子を含む、ことと、
該複数の試料のそれぞれに由来する該標識された分子を一緒に混合することと、
該標識された分子をイオン化して、前記標識された前駆体イオンを形成することと、
該標識された前駆体イオンを質量分析計内に注入することと、
分析のために該標識された前駆体イオンを選択することと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１つのタイプの分子が、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、脂質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および代謝産物からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記複数の化学的タグのそれぞれが、名目上同じ質量を有する、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記少なくとも１つのタイプの前駆体イオンが、複数のタイプの前駆体イオンを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
分析のために前記標識された前駆体イオンを選択することが、連続的なウィンドウを使用する、項目５に記載の方法。
（項目７）
分析のために前記標識された前駆体イオンを選択することが、複数の別個のウィンドウを使用する、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記標識された分子をイオン化することが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、ナノエレクトロスプレーイオン化（ｎＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、大気化学イオン化（ＡＰＣＩ）、大気光イオン化（ＡＰＰＩ）、およびソニックスプレーイオン化（ＳＳＩ）からなる群から選択される行為を含む、項目２に記載の方法。
（項目９）
前記標識された前駆体イオンを選択することが、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、四重極マスフィルター（ＱＭＦ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴ−ＩＣＲ）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、および飛行時間分析器（ＴＯＦ）からなる群から選択されるデバイスによって実施される、項目２に記載の方法。
（項目１０）
前記標識された前駆体イオンをフラグメント化するステップが、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、パルス化−ｑ解離（ＰＱＤ）、赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、紫外光子解離（ＵＶＰＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、インソース解離、電子移動解離（ＥＴＤ）、および電子捕獲解離（ＥＣＤ）からなる群から選択される行為を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記標識された前駆体イオンをフラグメント化するステップにより、少なくとも１つの電荷の喪失を伴って、または伴わないで少なくとも１つのそれぞれのタグが破断する、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記標識された前駆体イオンが、選択された後であるが、フラグメント化される前に操作される、項目２に記載の方法。
（項目１３）
前記標識された前駆体イオンを操作することが、プロトン移動反応を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの前記相対存在量を決定するステップが、同定のために実施されるいずれの分析とも独立して行われる、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記複数の試料のそれぞれにおける少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの相対存在量を決定するステップが、イオンの前記第１および第２のサブセットにおける同位体変動を補正することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
イオンの前記第２のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記化学的タグの同位体不純物を補正することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
イオンの前記第２のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記同位体変動の場所を考慮することを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
イオンの前記第２のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの同位体組成に関する情報、および前記複数の化学的タグのそれぞれの同位体組成に関する情報を使用することを含み、該情報が、理論的に導出され、または質量分析計で測定される、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記化学的タグの同位体不純物を補正することが、
イオンの前記第２のサブセットの各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することと、
イオンの該第２のサブセットの測定された相対存在量をイオンの該第２のサブセットの該理論相対存在量と比較することと
を含む、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
イオンの前記第２のサブセットの各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することが、前記複数の試料の第１の試料の同位体エンベロープを、前記それぞれの化学的タグに関連した不純物行列でコンボリューションすることを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記複数の試料のそれぞれの少なくとも１つのタイプの分子を標識することが、該複数の試料のそれぞれの複数のタイプの分子を標識することを含む、項目２に記載の方法。
（項目２２）
イオンが前記質量分析計内に注入される継続時間が、前記前駆体イオンの少なくとも１つの特性に基づいて決定される、項目２に記載の方法。
（項目２３）
前記少なくとも１つの特性が、前記前駆体イオンの荷電状態、該前駆体イオンの質量対電荷比、該前駆体イオンの強度、または該前駆体イオンの分子のタイプからなる群から選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
イオンが前記質量分析計内に注入される継続時間が、以前の質量分析法による分析の結果に基づいて決定される、項目２に記載の方法。
（項目２５）
実行されると一方法を実施する命令でコード化された少なくとも１つのコンピューター可読媒体であって、該方法は、
複数の化学的タグから選択されるそれぞれの化学的タグで複数の試料のそれぞれの少なくとも１つのタイプの分子を標識するステップであって、該複数の試料のそれぞれは、複数の分子を含む、ステップと
該標識された分子のそれぞれをフラグメント化して少なくとも第１の部分および第２の部分を作製するステップであって、該第１の部分は、該第２の部分より低い質量を有する、ステップと、
各第２の部分の相対存在量を測定するステップと、
該標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することによって該複数の試料のそれぞれにおける該少なくとも１つのタイプの標識された分子の相対存在量を決定するステップと
を含む、少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
（項目２６）
前記標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することが、前記少なくとも１つのタイプの分子の同位体エンベロープを補正することを含む、項目２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
（項目２７）
前記標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することが、前記複数の化学的タグのそれぞれの同位体不純物を補正することを含む、項目２６に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
（項目２８）
前記化学的タグの同位体不純物を補正することが、
前記第２の部分の各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することと、
該第２の部分の前記測定された相対存在量を該第２の部分の該理論相対存在量と比較することと、
を含む、項目２７に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
（項目２９）
前記第２の部分の各タイプの理論相対存在量を生成することが、前記複数の試料の第１の試料の同位体エンベロープを、前記それぞれの化学的タグに関連した不純物行列でコンボリューションすることを含む、項目２８に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
（項目３０）
前記複数の試料のそれぞれの前記少なくとも１つのタイプの分子を標識することが、該複数の試料のそれぞれの複数のタイプの分子を標識することを含む、項目２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
（項目３１）
前記第２の部分が少なくとも前記少なくとも１つのタイプの分子を含む、項目２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
（項目３２）
前記少なくとも１つのタイプの分子が、タンパク質またはペプチドを含む、項目２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
（項目３３）
前記複数の化学的タグのそれぞれが、名目上同じ質量を有する、項目２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
（項目３４）
前記標識された分子をフラグメント化するステップが、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、パルス化−ｑ解離（ＰＱＤ）、赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、紫外光子解離（ＵＶＰＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、インソース解離、電子移動解離（ＥＴＤ）、および電子捕獲解離（ＥＣＤ）からなる群から選択される行為を含む、項目２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。

図１Ａは、レポーターイオン以外のイオンからの干渉の例を例示する図である。 図１Ｂは、レポーターイオン以外のイオンからの干渉の実験例を例示する図である。 図２Ａは、ＴＭＴ−標識ペプチドをフラグメント化することから生じるペプチド同位体エンベロープ、レポーターイオンスペクトル、および相補イオンスペクトル（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を例示する図である。 図２Ｂは、等比の各タイプの化学的タグで標識されたペプチドのレポーターイオンスペクトルを例示する図である。 図２Ｃは、等比の各タイプの化学的タグで標識されたペプチドの相補イオンスペクトルを例示する図である。 図３Ａ〜ＢはＴＭＴタグの６つのタイプの例示的な実施形態についての不純物情報を例示する図である。 図３Ａ〜ＢはＴＭＴタグの６つのタイプの例示的な実施形態についての不純物情報を例示する図である。 図４は、相補イオンクラスターが例示的な多重ＭＳ^２実験で標識試料のそれぞれの相対存在量を定量化するのに使用されうる一般的原理を例示する図である。 図５Ａ〜Ｅは、例示的な実験データに基づいてＴＭＴレポーターイオン対ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを使用する定量化のより詳細な比較を例示する図である。 図５Ａ〜Ｅは、例示的な実験データに基づいてＴＭＴレポーターイオン対ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを使用する定量化のより詳細な比較を例示する図である。 図５Ａ〜Ｅは、例示的な実験データに基づいてＴＭＴレポーターイオン対ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを使用する定量化のより詳細な比較を例示する図である。 図５Ａ〜Ｅは、例示的な実験データに基づいてＴＭＴレポーターイオン対ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを使用する定量化のより詳細な比較を例示する図である。 図５Ａ〜Ｅは、例示的な実験データに基づいてＴＭＴレポーターイオン対ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを使用する定量化のより詳細な比較を例示する図である。 図６は、一部の実施形態による、質量分析法を実施する方法の流れ図である。 図７Ａ〜Ｂは、一部の実施形態による、タグ付き分子の各タイプの相対存在量を決定する方法を例示する図である。 図７Ａ〜Ｂは、一部の実施形態による、タグ付き分子の各タイプの相対存在量を決定する方法を例示する図である。 図８は、一部の実施形態による、タグ付き分子の各タイプの相対存在量を決定する方法の流れ図である。 図９Ａ〜Ｅは、一部の実施形態による、単一のＭＳ^２スペクトルからの複数のペプチドの定量化を例示する図である。 図９Ａ〜Ｅは、一部の実施形態による、単一のＭＳ^２スペクトルからの複数のペプチドの定量化を例示する図である。 図９Ａ〜Ｅは、一部の実施形態による、単一のＭＳ^２スペクトルからの複数のペプチドの定量化を例示する図である。 図９Ａ〜Ｅは、一部の実施形態による、単一のＭＳ^２スペクトルからの複数のペプチドの定量化を例示する図である。 図９Ａ〜Ｅは、一部の実施形態による、単一のＭＳ^２スペクトルからの複数のペプチドの定量化を例示する図である。 図１０Ａ〜Ｈは、定量化の精度に対するチャネル数およびチャネル間間隔の効果を、シミュレーション実験のボックスプロットを使用して例示する図である。 図１０Ａ〜Ｈは、定量化の精度に対するチャネル数およびチャネル間間隔の効果を、シミュレーション実験のボックスプロットを使用して例示する図である。 図１０Ａ〜Ｈは、定量化の精度に対するチャネル数およびチャネル間間隔の効果を、シミュレーション実験のボックスプロットを使用して例示する図である。 図１０Ａ〜Ｈは、定量化の精度に対するチャネル数およびチャネル間間隔の効果を、シミュレーション実験のボックスプロットを使用して例示する図である。 図１０Ａ〜Ｈは、定量化の精度に対するチャネル数およびチャネル間間隔の効果を、シミュレーション実験のボックスプロットを使用して例示する図である。 図１０Ａ〜Ｈは、定量化の精度に対するチャネル数およびチャネル間間隔の効果を、シミュレーション実験のボックスプロットを使用して例示する図である。 図１０Ａ〜Ｈは、定量化の精度に対するチャネル数およびチャネル間間隔の効果を、シミュレーション実験のボックスプロットを使用して例示する図である。 図１０Ａ〜Ｈは、定量化の精度に対するチャネル数およびチャネル間間隔の効果を、シミュレーション実験のボックスプロットを使用して例示する図である。 図１１は、一部の実施形態による適当なコンピューティングシステム環境の模式図である。 図１２は、一部の実施形態による質量分析法装置の模式図である。 図１３Ａ〜Ｆは、一部の実施形態による、相補イオンに基づく定量的データのフィルタリングを例示する図である。 図１３Ａ〜Ｆは、一部の実施形態による、相補イオンに基づく定量的データのフィルタリングを例示する図である。 図１３Ａ〜Ｆは、一部の実施形態による、相補イオンに基づく定量的データのフィルタリングを例示する図である。 図１３Ａ〜Ｆは、一部の実施形態による、相補イオンに基づく定量的データのフィルタリングを例示する図である。 図１３Ａ〜Ｆは、一部の実施形態による、相補イオンに基づく定量的データのフィルタリングを例示する図である。 図１３Ａ〜Ｆは、一部の実施形態による、相補イオンに基づく定量的データのフィルタリングを例示する図である。 図１４Ａ〜Ｆは、相補イオン定量化の例示的な大規模評価を例示する図である。 図１４Ａ〜Ｆは、相補イオン定量化の例示的な大規模評価を例示する図である。 図１４Ａ〜Ｆは、相補イオン定量化の例示的な大規模評価を例示する図である。 図１４Ａ〜Ｆは、相補イオン定量化の例示的な大規模評価を例示する図である。 図１４Ａ〜Ｆは、相補イオン定量化の例示的な大規模評価を例示する図である。 図１４Ａ〜Ｆは、相補イオン定量化の例示的な大規模評価を例示する図である。 図１５Ａ〜Ｃは、一部の実施形態による相補イオンベース定量化の効率を改善する方法を例示する図である。 図１５Ａ〜Ｃは、一部の実施形態による相補イオンベース定量化の効率を改善する方法を例示する図である。 図１５Ａ〜Ｃは、一部の実施形態による相補イオンベース定量化の効率を改善する方法を例示する図である。 図１６Ａ〜Ｃは、相補イオンクラスター強度に対するアミノ酸配列の影響の例を例示する図である。 図１６Ａ〜Ｃは、相補イオンクラスター強度に対するアミノ酸配列の影響の例を例示する図である。 図１６Ａ〜Ｃは、相補イオンクラスター強度に対するアミノ酸配列の影響の例を例示する図である。

本発明者らは、複合混合物を分析するとき、フラグメンテーションのために選択されたペプチドは一般に、より低い存在量の共溶出イオンが夾雑していることを認識および十分に理解した。したがって、レポーターイオンは、標的イオンおよび干渉イオンの両方に由来し得、それは、定量化のゆがみ（ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を引き起こす。この場合、タグ付き標的ペプチドの量を決定することは、標的ペプチドのレポーターイオンが干渉イオンのレポーターイオンと区別不能になっていることに起因して困難である。したがって、標的ペプチドと共単離された（ｃｏ−ｉｓｏｌａｔｅｄ）いずれの干渉イオンも、試料中の標的ペプチドの相対量を正確に決定する能力を破壊した。

図１は、この干渉問題を例示する。図１Ａは、ＬｙｓＣ消化ＴＭＴ標識ヒトペプチドの複合混合物と１対１の比で混合されたＬｙｓＣ消化ＴＭＴ標識酵母ペプチドの複合混合物を示す。酵母ペプチドは、この図解の実例の目的に関して、標的と見なされ、ヒトペプチドは、干渉イオンを生成する。酵母ペプチドを６種のＴＭＴ試薬（１２６〜１３１）のそれぞれで標識し、１０：４：１：１：４：１０（１２６：１２７：１２８：１２９：１３０：１３１）の比で混合した。ヒトペプチドは、最初の３種のＴＭＴ試薬１２６〜１２８でのみ標識されている。これらを１：１：１の比で混合し、酵母ペプチドとともにプールした。ヒトペプチドからの干渉がまったくなかった場合、酵母ペプチドイオンＭＳ^２スペクトル中のレポーターイオンは、標的試料の最初の比、すなわち、１０：４：１：１：４：１０と完全に一致するはずである。この理想的なスペクトルは、図１Ａの右下に示されたレポーターイオン強度分布によって例示されている。しかし、ヒトペプチドイオンからの干渉があると、図１Ａの右上のＭＳスペクトルによって例示したように、酵母ペプチドレポーターイオン強度比はゆがめられ、定量的データを不正確にする。ヒトペプチドイオンによる最初の３種のＴＭＴチャネルの寄与に起因して、最初の３つのタグのｍ／ｚ値と関連したピークの強度は正確でない。この干渉は、酵母試料で使用された各タグの相対比を正確に決定する能力を破壊する。

この干渉問題を、実験データに基づいて図１Ｂのスペクトルにも例示する。ペプチドＮＡＡＷＬＶＦＡＮＫを、１０：４：１：１：４：１０の比にてＴＭＴ標識で標識し、ＭＳ^１前駆体をフラグメント化したＭＳ^２スキャンを使用する連続スキャンで調べた。フラグメンテーションは、例えば、ＣＩＤ−ＮＣＥ３５またはＨＣＤ−ＮＣＥ４５を使用して行われうる。左のスペクトルは、衝突誘起解離（ＣＩＤ：ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を使用して酵母ペプチドイオンをフラグメント化することによって生成した上述した試料のＭＳ^２プロダクトイオンスペクトルを表す。図１Ｂの右のスペクトルは、１２５〜１３３のｍ／ｚ値範囲のみを示すＭＳ^２プロダクトイオンスペクトルの一部を表し、この範囲は、使用した６種の異なるタイプのＴＭＴタグの６種の異なるレポーターイオンのｍ／ｚ値を包含する範囲である。上記に論じたように、第１〜第３のＴＭＴチャネルの強度比は、ヒトペプチドからの干渉の非存在下で１０：１であるはずである。この特定の実験では、比は４．６：１であり、２超倍だけ（ｂｙ ａ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｗｏ）予期されたものより低い比にシフトしている。相対定量測定のこの劇的な不正確さは、共単離前駆体によって引き起こされるこの干渉問題の解決策を見つける必要性を例示する。

