JP6480874B2 - Talenに基づく遺伝子修正 - Google Patents
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Description
本発明は、突然変異の部位特異的な修正を提供することによって、オフターゲット効果を克服する。突然変異の修正は、細胞の形質転換または遺伝子移入によって遂行され得る。細胞は、繊維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、造血子孫細胞、T細胞、B細胞、グリア細胞、神経細胞、神経膠前駆細胞、神経膠幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞および網内系の細胞からなる群から選択され得る。
るための方法であって、a)細胞に(i)第1の転写活性化因子様(TAL:transcriptin activator−like)エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第1の核酸、(ii)第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第2の核酸および(iii)およびドナー配列を導入する工程であって、前記第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のTALエフェクター反復配列およびFokIエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のTALエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基(repeat−variable diresidue)を含み、前記第1のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、前記細胞内での標的DNAの第1のハーフサイト配列への結合能を含むとともに、前記第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が標的DNAの第2のハーフサイト配列に結合されるときに前記標的DNAを切断する能力を含み、前記標的DNAが、スペーサ配列によって分離される第1のハーフサイト配列および第2のハーフサイト配列を含み、前記第1および第2のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも標的配列の5’および3’末端で標的に対する相同性および事前に選択された遺伝子変化を含み、かつ、遺伝子突然変異の修正をもたらすDNA修復のための鋳型である、該導入工程;および、(b)突然変異を修正し、かつ、正確な遺伝子発現を復元するために、第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が発現される条件下で細胞を培養する工程を含む、方法を提供する。第1および第2の核酸のそれぞれは、(スペーサ配列とは異なる)スペーサを含み得る。スペーサ配列は、複数のTALエフェクター反復配列とFokIエンドヌクレアーゼドメインとの間に置かれ得る。スペーサ配列は12〜30ヌクレオチドであり得る。さらなる実施形態において、本発明は、遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための1つ以上の核酸の使用であって、(i)第1の核酸が、第1の転写活性化因子様(TAL)エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードし、(ii)第2の核酸が、第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードし、(iii)およびドナー配列であり、前記第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のTALエフェクター反復配列およびFokIエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のTALエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第1のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、前記細胞内での標的DNAの第1のハーフサイト配列への結合能を含み、かつ、前記第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が標的DNAの第2のハーフサイト配列に結合されるときの前記標的DNAに対する切断能を含み、前記標的DNAが、スペーサ配列によって分離される第1のハーフサイト配列および第2のハーフサイト配列を含み、前記第1および第2のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも標的配列の5’および3’末端で標的に対する相同性および事前に選択された遺伝子変化を含み、かつ、遺伝子突然変異の修正をもたらすDNA修復のための鋳型であり;および(b)突然変異を修正し、正確な遺伝子発現を修復するために、第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が発現される条件下で細胞を培養することである、使用を提供する。
ALEN核酸によりコードされるかまたは発現されるタンパク質を提供する。
ある実施形態は、ドナー配列を含むベクターまたはプラスミドであって、このドナー配列は、遺伝子突然変異の修正をもたらす部位特異的なDNA修復のための鋳型であり、このドナー配列は、少なくとも標的配列の5’および3’末端に対する相同性を含み、このドナー配列の一部分は、TALENタンパク質と併せて使用するための標的配列を修正するための修復配列を含む、ベクターまたはプラスミドを提供する。ある実施形態において、ドナーは配列番号22を含む。ある実施形態において、標的はCOL7A1(突然変異あり)である。ある実施形態において、ドナーの5’および3’末端はそれぞれ標的に対して少なくとも100塩基の配列同一性を有する。ある実施形態は、配列番号22、31、28、29または30のうち1つ以上を含むベクターまたはプラスミドを提供する。別の実施形態は、外来配列番号22、31、28、29もしくは30のうち1つ以上またはこのような配列から発現されるタンパク質を含む、単離宿主細胞を提供する。別の実施形態は、配列番号22、31、28、29もしくは30またはこのような配列から発現されるタンパク質を含む、遺伝子移入された細胞株を提供する。
