JP6480629B1 - グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] リン酸塩、NaCl、グリセリン、硫酸塩、アルギニン塩からなる群より選択される、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用する工程を含む、糸状菌を宿主として用いたグルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法。
[2] リン酸塩が、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸アンモニウム又はこれらの組み合わせであるか、或いは、硫酸塩が硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム又はこれらの組み合わせである、或いはアルギニン塩がアルギニン塩酸塩である、実施形態1に記載の製造方法。
[3] (i)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸塩であり、リン酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として200mM〜1Mである、
(ii)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、NaClであり、NaClについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として5mM〜1Mである、
(iii)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸マグネシウムであり、硫酸マグネシウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として300mM〜1Mである、
(iv)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸アンモニウムであり、リン酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として200mM〜1Mである、
(v)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、グリセリンであり、グリセリンについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として2.5〜10重量%である、
(vi)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸アンモニウムであり、硫酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として300mM〜1Mである、又は
(vii)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、アルギニン塩酸塩であり、アルギニン塩酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として100mM〜1Mである、
実施形態1または2に記載の製造方法。
[4] 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態1〜3のいずれかに記載の製造方法。
[5] 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が12箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態1〜4のいずれかに記載の製造方法。
[6] 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が10箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態5に記載の製造方法。
[7] 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が8箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態6に記載の製造方法。
[8] 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、ムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態4〜7のいずれかに記載の製造方法。
[9] 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、野生型遺伝子から改変された遺伝子によりコードされるムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態8に記載の製造方法。
[10] 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体に関し、そのアミノ酸配列中の糖鎖付加部位であるアミノ酸残基が、糖鎖付加されないアミノ酸残基に置換されているグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態9に記載の製造方法。
[11] グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造を行う宿主がアスペルギルス属の宿主である、実施形態1〜10のいずれかに記載の製造方法。
[12] 宿主がアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)又はアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)である、実施形態11に記載の製造方法。
[13] 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号5のアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態10に記載の製造方法。
[14] 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号5のアミノ酸配列に1又は数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、実施形態10に記載の製造方法。
[15] グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が2倍以上増大する、実施形態1〜14のいずれかに記載の製造方法。
[16] グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が6倍以上増大する、実施形態15に記載の製造方法。
配列番号1の27位、103位、158位、200位、216位、258位、270位、355位、367位、381位、403位、419位、432位、461位、498位、及び552位からなる群より選択される1以上の位置における、セリン及びトレオニン以外のアミノ酸への置換、並びに
配列番号1の26位、102位、157位、199位、215位、257位、269位、354位、366位、380位、402位、418位、431位、460位、497位及び551位からなる群より選択される1以上の位置のアミノ酸のプロリンへの置換が挙げられる。糖鎖付加部位を改変された変異体は、このようなアミノ酸置換を1以上、例えば1〜48、1〜40、1〜34、2〜25、3〜20、例えば4〜14有し得る。
培地組成1
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸2水素カリウム 4.6%
リン酸水素2カリウム 4.6%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸2水素カリウム 1.5%
リン酸水素2カリウム 1.5%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸2水素カリウム 7.6%
リン酸水素2カリウム 7.6%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
リン酸2水素ナトリウム 1.5%