本発明者らは、同重体化学的タグは、低質量レポーターイオンを使用して複合試料中の分子の相対存在量を定量化するように設計することができるが、共単離ペプチドの問題は、レポーターイオン強度に基づいて各差次的に標識されたペプチドの量を定量化する代わりに、各標識ペプチドと関連した各高質量相補イオンの強度を測定することによって矯正されうることを認識および十分に理解した。標識ペプチドのフラグメンテーション機構は、低質量レポーターイオンの形成と同時に、高質量相補イオンも同様に形成されるようなものである（図２Ａの上を参照）。図２Ａ中のアステリスクは、重同位体（^１３Ｃまたは^１５Ｎ）の部位を示す。ＴＭＴレポーターイオンおよびＴＭＴ^Ｃイオンは、示された位置での結合切断によって形成される。レポーターイオンおよびＴＭＴ^Ｃイオンの両方のｍ／ｚは、チャネル特異的である。高質量相補イオン（ＴＭＴ^Ｃイオン）はＴＭＴタグの質量収支基（ｍａｓｓ−ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）のほとんどを担持する。したがって、標識試料の相対存在量に関する情報は、相補イオンの相対存在量を測定することによって得ることができる。

本発明者らは、低ｍ／ｚレポーターイオンの使用と対照的に、これらの相補イオン（ＴＭＴタグの場合では、ＴＭＴ^Ｃイオンと呼ばれる）のｍ／ｚ値は、前駆体特異的であることを認識および十分に理解した。標的分子の相補イオンが干渉分子の相補イオンとＭＳ^２スペクトルにおいて厳密に同じ場所でスペクトルエンベロープを有するリスクは非常に低い。したがって、干渉ペプチドは、対象のＴＭＴ^Ｃイオンの測定に対してはるかに小さい効果を有する。さらに、他のペプチドがＴＭＴ^Ｃイオンクラスターと干渉する場合には、干渉ペプチドが対象のペプチドによってのみ生成されうるイオンクラスターをもたらす可能性は低い。観察されるイオンクラスターを理論的なイオンクラスターと比較することによって、不正確な定量を伴うペプチドを除去し、不正確な定量をさらに低減することができる。相対存在量を定量化するための相補イオンの使用は、広範囲の質量分析計、例えば、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ：ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）、四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ計測器（ＱＥｘａｃｔｉｖｅ）、ハイブリッド四重極イオントラップＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴分析器（ＦＴ−ＩＣＲ：Ｆｏｕｒｉｅｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ ｉｏｎ ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｎａｌｙｚｅｒｓ）で実行することができる。この相補イオン技法は、標識された分子の定量化においてより高い正確さをもたらすだけでなく、多重タグの並列化も維持し、したがってこれは、所与の時間枠内で定量化されうる別個のペプチドの数を増やす潜在性を有する。

本発明者らは、ＭＳ^３スペクトルの分析を必要とし、またはプロトン転移反応を利用するいくつかの技法と異なり、本願の実施形態は、いずれの追加の気相精製ステップも必要とせず、したがってより高い感度およびより速いデータ取得をもたらしうることを認識および十分に理解した。本発明者らは、高い質量正確さおよび高い分解能の質量分析計は、ＴＭＴ^Ｃイオンを使用するペプチドの定量化を可能にすることを認識および十分に理解した。ＭＳ^２スペクトルで低ｍ／ｚレポーターイオンを使用する代替として、諸実施形態では、ＴＭＴ^Ｃイオンに基づいて様々な試料間の差異が定量化される。相補イオンは、差次的に標識されたペプチドの相対的レベルについて、低ｍ／ｚレポーターイオンと等価な定量的情報を持つが、干渉ペプチドイオンによって最小限に影響される。低質量ｍ／ｚレポーターイオンは、異性体であり、したがって標的イオンまたは夾雑イオン由来のそれらの起源に関して区別不能であるが、標的イオンおよび夾雑イオンから生じるＴＭＴ^Ｃイオンは、そのｍ／ｚ値の差異を示すことが予期され、それによりこれらが最新の質量分析法を使用して区別可能になる。

本発明者らは、相補イオンの観察される量は、相対存在量の情報を直接与えないが、この情報は、タグおよび標識された分子についての詳細を使用するデータ分析に基づくデータから抽出されうることを認識および十分に理解した。相対存在量が測定される量で直接的に観察可能でない理由の１つは、測定されるペプチド内に天然の同位体変動があることである。例えば、炭素−１２は、世界で天然に存在する炭素の約９９％を構成するが、炭素−１３は、１％の寄与をする。標的ペプチドは、１２アミノ酸の長さであり得、およそ１２００ダルトン（Ｄａ）の質量を有しうる。炭素の各同位体の天然存在量に基づいて、同じ１２アミノ酸を有するペプチドの質量は、数ダルトン変動しうる。例えば、ＭＳスペクトルは、同位体が自然において出現するこれらの相対存在量から純粋に、１２００Ｄａ、１２０１Ｄａ、１２０２Ｄａ、および１２０３Ｄａのピークを示すスペクトルエンベロープをもたらしうる。図２Ａは、右上において、例えば、炭素−１２と炭素−１３の間の質量差を表す１ダルトンによって分離されたピークを有する同じペプチドスペクトルを表すペプチド同位体エンベロープを例示する。最も左のピークは、すべて炭素−１２原子からなるペプチドの存在量を表し、モノアイソトピックピークと呼ばれる。隣接するピークは、多くの炭素原子のうちの単一のものが、単一の炭素−１３（または単一のＮ−１５）であるペプチドの存在量を表す。同様に、約１ダルトンによってそれぞれの前のピークから分離されている追加のピークは、追加の炭素−１３原子を有するペプチドを表す。

測定される量で相対存在量が直接観察可能でない別の理由は、化学的タグが特定の同位体構成を有するように操作されているという事実にもかかわらず、同位体不純物が同重体タグの各タイプの全質量の変動のみだけでなく、レポーターイオン部分およびＴＭＴ^Ｃイオンの変動も引き起こすことである。例えば、図２Ａの左側は、６種のＴＭＴタグのそれぞれについてのレポーターイオンスペクトルを例示する。各スペクトルは、軽同位体が存在するように設計された場所で意図せずに使用された重同位体によって引き起こされた、または逆の場合も同様の主ピークより１ダルトン重いまたは軽い小さい二次ピークを示す。したがって、図２Ｂは、等数の各タイプの化学的タグでペプチドをタグ付けすることから生じるレポーターイオンスペクトルを例示する。レポーターイオンスペクトルの異なるフィルパターンは、どのタイプのタグが各ピークにおける特定のイオンの源であったかを表す。例えば、ＴＭＴ−１２６タグは、１２６Ｄａのピークに対する唯一の寄与であるが、１２７Ｄａのピークに少量寄与する。他のタイプのＴＭＴタグは、これらのそれぞれのピークに対して同様の方法で寄与する。ＴＭＴ−１３１タグ中の不純物は、他のタグが寄与しない１３２Ｄａのピークをもたらす。

図２Ａの右側は、各ＴＭＴ^Ｃイオンの同位体エンベロープを例示する。エンベロープは、ペプチド自体のエンベロープと同一でない場合があり、理由は、フラグメンテーション後にペプチドに結合して留まる化学的タグの一部における不純物からの追加の寄与がありうるためである。フラグメンテーション後にレポーターイオンにもＴＭＴ^Ｃイオンにも結合して留まらない各同重体タグの部分が存在しうることに留意されたい。この部分は、同じ質量を有する２種のＴＭＴ^Ｃイオン（例えば、それぞれＴＭＴ−１２９タグおよびＴＭＴ−１３０タグと関連した相補イオンであるＴＭＴ^Ｃ−１２９およびＴＭＴ^Ｃ−１３０）をもたらしうる。したがってこれらの２種のＴＭＴ^Ｃイオンは、区別不能であり得、異なる試料をタグ付けするのに同時に使用されるべきでない。これらの２種の相補イオンのコンボリューションは、どのようにこれらの特定の化学的タグが操作されたかの結果である。一部の実施形態では、このような区別可能性問題をまったく有さない一連の化学的タグを使用することができる。

図２Ｃは、等数の各タイプの化学的タグでペプチドをタグ付けすることから生じるＴＭＴ^Ｃイオンスペクトルを例示する。図２Ｂ中のレポーターイオンスペクトルと同じように、ＴＭＴ^Ｃイオンスペクトルの異なるフィルパターンは、どのタイプのタグが各ピークにおける特定のイオンの源であったかを表す。しかし、ＴＭＴ^Ｃイオンスペクトルは、２つを超えるピークに寄与する各ＴＭＴ^Ｃイオンに起因してＴＭＴレポーターイオンスペクトルより複雑である。示した例では、各ＴＭＴ^Ｃイオンは、５ｍ／ｚの領域に及ぶ全体的な同位体エンベロープに寄与する。諸実施形態は、５ｍ／ｚに限定されない。ＴＭＴ^Ｃイオンは、タグのサイズおよびペプチドのサイズに応じて、より多くてもまたはより少なくても任意の数のピークに寄与しうる。同位体不純物を無視すると、ＴＭＴ^Ｃイオンスペクトルの最低質量ピークは、もっぱらＴＭＴ^Ｃ−１３１イオンから生じる。次のピークは、ＴＭＴ^Ｃ−１３１イオンならびにＴＭＴ^Ｃ−１２９およびＴＭＴ^Ｃ−１３０イオン（ともにこれらの区別不能性に起因して寄与する）からの寄与を受ける。他のピークのそれぞれは、それらのそれぞれのＴＭＴ^Ｃイオンからの寄与を受ける。ＴＭＴ^Ｃイオンスペクトルは、９つのピークを有し、これらは、区別可能なＴＭＴ^Ｃイオンを有する５種のタグでコンボリューションされたペプチドエンベロープの５つの最初のピークに由来する。各ピークの相対存在量の読みは、多重試料中のタグ付きペプチドの各タイプの存在量を直接与えない。代わりに、この情報は、ＴＭＴ^Ｃイオンスペクトル内に埋まっており、抽出されなければならない。各ＴＭＴチャネルの高ｍ／ｚ ＴＭＴ^Ｃイオンエンベロープの重複に起因して、ペプチドは、理論的または実験的に得ることができる前駆体ペプチドの同位体エンベロープのイオン強度分布を使用してＴＭＴ^Ｃクラスターをデコンボリューションすることによって定量化される。

ＴＭＴ^Ｃイオンスペクトルに由来するタグ付きペプチドの各タイプの相対存在量を決定するために、標的分子中の同位体変動およびタグの同位体不純物の両方が考慮されなければならない。不純物の詳細は、どのように、いつ、かつどこで化学的タグが製造されたかに応じて異なりうる。製造される化学的タグの各バッチは、以前のバッチと異なりうる。化学的タグの製造者は、ＭＳデバイスのユーザーに特定のバッチについての不純物の詳細を提供することができる。代わりに、ＭＳデバイスのユーザーは、化学的タグを使用して１つまたは複数の実験を実施することによって不純物の詳細を決定してもよい。一部の実施形態では、化学的タグは、タグの不純物が無視できるように設計することができ、分析は、このこれらの不純物について明らかにすることを省略することができる。

図３Ａ〜Ｂは、ＴＭＴタグの６種のタイプについての不純物情報を判定するのに使用した１つのこのような例示的実験の結果を例示する。実験はＴＭＴタグのそれぞれの同位体組成を決定する。実験では、タグタイプのそれぞれが炭酸水素アンモニウムと別個に反応させられ、得られるＮＨ_２−ＴＭＴ同位体エンベロープがＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量分析計でＭＳを使用して測定される。ＮＨ_２−ＴＭＴイオン全体の標的ｍ／ｚは、２４７Ｄａである。図３Ａ〜Ｂ中のスペクトルエンベロープは、２４７ＤａにおけるＮＨ_２−ＴＭＴイオンの６種のタイプのそれぞれについての主ピークを例示する。主ピークの両側の追加のピークは、同位体不純物から生じ、それは、ＮＨ_２−ＴＭＴイオン全体が標的質量より１ダルトン多いまたは少ない質量を有する原因となる。各ピークの相対的ポピュレーションは、全体としてＮＨ_２−ＴＭＴイオンの異なる質量についての情報をもたらすが、不純物が分子内でどこに位置しているかについての情報をもたらさない。この情報は、各スペクトルエンベロープの各個々のピークをフラグメント化し、ＭＳ^２スペクトルを測定することによって推測されうる。ＭＳ^２スペクトルは、ＮＨ_２分子に結合して留まるタグの部分の質量についての情報をもたらす。タグの６種のタイプのそれぞれは、異なるタイプの陰影によって表されており、同位体エンベロープのそれぞれにおけるピークのそれぞれへのその寄与は、図３Ａ〜Ｂに例示されている。例えば、ＴＭＴ−１２８−ＮＨ_２エンベロープの２４７Ｄａにおける中心ピークは、フラグメンテーションで１５６Ｄａを失った化学的タグにもっぱら由来する。一方、２４８Ｄａにおけるピーク（全体的に１追加質量を有するＮＨ_２−ＴＭＴイオンを表す）は、フラグメンテーションで１５６Ｄａを失った化学的タグおよび１５７Ｄａを失った化学的タグからの寄与を受ける。

上記実験によって得られ、図３Ａ〜Ｂのスペクトルエンベロープで例示される不純物情報は、行列形式で書くことができる。したがって、６種のタグのそれぞれは、「不純物行列」、Ｉ_ＴＭＴと関連付けることができ、これは、上記実験で使用されるタグのバッチについて、

である。

不純物行列の列は、タグ中の不純物がフラグメンテーションの前に化学的タグ全体の質量にどのように影響するかを表し、すなわち、列は、ＴＭＴ−ＮＨ_２前駆体同位体エンベロープ中の位置を定義する（左から右に、約２４６、２４７、２４８Ｄａ）。例えば、中央の列は、２４７Ｄａの標的質量に等しい実際の質量を有するバッチ内タグの比率を反映する。他の２つの列は、質量の１ダルトン上／下のシフトを表す。行列は、１ダルトンの差異でカットオフされ、理由は、より大きな質量差を示すイオンは、これらがＴＭＴ^Ｃイオンエンベロープの全体的な分布における変化に有意に寄与しない低強度のものであると予期されるためである。しかし、より大きい質量シフトが見込まれる実施形態では、不純物行列は、より多くの列を含むように拡張することができることを当業者は認識するはずである。また、６種を超える異なるタグタイプを有する一連の化学的タグが使用される場合、より多くの行を追加することができる。

不純物行列の行は、ＭＳ^２実験でのフラグメンテーションから生じる６つの異なる質量減分（Δｍ）、すなわち、この前駆体イオンとフラグメンテーション後のその得られるＴＭＴ^Ｃイオンとの間の質量差を表す（上から下に約１５４Ｄａ〜約１５９Ｄａ）。例えば、一番上の行は、フラグメンテーションで約１５４Ｄａの質量を失ったタグを表す。最初の後の各行は、１ダルトンの増分で、フラグメンテーションでより多くの質量を失うタグを表し、フラグメンテーションで１５９Ｄａを失うタグを表す一番下の行まで続く。６つの異なる質量減分は、５種の異なるＴＭＴチャネル（１２６〜１３１、上述したようにＴＭＴ−１２９とＴＭＴ−１３０の間にΔｍは存在しないので１２９を含まない）、およびＴＭＴ−１３１タグ中の同位体不純物の結果である約１３２Ｄａの追加のイオンから生じる。

タグのタイプのそれぞれについて、「同位体不純物ベクトル」ｔ_１２６．．．ｔ_１３１を、それぞれの行列Ｉ_１２６．．．Ｉ_１３１の行を合計することによって定義することができる。例えば、数値が、フラグメンテーションパターンにかかわらず、それぞれ約２４６、２４７、および２４８Ｄａを有するＴＭＴ−ＮＨ_２イオンの相対存在量を表す、同位体不純物ベクトルｔ_１２６＝［０．０３２ ０．８８９ ０．０７９］。言い換えれば、同位体不純物ベクトルは、各ピークをフラグメント化してＭＳ^２スペクトルを決定する前の、ＭＳ^１段階後に化学的タグの不純物を特性化するために上記実験で得られたデータを表す。

同位体不純物が相補イオンのスペクトルエンベロープにどのように影響するかの上記記述に基づくと、相補イオンが、重なりうるピークのクラスターをどのようにもたらすかが明確であるはずである。図４は、多重ＭＳ^２実験でこれらの相補イオンクラスターを使用して標識試料のそれぞれの相対存在量を定量化することができる一般的原理を例示する。図４の上は、ＴＭＴ−１３１タグで標識された標的ペプチド（Ｐｅｐ１）の第１の試料、およびＴＭＴ−１２６タグで標識された標的ペプチドの第２の試料を例示する。両形態は、１：１の比で混合されている。ＭＳ^１前駆体は、当技術分野で公知であるように、単離ウィンドウを使用してＭＳデバイスで単離される。しかし、ＴＭＴ−１３１でタグ付けされた干渉ペプチド（Ｐｅｐ２）も単離ウィンドウ内に入り、標的ペプチドとともに共溶出する。単離ペプチドが、例えば、ＨＣＤを使用してフラグメント化されるとき、２種のタグタイプが図４の上で破線によって示された２つの位置でフラグメント化する。最も左の部分は、低質量レポーターイオンであり、これらは、各試料の相対存在量を決定するために先行技術で使用される。最も右の部分は、高質量相補イオンであり、これらは、ペプチド、およびＴＭＴタグの少なくとも一部（すなわち、質量収支部分）を含む。イオンに伴ったアステリスクは、炭素−１３同位体が炭素−１２同位体の代わりに意図的に使用され、または窒素−１５が窒素−１４の代わりに意図的に使用されている場所を示す。