なすために左TALENと協働する右TALENをさらに含む。右TALENは、この核酸または第2の核酸によりコードされ得る。左TALENおよび右TALENは、複数のTALエフェクター反復配列およびエンドヌクレアーゼドメインを含み得る。左および右TALENのそれぞれは、スペーサ(スペーサ配列とは異なる)を含み得る。スペーサ配列は、複数のTALエフェクター反復配列とエンドヌクレアーゼドメインとの間に置かれ得る。スペーサ配列は、12〜30ヌクレオチドの配列によりコードされ得る。本発明は、核酸を提供し、ここでTALENをコードする核酸および/または核酸ドナー配列は、ベクターまたはプラスミドの一部である。本発明は、核酸を提供し、ここで標的遺伝子は、遺伝子変化/突然変異がある遺伝子である。本発明は、核酸を提供し、ここで標的遺伝子はCOL7A1である。本発明は、核酸を提供し、ここでTALENはスペーサを含む。本発明は、核酸を提供し、ここでスペーサ配列は12〜30ヌクレオチド長である。本発明は、核酸を提供し、ここで遺伝性疾患は、表皮水疱症、骨形成不全症、先天性角化不全症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症(CFTR)、ファンコニ貧血、スフィンゴリピドーシス、リポフスチン沈着症、副腎白質ジストロフィー、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球貧血またはサラセミアである。本発明は、核酸を提供し、ここで遺伝性疾患は表皮水疱症である。本発明は、少なくとも1つの核酸であって、(i)第1の転写活性化因子様(TAL)エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第1の核酸、(ii)第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第2の核酸、および(iii)およびドナー配列を含み、前記第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれは、複数のTALエフェクター反復配列およびFokIエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のTALエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第1のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体は、前記細胞内での標的DNAの第1のハーフサイト配列への結合能を含み、かつ、前記第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が標的DNAの第2のハーフサイト配列に結合されるときの前記標的DNAに対する切断能を含み、前記標的DNAは、スペーサ配列によって分離される第1のハーフサイト配列および第2のハーフサイト配列を含み、前記第1および第2のハーフサイトは同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列は、少なくとも標的配列の5’および3’末端で標的に対する相同性および事前に選択された遺伝子変化を含み、かつ、遺伝子突然変異の修正をもたらすDNA修復のための鋳型である、核酸と;(b)突然変異を修正し、かつ、正確な遺伝子発現を復元するために、第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が発現される条件下で細胞を培養することとを提供する。本発明は、核酸によりコードされるかまたは発現されるタンパク質を提供する。本発明は、核酸を含むベクターまたはプラスミドを提供する。本発明は、核酸を含む単離宿主細胞を提供する。
(発明の詳細な説明)
本発明は、易感染性の遺伝性障害がある患者を処置するためのヒトゲノムおよびヒト細胞との関連における、疾患を引き起こす突然変異の、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)が介在するDNA編集を対象とする。これは、無作為または半無作為にゲノムに組み込む治療用遺伝子の機能的コピーの提供に依存する以前の遺伝子治療試行/ツールを上回る進歩である。以前の遺伝子治療法の結果として、カーゴが着地する遺伝子座の撹乱が起こり、遺伝子不活性化または制御不全が生じる可能性がある。これらの結果、生命を脅かす副作用が起こり得る。本明細書中に記載のアプローチは、例えばゲノムの残りの部分を元の状態に維持しながら突然変異スポットのみを修正する、ヒト遺伝子に対するテーラーメードのTALENを使用することによって、安全性および有効性を最大化し、言い換えると、残りのゲノムを破壊せず、したがって既存の技術に付随するオフターゲット効果(例えばウイルスが介在する遺伝子付加)を排除する。これは新規アプローチであり、細胞、例えばヒト細胞中での疾患を引き起こす突然変異の、TALENが
介在する、導入遺伝子を含まない修正による最初の個人向け遺伝子治療である。したがって、この技術は細胞、例えばヒト細胞などにおいて使用され得、正常な細胞機能の回復により機能喪失突然変異が継ぎ目なく修正され得るようになる。他の実施形態において、遺伝子発現が促進され得る。
本発明を記載し、主張することにおいて、下記で示される定義に従い、次の技術用語を使用する。別段の定めがない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書中に記載のものと同様または均等な何らかの方法および材料が使用され得る。ラジカル、置換基および範囲に対して下記で列挙される具体的なおよび好ましい値は単なる例示であり、ラジカルおよび置換基に対して定められる他の値または定められる範囲内の他の値を排除するものではない。
「細胞」は、脊椎動物、例えばヒトを含む哺乳動物からの細胞であり、または「対象」は、脊椎動物、例えばヒトを含む哺乳動物である。哺乳動物としては、ヒト、家畜、競走用の動物および愛玩動物が挙げられるが限定されない。「動物」という用語に含まれるのは、イヌ、ネコ、魚、スナネズミ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、サル(例えば、類人猿、ゴリラ、チンパンジーまたはオランウータン)、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびトリである。
「疾患」は、ホメオスタシスを維持することができない対象の健康状態であり、疾患が改善されない場合、対象の健康が悪化し続ける。対して、対象における「障害」は、対象がホメオスタシスを維持できるが、対象の健康状態が障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。しかし、上述のような「疾患」および「障害」の定義は、具体的な習慣性疾患または障害に関連する定義または一般的使用に優先するものではない。
本明細書中で使用される場合、「有効量」は、例えば、疾患または障害の症状の改善など、選択された効果を生じさせるのに十分な量を意味する。
化合物の「治療的有効量」は、例えば化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。
フルネーム 三文字コード 一文字コード
アスパラギン酸 Asp D
グルタミン酸 Glu E