リン酸水素2ナトリウム 1.5%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
リン酸2水素ナトリウム 4.6%
リン酸水素2ナトリウム 4.6%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
リン酸2水素ナトリウム 7.7%
リン酸水素2ナトリウム 7.7%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
NaCl 0.3%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
NaCl 2.9%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
NaCl 5.8%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
グリセリン 10%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
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パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
リン酸アンモニウム 2.6%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
硫酸アンモニウム 13.2%
硫酸マグネシウム・7水和物 0.05%
しょうゆ油 0.40%
パインデックス#2 2%
ハイポリペプトン 2%
酵母エキス 1%
リン酸1カリウム 0.25%
リン酸2カリウム 0.25%
硫酸マグネシウム・7水和物 24.6%
しょうゆ油 0.40%
FAD−GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。FAD−GDHの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート(PMS)および2,6−ジクロロインドフェノール(DCIP)を用いた以下の系を用いて測定することができる。
(反応1) D−グルコ−ス + PMS(酸化型)
→ D−グルコノ−δ−ラクトン + PMS(還元型)
(反応2) PMS(還元型) + DCIP(酸化型)
→ PMS(酸化型) + DCIP(還元型)
ある実施形態において、FAD−GDHは、配列番号5のアミノ酸配列を有するものであり得る。別の実施形態において、FAD−GDHは、該アミノ酸配列において1もしくは数個(例えば21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個又は2個)のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものであり得る。別の実施形態において、FAD−GDHは、配列番号5において156〜158位への変異、198〜200位への変異、214〜216位への変異、247〜249位への変異、256〜258位への変異、379〜381位への変異、430〜432位への変異、459〜461位への変異、550〜552位への変異、からなる群より選択される変異を、1以上、2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、例えば9以上有しうる。
ある実施形態において、FAD−GDHをコードする遺伝子は、配列番号6の塩基配列を有するものであり得る。遺伝子は全合成されたものでもよく、または天然配列を取得して変異を導入し作製したものでもよい。また、その改変体を遺伝子工学的手法により作製しうる。
FAD−GDHは、他の公知のFAD−GDHより取得することもできる。公知のFAD−GDHの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属、シルシネラ(Circinella)属由来のFAD−GDH等が挙げられる。または、アスペルギルス属、ペニシリウム属、グロメラ属由来のFAD−GDHが挙げられる。
上述のように得られたFAD−GDH遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
FAD−GDH酵素は、上述のように取得したFAD−GDHを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるFAD−GDH遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からFAD−GDHを単離することにより製造すればよい。
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはFAD−GDH、電子受容体、そして反応促進剤としてN−(2−アセトアミド)イミド2酢酸(ADA)、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis−Tris)、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる1以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてpH緩衝剤、発色試薬を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、還元により退色する電子受容体もしくは電子受容体より電子を受け取ることによって重合し生成する色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作成したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
まずMucor属由来GDH(MpGDH、配列番号1)にN66Y/N68G/C88A/A175C/S192P/S196N/I212L/N214C/A218H/I226T/D228N/E230Q/V232A/Q233R/V235A/T239A/T387C/G466D/E554D/L557V/S559Kの変異を導入した改変GDH(MpGDH−M3)をコードする遺伝子を取得した(以下、単にM3ということがある)。上記において、例えば「N66Y」は、配列番号1の66位のアスパラギンがチロシンに置換されていることを意味する。また「/」記号で並列されたアミノ酸置換はそのすべての置換を有することを意味する。MpGDH−M3のアミノ酸配列は配列番号3に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号4に示す。次に、In−Fusion HD Cloning Kitを使用し、キットに添付されたプロトコールに従って、プラスミドpUC19のマルチクローニングサイトにあるIn−Fusion Cloning Siteに、対象遺伝子であるMpGDH−M3遺伝子を連結して、コンストラクト用プラスミド(pUC19−MpGDH−M3)を得た。
M3、M3/S103Q/N365D、M3/N417R/N496R、M3/S103Q/N353D/N365D、M3/S27A/S103Q/N353D/N365D、M3/S27A/S103Q/N268S/N353D/N365D/N401R、M3/S27A/S103Q/N268S/N353D/N365D/N401R/N417R/N496Rのうち、生産量の良好な発現株それぞれ1株を用いて、発現したGDHの分子サイズを下記の手順で比較した。菌体外画分をAmicon Ultra−30K NMWL(ミリポア社製)で5mLまで濃縮し、透析により培地成分を20mMリン酸カリウム緩衝液に置き換えたGDH溶液を調製した。150mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200pg(GEヘルスケア社製)に調製したGDH溶液をアプライし、同緩衝液で溶出させた。
糖鎖量低減型GDHの生産量が低いという課題を解決するため、最も分子サイズが減少していたDG8発現株を用いて、培養条件の観点から検討を行った。
配列番号1 Mucor prainii GDH(MpGDH) aa
配列番号2 MpGDH遺伝子 DNA
配列番号3 MpGDH−M3 aa
配列番号4 MpGDH−M3遺伝子DNA
配列番号5 MpGDH−DG8 aa
配列番号6 MpGDH−DG8遺伝子DNA