図４の下は、得られるＭＳ^２スペクトルを例示し、１２６Ｔｈおよび１３１Ｔｈにおけるレポーターイオンピークに対する相対存在量測定に基づいて生じる上述の問題を明らかに示す。２種の標的ペプチド試料を１：１の比で混合したが、ＴＭＴ−１３１タグでやはりタグ付けされた干渉ペプチドは、ＴＭＴ−１３１の寄与を増大させる。干渉ペプチドに由来するシグナルは、標的ペプチドに由来するシグナルと区別不能であるため、ＴＭＴ−１２６レポーターイオンおよびＴＭＴ−１３１レポーターイオンの相対存在量を使用して標的ペプチドの各試料の相対存在量を正確に定量化することは可能でない。しかし、上述したように、標的ペプチドに由来する相補イオンクラスターは、干渉ペプチドに由来する相補イオンクラスターと区別可能である。したがって、ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターの測定を使用して、干渉ペプチドからの干渉を伴うことなく、各試料に由来する標的ペプチドの相対存在量を正確に得ることができる。したがって、ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターは、単一のＭＳ^２スペクトルで複数のペプチドを定量化するのに使用されうる正確な定量的情報を含む。図４で示した例では、例えば、ペプチド１およびペプチド２をそれぞれ定量化することができ、理由は、各ペプチドのＴＭＴ^Ｃイオンは重複しないためであることが分かる。

図５Ａ〜Ｅは、実験データに基づいてＴＭＴレポーターイオン対ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを使用する定量化のより詳細な比較を例示する。試料の調製を図５Ａに例示する。既知の混合比および既知の量の干渉ペプチドの２種の試料を使用して、定量化の正確さおよび干渉の効果を調査する。試料は、それぞれチャネル１２６、１２７、１２８、１３０、および１３１においてＴＭＴで標識された１μｇ：４μｇ：１０μｇ：４μｇ：１μｇのＬｙｓ−Ｃ消化酵母ペプチドを含む。干渉は、それぞれＴＭＴ−１２６およびＴＭＴ−１２７で標識された１０μｇ：１０μｇのヒトＬｙｓ−Ｃ消化ペプチドの混合物を添加することによってシミュレートする。以前に記載したように、ＴＭＴ^Ｃ−１２９イオンおよびＴＭＴ^Ｃ−１３０イオンは区別不能であるので、ＴＭＴ−１２９チャネルは省略する。

図５Ｃは、設定した単離ウィンドウ内のＭＳ^１前駆体スペクトル領域を例示する。干渉イオンから生じる多くの小さいピークが、ＭＳ^２分析用のより大きい標的ピークを捕捉するのに使用した単離幅内で明らかである。したがって、前駆体が、例えば、ＨＣＤを使用してフラグメント化されるとき、標的および干渉ペプチドがともにフラグメント化され、図５Ｂに示したＭＳ^２スペクトルに寄与する。図５Ｂは、図５Ａに記載のヒト−酵母干渉試料から採用した５種のＴＭＴタグで標識された酵母ペプチドＡＩＥＬＦＴＫのＭＳ^２スペクトル全体を例示する。ＭＳ^２スペクトルは、３５ｋの名目上の分解能設定および±２ｍ／ｚの単離ウィンドウによるＱＥｘａｃｔｉｖｅで取得した。ＭＳ^２スペクトルは、対象の２つの範囲：５種のタグのそれぞれについてのレポーターイオンの相対存在量を示す低質量範囲（１２６〜１３１ｍ／ｚの範囲内に位置した）、およびＴＭＴ^Ｃクラスターの相対存在量を示す高質量範囲（約１１２５ｍ／ｚに位置した）を有する。これらのｍ／ｚ領域の両方のイラストの拡大図を、それぞれ図５Ｄおよび図５Ｅに例示する。低質量レポーターイオンを使用して決定した場合の標的試料のそれぞれの相対存在量も図５Ｄに示す。試料のそれぞれの比は、図５Ａに示した最初の比、すなわち、１：４：１０：４：１に一致するはずである。しかし、レポーターイオン定量化は、無干渉チャネル（１２８〜１３１）内で正確である一方、ヒトペプチドからの干渉は、チャネル間の比をゆがめ、ＴＭＴ−１２６およびＴＭＴ−１２７標識試料の相対存在量を正確に決定する能力を破壊する。同位体不純物について補正した後に得られた比を図５Ｄの左側に示す。混合比が未知である現実の生体試料では、ＭＳデバイスのユーザーは、レポーターイオンのどの画分が対象のペプチドに由来し、どの画分が干渉ペプチドに由来するかを区別することができないはずである。

諸実施形態では、高質量ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを使用して、干渉イオンからの干渉が低減された試料の相対存在量を得ることができる。図５Ｅは、標的ペプチドに関連した検出されたＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを例示する。レポーターイオンと異なり、このイオンクラスターの位置は、前駆体イオンの厳密な質量および荷電状態に依存する。ｃ（−１）〜ｃ（＋７）でラベル表示された９つのチャネルが例示されている。ｃ（０）のピークは、ＴＭＴ−１３１標識疑似モノアイソトピック前駆体に由来するピークであり、他のピークは、この位置に対してラベル表示されている。各ピークは、異なるタイプの１種または複数のＴＭＴ標識ペプチドの結果である。各バーの各部分の陰影は、どのタイプのＴＭＴタグがペプチドを標識しており、そのそれぞれの部分をもたらしていたかを表す。以下により詳細に記載した方法を使用して、図５Ｅの右側に例示したように、上述の不純物行列を使用して、標識試料のそれぞれの実際の相対存在量を決定することができる。ＴＭＴ試薬１２６および１２７で標識されたペプチドのレポーターイオン強度について測定される比のゆがみは、定量化が高質量相補イオンの強度に基づいているとき存在せず、無干渉定量化をもたらす。

図６は、一部の実施形態に従って質量分析法を実施する例示的な方法を例示する。行為６０２で、分析されている異なる試料がそれぞれの化学的タグで標識される。任意の適当な化学的タグを使用することができる。タグは、フラグメンテーションの前に異なるタイプが同じ質量を有するように同重体でありうる。例えば、同重体タグは、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）または相対および絶対定量化のための同重体タグ（ｉＴＲＡＱ）であり得、これらは、２つの市販タイプの試薬であるが、諸実施形態はそのように限定されない。

行為６０４で、標識された前駆体イオンの少なくとも１種のタイプが単離される。これは、任意の適当な方法で行うことができ、ＭＳデバイスの細目に依存する。例えば、単離ウィンドウは、ＭＳデバイスのイオントラップを制御する波形発生器を使用して作製することができる。しかし、諸実施形態は、前駆体イオンを単離するいずれの特定の方法にも限定されない。

行為６０６で、ＭＳデバイスで単離された少なくとも１種の標識された前駆体イオンがフラグメント化される。これは、ＨＣＤなどの任意の適当な方法で実現されうる。フラグメンテーションは、各化学的タグの部分が標識イオンの残りから離脱するとき起こる。離脱する化学的タグの部分は、レポーターイオンとして公知である場合があり、理由は、これが先行技術に従って測定されるように設計された化学的タグの部分であるためである。

様々なタグからのレポーターイオンは、フラグメンテーションを介して生成される分子の第１のサブセットを形成する。レポーターイオンより大きな質量を有する最初の標識された分子の部分を代表する分子の第２のサブセットもフラグメンテーション行為によって生成される。分子の第２のサブセットは、各試料に由来する標識された分子に結合したままである化学的タグの部分、および分子自体、および潜在的に他のフラグメント化されていない、またはフラグメント化されたタグを含む。分子の第２のサブセットは、相補イオン、例えば、ＴＭＴタグの場合ではＴＭＴ^Ｃイオンでありうる。しかし、諸実施形態は、そのように限定されない。

行為６０８で、分子の第２のサブセットの各タイプのイオンの相対存在量が測定される。一部の実施形態では、この測定は、ＭＳ^２測定である。測定がどのように実施されるかの詳細は、使用されるＭＳデバイスのタイプに依存し、当技術分野で公知である。

行為６１０で、タグ付き分子の各タイプの相対存在量が決定される。行為６１０の一例示的実施形態は、図７Ａ〜Ｂおよび図８とともに以下に記載する。

標識試料の相対的存在量を決定する方法を、分析で使用される様々な相対強度を例示する図７Ａ〜Ｂ、および一実施形態による例示的な方法を例示する流れ図である図８に関して記載する。本明細書に記載の方法の実施形態は、タグのそれぞれのタイプについて上述の不純物行列を使用する。これらの不純物行列は、任意の適当な方法で得ることができる。例えば、これらは、化学的タグの製造者から提供されてもよい。代わりに、ＭＳデバイスのユーザーは、図３Ａ〜Ｂとともに上述したように、不純物行列を実験的に得ることができる。諸実施形態は、上述した不純物行列を使用することに限定されない。例えば、当業者は、不純物行列が化学的タグの詳細に応じて任意の数の行および列を有しうることを認識するはずである。さらに、行列形式で不純物情報を書くことが好都合であるが、分子を標識するのに使用される化学的タグ内の同位体変動を記述する不純物情報は、任意の適当な方法で表されうる。

本方法は、定量化される非標識分子の同位体エンベロープであって、各ｍ／ｚチャネルの相対的ポピュレーションを表す同位体エンベロープを決定することによって図８の行為８０２から始まる。このエンベロープは、ベクトルｐによって表される。ベクトルｐは、任意の適当な方法で決定されうる。一部の実施形態では、ベクトルｐは、分子の組成および自然における様々な同位体の天然存在量を詳述する情報に基づいて計算することができる。他の実施形態では、例えば、質量分析法を使用して分子の同位体エンベロープを実験的に決定することによってベクトルｐを決定することができる。代わりに、一部の実施形態では、分子のライブラリーのスペクトルエンベロープ情報を記憶するデータベースからスペクトルエンベロープを単に調べることができる。

図７Ａの最も左のグラフは、非標識分子の同位体エンベロープ、すなわち、ベクトルｐを例示する。ベクトル内の最初の位置、ｐ（０）は、モノアイソトピックピークの位置である。ベクトルｐ内の他の位置は、モノアイソトピックピークより１ダルトン重いピークに対応する。ベクトルｐは、１に正規化することができる。非標識分子の同位体エンベロープは、分子の原子構成、および原子の１つまたは複数が自然において存在する最も存在量の多い同位体以外の同位体になる確率に基づいて理論的に決定することができる。代わりに、非標識分子の同位体エンベロープのピークは、ＭＳを使用して実験的に測定することができる。

図８の行為８０４で、標識された分子の理論相対存在量を計算するのに使用されうる多重前駆体行列（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍａｔｒｉｘ）Ｐ_Ｍが、分子の非標識同位体エンベロープに基づいて決定される。多重前駆体行列は、使用されるタグのタイプのそれぞれについて個々の前駆体行列Ｐ_ＴＭＴを最初に決定することによって決定することができる。個々の前駆体行列Ｐ_ＴＭＴは、例えば、不純物行列（Ｉ_ＴＭＴ）、同位体不純物ベクトル（ｔ_ＴＭＴ）、分子に結合したＴＭＴタグの数（ｋ）、および非標識分子の同位体エンベロープ（ｐ）に基づいて決定されうる。ＴＭＴ＝１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１について、タグの各タイプの個々の前駆体行列は、

として決定することができ、式中、＊記号は、畳み込み操作を表し、

は、（ｋ−１）の畳み込み操作を実施することを示す。得られるＰ_ＴＭＴ行列は、Ｉ_ＴＭＴについて記載されるフラグメンテーション後のデルタ質量を示す行、および同位体エンベロープにおける位置を示す列を有する。本実施例では列ｐ（−１）〜ｐ（１０）が計算されているが、任意の適当な数の列を使用することができる。（疑似）−モノアイソトピックピークはやはり、ｐ（０）の位置を定義する。

次いで前駆体行列Ｐ_Ｍを、Ｐ_１２６．．．Ｐ_１３１行列の加重和を実施することによって、所与の混合比のｒ_ＴＭＴ（１に正規化することができる、ｒ_１２６：ｒ_１２７：ｒ_１２８：ｒ_１３０：ｒ_１３１として表現される）について決定することができる：

図７Ａの中央のグラフは、前駆体行列Ｐ_Ｍを視覚的に例示し、各ピークは、タグ付き試料の同位体エンベロープにおける位置（すなわち、前駆体行列の列）を表し、異なるフィルパターンは、フラグメンテーション後のタグのデルタ質量のそれぞれからの寄与（すなわち、前駆体行列の行）を表す。

実験データに最良に適合する相補イオンの相対存在量をもたらす混合比は、反復技法を使用して決定されうる。図８の行為８０５で、理論混合比を自由裁量で選択することができる。例えば、反復技法の出発点は、混合比１：１：１：１：１でありうる。

図８の行為８０６で、理論的な相補イオンクラスターにおけるイオンの相対存在量は、選択された混合比に基づいて決定され、ベクトル

によって表される。位置

は、疑似モノアイソトピックピーク

のＴＭＴ−１３１レポーターイオンの喪失から生じる位置として定義される。本実施例では、

は、式：

（式中、ｉ＋ｋ−５＝ｊ、ｋ＝−１．．．１４、ｉ＝１．．．６、ｊ＝−１．．．１０である）を使用して−１位〜１４位について計算され、これは、多重前駆体行列Ｐ_Ｍの対角要素（ｄｉａｇｏｎａｌｓ）を合計することに対応する。理論的な相補イオン内のイオンの一例示的相対存在量

は、図７Ａの最も左のグラフに例示されている。この例は、１：１：１：１：１のＴＭＴチャネル１２６：１２７：１２８：１３０：１３１について自由裁量で選択された混合比を使用し、これは、上記に論じたように、実験データに最良に適合する混合比を決定するための反復アルゴリズムの出発点でありうる。グラフは、前駆体イオンクラスターにおける質量減分の分布に基づくＴＭＴ^Ｃクラスターにおける予測された強度分布（様々なフィルパターンを有するバー）を観測値（破線のバー）に対して比較する。

行為８０８で、ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターについて理論的に計算されたベクトル

が観察されたイオンクラスターｃと比較される。この比較は、相似関数または差分関数を使用することができる。任意の適当な差分関数を使用することができる。例えば、コサイン距離（ｃｏｓｉｎｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ）関数またはユークリッド距離関数を使用して、２つのベクトル、ｃと

の間の差異を計算することができる。

一部の実施形態では、空の位置のノイズのフィッティングは、理論的に予測されるＴＭＴ^Ｃエンベロープ

内のどの位置が理論的な比

について全イオンクラスターの１％未満で占められているかを最初に計算することによって回避されうる。例えば、いくつかのペプチドについて、この要件は、モノアイソトピック位置

から

〜

について満たされている。

次いで

における比を、行為８０５に戻り、行為８０８での比較に基づいて異なる理論的な混合比を選択することによって変更することができる。理論的な混合比を反復し、洗練させて実験データをより良好に表すことによって、差分関数は、最小限にされる。例えば、

関数を、最小化がすべての

について操作：

を実施することによって実現されるように二次式の差分関数として定義することができ、式中、

であり、

および

である。イオンエンベロープの差分関数を最小限にする混合比率を決定することは、標準的な多変量最適化問題である。一部の実施形態では、最小化は、凸最適化の一事例であり、ＭＡＴＬＡＢのｆｍｉｎｃｏｎ関数などのローカルサーチソルバーで解くことができる。

諸実施形態は、混合比を決定するいずれの特定の方法にも限定されない。一部の実施形態では、理論エンベロープは、いくつかの混合比に基づいて見積もり、実験的測定値と比較することができる。このプロセスは、理論エンベロープを変更し、それを実験データと比較することによって反復することができる。このようにして、実験データに最良に適合する理論エンベロープを決定することができる。この最良の適合は、実験で使用される実際の混合比であると決定されるものである。一部の実施形態では、例えば、異なる制約、例えば、理論エンベロープのコンポーネントは実数値および非負値であるという要件などを分析ルーチンに設定してもよい。代替の制約は、同じタンパク質に由来するペプチドは、同じ混合比を共有することでありうる。