リジン Lys K
アルギニン Arg R
ヒスチジン His H
チロシン Tyr Y
システイン Cys C
アスパラギン Asn N
グルタミン Gln Q
セリン Ser S
スレオニン Thr T
グリシン Gly G
アラニン Ala A
バリン Val V
ロイシン Leu L
イソロイシン Ile I
メチオニン Met M
プロリン Pro P
フェニルアラニン Phe F
トリプトファン Trp W
「アミノ酸」という表現は、本明細書中で使用される場合、天然および合成アミノ酸の両方ならびにDおよびLアミノ酸の両方を含むものとする。「標準的アミノ酸」は、天然のペプチドで一般に見られる20種類の標準的なL−アミノ酸の何れかを意味する。「非標準的アミノ酸残基」は、それが合成により調製されるかまたは天然源由来であるかにかかわらず、標準的なアミノ酸以外の何らかのアミノ酸を意味する。本明細書中で使用される場合、「合成アミノ酸」はまた、化学的に修飾されたアミノ酸も包含し、塩、アミノ酸誘導体(アミドなど)および置換が挙げられるが限定されない。本発明のペプチド内に含有されるアミノ酸は、特にカルボキシまたはアミノ末端で、メチル化、アミド化、アセチル化またはそれらの活性に悪影響を与えることなくペプチドの循環半減期を変化させ得る他の化学基での置換により修飾され得る。さらに、ジスルフィド結合は、本発明のペプチド中に存在してもよく、または存在しなくてもよい。
I.小型、脂肪族、非極性または僅かに極性の残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性、負荷電残基およびそれらのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln;
III.極性、正電荷残基:
His、Arg、Lys;
IV.大型、脂肪族、非極性残基:
Met Leu、Ile、Val、Cys
V.大型、芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp
本明細書中で使用される場合、「核酸」という用語は、RNAならびに1本、2本および3本鎖DNAおよびcDNAを包含する。さらに、「核酸」、「DNA」、「RNA」という用語および同様の用語はまた、核酸類似体、すなわちホスホジエステルバックボー
ン以外を有する類似体も含む。例えば、当技術分野で公知であり、バックボーン中でホスホジエステル結合のかわりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内とみなされる。「核酸」とはまた、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドから構成されるか、およびホスホジエステル結合または修飾結合、例えばホスホトリエステル、ホスホールアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホールアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホールアミデート、架橋ホスホールアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合およびこのような結合の組み合わせから構成されるかに関わらず、あらゆる核酸も意味する。核酸という用語はまた、具体的に、5種類の生体に存在する塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基から構成される核酸も含む。ポリヌクレオチド配列を記載するために従来の表記法が本明細書中で使用され:1本鎖ポリヌクレオチド配列の左手の末端は5’末端であり;2本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は5’方向と呼ばれる。新生RNA転写産物に対するヌクレオチドの5’から3’の付加方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は「コード鎖」と呼ばれ;DNA上の参照点に対して5’に位置するDNA鎖上の配列は「上流配列」と呼ばれ;DNA上の参照点に対して3’にあるDNA鎖上の配列は「下流配列」と呼ばれる。
2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して遂行され得る。例えば、2つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、カーリン(Karlin)およびアルトシュル(Altschul)(1990年、米国科学アカデミー紀要(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、第87巻、p.2264〜2268)のアルゴリズムであり、カーリン(Karlin)およびアルトシュル(Altschul)(1993年、米国科学アカデミー紀要(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、第90巻、p.5873〜5877)におけるように改変されている。このアルゴリズムは、アルトシュル(Altschul)ら(1990年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol.)、第215巻、p.403〜410)のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれ、例えば国立生物工学情報センター(NCBI:National Center for Biotechnology Information)のワールドワイドウェブサイトで利用可能である。BLASTヌクレオチド検索は、例えば、本明細書中に記載の核酸と相同であるヌクレオチド配列を得るために、次のパラメータ:ギャップ
ペナルティー=5;ギャップ伸長ペナルティー=2;ミスマッチペナルティー=3;一致報酬=1;予想値10.0;およびワードサイズ=11を用いて、NBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と呼ばれる)を用いて行い得る。BLASTタンパク質検索は、本明細書中に記載のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、次のパラメータ:予想値10.0、BLOSUM62スコアリングマトリクスを用いて、XBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と呼ばれる)またはNCBI「blastp」プログラムにより行い得る。比較目的に対してギャップ付きアライメントを得るために、アルトシュル(Altschul)ら(1997年、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acid Res.)、第25巻、p.3389〜3402)に記載のようにギャップ付きBLASTを利用し得る。