配列番号7 M3/S103Q/N365D aa
配列番号8 M3/S103Q/N365D DNA
配列番号9 M3/N417I/N496L aa
配列番号10 M3/N417I/N496L DNA
配列番号11 M3/N417R/N496R aa
配列番号12 M3/N417R/N496R DNA
配列番号13 M3/S103Q/N353D/N365D aa
配列番号14 M3/S103Q/N353D/N365D DNA
配列番号15 M3/27A/S103Q/N353D/N365D aa
配列番号16 M3/27A/S103Q/N353D/N365D DNA
配列番号17 M3/27A/S103Q/N268S/N353D/N365D/N401R aa
配列番号18 M3/27A/S103Q/N268S/N353D/N365D/N401R DNA
配列番号19 M3/27A/S103Q/N256D/N268S/N353D/N365D aa
配列番号20 M3/27A/S103Q/N256D/N268S/N353D/N365D DNA
配列番号21 M3/27A/S103Q/N256D/N268S/N353D/N365D/N417R/N496R aa
配列番号22 M3/27A/S103Q/N256D/N268S/N353D/N365D/N417R/N496R DNA
Claims (13)
- リン酸塩、NaCl、グリセリン、硫酸塩、アルギニン塩からなる群より選択される、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用する工程を含む、糸状菌を宿主として用いたグルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造方法であって、前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が12箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼであり、かつ、
(i)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸塩であり、リン酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として200mM〜1Mである、
(ii)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、NaClであり、NaClについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として5mM〜1Mである、
(iii)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸マグネシウムであり、硫酸マグネシウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として300mM〜1Mである、
(iv)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、リン酸アンモニウムであり、リン酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として200mM〜1Mである、
(v)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、グリセリンであり、グリセリンについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として2.5〜10重量%である、
(vi)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、硫酸アンモニウムであり、硫酸アンモニウムについてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として300mM〜1Mである、又は
(vii)グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物が、アルギニン塩酸塩であり、アルギニン塩酸塩についてのグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度が、培地中の終濃度として100mM〜1Mである、前記方法。 - リン酸塩が、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸アンモニウム又はこれらの組み合わせであるか、或いは、硫酸塩が、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム又はこれらの組み合わせである、或いはアルギニン塩が、アルギニン塩酸塩である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が10箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼに関し、糖鎖付加部位が8箇所以内であるグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、請求項4に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、ムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼである、請求項3〜5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼが、野生型遺伝子から改変された遺伝子によりコードされるムコール属由来のフラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、請求項6に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体に関し、そのアミノ酸配列中の糖鎖付加部位であるアミノ酸残基が、糖鎖付加されないアミノ酸残基に置換されているグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、請求項7に記載の製造方法。
- グルコースデヒドロゲナーゼの組換え製造を行う宿主がアスペルギルス属の宿主である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の製造方法。
- 宿主がアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)又はアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)である、請求項9に記載の製造方法。
- 前記グルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号5のアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼ変異体である、請求項8に記載の製造方法。
- グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が2倍以上増大する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の製造方法。
- グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を含まない培地、又は、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物をグルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度未満の濃度であって通常の濃度で含む培地を用いてグルコースデヒドロゲナーゼを産生した場合と比較して、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量が、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる化合物を、グルコースデヒドロゲナーゼの産生量を向上させる濃度にて含む培地を使用した場合に、菌体外のグルコースデヒドロゲナーゼ活性が6倍以上増大する、請求項12に記載の製造方法。
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