図７Ａの最も右のグラフは、１．０：３．５：１０：４．４：１．０のＴＭＴチャネル１２６：１２７：１２８：１３０：１３１についての比を有する観察されたＴＭＴ^Ｃクラスターエンベロープ（破線のバー）の、１：１：１：１：１のＴＭＴチャネル１２６：１２７：１２８：１３０：１３１についての自由裁量で選択された混合比に基づく理論エンベロープ（様々なフィルパターンを伴ったバーとして示されている）との比較を例示する。陰影付きのバーの高さは、測定結果とあまり一致しないことに留意されたい。しかし、上記最適化ルーチンが最適混合比を計算するのに使用される場合、観察されたおよび理論的ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターエンベロープは、図７Ｂの最も右のグラフに例示したように非常に密接に一致している。

図９Ａ〜Ｅは、複数の試料中の分子の相対存在量を定量化するのにＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを使用することのさらなる利点を例示する。ＭＳ^２スペクトル中の同位体エンベロープの位置は、標識されている分子のｍ／ｚに依存するので、１種を超える分子を単一実験で定量化することができる。標識された分子を定量化するのに区別不能なレポーターイオンを使用する先行技術は、単一実験で複数のタイプの分子を定量化することができず、理由は、標識された分子のそれぞれに由来するレポーターイオンが正確に同じｍ／ｚチャネル内で重複するためである。図９Ａは、２つの異なるペプチド（酵母由来のＹＴＴＬＧＫおよびヒト由来のＬＤＥＲＥＡＧＩＴＥＫ）が同じ５種の化学的タグで標識されている分析からのＭＳ^２スペクトルを例示する。図９Ｃは、依然としてインタクトであり、フラグメント化しなかった標識された前駆体イオンクラスターを例示する。２つの同位体エンベロープの位置は、共に十分すぐ近くにあり、その結果、単一単離ウィンドウを使用して２種の前駆体イオンを同時に単離することができる。この特定の例では、±３ｍ／ｚの単離ウィンドウを使用した。一部の実施形態では、２つの前駆体同位体エンベロープが互いに近くにない場合、異なる場所の前駆体の部分を単離するマルチノッチ単離ウィンドウを使用することができる。

図９Ｂは、レポーターイオンの位置に対応するＭＳ^２スペクトルの部分の拡大図を示す。どんな比率の各チャネルが酵母ペプチドイオンまたはヒトペプチドイオンのいずれかから生成されたかを見分けることができない５種のレポーターイオンチャネルがある。したがって、複数のペプチドの定量化は、レポーターイオンを使用して可能でない。

図９Ｄおよび９Ｅはそれぞれ、ヒトＴＭＴ^Ｃイオンクラスターおよび酵母ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターに対応するＭＳ^２スペクトルの部分の拡大図を例示する。各ＴＭＴチャネルからのＴＭＴ^Ｃイオンクラスターへの寄与は、異なるフィルパターンを使用して示されており、デコンボリューションによって決定される。デコンボリューションに基づいて得られた予測は、２プロテオーム試料中の酵母とヒトペプチドの実際の混合比（ｍｉｘｉｎｇ ｒａｔｉｏｎ）に近い。スペクトル中のＴＭＴ^Ｃイオン同士を区別する能力は、両ペプチドを、例えば、上記分析技法を使用して分析するのを可能にする。諸実施形態は、２分子を同時に定量化することに限定されない。分子のそれぞれの同位体エンベロープが区別可能である場合、任意の適当な数の分子を定量化することができる。

他の実施形態では、２種以上の前駆体を同時に慎重に単離、フラグメント化、および分析することができる。一部の実施形態では、複数の前駆体の慎重な共単離は、複数の前駆体イオンを同時に捕獲する非常に広い単離ウィンドウを使用することを包含し得る。他の実施形態では、各前駆体イオンは、別個のステップで、または複数の別個のノッチを伴った単離波形を用いて単離されうる。一部の実施形態では、すべての前駆体イオンが一緒にフラグメント化され、他の実施形態では、各前駆体イオンが個々に分析されうる。

本発明の実施形態は、任意の特定のタイプの化学的タグを使用することに限定されない。上記実施形態は、一例としてＴＭＴタグを使用して記載した。しかし、相対および絶対定量化のための同重体タグ（ｉＴＲＡＱ）または任意の他の適当なセットの化学的タグを使用してもよい。さらに、１ダルトン超によって質量が分離された化学的タグを使用することが有利でありうる。例えば、図１０Ａ〜Ｈは、上述したものと同様のシミュレーション実験についてのボックスプロットを例示する。図１０Ａは、５種の化学的タグがデータを定量化するのに使用されるときのボックスプロットを例示する一方、図１０Ｂ〜Ｇは、実験から１種または複数の化学的タグを取り除く結果を例示する。例えば、図１０Ｄは、得られる定量化の精度は、３種のタグのみが使用されるときにより高く、タグのそれぞれは、１ダルトン質量差ではなく２ダルトン質量差によって分離されていることを示す。同様に、図１０Ｆは、２種の化学的タグ間の４ダルトン質量差を有する２種の該化学的タグのみを使用して生じる精度の増大を示す。さらに、図１０Ｈは、図１０Ａ〜Ｇに例示した異なるタグ構成についてのＴＭＴ^Ｃクラスターにおけるイオンの中央値偏差と数との間の関係を例示する。予期されるはずであるように、すべての実験でイオンの数が増加するにつれて精度は改善するが、２Ｄａ質量間隔によって分離された３チャネルを使用する実験で実現されるものと同様の精度を得るのに、およそ１０倍多くのイオンが５重試料（５−ｐｌｅｘ ｓａｍｐｌｅ）に必要とされる。したがって、一部の実施形態では、１ダルトンより大きい質量差を有する化学的タグを使用することが有利でありうる。

本発明の実施形態は、単一のスキャンのみを使用して各前駆体を調べることに限定されない。ある特定の実施形態では、各前駆体を、２回以上のスキャンを使用して調べることができる。例えば、一対のスキャンを利用する実施形態では、第１のスキャンを使用して所与の前駆体のＴＭＴ^Ｃ生成効率を迅速に決定することができる。この最初のサーベイスキャンに基づいて、後続の繰り返し分析を、適当な定量化のために十分なＴＭＴ^Ｃシグナルを生成するように適合させることができる。一部の実施形態では、第２のスキャンは、任意の適当な手段においてサーベイスキャンと異なりうる。例えば、前駆体集団を蓄積するのに使用される注入時間を変更することができる。他の実施形態では、第２のスキャンは、使用されるフラグメンテーション方法（例えば、ＨＣＤ対ＣＩＤ）、フラグメンテーションエネルギー（低対高正規化衝突エネルギー）などが異なりうる。一部の実施形態では、サーベイキャンのスキャン範囲は、サーベイスキャン分析時間を短時間に保つ目的で、小さく保たれる（ＴＭＴ^Ｃイオンを包含するだけ）。

本発明の他の実施形態では、各前駆体は、一対のスキャンを使用して調べられ、第１のスキャンは、前駆体イオンを同定する目的で収集され、第２のスキャンは、各試料の前駆体集団への相対的な寄与を決定する目的で収集される。このようにして、２つのスキャンは、これらの特定の目的のために最適化される。したがって、フラグメンテーション方法、分析方法、スキャン速度などは、２つのスキャン間で異なりうる。

図１１は、本発明の実施形態が実行されうる適当なコンピューティングシステム環境１１００の例を例示する。本発明の実施形態、例えば、図６および図８に記載の方法は、コンピューティングシステム環境１１００で部分的または完全に実行することができる。例えば、このようなコンピューティングシステム環境は、図６および図８の行為の一部またはすべての実施、ならびにまた理論ベクトル

を観察ベクトルｃに一致させる計算で使用される質量分析計を制御するソフトウェアを実行することができる。

コンピューティングシステム環境１１００は、適当なコンピューティング環境の単に一例であり、本発明の使用または機能性の範囲に関していかなる限定事項も示唆するように意図されていない。コンピューティング環境１１００は、例示的な動作環境１１００に例示したコンポーネントのいずれか１つまたは組合せに関していかなる依存性や要件を有すると決して解釈されるべきでない。

本発明は、多数の他の汎用または特殊目的コンピューティングシステム環境または構成で動作可能である。本発明で使用するのに適し得る周知のコンピューティングシステム、環境、および／または構成の例としては、それだけに限らないが、パーソナルコンピューター、サーバーコンピューター、携帯用またはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースシステム、セットトップボックス、プログラム可能消費者向け電子機器、ネットワークＰＣ、ミニコンピューター、メインフレームコンピューター、上記システムまたはデバイスのいずれかを含む分散コンピューティング環境などが挙げられる。

コンピューティング環境は、プログラムモジュールなどのコンピューター実行可能命令を実行することができる。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを実施し、または特定の抽象データ型を実行するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。本発明は、タスクが通信ネットワークによってリンクされたリモート処理デバイスによって実施される分散コンピューティング環境でも実行されうる。分散コンピューティング環境では、プログラムモジュールは、メモリー記憶デバイスを含めたローカルおよびリモートコンピューター記憶媒体の両方に設置されうる。

図１１を参照すると、本発明の実施形態を実行するための例示的なシステムは、コンピューター１１１０の形態での汎用コンピューティングデバイスを含む。コンピューター１１１０のコンポーネントとしては、それだけに限らないが、プロセシングユニット１１２０、システムメモリー１１３０、およびシステムメモリーを含めた様々なシステムコンポーネントをプロセシングユニット１１２０にカップリングするシステムバス１１２１を挙げることができる。システムバス１１２１は、メモリーバスまたはメモリーコントローラー、周辺機器用バス（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｕｓ）、および様々なバスアーキテクチャのいずれかを使用するローカルバスを含めた、バス構造のいくつかのタイプのいずれかでありうる。例として、かつ限定ではなく、このようなアーキテクチャとしては、業界標準アーキテクチャ（ＩＳＡ：Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）バス、マイクロチャネルアーキテクチャ（ＭＣＡ：Ｍｉｃｒｏ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）バス、エンハンストＩＳＡ（ＥＩＳＡ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＩＳＡ）バス、ビデオエレクトロニクススタンダーズアソシエーション（ＶＥＳＡ：Ｖｉｄｅｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）ローカルバス、およびメザニンバスとしても公知のペリフェラルコンポーネントインターコネクト（ＰＣＩ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔ）バスが挙げられる。

コンピューター１１１０は一般に、様々なコンピューター可読媒体を含む。コンピューター可読媒体は、コンピューター１１１０がアクセスすることができる任意の利用可能な媒体であり得、揮発性および不揮発性媒体、リムーバブルおよび非リムーバブル媒体の両方を含む。例として、かつ限定ではなく、コンピューター可読媒体は、コンピューター記憶媒体および通信媒体を含みうる。コンピューター記憶媒体としては、情報を記憶するための任意の方法または技術、例えば、コンピューター可読命令、データ構造、プログラムモジュール、または他のデータで実行される揮発性および不揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブル媒体の両方が挙げられる。コンピューター記憶媒体としては、それだけに限らないが、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリー、もしくは他のメモリー技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、もしくは他の光ディスクストレージ、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶デバイスもしくは他の磁気記憶デバイス、または所望の情報を記憶するのに使用することができ、コンピューター１１１０がアクセスすることができる任意の他の媒体が挙げられる。通信媒体は一般に、コンピューター可読命令、データ構造、プログラムモジュール、または変調データ信号、例えば、搬送波もしくは他の輸送機構での他のデータを具現化し、任意の情報送達媒体を含む。用語「変調データ信号」は、信号での情報をコード化する様式で設定または変更されたその特性の１つもしくは複数を有する信号を意味する。例としてかつ限定ではなく、通信媒体としては、有線媒体、例えば、有線ネットワークまたは直接有線接続、ならびに無線媒体、例えば、音響、ＲＦ、赤外線、および他の無線媒体が挙げられる。上記のいずれかの組合せも、コンピューター可読媒体の範囲内に含められるべきである。

システムメモリー１１３０には、揮発性および／または不揮発性メモリー、例えば、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）１１３１およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１１３２の形態でのコンピューター記憶媒体が含まれる。起動中などにコンピューター１１１０内のエレメント間で情報を転送するのに役立つ基本ルーチンを含有する基本入出力システム１１３３（ＢＩＯＳ）は、一般にＲＯＭ １１３１内に記憶される。ＲＡＭ １１３２は一般に、プロセシングユニット１１２０に直ちにアクセス可能な、かつ／またはそれによって現在運転されているデータおよび／またはプログラムモジュールを含有する。例として、かつ限定ではなく、図１１は、オペレーティングシステム１１３４、アプリケーションプログラム１１３５、他のプログラムモジュール１１３６、およびプログラムデータ１１３７を例示する。

コンピューター１１１０は、他のリムーバブル／非リムーバブル、揮発性／不揮発性コンピューター記憶媒体も含みうる。単なる例として、図１１は、非リムーバブル、不揮発性磁気媒体から読み取り、またはそれに書き込むハードディスクドライブ１１４１、リムーバブル、不揮発性磁気ディスク１１５２から読み取り、またはそれに書き込む磁気ディスクドライブ１１５１、およびリムーバブル、不揮発性光ディスク１１５６、例えば、ＣＤ ＲＯＭまたは他の光媒体から読み取り、またはそれに書き込む光ディスクドライブ１１５５を例示する。例示的な動作環境で使用されうる他のリムーバブル／非リムーバブル、揮発性／不揮発性コンピューター記憶媒体としては、それだけに限らないが、磁気テープカセット、フラッシュメモリーカード、デジタル多用途ディスク、デジタルビデオテープ、ソリッドステートＲＡＭ、ソリッドステートＲＯＭなどが挙げられる。ハードディスクドライブ１１４１は一般に、インターフェース１１４０などの非リムーバブルメモリインターフェースによってシステムバス１１２１に接続されており、磁気ディスクドライブ１１５１および光ディスクドライブ１１５５は一般に、インターフェース１１５０などのリムーバブルメモリインターフェースによってシステムバス１１２１に接続されている。

上記に論じ、図１１に例示したドライブおよびこれらの関連したコンピューター記憶媒体は、コンピューター１１１０のためのコンピューター可読命令、データ構造、プログラムモジュール、および他のデータを記憶する。図１１では、例えば、ハードディスクドライブ１１４１は、オペレーティングシステム１１４４、アプリケーションプログラム１１４５、他のプログラムモジュール１１４６、およびプログラムデータ１１４７を記憶するとして例示されている。これらのコンポーネントは、オペレーティングシステム１１３４、アプリケーションプログラム１１３５、他のプログラムモジュール１１３６、およびプログラムデータ１１３７と同じであっても、異なっていてもよいことに留意されたい。オペレーティングシステム１１４４、アプリケーションプログラム１１４５、他のプログラムモジュール１１４６、およびプログラムデータ１１４７は、最低でもこれらが異なるコピーであることを例示するようにここでは異なる番号が与えられている。ユーザーは、入力デバイス、例えば、キーボード１１６２、および一般にマウス、トラックボール、またはタッチパッドと呼ばれるポインティングデバイス１１６１によってコンピューター１１１０にコマンドおよび情報を入力することができる。他の入力デバイス（図示せず）として、マイクロフォン、ジョイスティック、ゲームパッド、サテライトディッシュ、スキャナーなどを挙げることができる。これらおよび他の入力デバイスは、システムバスにカップリングされたユーザー入力インターフェース１１６０によってプロセシングユニット１１２０に接続されていることが多いが、他のインターフェースおよびバス構造、例えば、パラレルポート、ゲームポート、またはユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）によって接続されていてもよい。モニター１１９１または他のタイプの表示デバイスも、ビデオインターフェース１１９０などのインターフェースを介してシステムバス１１２１に接続されている。モニターに加えて、コンピューターは、他の周辺出力デバイス、例えば、スピーカー１１９７およびプリンター１１９６も含むことができ、これらは、出力周辺インターフェース１１９５によって接続されうる。

コンピューター１１１０は、リモートコンピューター１１８０などの１つまたは複数のリモートコンピューターに論理結合を使用してネットワーク化された環境内で稼働しうる。リモートコンピューター１１８０は、パーソナルコンピューター、サーバー、ルーター、ネットワークＰＣ、ピアデバイス、または他の一般的なネットワークノードであり得、一般にコンピューター１１１０に関連して上述したエレメントの多くまたはすべてを含むが、メモリー記憶デバイス１１８１のみが図１１に例示されている。図１１に表した論理結合は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）１１７１および広域ネットワーク（ＷＡＮ）１１７３を含むが、他のネットワークも含みうる。このようなネットワーキング環境は、オフィス、エンタープライズワイドコンピューターネットワーク、イントラネット、およびインターネットに普及している。