あるいは、分子間の遠縁関係(Id.)および共通パターンを共有する分子間の関係を検出する繰り返し検索を行うために、PSI−BlastまたはPHI−Blastを使用し得る。BLASTを利用する場合、ギャップ付きBLAST、PSI−BlastおよびPHI−Blastプログラム、個々のプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)の初期設定パラメータを使用し得る。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合させることにより作製される人工的制限酵素である。これらの試薬は、効率的でプログラム可能で特異的なDNA切断を可能にし、インサイチューでのゲノム編集のための強力なツールとなる。転写活性化因子様エフェクター(TALE)は、何らかのDNA配列を実際に結合させるために迅速に設計され得る。TALENという用語は、本明細書中で使用される場合、幅広く、別のTALENなく自力で2本鎖DNAを切断し得る単量体のTALENを含む。TALENという用語はまた、同じ部位でDNAを切断するために一緒に機能するように設計されるTALENのペアの片方または両方のメンバーを指すためにも使用される。一緒に機能するTALENは、DNAの掌性を基準として、左TALENおよび右TALENとも呼ばれ得る。全て参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願第12/965,590号明細書;米国特許出願第13/426,991号明細書(米国特許第8,450,471号明細書);米国特許出願第13/427,040号明細書(米国特許第8,440,431号明細書);米国特許出願第13/427,137号明細書(米国特許第8,440,432号明細書);および米国特許出願第13/738,381号明細書を参照されたい。
遺伝子の発現を得るために、様々な核酸が細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、核酸という用語は、DNA、RNAおよび核酸類似体ならびに2本鎖または1本鎖である核酸(すなわちセンスまたはアンチセンス1本鎖)を含む。核酸類似体は、例えば核酸の安定性、ハイブリッド形成または溶解度を改善するために、塩基部分、糖部分またはリン酸バックボーンにおいて修飾され得る。塩基部分での修飾には、デオキシチミジンに対するデオキウリジンおよびデオキシシチジンに対する5−メチル−2’−デオキシシチジンおよび5−ブロモ−2’−ドキシシチジン(doxycytidine)が含まれる。糖部分の修飾としては、2’−O−メチルまたは2’−O−アリル糖を形成させるための、リボース糖の2’ヒドロキシルの修飾が挙げられる。デオキシリボースリン酸バックボーンは、モルホリノ核酸を生成させるために修飾され得、各塩基部分は、6員の、モルホリノ環またはペプチド核酸に連結され、デオキシリン酸バックボーンはシュードペプチドバックボーンにより置換され、4個の塩基が保持される。サマートン(Summerton)およびウェラー(Weller)著、1997年、アンチセンス・ヌクレイック・アシッド・ドラッグ・デベロップメント(Antisense Nucleic Acid Drug Dev.)、第7巻(3)、p.187;およびハイラップ(Hyr
up)ら著、1996年、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー(Bioorgan.Med.Chem.)、第4巻、p.5を参照されたい。さらに、デオキシリン酸バックボーンは、例えばホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートバックボーン、ホスホロアミダイトまたはアルキルホスホトリエステルバックボーンで置換され得る。
TALENに基づく遺伝子修正は、多くの臨床および前臨床(例えば研究)適用を有する。例えば、TALENに基づく遺伝子修正は、突然変異が疾患へとつながる遺伝子を修正するために使用され得る。例えば、表皮水疱症、骨形成不全症、先天性角化不全症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症(CFTR)、ファンコニ貧血、スフィンゴリピドーシス、リポフスチン沈着症、副腎白質ジストロフィー、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球貧血、サラセミアなどであるが限定されない、挿入および欠失を含む小さな塩基変化を特徴とする何らかの疾患である。
、繊維芽細胞における内在性ヒト遺伝子の最初のTALEN介在性インサイチュー修正である。
細胞の増殖/増大
TALENに基づく遺伝子修正により修飾しようとする細胞は、患者から、またはドナーから得ることができる。この細胞は、繊維芽細胞などのあらゆるタイプの細胞であり得る。TALENに基づく遺伝子修正により修飾されると、細胞は、疾患を処置すべく、増殖されおよび/または患者に投与され得る。
、ラット血清(RS:rat serum)、血清代替物(ノックアウト血清代替物(KSR:KnockOut Serum Replacement、インビトロジェン(Invitrogen))を含むが限定されない)およびウシ胎仔体液が挙げられる。補体カスケードの成分を不活性化するために必要とされるとみなされる場合、55〜65℃で血清を熱不活性化し得ることが理解される。1つ以上の所望の細胞タイプの生存を促進するために、血清濃度の変更または培養液からの血清の除去も使用され得る。ある実施形態において、FBS/または種細胞タイプに特異的な血清の存在下で細胞を培養する。例えば、細胞は、単離され得、および/または約5%〜約15%以上、例えば約20%、約25%または約30%などを含む、約0.5%〜約5%以上の総血清(例えばFBS)または血清代替物濃度で増大させられ得る。血清の濃度は経験的に決定され得る。
アルブミンは、脂肪酸不含処方において同様に使用され得る。
次の例は、本発明のある一定の実施形態および態様を明らかにし、さらに説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものと解釈すべきものではない。
材料および方法。
試験対象および細胞株誘導。
図1Aに記載のTALEN候補を、ゴールデンゲートアセンブリ(Golden Gate Assembly)法を介して作製し、記載されるようなCAGGプロモータ駆動性FokIエンドヌクレアーゼのホモ二量体に挿入した[1、2]。表1で示されるLAFおよびLARプライマーを用いて左ドナーアームを増幅させた。記載のように重複オリゴヌクレオチドアセンブリストラテジーを用いて2個の断片(内側および外側)において
右アームを合成した[3、4]。表1に全プライマーセットを示す。loxPが導入されたPGKピューロマイシンカセットに左および右アームをクローニングした。