ＬＡＮネットワーキング環境で使用される場合、コンピューター１１１０は、ネットワークインターフェースまたはアダプター１１７０によってＬＡＮ １１７１に接続されている。ＷＡＮネットワーキング環境で使用される場合、コンピューター１１１０は一般に、インターネットなどのＷＡＮ １１７３に対して通信を確立するためのモデム１１７２または他の手段を含む。モデム１１７２は、内蔵であっても外付けであってもよく、ユーザー入力インターフェース１１６０または他の適切な機構を介してシステムバス１１２１に接続されうる。ネットワーク化された環境では、コンピューター１１１０に関連して表されたプログラムモジュール、またはその部分は、リモートメモリー記憶デバイスに記憶されうる。例として、かつ限定ではなく、図１１は、メモリーデバイス１１８１に存在しているリモートアプリケーションプログラム１１８５を例示する。示したネットワーク接続は、例示的であり、コンピューター間の通信リンクを確立する他の手段も使用されうることが十分に理解されるであろう。

図１２は、本発明の実施形態の諸態様を実施することができる質量分析法装置１２００のブロック図を例示する。装置１２００自体も本発明の諸態様を具現化しうる。装置１２００は、本発明の使用または機能性の範囲に関していずれの限定事項も示唆するように意図されていない。また装置１２００は、例示的な装置１２００に例示したコンポーネントのいずれか１つまたは組合せに関していかなる依存性や要件も有するとは解釈されるべきではない。

装置１２００は、ハードウェア、ソフトウェア、またはハードウェアとソフトウェアの組合せから構成されうるコントローラー１２０２を備えうる。一部の実施形態では、コントローラー１２０２は、イオンを単離するのに使用される１つまたは複数のノッチの中心および幅を決定する。例えば、コントローラー１２０２は、図６および図８に表された行為の少なくともいくつかを実施しうる。装置１２００は、単一のコントローラーに限定されない。

装置１２００は、イオントラップ１２０４および単離波形発生器１２０６を備えうる。コントローラー１２０２は、イオントラップ１２０４および／または単離波形発生器１２０６にカップリングされて通信を可能にすることができる。任意の適当な形態のカップリングを使用することができる。例えば、コンポーネントは、システムバスを介してカップリングされうる。代わりに、装置１２００のコンポーネントは、イーサネット（登録商標）ネットワークなどの通信ネットワークを介してカップリングされうる。本発明の実施形態は、いずれの特定のタイプのカップリングにも限定されない。

イオントラップ１２０４は、質量分析法で使用するのに適した任意のイオントラップでありうる。例えば、イオントラップ１２０４は、四重極イオントラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）ＭＳ、またはＯｒｂｉｔｒａｐ ＭＳでありうる。

単離波形発生器１２０６は、フラグメンテーションの前にイオントラップ１２０４内で前駆体イオンを単離するのに使用される単離波形を生成するための任意の適当なデバイスでありうる。例えば、単離波形発生器１２０６は、無線周波数（ＲＦ）信号発生器でありうる。

本発明者らは、多重定量化に関して、同重体定量化のために相補イオンクラスターを使用すると、低質量レポーターイオンが使用されるとき干渉イオンによって引き起こされる問題を克服することができることを認識および十分に理解した。

したがって、本発明の態様は、相補イオンクラスターを使用して１種または複数の標識された分子の相対存在量を決定する方法として具現化されうる。一部の態様は、相補イオンクラスターを使用して１種または複数の標識された分子の相対存在量を決定することができるＭＳ装置として具現化されうる。一部の実施形態は、実行されるとき、相補イオンクラスターを使用して１種または複数の標識された分子の相対存在量を決定するための方法を実施する命令でコード化された少なくとも１つのコンピューター可読媒体として実行されうる。方法は、それだけに限らないが、図６および図８に記載の方法でありうる。

本発明は、いずれかの特定の数の化学的タグまたは化学的タグのタイプを使用することに限定されない。さらに、本発明は、前駆体イオンをフラグメント化してＭＳ^２スペクトルを生成するのに使用される技法によって限定されないことが理解されるべきである。さらに、本発明は、フラグメンテーションの前に前駆体イオンを単離するのに使用される技法によって限定されないことが十分に理解されるべきである。

上記技法の具体例
本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様をこうして記載して、以下は、一部の実施形態で記載した技法の具体例である。

緒言
質量分析法（ＭＳ）ベースプロテオミクスは、過去数年にわたって注目すべき改善が行われ、単一実験で哺乳動物試料からの１０，０００超のタンパク質の同定を今日ではもたらしている。タンパク質同定は、現在では成熟しているが、複数の条件の中での正確な定量化は、いまだ課題である。予測不可能なイオン化効率により、ハイスループット実験におけるタンパク質存在量の絶対定量化が現在妨げられている。この制限を回避するために、異なる条件に由来するペプチドを、これらの化学構造は同一であるが、これらの同位体組成が異なるように同位体標識することができる方法が開発された。ＭＳによって分析されるとき、タンパク質存在量の相対的変化は、調査される異なる条件にとってユニークであるイオンの相対存在量から推測することができる。

最も一般には、ペプチドは、差次的に標識された種の相対存在量に基づいてＭＳ^１スペクトルから定量化される。一例は、代謝標識である。代わりに、異なる実験条件から得られたタンパク質に由来するペプチドを化学修飾して安定同位体を組み込み、定量化することができる。これらのＭＳ^１ベース定量化法の主要な不利点は、ＭＳ^１スペクトルの複雑性が異なって修飾されるペプチドの数とともに増大し、その結果、データ取得速度および感度が冗長なＭＳ^２収集に起因して低減されることである。ＭＳ^１ベース定量化を用いた多重プロテオミクスは実現可能であり、例えば、Ｌｙｓ−Ｃ消化ペプチドに対して還元的ジメチル化すると、５つの区別可能な種の生成が可能になるが、同定および定量化され得るタンパク質の数は、スペクトルの複雑性の増大に起因して低減される。したがって、ＭＳ^１ベース定量化を使用する複合混合物の深いカバレッジは現在、２または最大で３条件についてのみ使用されている。したがって、カバレッジの深さを犠牲にすることなく単一実験で多数の試料を比較する実用的手段の大きな必要性がある。

ＴＭＴまたはｉＴＲＡＱなどの同重体タグは、深いカバレッジを伴ったこのような定量的多重プロテオミクスを期待させた。これらのタグで標識されたペプチドは、ＭＳ^１スペクトルで区別不能な質量を有し、したがってスペクトルの複雑性を増大させないが、フラグメンテーション後、多重試料の各コンポーネントは、低ｍ／ｚ領域でユニークな質量を有するレポーターイオンを生成し、これを相対定量化に使用することができる。現在、最大８チャネルが商業化されている^７。同重体標識は、従来のＭＳ^１ベース定量化と組み合わせて多重化容量を増大させることができる。１８重（１８−ｐｌｅｘ）実験が実証された。

同重体標識の深刻な欠点がある。複合混合物を分析するとき、フラグメンテーションのために選択されたペプチドは一般に、より低い存在量の共溶出イオンが夾雑している。したがってレポーターイオンは、標的イオンおよび干渉イオンの両方に由来し、それは、定量化のゆがみを引き起こす。この問題を克服するために２つのストラテジーが導入された。Ｔｉｎｇらは、ＭＳ^２スペクトルで最も存在量の多いイオンを再単離し、それを再フラグメント化した。ＭＳ^３スペクトルで得られるレポーターイオンは、その時標的ペプチドにほとんどもっぱら由来した。代わりに、Ｗｅｎｇｅｒらは、フラグメンテーションの前にプロトン移動イオン−イオン反応（ＰＴＲ：ｐｒｏｔｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｏｎ−ｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を使用して前駆体ペプチドの荷電状態を低減し、それによって異なる荷電状態を有する干渉イオンを除去した。両方法は、定量化の正確さおよび精度を大幅に改善するが、これらは、データ取得速度および感度の減少という代償を払う。

ここで、本発明者らは、正確な同重体定量化のための代替手法を導入する。これは、追加の精製ステップを必要としないが、むしろＯｒｂｉｔｒａｐ、ＦＴ−ＩＲ、およびＴＯＦ計測器を含めた最新の質量分析計の高い質量正確さおよび分解能を活用する。ＭＳ^２スペクトルの低ｍ／ｚ領域内のレポーターイオン（ＴＭＴレポーターイオン）を使用する代替として、本発明者らはＴＭＴタグの部分的な喪失に由来する相補体ＴＭＴフラグメントイオンクラスター（ＴＭＴ^Ｃクラスター）に基づいて試料差異を定量化する（図２Ａ〜Ｃ、図４）。ＴＭＴ^Ｃクラスターは、低質量レポーターイオンとして異なって標識されたペプチドの相対的レベルについて等価な定量的情報を担持し、本質的にこれらの相補体である。ＴＭＴ^Ｃクラスターの位置は、荷電状態特異的であり、最新の計測器の質量正確さは、ＴＭＴ^Ｃクラスターを正確に定量化するのに十分である０．０２ｍ／ｚ未満異なるフラグメントイオンを容易に区別することができる。既知であるが異なる混合比を有するＴＭＴ標識酵母ペプチドおよびヒトペプチドの混合物を分析することによって、本発明者らは、本方法が干渉ペプチドイオンによって影響されていない正確な定量的データを生成することを示す。最後に、本発明者らは、本方法が、同じＭＳ^２スペクトル内の複数の別個のペプチドを、これらが共フラグメント化される場合、定量化することができることを実証する。これは、同重体標識ペプチドの定量化を並列処理する将来の可能性を広げ、多重プロテオミクス実験で定量化されるペプチドの数を潜在的に増やす。

結果および考察
相補体ＴＭＴイオンクラスター
６種の異なるＴＭＴチャネルのいずれか１つで標識されたペプチドは、ＭＳ^１スペクトルで区別不能であるが、これらの低ｍ／ｚレポーターイオン（レポーターイオン）に基づいてフラグメント化すると定量化することができる。ＴＭＴ標識ペプチドからのＭＳ^２スペクトルをより詳しく検査すると、本発明者らは、本発明者らがＴＭＴタグ内の一結合においてもっぱらフラグメント化されたペプチドイオンに割り当てた別のイオンクラスターを観察した（図４、５Ｂ）。これらのイオンは、ＴＭＴ標識のカルボニル炭素と二級アミンとの間の結合の切断によって生成される（図２Ａ）。脱離基は一般に一電荷を取得し、したがってＴＭＴ^Ｃプロダクトイオンは、前駆体より１つ少ない電荷を有する。本発明者らは、これらのフラグメントイオンを相補体ＴＭＴ（ＴＭＴ^Ｃ）イオンと呼んだ。

ＴＭＴ^Ｃイオンは、質量収支基のほとんどを担持し、したがって標識ペプチドの相対的差異についての情報を含有する。標識されたカルボニル炭素は、脱離基の一部であるので、ＴＭＴ^Ｃ−１３０イオンとＴＭＴ^Ｃ−１２９イオンは、本発明者らの分析では区別不能である（図２Ａ）。これらの相補イオンクラスターは、これらの関連する低質量レポーターイオンより複雑であり、理由は、それぞれも標識ペプチドの同位体エンベロープを反映するためである。したがって、隣接するＴＭＴチャネルのＴＭＴ^Ｃイオンクラスターは、重複する。相対的なペプチドレベル比を得るために、本発明者らは、前駆体ペプチドイオンの同位体エンベロープでＴＭＴ^Ｃイオンクラスターを本質的にデコンボリューションしなければならない（図４）。低ｍ／ｚレポーターイオンの定量的情報が容易に入手可能であるとき、定量化のためにＴＭＴ^Ｃクラスターを使用するのは反直観的のようであるが、ＴＭＴ^Ｃイオンは、スペクトル内のこれらのユニークな場所がタグ付きペプチドの厳密な質量および電荷に依存するという原理的利点を有する（図４）。対照的に、標的ペプチドおよび任意の共単離ペプチドの両方からの小ＴＭＴレポーターイオンは、区別不能である。したがって本発明者らは、ペプチド特異的ＴＭＴ^Ｃクラスターは、共溶出ペプチドからの干渉を無視できる状態で、追加の気相精製ステップの必要性を回避して、ＭＳ^２レベルでの定量化を可能にするはずであると論断した。

著しい干渉を伴ったＭＳ^２スペクトル内のＴＭＴ^Ｃクラスターのデコンボリューション
ＴＭＴ^Ｃクラスターを使用する定量化の正確さを評価するために、特に、干渉に対するその感度を試験するために、本発明者らは、本発明者らが共溶出ペプチドの干渉を同定および定量化することができる既知の混合比の試料を作製した。本発明者らは、それぞれチャネル１２６、１２７、１２８、１３０、および１３１内で、ＴＭＴで標識された１μｇ：４μｇ：１０μｇ：４μｇ：１μｇのＬｙｓ−Ｃ消化酵母ペプチドを組み合わせた。干渉をシミュレートするために、本発明者らは、それぞれＴＭＴ−１２６およびＴＭＴ−１２７で標識された１０μｇ：１０μｇのヒトＬｙｓ−Ｃ消化ペプチドの混合物を添加した（図５Ａ）。ＴＭＴ^Ｃ−１２９イオンおよびＴＭＴ^Ｃ−１３０イオンは区別不能であるので、本発明者らはＴＭＴ−１２９チャネルを省略した（図２Ａ）。本発明者らが従来のＴＭＴレポーターイオンを使用して干渉試料を分析したとき、本発明者らは、酵母だけに限定されているペプチドは、無干渉チャネル（１２８、１３０、および１３１）内で正確に定量化されたが、ヒト干渉を有するチャネル（１２６および１２７）内の相対存在量は、ヒト起源の夾雑レポーターイオンに起因して重くゆがめられることを見出した（図５Ｄ）。混合比が未知である現実の生体試料では、本発明者らは、レポーターイオンのどの画分が対象のペプチドに由来し、どの画分が干渉共溶出ペプチドに由来するかを区別することができないはずである。

図５Ｃに示したＭＳ^２スペクトルは、±２ｍ／ｚの単離幅、９０分の勾配、および２００ｍ／ｚで３５ｋの名目上の分解能を用いたＱＥｘａｃｔｉｖｅで分析した実験からのものである。このスペクトルは、酵母ペプチドＡＩＥＬＦＴＫを同定する。先行するＭＳ^１スペクトルでは、前駆体の同位体エンベロープは、褐色でマークされている。多くの他のピークもＭＳ^２分析の単離幅内で明らかである（図５Ｃ）。ＴＭＴレポーターイオンは、ＭＳ^２スペクトルの低ｍ／ｚ領域内に位置している。強度情報はピーク面積に由来するので、図５Ｄ中のスペクトルのピーク高さと推定相対存在量は完全には照応せず、本発明者らは、同位体不純物を補償するために供給業者によって提供された補正係数を適用する。ＴＭＴ^Ｃクラスターは、スペクトルの高ｍ／ｚ領域内に位置する（図５Ｂ、Ｅ）。この例では、前駆体イオンは、２電荷を担持する一方、ＴＭＴ^Ｃイオンは単一荷電している。レポーターイオンと異なり、このイオンクラスターの位置は、前駆体の厳密な質量および荷電状態に依存する。本発明者らは、ＴＭＴ−１３１標識疑似モノアイソトピック前駆体に由来するＴＭＴ^Ｃイオンのピークをｃ（０）位と定義し、この位置に対してすべての他のピークをラベル表示する。いくつかのスペクトルでは、共単離ペプチドのＴＭＴ^Ｃクラスターが容易に観察可能であるが（例えば、図９Ａ〜Ｅを参照）、多くの場合これは当てはまらない。本発明者らは、これは、おそらく多くの場合異なる荷電状態を伴った多くの異なる低存在量のペプチドに由来し、スペクトル全体にわたって非常に低存在量で高度に分散したＴＭＴ^Ｃイオンをもたらしている干渉に起因すると考えている。本発明者らは、Ｃｏｏｎ ｌａｂで実施されたＰＴＲ実験が、前駆体ペプチド単独の荷電状態を有するイオンの単離は、ほとんどの干渉を除去するのに十分であることを実証したことに留意する。

ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターから元の混合比を推定することは、低ｍ／ｚレポーターイオンからそれを導出することより複雑である。ＴＭＴタグの質量収支部分は、レポーターイオンと同様に相対的な定量的情報を本質的にコード化する一方、この情報は、標識ペプチドの同位体エンベロープでコンボリューションされている。元の混合比を推定するために、したがって本発明者らは本質的に、前駆体ペプチドの同位体エンベロープでＴＭＴ^Ｃクラスターをデコンボリューションしなければならない。またＴＭＴタグに由来する同位体不純物が考慮される必要がある（本発明者らの計算の詳細な説明については、材料および方法（以下）ならびに図３Ａ〜Ｂおよび７Ａ〜Ｂを参照）。図５中のＴＭＴ^Ｃ定量化は、１．０：３．５：１０：４．４：１．０の相対比を報告し、これは、既知の混合比に近い、干渉を伴った、および伴わないチャネルについての同様の比を示す（図５Ｅ）。対照的に、レポーターイオン比は、干渉を伴ったチャネル内に強い比のゆがみを伴って５．３：７．９：１０：４．４：１．０と報告されている（図５Ｄと比較されたい）。

完全な実験でのＴＭＴ^Ｃ定量化の評価
完全な実験にわたるＴＭＴ^Ｃ定量化（試料が図５Ａ〜Ｅのものである）を図１４に示す。方法を評価するために、相対的な酵母ペプチドＴＭＴチャネル強度を、ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターをデコンボリューションすることによって計算し、干渉を伴った、および伴わない１：１０および４：１０のチャネルについての絶対偏差の中央値を、本発明者らがＴＭＴ^Ｃクラスター内で観察することができたイオンの数に対してプロットした（図１３Ａ）。測定をヒトペプチドによる干渉の非存在下およびこの干渉の影響下で行った。さらなる分析のために、本発明者らは、自信のある定量化のカットオフポイントである、ＴＭＴ^Ｃクラスターにおける１０００イオン未満のペプチドを除外した。品質の追加の尺度として、本発明者らは、観察されたＴＭＴ^Ｃクラスターがいかに良く理論分布にフィットするかを評価した（図１３Ｂ）。予測されたＴＭＴ^Ｃイオンクラスターと観察されたＴＭＴ^Ｃイオンクラスターとの間の二乗差の合計（Ｄｉｆｆ）を第２のフィルター基準として使用した。測定されたＴＭＴチャネル比と予測されたＴＭＴチャネル比との間で０．０２未満のコサイン距離を有するペプチドを、十分に定量化されたペプチドとして定義した。グラフは、十分に定量化されたペプチドおよび他のペプチドを、ＴＭＴ^Ｃクラスターにおけるイオンのこれらの合計および観察されたＴＭＴ^Ｃクラスターと計算されたＴＭＴ^Ｃクラスターとの間の二乗差の合計について示す。図１３Ｃは、フィルター基準（ｆｉｌｅｒ ｃｒｉｔｅｒｉａ）（Ｄｉｆｆ＝０．００１７）を満たさなかったペプチドの予測および観察されたＴＭＴ^Ｃクラスターを表し、図１３Ｄは、フィルター基準（Ｄｉｆｆ＝０．００２）を確かに満たしたペプチドの予測および観察されたＴＭＴ^Ｃクラスターを表す。図１４Ａは、２０に正規化された比を有するフィルタリングされた酵母ペプチドのボックスプロットを示す。ウィスカーは、５〜９５パーセンタイルに到達する。図１４Ｂは、図１４Ａに示した比についての対応する頻度分布を表す。干渉は、系統的な誤差を引き起こさないが、干渉イオンを伴ったチャネルの比の分布は、干渉を伴わないチャネルのものより広い。また、図１４Ａで分かるように、１２６チャネルおよび１２７チャネルは、１３０チャネルおよび１３１チャネルより広い比の分布を示すが、干渉を伴った、および伴わない等価なチャネルの中央値は、注目すべきことに同様であり、既知の混合比に非常に近い。異常値は、干渉を伴った、および伴わないチャネルの中で事実上同様に分布しているようである。本発明者らは、以下の干渉を伴ったチャネルのより広い分布に対処する。総合すると、ボックスプロットおよびヒストグラムは、ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターをデコンボリューションすると、異なる混合比を有する共溶出ヒトペプチドにもかかわらず、ＭＳ^２スペクトル内の同重体標識ペプチドが忠実に定量化されることを実証する。

本発明者らはまた、慣例的なＭＳ^２レポーターイオン法および無干渉ＭＳ^３法の両方でＴＭＴ^Ｃ定量化の性能を比較した。本発明者らは、ＱＥｘａｃｔｉｖｅで、ＴＭＴ^Ｃイオンおよびレポーターイオンについて干渉を伴った１：１０および４：１０の比（１２６／１２８および１２７／１２８）の酵母を定量化し（上述したのと同じ実験）、ＭＳ^３法および同等の溶出勾配を用いてＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅで分析した同じ試料とそれを比較した。ＭＳ^２レポーターイオンによって得られた比は、強くゆがめられた（図１４Ｃ、Ｄ）。対照的に、干渉を有する１：１０および４：１０の比についてＴＭＴ^Ｃで導出した中央値は、干渉に起因するゆがみが無視できる状態で既知の混合比の近くに集中した。同じことがＭＳ^３法で得られた比についても当てはまった。この例では、本発明者らは、ＭＳ^３法と比較してＴＭＴ^Ｃ手法で約３０％多いペプチドを定量化したが（以下の表１を参照）、比の分布は、特に４：１０比についてＴＭＴ^Ｃでとりわけ、より広い（図１４Ｄ）。

ＴＭＴ^Ｃ定量化の精度の理論的限界を評価するために、本発明者らは、干渉および他の測定誤差を無視してモンテカルロ計算で観察されるイオンの数についての実験的なサンプリングエラーをシミュレートした。シミュレートおよび測定された比の得られた中央値絶対偏差は、注目すべきことに同様であった（図１３Ａ、Ｅ）。図１３Ａは、実際の実験から測定された比の中央値絶対偏差を表し、一方、図１３Ｅは、アミノ酸配列、ならびに図１３Ａおよび図１３Ｄの実験で観察されたイオンの数に基づく既知の混合比を用いてモンテカルロでシミュレートした酵母ペプチドについてのデータを表す。シミュレーション実験は、極端な異常値が無かった（図１３Ｆ、これは、図１３Ｂに記載したようにプロットされたモンテカルロ結果を示す）。図１４Ｅは、モンテカルロでシミュレートした酵母ペプチドの比のボックスプロットである。ＴＭＴ^Ｃエンベロープを、既知の混合比に基づいてシミュレートした。興味深いことに、シミュレーション実験のボックスプロットおよびヒストグラムは、１３０チャネルおよび１３１チャネルと比較して１２６チャネルおよび１２７チャネルのより広い分布を示した（図１４Ｅ、Ｆ）。本発明者らは最初、本発明者らが実際の実験でも観察したこの広幅化を干渉に起因するとした。しかし、シミュレーションは、干渉が無い。したがって本発明者らは、より低いＴＭＴチャネル内のより広い分布は、ＴＭＴ^Ｃクラスター内に

イオンが埋もれていることに起因する可能性があると結論付ける（図５Ｅ）。結果として、計測誤差は、蓄積するようであり、測定の精度は減少する。全体的に、シミュレーションデータは、極端な異常値を除いて現実の実験と非常に同様であり、本方法が理論的限界に近接していることを示唆した。

ＴＭＴ^Ｃ法の精度の改善
本発明者らは、実際の実験とモンテカルロシミュレーションとの間の明らかな照応を利用し（図１４Ａ、Ｂ、図１４Ｅ、Ｆ）、ＴＭＴ^Ｃ定量化の精度がＴＭＴチャネル間のより大きい質量分離によって改善されうるかを試験した。この目的を達成するために、本発明者らは、アミノ酸配列および図１４Ａ、Ｂに記載の実験で観察されたイオンの数に基づいて１０：１０：１０：１０：１０の比をシミュレートした。次いで本発明者らは、実際の実験のために本発明者らが使用した同じ方法によって、シミュレートされたＴＭＴ^Ｃクラスターを分析した。図１０Ａは、得られた比のボックスプロットを示す。中間チャネル（１２７〜１３０）の精度は、縁部のチャネルの精度より著しく悪い。本発明者らが１２８チャネルを取り除いたとき、すべてのチャネルの精度は増大する（図１０Ｂ）。対照的に、１３１チャネルのみを取り除いたとき、精度の利得はより小さかった（図１０Ｃ）。これは、精度の改善が１チャネル当たりのイオンのより大きい数ではなく、ＴＭＴ^Ｃクラスターにおけるイオンのより広い間隔に主に起因することを示唆する。精度のより大きい利得は、各チャネルが少なくとも２ダルトン離れている場合実現されうる（図１０Ｄ〜Ｈ）。本発明者らは、複数のＴＭＴレポーターイオンの除去に由来するイオンクラスターは、５重試料に対してこの所望の性質を有するはずであることに言及したい（データを示さず）。

ＴＭＴ^Ｃイオン形成の効率
図１５Ａは、異なるＭＳ^２分解能設定：１８ｋ、３５ｋ、および７０ｋを使用する相補イオンベース定量化を比較するものである。最大イオン注入時間は、異なる分解能設定：それぞれ６０ｍｓ、１２０ｍｓ、および２４０ｍｓでのＯｒｂｉｔｒａｐスキャン時間に従って設定した。垂直線は、１：１０（破線）および４：１０（実線）の既知の混合比を示す。図１５Ａは、１８ｋという低分解能設定でさえ、干渉に起因する系統的な誤差は軽微であることを例示する。しかし、１８ｋの分解能に関連してイオン注入時間がより短いことにより、そしてその結果として、蓄積されるイオンの数が低いことにより、図１３Ａ〜Ｆに関して記載したデータフィルタリング基準を満たさなかったＴＭＴ^Ｃクラスターイオンが増大した。３５ｋの分解能において、ほとんどのペプチドはフィルタリング基準に合格し、より狭い比の分布は、これらの設定により、取得される定量的データの精度が増大することを示す。

図１５Ｂは、異なる単離幅設定の比較、および３５ｋの分解能でのＴＭＴ^Ｃイオンベース定量化に対する効果を示す。±１．５ｍ／ｚという単離幅は、前駆体イオンエンベロープの不完全な単離をもたらし、定量的結果の正確さに強く影響する。正確さは、単離ノッチ幅を±２．０ｍ／ｚに拡大することによって改善される。単離ノッチ幅を±２．５ｍ／ｚおよび±３．０ｍ／ｚにさらに拡大すると、定量化の正確さは有意に改善されないが、夾雑ペプチドイオンの共単離の増大に起因して同定されるペプチドの数が減少する。

図１５Ｃは、図１５Ａ〜Ｂに示した実験からのＭＳ^２スペクトルの数、同定および定量化されたペプチドの数を含む表を示す。

以下の表１は、ＴＭＴ^ＣおよびＭＳ^３定量化法を使用してＱＥｘａｃｔｉｖｅおよびＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅで実行した干渉試料実験を要約する。

各分析では、約９０分の同等の溶出勾配を使用した。特に、１２０ｍｓの注入時間および３５ｋの名目上の分解能を用いたＱＥｘａｃｔｉｖｅでの取得したＭＳ^２スペクトルの数および同定されたペプチドの数は、等価なＴＭＴ^Ｃ実験をほんのわずかにより高い名目上の分解能（４２ｋの分解能、５０ｋのＡＧＣ標的、２５０ｍｓの最大注入時間）を用いてＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅで実行したとき取得したＭＳ^２スペクトルの数のほぼ２倍である。異なる実験セットアップは、厳密な比較を妨げるが、異なる負荷サイクルは、ＱＥｘａｃｔｉｖｅでのイオン注入およびスペクトル取得の並列化に起因する可能性がある。対照的に、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅでのイオン注入およびスペクトル取得は、逐次である。

ＭＳ^３法と比較したときのＴＭＴ^Ｃ手法の利点の１つは、無干渉定量化をもたらすのに追加の精製ステップはまったく必要でなく、前駆体イオンのより大きい画分が（相補体）レポーターイオンに潜在的に変換されることである。これは、定量化のための注入時間を低減し、かつ／または感度を増大させることができる。しかし、現在のインプリメンテーションで、所与の時間内に定量化されうるペプチドの数は、ＭＳ^３法で得られる数と同様である（表１）。これは、ペプチドの大部分について有意な数のＴＭＴ^Ｃイオンの形成が不十分であることに主に起因する。本発明者らが同定された酵母ペプチドイオンをこれらの荷電状態によって分離する場合、本発明者らは、１２０ｍｓの注入時間で、フラグメンテーション後、二重荷電ペプチドイオンの７０％が定量化を可能にする強度でＴＭＴ^Ｃイオンを作製することを観察する。例えば、図１６Ａは、異なる前駆体荷電状態についてのＴＭＴ^Ｃイオンの数の頻度分布を例示する。より高い荷電状態ペプチドの大部分は、有意な量のＴＭＴ^Ｃイオンを生成しない。破線の垂直線は、定量的データをフィルタリングするのに本試験全体にわたって使用した１，０００イオンカットオフを表す。ペプチドのこの画分は、より高い荷電状態を有するペプチドに関してさらに減少する。しかし、ＴＭＴ^Ｃイオン形成の効率をより低くするのは荷電状態自体ではなく、荷電状態とアミノ酸組成との組合せであるようである。おそらく、塩基性残基（アルギニン、リシン、ヒスチジン、およびＮ末端）より多くの電荷を含有するペプチドイオンは、高度に移動性である少なくとも１つのプロトンを呈する。本発明者らがこの基準に基づいてペプチドイオンを分離するとき、本発明者らは、高度に移動性のプロトンを有するペプチドは一般に、十分な強度でＴＭＴ^Ｃイオンを生成しないことを見出した。本発明者らは、高度に移動性のプロトンがペプチド骨格でのフラグメンテーションを増大させ、それによってＴＭＴ^Ｃイオンの形成を抑制すると考える。高移動性プロトンを担持しないペプチドイオンを考慮するときでさえ、より高い荷電状態のペプチドイオンは、あまり効率的にＴＭＴ^Ｃイオンを形成しない傾向があることを本発明者らは依然として観察することに言及しなければならない。例えば、図１６Ｃは、異なる荷電状態のペプチドイオンについての高移動性プロトンを担持しないペプチドの頻度分布を例示する。このプロットは、ペプチド荷電状態とＴＭＴ^Ｃイオン強度の負の相関を示す。ある程度、これは、イオンでない電荷の数によってＭＳ^２スペクトルのための前駆体に優先順位をつけるデフォルトのＭＳ計測器設定によって説明されうる。さらに、より高い荷電状態のペプチドは、より長い傾向があり、したがってペプチド骨格で破断する可能性がより高くなり得、ＴＭＴ^Ｃイオン形成の可能性を低下させる。

ペプチドの大部分についての非効率なＴＭＴ^Ｃシグナルは、ＴＭＴ^Ｃ定量化にとってその現在のインプリメンテーションにおいて制限事項である。重大な問題であるが、調整するための実行可能なパラメータである同重体タグの化学反応を用いた実行可能な解決策がある。慣例的なＴＭＴタグは、ＴＭＴ^Ｃイオンのためでなく低ｍ／ｚレポーターイオンの形成のために合成および最適化される。現在のＴＭＴタグより効率的に相補体レポーターイオンを形成するタグを作製することが可能である。例えば、ホスホ−エステル結合を有するタグを作製することができる。ホスホ基のニュートラルロスは一般に、特に共鳴ＣＩＤフラグメンテーションを伴ってリンペプチドのＭＳ^２スペクトルで優位を占める。さらに、同重体標識中の追加の塩基性基は、ペプチド骨格から高移動性プロトンを隔離しうる。相補体レポーターイオンをより効率的に形成すると、定量化に適用できるペプチドの画分が著しく増大するはずであり（図１６Ｂ）、すべてのペプチドの定量化の精度に役立つはずである（図１０Ａ）。例えば、図１６Ｂは、図１６Ａで観察される差異が、荷電状態に関係なく、高移動性のプロトンを含む、および含まないペプチドを比較することによって部分的に説明されうることを例示する。高移動性プロトンを含むペプチドは、微々たる数のＴＭＴ^Ｃイオンを生じる傾向がある。高移動性プロトンは、ペプチド骨格で結合破壊を支持する可能性があり、それによってＴＭＴ^Ｃイオンの形成を抑制する。

ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターは、ペプチド定量化の並列化を促進する
ＭＳ^３またはＰＴＲのような代替の定量化法に対する相補体レポーターイオン手法の一利点は、定量的なシグナルが前駆体特性に依存することである。本質的に、これは、干渉を除去するだけでなく、共単離ペプチドの並列の定量化を可能にすることができる。図９では、単一ＭＳ^２スペクトルで複数のペプチドを並列定量化するための原理の証明が示されている。２種のペプチドを、±３ｍ／ｚの単離幅でヒト−酵母干渉試料の分析中のフラグメンテーションのために単離した（図９Ａ）。デコイを含むヒト−酵母ペプチドデータベースに対してＳｅｑｕｅｓｔで２つの前駆体を検索すると、＋２前駆体について酵母ペプチドＹＴＴＬＧＫ、および＋３前駆体についてヒトペプチドＬＤＥＲＥＡＧＩＴＥＫが同定された。レポーターイオンは、酵母起源およびヒト起源の両方から生じた（図９Ｂ）。対照的に、ＴＭＴ^Ｃクラスターは、各ペプチドにユニークであり、これらの前駆体特異的フラグメントイオンから、２種のペプチドが独立して定量化された。ヒトペプチドは、１０．５：９．３：０．１：０．０：０．０で定量化され、酵母ペプチドは、１．５：４．６：９．６：２．１：１．１で定量化された（２０に正規化された比）。本発明者らは、酵母ペプチドの定量化が、単離ウィンドウの縁部に近いペプチド前駆体の局在化を被ったと考える（ヒトペプチドの疑似モノアイソトピックピークがＭＳ^２スペクトルについて計測器によって選択される標的であった）。したがって、酵母同位体エンベロープのより低いｍ／ｚ側のピークは、あまり効率的に単離されず、ＴＭＴ−１２６チャネルおよびＴＭＴ−１２７チャネルの過大評価をもたらした。この警告があっても、両ペプチドの定量化は、既知の異なる混合比に合理的に近く、相補体レポーターイオン定量化が、複数の前駆体がＳＷＡＴＨ ＭＳのように意図的に単離およびフラグメント化される方法にユニークに適用可能であることを実証した。多重プロテオミクス実験におけるデータ取得速度は、定量化のためにＭＳ^ｎスペクトル内に十分な（相補体）レポーターイオンを蓄積するのに必要とされるイオン注入時間によって主に制限される。これらのイオン注入時間と比較して、同定のためのＭＳ^２スペクトルの全取得時間は短く、同定および定量化のためのＭＳ^２スペクトルは、分離されうる。相補体レポーターイオン手法は、相補体レポーターイオンを蓄積するためのイオン注入を並列化することを可能にし、それによって所与の時間枠内で定量化されうるペプチドの数を増やす機会を広げる。

材料および方法
試料調製およびデータ取得：
別段の注記のない限り、干渉試料は、以前に記載された通り調製した。ＨｅＬａ Ｓ３細胞を、懸濁液中で増殖させて１×１０^６細胞／ｍＬにした。酵母細胞は、１．０のＯＤまで増殖させた。細胞を６Ｍチオシアン酸グアニジウム、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．５（ＨＣｌ）中に溶解した。タンパク質含量は、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定し、ジスルフィド結合をジチオトレイトール（ＤＴＴ）で還元し、システイン残基を、以前に記載された通りヨードアセトアミドでアルキル化した。タンパク質溶解産物をメタノール−クロロホルム沈殿によって浄化した。試料を６Ｍ チオシアン酸グアニジウム、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．５中に取り込み、希釈して１．５Ｍチオシアン酸グアニジウム、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．５にした。両溶解産物を、１：５０の酵素：タンパク質比の消化（ｄｉｇｅｓｔ）で、Ｌｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ）を用いて一晩消化させた。消化後、試料を三フッ素酸（ｔｒｉ−ｆｌｕｏｒｉｃ−ａｃｉｄ）でｐＨ＜２まで酸性化し、Ｃ_１８固相抽出（ＳＰＥ：ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）（Ｓｅｐ−Ｐａｋ、Ｗａｔｅｒｓ）に供した。アミノ反応性ＴＭＴ試薬（１２６〜１３１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロット番号ＭＪ１６４４１５、０．８ｍｇ）をアセトニトリル４０μｌ中に溶解させ、溶液１０μｌを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）１００μｌ中に溶解したペプチド１００μｇに添加した。室温（２２℃）で１時間後、５％ヒドロキシルアミン８μｌを添加することによって反応をクエンチした。標識した後、試料を所望の比（例えば、１：４：１０：４：１）で組み合わせた。標識酵母試料の画分を標識ヒト試料から別個に保持し、その試料を無干渉分析のために用意した。試料をＣ_１８固相抽出（ＳＰＥ）（Ｓｅｐ−Ｐａｋ、Ｗａｔｅｒｓ）に供した。

ＬＣ−ＭＳ実験は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥｌｉｔｅまたはＱＥａｃｔｉｖｅ ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅは、Ｆａｍｏｓオートサンプラー（ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ）およびＡｇｉｌｅｎｔ１１００バイナリ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えていた。各ランについて、ペプチド約１μｇを、Ｍａｇｉｃ Ｃ_４樹脂（５μｍ、２００Å、Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）およそ０．５ｃｍを最初に充填し、その後Ｍａｃｃｅｌ Ｃ_１８ ＡＱ樹脂（３μｍ、２００Å、Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ）２０ｃｍを充填した内径１００または７５μｍのマイクロキャピラリーカラムで分離した。分離は、約３００ｎｌ／分で９０分にわたって０．１２５％ギ酸中９〜３２％のアセトニトリル勾配を適用することによって実現した。エレクトロスプレーイオン化は、マイクロキャピラリーカラムの入口のＰＥＥＫマイクロ−ティー（ｍｉｃｒｏ−ｔｅｅ）によって１．８ｋＶの電圧を印加することによって可能にした。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅは、データ依存モードで運転した。サーベイスキャンを、８４ｋの分解能で３００〜１，５００ｍ／ｚの範囲にわたってＯｒｂｉｔｒａｐで実施し、その後、±２ｍ／ｚの前駆体単離幅ウィンドウを使用してＨＣＤ−ＭＳ^２フラグメンテーションのために１０の最も強いイオン（トップ１０）を選択し、その後、４２ｋの分解能でＭＳ^２を行った。自動利得制御（ＡＧＣ：ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｇａｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ）設定は、サーベイおよびＭＳ^２スキャンについてそれぞれ、３×１０^６イオンおよび５×１０^５イオンであった。イオンは、これらの強度が５００カウントの閾値に到達し、同位体エンベロープが割り当てられたときＭＳ^２のために選択した。最大イオン蓄積時間は、サーベイＭＳスキャンについて１，０００ｍｓ、およびＭＳ^２スキャンついて２５０ｍｓに設定した。ＨＣＤ−ＭＳ^２実験のための正規化衝突エネルギーは、３０ｍｓの活性化時間で３２％に設定した。単一荷電イオンおよび荷電状態を決定することができなかったイオンは、ＭＳ^２に供さなかった。ＭＳ^２のために選択されたイオンの周りの±１０ｐｐｍ ｍ／ｚウィンドウ内のイオンは、１２０秒間さらなる分析から除外した。

ＱＥｘａｃｔｉｖｅは、ｅａｓｙ−ｎＬＣ １０００ ＵＨＰＬＣポンプを備えていた。各ランについて、ペプチド約１μｇを、Ｍａｇｉｃ Ｃ_４樹脂（５μｍ、２００Å、Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）およそ０．５ｃｍを最初に充填し、その後ＧＰ−Ｃ１８樹脂（１．８μｍ、１２０Å、Ｓｅｐａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２５ｃｍを充填した内径７５μｍのマイクロキャピラリーカラムで分離した。分離は、約４００ｎＬ／分で９０分にわたって０．１２５％ギ酸中９〜３２％のアセトニトリル勾配を適用することによって実現した。エレクトロスプレーイオン化は、マイクロキャピラリーカラムの入口でＰＥＥＫジャンクションによって１．８ｋＶの電圧を印加することによって可能にした。ＱＥｘａｔｉｖｅは、データ依存モードで運転した。サーベイスキャンを、７０ｋの分解能設定で実施し、その後、ＨＣＤ−ＭＳ^２フラグメンテーションのために１０の最も強いイオン（トップ１０）を選択した。ＨＣＤ−ＭＳ^２実験のための正規化衝突エネルギーは、３０％に設定した。単一荷電イオンおよび荷電状態を決定することができなかったイオンは、ＭＳ^２に供さなかった。ＭＳ^２のためのイオンは、４０秒間、フラグメンテーションのためのさらなる選択から除外した。ＱＥｘａｃｔｉｖｅでのＴＭＴ^Ｃ定量化のための異なるパラメータの試験については、図１５Ａ〜Ｃを参照。

データ分析
ひと揃いの組織内開発ソフトウェアツールを使用してＲＡＷファイルからｍｚＸＭＬフォーマットに質量分析データを変換し、かつペプチドイオン荷電状態およびモノアイソトピックｍ／ｚの誤った割り当てを補正した。本発明者らは、ＲｅＡｄＷ．ｅｘｅを改良してｍｚＸＭＬファイルフォーマットへの変換中の各ピークのシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を含めた（ｈｔｔｐ：／／ｓａｓｈｉｍｉ．ｓｖｎ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｖｉｅｗｖｃ／ｓａｓｈｉｍｉ／）。ＭＳ^２スペクトルの割り当ては、ヒト国際タンパク質指標データベース（バージョン３．６）からのすべてのエントリーを含むタンパク質配列データベース、その後すべての公知のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＯＲＦによってコードされるタンパク質の配列、およびヒトケラチンなどの公知の夾雑物に対してデータを検索することによってＳｅｑｕｅｓｔアルゴリズムを使用して実施した。この順方向（標的）データベースコンポーネントの後に、逆の順序ですべての列挙されたタンパク質配列を含むデコイコンポーネントが続いた。ヒトデータベースからのタンパク質配列は、酵母からのものの前に列挙され、その結果、両データベース内に含まれるペプチドは、ヒトタンパク質に常に割り当てられ、干渉効果の測定を邪魔しなかった。検索は、２０ｐｐｍの前駆体イオントレランスを使用して実施し、この場合、両ペプチド末端は、Ｌｙｓ−Ｃ特異性と一致することが必要とされた一方、最大２つの逸した切断を許した。リシン残基およびペプチドＮ末端上のＴＭＴタグ（＋２２９．１６２９３２Ｄａ）、ならびにシステイン残基のカルバミドメチル化（＋５７．０２１４６Ｄａ）を静的修飾として設定し、メチオニン残基の酸化（＋１５．９９４９２Ｄａ）を可変修飾として設定した。１％未満のＭＳ^２スペクトル割り当て偽発見率が、標的−デコイデータベースサーチストラテジーを適用することによって達成された。フィルタリングは、以下のペプチドイオンおよびＭＳ^２スペクトルの性質：ＳｅｑｕｅｓｔパラメータＸＣｏｒｒおよびΔＣｎ、絶対ペプチドイオン質量正確さ、ならびに荷電状態から１つの組み合わされたフィルターパラメータを作製するのに線形判別分析法を使用して実施した。前駆体の理論的ｍ／ｚの３標準偏差内の順方向ペプチドを正のトレーニングセットとして使用した。すべての逆ペプチドを負のトレーニングセットとして使用した。線形判別スコアを使用して、少なくとも６残基を有するペプチドを分類し、デコイデータベースに基づいて１％の偽発見率のカットオフでフィルタリングした。

各検索は、ソフトウェアで再較正して、ペプチド溶出時間または観察されるｍ／ｚに依存したいずれの系統的な質量誤差も軽減した。ＭＳ^１スペクトル全体におけるすべてのイオンを最初に調整した。ペプチドの代表的なサブセットは、中央値ＸＣｏｒｒを超えた、かつ全体的な質量誤差の１標準偏差内のものを使用して選択した。次に、このサブセットの質量誤差を、ＬＯＥＳＳ回帰を使用して各パラメータにフィッティングした。ＭＳ^１スペクトル内のあらゆるイオンのｍ／ｚを、次に、回帰モデル内の最近傍のデータ点の値を補間することによって予測された誤差によって調整した。２つのパラメータのそれぞれの調整を反復して行った。次いでＭＳ^２スペクトルを同様の方法で較正した。質量誤差は、全体的な質量誤差の２標準偏差以内であり、かつ強度の上位四分位点を超えるマッチしたペプチドフラグメントイオンから計算した。質量誤差を、ＬＯＥＳＳ回帰を使用して各パラメータにフィッティングし、ＭＳ^２スペクトル内のあらゆるイオンのｍ／ｚを上記の通り調整した。

レポーターイオンを介した定量化のために、±２０ｐｐｍウィンドウ内の理論的なｍ／ｚに最も近いシグナルの強度を記録した。レポーターイオン強度は、製造者が推奨したすべてのレポーターイオンの同位体エンベロープの重複に基づいて調整した。

ＴＭＴ−１３１の最も存在量の多いピークで標識されたモノアイソトピック前駆体から生じたピークは、分画後、０位として定義した。−１位〜＋１０位のピーク強度（Ｓ／Ｎ）を定量化のために抽出した。予測された質量に最も近いピークを±２０ｐｐｍのウィンドウ内で選択した。本発明者らは、Ｃ１３とＣ１２の質量差異（１．００３３６Ｄａ）を引いた、またはそれを足した疑似モノアイソトピック質量から理論質量差異を計算した。

図９については、データファイルを手作業で編集して、ＭＳ^２スペクトル内の残存前駆体の荷電状態およびｍ／ｚ値に基づいて２種のペプチドを表した。このデータファイルを、５ｐｐｍのウィンドウで酵母ヒト−ペプチドデータベース（デコイを含む）に対して検索した。

ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターの理論前駆体エンベロープでのデコンボリューション
ＴＭＴ−試薬のＴＭＴ同位体不純物を測定するために、本発明者らは、各アミノ反応性ＴＭＴを炭酸アンモニウムと別個に組み合わせ、ＭＳ^１内の得られたＴＭＴ−ＮＨ_２から同位体エンベロープを測定した（本発明者らは、エンベロープ全体が１に正規化されるとき＋１のピークについて約０．４％であるＮＨ_２同位体エンベロープを無視した）。本発明者らは、エンベロープ全体が１に正規化されるとき１％超の存在量で約２４６、２４７、および２４８ｍ／ｚにおける３つのピークで構成された同位体エンベロープを観察した。これらの同位体エンベロープから、本発明者らは、各ピークを個々に選択し、ＨＣＤでそれをフラグメント化し、得られたレポーターイオンを測定した（約１２６Ｄａ〜約１３２Ｄａ）。これらのスペクトルから、本発明者らは、図３Ａ〜Ｂで、グラフで表されている６つのＴＭＴ−不純物行列

を導出する。各エントリーは、同位体の相対存在量およびこれらのフラグメンテーションパターンを報告する（行列は、１に正規化されている）。列は、ＴＭＴ−ＮＨ_２前駆体同位体エンベロープにおける位置を定義し（左から右に約２４６、２４７、２４８Ｄａ）、一方、上から下の行は、この前駆体イオンとフラグメンテーション後のその得られるＴＭＴ^Ｃイオンとの間の質量差であるデルタ質量（Δｍ）に対応する（上から下に約１５４Ｄａ〜約１５９Ｄａ）。６つの異なるデルタ質量は、５つの異なるＴＭＴチャネル（本発明者らは、１２９および１３０のデルタ質量を区別することができないので１２９を含まない１２６〜１３１；図２Ａを参照）、および１３１−ＴＭＴタグにおける同位体不純物の結果である約１３２Ｄａにおける追加のイオンから生じる。

ＴＭＴチャネルのそれぞれについて、本発明者らは、それぞれの行列

の行を合計することによって同位体不純物のベクトル

も定義することができる。すなわち、同位体不純物ベクトル

、ここで数値は、フラグメンテーションパターンにかかわらず、それぞれ約２４６、２４７、および２４８Ｄａを有するＴＭＴ−ＮＨ_２イオンの相対存在量を表す。

ベクトル

は、所与の非ＴＭＴ標識ペプチドについての同位体エンベロープの相対的ポピュレーションを表す。このベクトルは、同位体の天然存在量に基づいてアミノ酸組成から計算することができる。このベクトルの最初の位置

は、モノアイソトピックピークの位置である。続く位置は、１質量単位（約１．００３Ｄａ）重いピークである。

内の値は、１に正規化されている。

ペプチドに結合したＴＭＴタグの数

は、リシン残基＋１（Ｎ末端）の数である。

および

から、本発明者らは、前駆体行列

を計算することができる（図７Ａ〜Ｂも参照）。

について

これらの行列

では、行は、

について記載したとおりのフラグメンテーション後のデルタ質量を示し、列は、同位体エンベロープにおける位置を示す。本発明者らは、位置ｐ（０）を定義する疑似モノアイソトピックピークを用いて、列ｐ（−１）〜ｐ（１０）を計算する。