細胞を、20%FBS、100U/mL非必須アミノ酸、並びに各0.1mg/mLのペニシリンおよびストレプトマイシン(インビトロジェン(Invitrogen))がそれぞれ補給されたDMEMから構成される増殖培地中に維持し、2%O2、5%CO2および37Cで培養した。
ゲノムDNAを、TALEN遺伝子導入から48時間後に単離するとともに、サーベイヤFプライマーおよびサーベイヤRプライマーを用いて30サイクル増幅させ、記載のようにサーベイヤヌクレアーゼ処理に供した[6]。10%TBE PAGEゲル(インビトロジェン(Invitrogen))上で生成物を分離した。オフターゲットのアンプリコンについて、PCR反応を35サイクル進めており、プライマーは全て表1に列挙されている。
HDRの定量のために、TALENおよび5μLの40μMの1本鎖オリゴヌクレオチドドナーを細胞に遺伝子移入し、3種類のプライマー:サーベイヤF、サーベイヤRおよびリンカーフォワードプライマーを用いて、48時間でPCRによりスクリーニングした。記載のように、デンシトメトリーを行った[6]。遺伝子修正のために、各2.5μgのTALEN DNAとともに10μgのドナープラスミドを導入し、次に記載のように選択を行った。
細胞を、0.2μg/mLピューロマイシンにおいてバルクで選択し、サブプールに分
離し、HDRについてスクリーニングし、次いで10cm2皿中に低密度(250〜750個の総細胞)で播種した。10ng/mL上皮増殖因子および0.5ng/mL繊維芽細胞増殖因子を補給した基礎培地の存在下で、シリコーングリース付きのクローニングディスク(全てコーニング(Corning)から)を単一細胞上に置いた。連続的に容器を大きくして、細胞を増大させた。アデノウイルスcreレコンビナーゼを20のMOIで添加してPGKピューロマイシンカセット(ベクターバイオラボズ(Vector BioLabs))を除去した。
C7GT1およびC7GT2プライマー対を使用して、ドナーからの連結部を内在性遺伝子座へと増幅させた(上流SPMPスクリーニング)。ApaI SPMP領域を、C7APAFおよびC7GT2でのPCR増幅前および後にApaIで処理したゲノムDNA上で評価した。クローン性単離株からのメッセンジャーRNAをcDNAに変換し、RT1およびRT2によりスクリーニングし、次いでApaIで消化した。ApaI耐性アンプリコンをクローニングし、サンガー配列決定を行った。
遺伝子修正した繊維芽細胞を、T150フラスコ中で増大させ、トリプシン処理して単一細胞懸濁液を得た。次いで100μL PBS+0.5%BSA+ヨウ化プロピジウム(イーバイオサイエンシーズ(eBiosciences))中で細胞を再懸濁し、続いて等体積のPKH26参照マイクロビーズ(シグマ(SIGMA))を添加した。5000個のビーズ事象を回収し、製造者のプロトコール(シグマ(SIGMA))に従い、明白な生存可能細胞数を算定した。
遺伝子修正された繊維芽細胞(または対照としての未修正細胞)を、[7、8]に記載のようにiPSCに対して再プログラムし、次いで可視的な塊が形成されるまでSCIDマウスの側腹部に入れた。包埋し染色するために塊を切除した。
遺伝子修正した細胞を、チャンバースライド上に置き、24時間後に4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.2%TritonXにより浸透処理し、1%BSAでブロッキング処理し、ポリクローナル抗VII型コラーゲン抗体(1:1500;デビッド・ウッドリー(David Woodley)博士およびメイ・チェン(Mei Chen)博士より厚意で提供された)で染色した。二次抗体染色は、ロバ抗ウサギIgG Cy3(1:500;ジャクソンイムノリサーチ(Jackson Immunoresearch))で行った。アイソタイプ対照染色は、全分子ウサギIgG(ジャクソンイムノリサーチ(Jackson Immunoresearch))を用いて行った。4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories))で核を染色した。画像は、オリンパスBX61 FV500共焦点顕微鏡(オリンパス株式会社)で745のPMT電圧を用いて撮影し、フルオビュー(Fluoview)ソフトウェアバージョン4.3を用いて分析した。ライカ顕微鏡上で光学顕微鏡検査を実施した。
CMV−GFP導入ベクター、D64Vインテグラーゼ突然変異を有するpCMV−ΔR8.2パッケージングプラスミド[9、10]、およびpMD2.VSV−Gエンベロープをコードするプラスミドについての、脂質ベース同時遺伝子導入(リポフェクタミン(Lipofectamine)2000、インビトロジェン(Invitrogen))を介して、インテグラーゼ欠損型レンチウイルス(IDLV:Integrase−d
efective lentiviral)粒子を293T細胞において生成させた。TALENを用いたHEK293細胞のヌクレオフェクション(nucleofection)によって遺伝子タグ付加を行い、続いて24時間後、7のMOIでGFP IDLVの導入を行った。酵素MseIおよびTsp509Iを用いたLAM−PCR[11]およびnrLAM−PCR[12]によって100ngのゲノムDNAを二重分析し、IDLV組み込み部位のゲノム全域にわたる回復を確認した。(nr)LAM−PCRアンプリコンを、ロシュ(Roche)/454ピロシーケンスプラットフォームによって配列決定し、HISAPパイプラインを用いて組み込み部位データを分析した[13]、[14]、[15]。パターン・マッチャー・スキャン・フォー・マッチーズ(pattern matcher scan−for−matches)を用いて、潜在的TALENオフターゲット結合部位について、近距離で>1 ISを有するゲノム位置をスキャンした[13]。
真皮表皮接合部(DEJ:dermal−epidermal junction)でのVII型コラーゲンタンパク質の喪失は、皮膚の構造完全性の損失をもたらす。同種由来の全身造血細胞または局所繊維芽細胞移植によるDEJでのVII型コラーゲンの蓄積の復元は、症状を改善し得る[16〜18]。しかし、毒性、感染および移植失敗のリスクのために同種細胞移植の有効性は最適とは言えないため、新規の自己細胞に基づく治療の開発の推進が急がれる。したがって、本明細書中でTALEN技術に基づくCOL7A1修正に対するゲノム編集ストラテジーを記載する。繊維芽細胞は、その誘導が容易なことおよび培養において増殖停止に対して低感受性であることならびにそれらのDEJでのVII型コラーゲン沈着能ゆえに、理想的な細胞タイプである[18、19]。TALENは、使用者が定めたゲノム遺伝子座で2本鎖DNA破壊を誘導し得、したがってHDRを刺激する人工ヌクレアーゼであり、それらの標的化能および作製が容易なことにおいて他のヌクレアーゼよりも優れている[20、21]。
の14.6%の比率およびHDRの2.1%の比率は、ヒト繊維芽細胞の高レベル修飾に対するTALEN使用の有効性を示す。
次のものが挙げられる:(i)各ヌクレアーゼの単量体のDNA結合タンパク質を一対で用いてインビトロで試験管内進化法(SELEX:Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)を行い、次に潜在的オフターゲット部位を予想するためにこのデータを使用すること[25]、(ii)二量体のヌクレアーゼを使用してインビトロ切断部位選択を行い、次にヌクレアーゼ誘導性突然変異についての目的の細胞のゲノムで生じる、この選択由来の部位を調べること、(iii)組み込み欠損型レンチウイルス(IDLV)の傾向を利用してヌクレアーゼ誘導性DSBに組み込み、次いでLAM−PCRによって挿入点を同定すること[9]。方法(ii)および(iii)が方法(i)よりもヌクレアーゼオフターゲット部位の同定においてより優れていると思われるものの、前者の方法は、他法により予想されるオフターゲット部位を同定することができず、このことから、そのオフターゲット事象検出において網羅的である方法はないことが示唆される。ヌクレアーゼ生成DSBに捕捉され得る緑色蛍光タンパク質(GFP:green fluorescent protein)遺伝子とともにIDLVを用いて、方法(iii)を利用した(図11A)[9、26]。ヒト胚性腎臓(293)細胞を加速的増殖能があるために使用したが、これにより非組み込みIDLVの迅速な希釈が促進され、無作為な組み込みが最小化されるはずである。さらに、293細胞のオープンクロマチン構造ゆえに、何らかのオフターゲット効果が初代細胞よりも大きい度合いまで顕在化し、オフターゲット事象のより感度の高いマッピングを可能にするという仮説が立てられた。GFP IDLVのみの導入は、293細胞におけるGFP発現の急速な喪失をもたらした(図12)。IDLVおよびTALENの同時導入は、GFP細胞の安定な集団をもたらし(図11B)、非制限的直線状増幅介在(nonrestrictive linear amplification−mediated)PCR((nr)LAM−PCR)により組み込み部位をマッピングするためにこれを使用した(図11C)。IDLVと隣接ゲノム配列との間の接合部を示す5個の部位を回復させた(図11D)。これらの事象は、予想外ではなく[9]、臨床試験で使用されるヌクレアーゼでさえオフターゲット効果を示し、回復された非コード領域は、このTALENが、遺伝子発現に負の影響を与えないと予想される安全性プロファイルを保持することを示唆する。
ドナープラスミド配列の例は配列番号22で示される。ドナー配列の左アームの例は配列番号31で示される。ドナーのLoxp部位の例は配列番号23で示される。ドナーのPGKプロモータの例は配列番号24で示される。ドナー配列のピューロマイシン遺伝子の例は配列番号25で示される。ドナーのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの例は配列番号26で示される。ドナーのLoxp部位の例は配列番号27で示される。ドナーの右アームの例は配列番号28で示される。TALEN左(pTAL286)の例は配
列番号29で示される。TALEN右(pTAL287)の例は配列番号30で示される。
(付記)
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、記載する。
[項1]
標的遺伝子における遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための方法であって、
複数のTALエフェクター反復配列およびエンドヌクレアーゼドメインを含むTALENタンパク質をコードする1つ以上の核酸および
核酸ドナー配列
と細胞を接触させることを含み、
前記TALENタンパク質が前記細胞中で発現され、前記標的遺伝子において部位特異的な2本鎖DNA破壊を誘導し、前記ドナー配列が、前記遺伝性疾患または障害を処置するために、遺伝子突然変異の修正をもたらすDNA修復のための鋳型であり、正確な遺伝子発現をもたらす、方法。
[項2]
前記細胞が、線維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、造血子孫細胞、T細胞、B細胞、グリア細胞、神経細胞、神経膠前駆細胞、神経膠幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞および網内系の細胞からなる群から選択される、項1に記載の方法。
[項3]
前記TALENタンパク質が左TALENであり、前記1つ以上の核酸が、前記標的遺伝子において前記2本鎖破壊をなすために前記左TALENと協働可能な右TALENをコードする核酸をさらに含む、項1に記載の方法。
[項4]
前記TALENをコードする前記核酸または前記核酸ドナー配列が、ベクターまたはプラスミドの一部である、項1に記載の方法。
[項5]
前記標的遺伝子が、遺伝子変化または突然変異を有する遺伝子である、項1に記載の方法。
[項6]
前記標的遺伝子がCOL7A1である、項5に記載の方法。
[項7]
前記TALENタンパク質をコードする前記核酸が、前記複数のTALエフェクター反復配列と前記エンドヌクレアーゼドメインとの間にスペーサを含む、項1に記載の方法。
[項8]
前記スペーサが、12〜30ヌクレオチド長である、項7に記載の方法。
[項9]
前記遺伝性疾患が、表皮水疱症、劣性栄養障害型表皮水疱症(RDEB)、骨形成不全症、先天性角化不全症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症(CFTR)、ファンコニ貧血、スフィンゴリピドーシス、リポフスチン沈着症、副腎白質ジストロフィー、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球貧血およびサラセミアからなる群から選択される、項1に記載の方法。
[項10]
前記遺伝性疾患が表皮水疱症である、項1に記載の方法。
[項11]
遺伝子突然変異により引き起こされる遺伝性疾患または障害を処置するための方法であって、
a)細胞に(i)第1の転写活性化因子様(TAL)エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第1の核酸、(ii)第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第2の核酸、および(iii)およびドナー配列を導入する工程であって、前記第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のTALエフェクター反復配列およびFokIエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のTALエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第1のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、前記細胞内での標的DNAの第1のハーフサイト配列への結合能を含むとともに、前記第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的DNAの第2のハーフサイト配列に結合されるときに前記標的DNAを切断する能力を含み、前記標的DNAが、スペーサ配列によって分離される前記第1のハーフサイト配列および前記第2のハーフサイト配列を含み、前記第1および第2のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも前記標的配列の5’および3’末端で標的に対する相同性および事前に選択された遺伝子変化を含み、かつ、前記遺伝子突然変異の修正をもたらすDNA修復のための鋳型である、該導入工程;および