所与の混合比

（

として表現され、１に正規化された）について、本発明者らは、

行列の加重和として計算される前駆体行列

：

でコード化される同位体前駆体エンベロープ全体にわたるデルタ質量の分布を計算することができる。

この行列

から、本発明者らは、本発明者らがベクトル

で表す理論的なＴＭＴ^Ｃイオンクラスターにおけるイオンの相対存在量を計算することができる。位置

は、疑似モノアイソトピックピーク

のＴＭＴ−１３１レポーターイオンの喪失から生じる位置として定義される。本発明者らは、−１位〜１４位について

を計算する。

式中、ｉ＋ｋ−５＝ｊ、ｋ＝−１．．．１４、ｉ＝１．．．６、ｊ＝−１．．．１０である。
これは、

の対角要素を合計することと等価である。

次に本発明者らは、ＴＭＴ^Ｃイオンクラスターについて理論的に計算されるベクトル

を、観察されるイオンクラスター

と比較する。空の位置のフィッティングノイズを回避するために、本発明者らは、理論的に予測されるＴＭＴ^Ｃエンベロープ

におけるどの位置が、理論的な比

について全イオンクラスターの１％未満で占められているかを最初に計算する。一般的なペプチドについて、この要件は、疑似モノアイソトピック位置

から

〜

について満たされる。次いで本発明者らは、

の比を変更し、

を最小限にする。

（すべての

について）（式中、

であり、

および

である）

イオンエンベロープ相似関数を最小限にする混合比率についての検索は、標準的な多変量最適化問題である。

は、二次式の相似関数として定義される。したがって本発明者らは、凸最適化の事例を得、ＭＡＴＬＡＢ中のｆｍｉｎｃｏｎ関数によって実行される単純なローカルサーチソルバーで最適化問題を解決することができる。

十分定量化されたペプチドについてフィルタリングするために、本発明者らは、ＴＭＴ^Ｃエンベロープ中の少なくとも約１０００イオンおよび０．００５未満の

値を必要とする。本論文の目的に関して、本発明者らは、各ペプチドについてこれを個々に解くことに重点を置き、一方、本方法の他の実施形態では、所与のタンパク質のすべてのペプチドについて合同で解くことができる。

ＭＳ^３法をＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅで以前に記載した通り実施した。好結果の定量化のために、本発明者らは、少なくとも５００レポーターイオンを必要とし、これは、本発明者らの研究室で使用される標準となった。

ピークにおけるイオンの数の見積もり
Ｏｒｂｉｔｒａｐで取得されるスペクトルについて、本発明者らは、ピークにおけるイオンの数は、電荷に対するシグナル対ノイズに比例すると仮定する。本発明者らは、ノイズ帯域は、過渡現象（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）が３０ｍｓの長さであり、Ｄ２０ Ｏｒｂｉｔｒａｐで収集されるとき５電荷におよそ等しいという仮定を使用して、所与のフラグメントイオンピークにおける分子の数を見積もる。この数は、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおける電荷の、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅにおけるイオントラップとの比較に基づいて見積もった。これは、以前の公開された結果と十分相関する。ＥｌｉｔｅのＤ２０ Ｏｒｂｉｔｒａｐは、ＱＥｘａｃｔｉｖｅのＤ３０ Ｏｒｂｉｔｒａｐと比較したとき、同じイオンの所与の数についての同じシグナル対ノイズを半分の時間で取得する。異なる分解能（より長い取得時間）について、ノイズは、取得時間の平方根とともに減少する一方、シグナルはおよそ一定に留まる。結果として、本発明者らは、ＱＥｘａｃｔｉｖｅでのＭＳ^２スペクトルのノイズ帯域は、以下のような電荷（ｅ）に等価であると仮定する：１８ｋの名目上の分解能で５ｅ、３５ｋで３．５ｅ、および７０ｋで２．５ｅ。同様に、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅについてのノイズ帯域は、２１ｋで５ｅ、および４２ｋで３．５ｅであると見積もられる（すべての名目上の分解能は、２００ｍ／ｚに対して表現されている）。

結論
ここで本発明者らは、相補体レポーターイオンクラスター（ＴＭＴ^Ｃ）がＭＳ^２レベルで同重体標識ペプチドの正確な定量化に使用されうることを示す。本明細書に示した例を生成するのに使用されたインプリメンテーションでは、ペプチドのおよそ半分が好結果の定量化を可能にするのに十分なＴＭＴ^Ｃイオンを形成しなかった。それでもやはり、本方法は、現存する方法に対して依然として競争力があり、取得データは、干渉ペプチドイオンによってほとんど完全に無影響であることが判明した。本発明者らは、相補体レポーターイオン生成効率を改善し、より大きい数のペプチドをより高い精度で定量化するのを可能にするルートを示す。最後に、本発明者らは、相補体レポーターイオン手法が単一ＭＳ^２スペクトルにおいて複数の別個のペプチドを定量化するのに使用されうることを実証した。これは、多重プロテオミクスでの取得速度を実質的に増大させる潜在性を有する。

他の実施形態
本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様をこうして記載してきたが、様々な変更、改変、および改善は、当業者が容易に思いつくことが十分に理解されるべきである。

このような変更、改変、および改善は、本開示の一部であるように意図されており、本発明の趣旨および範囲内であるように意図されている。さらに、本発明の利点が示されているが、本発明のあらゆる実施形態があらゆる記載した利点を含むわけではないことが十分に理解されるべきである。一部の実施形態では、本明細書および一部の事例において有利であると記載された任意の機能を実行しない場合がある。したがって、前述の記述および図面は、単なる例としてのものである。

本発明の上述した実施形態は、多数の方法のいずれかで実行されうる。例えば、諸実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはこれらの組合せを使用して実行されうる。ソフトウェアで実行される場合、ソフトウェアコードは、単一コンピューターに備えられていても、複数のコンピューター間に分布していても任意の適当なプロセッサまたはプロセッサのコレクションで実行することができる。このようなプロセッサは、集積回路コンポーネントにおいて１つまたは複数のプロセッサを伴った集積回路として実行されうる。しかし、プロセッサは、任意の適当なフォーマットで回路網（ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）を使用して実行されてもよい。

また、本明細書に概説した様々な方法またはプロセスは、様々なオペレーティングシステムまたはプラットフォームのいずれか１つを使用する１つまたは複数のプロセッサで実行可能なソフトウェアとしてコード化することができる。さらに、このようなソフトウェアは、いくつかの適当なプログラミング言語および／またはプログラミングツールもしくはスクリプトツールのいずれかを使用して書くことができ、また、フレームワークまたは仮想機械で実行される実行可能な機械語コードまたは中間コードとしてコンパイルされてもよい。

用語「プログラム」または「ソフトウェア」は、上記に論じた本発明の様々な態様を実行するためにコンピューターまたは他のプロセッサにプログラムするのに使用されうる任意のタイプのコンピューターコードまたはコンピューター実行可能命令のセットを指すための一般的な意味で、本明細書で使用される。さらに、本実施形態の一態様によれば、実行されると本発明の方法を実施する１つまたは複数のコンピュータープログラムは、単一のコンピューターまたはプロセッサに存在する必要はないが、本発明の様々な態様を実行するためにいくつかの異なるコンピューターまたはプロセッサにおいて、モジュール様式で分布していてもよいことが十分に理解されるべきである。

コンピューター実行可能命令は、１つまたは複数のコンピューターまたは他のデバイスによって実行されるプログラムモジュールなどの多くの形態でありうる。一般に、プログラムモジュールとしては、特定のタスクを実施し、または特定の抽象データ型を実行するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などが挙げられる。一般に、プログラムモジュールの機能性は、様々な実施形態において所望される通り組み合わせ、または分布させることができる。

また、データ構造は、任意の適当な形態でコンピューター可読媒体に記憶されうる。例示の単純性のために、表などのデータ構造は、データ構造内の場所を介して関連するフィールドを有するように示すことができる。このような関係は、フィールド間の関係を伝えるコンピューター可読媒体内の場所でフィールドに記憶領域を割り当てることによって同様に実現されうる。しかし、ポインター、タグ、またはデータ要素間の関係を確立する他の機構の使用によるものを含めて、データ構造のフィールド内の情報間の関係を確立するのに、任意の適当な機構を使用することができる。

本発明の様々な態様は、単独で、組み合わせて、または上記に記載した実施形態で特に論じられていない様々な配列（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）で使用することができ、したがって、上記の記述で示した、または図面に例示した詳細およびコンポーネントの配列へのその適用に限定されない。例えば、一実施形態で記載した態様を、他の実施形態で記載した態様と任意の方法で組み合わせることができる。

また、本発明は、少なくとも１つの例が提供されている一方法として具現化されうる。本方法の一部として実施される行為は、任意の適当な方法で並べることができる。したがって、行為が例示されているのと異なる順序で実施される実施形態を構築することができ、それは、例示的な実施形態では逐次の行為として示されているが、いくつかの行為を同時に実施することも含みうる。

請求項要素を修飾するのに特許請求の範囲での順序の用語、例えば、「第１の」、「第２の」、「第３の」などの使用は、それ自体、一請求項要素の、別のものに対するいかなる優先、先行、もしくは順序を内包せず、また方法の諸行為が実施される時間的順序も内包しないが、請求項要素を区別するために、ある特定の名称を有する一請求項要素を同じ名称を有する別の要素と区別するための（しかし順序の用語の使用のための）標識として単に使用されている。

また、本明細書で使用される表現法および専門用語は、記述の目的のためであり、限定的として見なされるべきでない。本明細書での「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」ならびにこれらの変形の使用は、それより後に列挙されるアイテムおよびこれらの均等物、ならびに追加のアイテムを包含することを意味する。

Claims (34)

1. 質量分析法による分析を実施する方法であって、
   複数の試料の混合物を作製するステップであって、該複数の試料のそれぞれは、複数の化学的タグから選択される少なくとも１つのタイプの化学的タグで標識された少なくとも１つのタイプの前駆体イオンを含み、該複数の試料のそれぞれは、該少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの複数の前駆体イオンを含む、ステップと、
   該標識された前駆体イオンをフラグメント化してイオンの第１のサブセットおよびイオンの第２のサブセットを含む複数のイオンを形成するステップであって、
   イオンの該第１のサブセットの各イオンは、該それぞれの化学的タグの少なくとも一部を含むが、該それぞれの分子は含まず、
   イオンの該第２のサブセットの各イオンは、該それぞれの化学的タグの少なくとも一部および該それぞれの分子を含む、ステップと
   イオンの該第２のサブセットの各タイプのイオンの存在量を測定するステップと、
   イオンの該第２のサブセットの各タイプのイオンの該存在量を分析することによって、該複数の試料のそれぞれにおける少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの相対存在量を決定するステップと
   を含む、方法。
2. 前記複数の試料の前記混合物を作製するステップが、
   複数の試料のそれぞれの少なくとも１つのタイプの分子をそれぞれの化学的タグで標識することであって、該複数の試料のそれぞれは、該少なくとも１つのタイプの分子の複数の分子を含む、ことと、
   該複数の試料のそれぞれに由来する該標識された分子を一緒に混合することと、
   該標識された分子をイオン化して、前記標識された前駆体イオンを形成することと、
   該標識された前駆体イオンを質量分析計内に注入することと、
   分析のために該標識された前駆体イオンを選択することと
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つのタイプの分子が、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、脂質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および代謝産物からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記複数の化学的タグのそれぞれが、名目上同じ質量を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つのタイプの前駆体イオンが、複数のタイプの前駆体イオンを含む、請求項１に記載の方法。
6. 分析のために前記標識された前駆体イオンを選択することが、連続的なウィンドウを使用する、請求項５に記載の方法。
7. 分析のために前記標識された前駆体イオンを選択することが、複数の別個のウィンドウを使用する、請求項５に記載の方法。
8. 前記標識された分子をイオン化することが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、ナノエレクトロスプレーイオン化（ｎＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、大気化学イオン化（ＡＰＣＩ）、大気光イオン化（ＡＰＰＩ）、およびソニックスプレーイオン化（ＳＳＩ）からなる群から選択される行為を含む、請求項２に記載の方法。
9. 前記標識された前駆体イオンを選択することが、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、四重極マスフィルター（ＱＭＦ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴ−ＩＣＲ）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、および飛行時間分析器（ＴＯＦ）からなる群から選択されるデバイスによって実施される、請求項２に記載の方法。
10. 前記標識された前駆体イオンをフラグメント化するステップが、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、パルス化−ｑ解離（ＰＱＤ）、赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、紫外光子解離（ＵＶＰＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、インソース解離、電子移動解離（ＥＴＤ）、および電子捕獲解離（ＥＣＤ）からなる群から選択される行為を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記標識された前駆体イオンをフラグメント化するステップにより、少なくとも１つの電荷の喪失を伴って、または伴わないで少なくとも１つのそれぞれのタグが破断する、請求項１に記載の方法。
12. 前記標識された前駆体イオンに対する追加の操作を実施するステップを、前記前駆体イオンが選択された後であるが、前記前駆体イオンがフラグメント化される前に、さらに含む、請求項２に記載の方法。
13. 前記標識された前駆体イオンに対する追加の操作が、プロトン移動反応を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの前記相対存在量を決定するステップが、同定のために実施されるいずれの分析とも独立して行われる、請求項１に記載の方法。
15. 前記複数の試料のそれぞれにおける少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの相対存在量を決定するステップが、イオンの前記第１および第２のサブセットにおける同位体変動を補正することを含む、請求項１に記載の方法。
16. イオンの前記第２のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記化学的タグの同位体不純物を補正することを含む、請求項１に記載の方法。
17. イオンの前記第２のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記同位体変動の場所を考慮することを含む、請求項１６に記載の方法。
18. イオンの前記第２のサブセットにおける同位体変動を補正することが、前記少なくとも１つのタイプの前駆体イオンの同位体組成に関する情報、および前記複数の化学的タグのそれぞれの同位体組成に関する情報を使用することを含み、該情報が、理論的に導出され、または質量分析計で測定される、請求項１５に記載の方法。
19. 前記化学的タグの同位体不純物を補正することが、
    イオンの前記第２のサブセットの各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することと、
    イオンの該第２のサブセットの測定された相対存在量をイオンの該第２のサブセットの該理論相対存在量と比較することと
    を含む、請求項１６に記載の方法。
20. イオンの前記第２のサブセットの各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することが、前記複数の試料の第１の試料の同位体エンベロープを、前記それぞれの化学的タグに関連した不純物行列でコンボリューションすることを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記複数の試料のそれぞれの少なくとも１つのタイプの分子を標識することが、該複数の試料のそれぞれの複数のタイプの分子を標識することを含む、請求項２に記載の方法。
22. イオンが前記質量分析計内に注入される継続時間が、前記前駆体イオンの少なくとも１つの特性に基づいて決定される、請求項２に記載の方法。
23. 前記少なくとも１つの特性が、前記前駆体イオンの荷電状態、該前駆体イオンの質量対電荷比、該前駆体イオンの強度、または該前駆体イオンの分子のタイプからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. イオンが前記質量分析計内に注入される継続時間が、以前の質量分析法による分析の結果に基づいて決定される、請求項２に記載の方法。
25. 実行されると一方法を実施する命令でコード化された少なくとも１つのコンピューター可読媒体であって、該方法は、
    複数の化学的タグから選択されるそれぞれの化学的タグで複数の試料のそれぞれの少なくとも１つのタイプの分子を標識するステップであって、該複数の試料のそれぞれは、複数の分子を含む、ステップと
    該標識された分子のそれぞれをフラグメント化して少なくとも第１の部分および第２の部分を作製するステップであって、該第１の部分は、該第２の部分より低い質量を有する、ステップと、
    各第２の部分の相対存在量を測定するステップと、
    該標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することによって該複数の試料のそれぞれにおける該少なくとも１つのタイプの標識された分子の相対存在量を決定するステップと
    を含む、少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
26. 前記標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することが、前記少なくとも１つのタイプの分子の同位体エンベロープを補正することを含む、請求項２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
27. 前記標識された分子のそれぞれにおける同位体変動を補正することが、前記複数の化学的タグのそれぞれの同位体不純物を補正することを含む、請求項２６に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
28. 前記化学的タグの同位体不純物を補正することが、
    前記第２の部分の各タイプのイオンの理論相対存在量を生成することと、
    該第２の部分の前記測定された相対存在量を該第２の部分の該理論相対存在量と比較することと、
    を含む、請求項２７に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
29. 前記第２の部分の各タイプの理論相対存在量を生成することが、前記複数の試料の第１の試料の同位体エンベロープを、前記それぞれの化学的タグに関連した不純物行列でコンボリューションすることを含む、請求項２８に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
30. 前記複数の試料のそれぞれの前記少なくとも１つのタイプの分子を標識することが、該複数の試料のそれぞれの複数のタイプの分子を標識することを含む、請求項２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
31. 前記第２の部分が少なくとも前記少なくとも１つのタイプの分子を含む、請求項２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
32. 前記少なくとも１つのタイプの分子が、タンパク質またはペプチドを含む、請求項２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
33. 前記複数の化学的タグのそれぞれが、名目上同じ質量を有する、請求項２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
34. 前記標識された分子をフラグメント化するステップが、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、パルス化−ｑ解離（ＰＱＤ）、赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）、紫外光子解離（ＵＶＰＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、インソース解離、電子移動解離（ＥＴＤ）、および電子捕獲解離（ＥＣＤ）からなる群から選択される行為を含む、請求項２５に記載の少なくとも１つのコンピューター可読媒体。
    

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