(b)前記突然変異を修正し、かつ、正確な遺伝子発現を復元するために、前記第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が発現される条件下で前記細胞を培養する工程、を含む方法。
[項12]
ドナー配列を含む核酸であって、前記ドナー配列が遺伝子突然変異の修正をもたらす部位特異的なDNA修復のための鋳型であり、前記ドナー配列が、少なくとも標的配列の5’および3’末端に対する相同性を含み、前記ドナー配列の一部分が、TALENタンパク質と併せて使用するための前記標的配列を修正するための修復配列を含む、核酸。
[項13]
ドナーが配列番号22を含む、項12に記載の核酸。
[項14]
標的がCOL7A1である、項12に記載の核酸。
[項15]
ドナーの5’および3’末端がそれぞれ標的に対する少なくとも100塩基の配列同一性を有する、項12に記載の核酸。
[項16]
配列番号29を含む、TALENタンパク質をコードする核酸。
[項17]
配列番号30を含む、TALENタンパク質をコードする核酸。
[項18]
項16に記載の核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
[項19]
項17に記載の核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
[項20]
ドナー配列を含むベクターまたはプラスミドであって、前記ドナー配列が、遺伝子突然変異の修正をもたらす部位特異的なDNA修復のための鋳型であり、前記ドナー配列が、少なくとも標的配列の5’および3’末端に対する相同性を含み、前記ドナー配列の一部分が、TALENタンパク質と併せて使用するための前記標的配列を修正するための修復配列を含む、ベクターまたはプラスミド。
[項21]
ドナーが配列番号22を含む、項20に記載のベクターまたはプラスミド。
[項22]
標的がCOL7A1である、項20に記載のベクターまたはプラスミド。
[項23]
ドナーの5’および3’末端がそれぞれ標的に対して少なくとも100塩基の配列同一性を有する、項20に記載のベクターまたはプラスミド。
[項24]
配列番号22、31、28、29または30のうち1つ以上を含む、ベクターまたはプラスミド。
[項25]
外来配列番号22、31、28、29もしくは30のうち1つ以上またはこのような配列から発現されるタンパク質を含む、単離宿主細胞。
[項26]
配列番号22、31、28、29もしくは30またはこのような配列から発現されるタンパク質を含む、遺伝子移入された細胞株。
[項27]
細胞中で標的遺伝子における部位特異的な2本鎖DNA破壊を誘導可能な第1のTALENタンパク質をコードする核酸と、
前記標的遺伝子における遺伝子突然変異の修正のための鋳型である核酸ドナー配列と、
を含む組成物。
[項28]
前記細胞が、繊維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、造血子孫細胞、T細胞、B細胞、グリア細胞、神経細胞、神経膠前駆細胞、神経膠幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞および網内系の細胞からなる群から選択される、項27に記載の組成物。
[項29]
前記第1のTALENタンパク質が、左TALENであり、および前記核酸が、前記標的遺伝子において前記部位特異的な2本鎖DNA破壊をなすために前記左TALENと協働する右TALENである第2のTALENをさらにコードする、項27に記載の組成物。
[項30]
前記TALENタンパク質をコードする前記核酸または前記核酸ドナー配列がベクターまたはプラスミドの一部である、項27に記載の組成物。
[項31]
前記標的遺伝子がCOL7A1である、項27に記載の組成物。
[項32]
前記第1のTALENまたは前記第2のTALENが、複数のTALエフェクター反復配列およびエンドヌクレアーゼドメインと、前記複数のTALエフェクター反復配列の間のスペーサとを含み、前記エンドヌクレアーゼドメインがスペーサを含む、項29に記載の組成物。
[項33]
前記スペーサが12〜30ヌクレオチド長である、項32に記載の組成物。
[項34]
遺伝性疾患が、表皮水疱症、劣性栄養障害型表皮水疱症(RDEB)、骨形成不全症、先天性角化不全症、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症(CFTR)、ファンコニ貧血、スフィンゴリピドーシス、リポフスチン沈着症、副腎白質ジストロフィー、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球貧血およびサラセミアからなる群から選択される、項27に記載の組成物。
[項35]
前記遺伝性疾患が表皮水疱症である、項34に記載の組成物。
[項36]
少なくとも1つの核酸を含む組成物であって、
(i)第1の転写活性化因子様(TAL)エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第1の核酸、
(ii)第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードする第2の核酸、および
(iii)およびドナー配列、
を含み、
前記第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のTALエフェクター反復配列およびFokIエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のTALエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第1のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、細胞内で標的DNAの第1のハーフサイト配列に結合可能であり、前記標的DNAが遺伝子突然変異を有し、かつ、前記第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的DNAの第2のハーフサイト配列に結合されるときに前記第1のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的DNAを切断可能であり、前記標的DNAが、スペーサ配列によって分離される前記第1のハーフサイト配列および前記第2のハーフサイト配列を含み、前記第1および第2のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも前記標的DNAの5’および3’末端で前記標的DNAと相同である領域を含み、かつ、前記標的DNAにおいて遺伝子突然変異の修正をもたらすDNA修復のための鋳型である、組成物。
[項37]
項27に記載の第1のTALENタンパク質をコードする核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
[項38]
項37に記載の第1の核酸または第2の核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
[項39]
項27に記載の第1のTALENタンパク質をコードする核酸を含むベクター。
[項40]
項37に記載の第1の核酸または第2の核酸を含むベクター。
[項41]
第1のTALENタンパク質をコードする核酸と、
核酸ドナー配列と、を含む組成物であって、
前記第1のTALENタンパク質は、細胞中で、表皮水疱症を引き起こし得る遺伝子突然変異を有するCOL7A1遺伝子において部位特異的な2本鎖DNA破壊を誘導可能であり、
前記核酸ドナー配列は、前記COL7A1遺伝子において前記遺伝子突然変異の修正のための鋳型である、組成物。
Claims (13)
- 配列番号29および配列番号30からなる群から選択された配列を含む、TALENタンパク質をコードする核酸。
- 請求項1に記載の核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
- 遺伝子突然変異遺伝子により引き起こされる遺伝性疾患または障害の処置での使用のための組成物であって、
細胞中で標的遺伝子における部位特異的な2本鎖DNA破壊を誘導可能な第1のTALENタンパク質をコードするとともに、配列番号29および配列番号30からなる群から選択された配列を含む核酸と、
前記標的遺伝子における遺伝子突然変異の修正のための鋳型である核酸ドナー配列と、
を含み、
前記細胞が、線維芽細胞、ケラチン産生細胞、誘導型多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、造血子孫細胞、T細胞、B細胞、グリア細胞、神経細胞、神経膠前駆細胞、神経膠幹細胞、筋肉細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝臓細胞および網内系の細胞からなる群から選択され、
前記遺伝性疾患が表皮水疱症であり前記標的遺伝子がCOL7A1である、組成物。 - 前記第1のTALENタンパク質が、左TALENであり、および前記核酸が、前記標的遺伝子において前記部位特異的な2本鎖DNA破壊をなすために前記左TALENと協働する右TALENである第2のTALENをさらにコードする、請求項3に記載の組成物。
- 前記TALENタンパク質をコードする前記核酸または前記核酸ドナー配列がベクターまたはプラスミドの一部である、請求項4に記載の組成物。
- 前記第1のTALENまたは前記第2のTALENが、複数のTALエフェクター反復配列およびエンドヌクレアーゼドメインと、前記複数のTALエフェクター反復配列の間のスペーサとを含み、前記エンドヌクレアーゼドメインがスペーサを含む、請求項4または請求項5に記載の組成物。
- 前記スペーサが12〜30ヌクレオチド長である、請求項6に記載の組成物。
- 遺伝子突然変異遺伝子により引き起こされる遺伝性疾患または障害の処置での使用のための、少なくとも1つの核酸を含む組成物であって、
(i)第1の転写活性化因子様(TAL)エフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードするとともに、配列番号29および配列番号30からなる群から選択された配列を含む第1の核酸、
(ii)第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体をコードするとともに、配列番号29および配列番号30からなる群から選択された配列を含む第2の核酸、および
(iii)ドナー配列、
を含み、
前記第1および第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体のそれぞれが、複数のTALエフェクター反復配列およびFokIエンドヌクレアーゼドメインを含み、前記複数のTALエフェクター反復配列のそれぞれが反復可変性二残基を含み、前記第1のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、細胞内で標的DNAの第1のハーフサイト配列に結合可能であり、前記標的DNAが遺伝子突然変異を有し、かつ、前記第2のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的DNAの第2のハーフサイト配列に結合されるときに前記第1のTALエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が前記標的DNAを切断可能であり、前記標的DNAが、スペーサ配列によって分離される前記第1のハーフサイト配列および前記第2のハーフサイト配列を含み、前記第1および第2のハーフサイトが同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し、前記ドナー配列が、少なくとも前記標的DNAの5’および3’末端で前記標的DNAと相同である領域を含み、かつ、前記標的DNAにおいて遺伝子突然変異の修正をもたらすDNA修復のための鋳型であり、
前記ドナー配列が前記標的DNAにおける遺伝子突然変異の修正のための鋳型であり、前記遺伝性疾患が表皮水疱症であり、さらに前記標的DNAがCOL7A1である、組成物。 - 請求項3〜5のいずれか一項に記載の第1のTALENタンパク質をコードする核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
- 請求項8に記載の第1の核酸または第2の核酸によりコードされるかまたは発現される、タンパク質。
- 請求項3〜5のいずれか一項に記載の第1のTALENタンパク質をコードする核酸を含むベクター。
- 請求項8に記載の第1の核酸または第2の核酸を含むベクター。
- 第1のTALENタンパク質をコードするとともに、配列番号29および配列番号30からなる群から選択された配列を含む核酸と、
核酸ドナー配列と、を含む組成物であって、
前記第1のTALENタンパク質は、細胞中で、表皮水疱症を引き起こし得る遺伝子突然変異を有するCOL7A1遺伝子において部位特異的な2本鎖DNA破壊を誘導可能であり、
前記ドナー配列は、前記COL7A1遺伝子における前記遺伝子突然変異の修正のための鋳型である、組成物。
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