JP6479761B2

JP6479761B2 - イヌ用がんワクチン

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Publication number: JP6479761B2
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Authority: JP
Inventors: ピエール・ラングラード・ドゥモイヤン; サイモン・ウェイン−ホブソン; クリステル・リアール
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Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2019-03-06
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Description

本発明は、イヌにおけるがんワクチン接種に関する。

ヒトの場合でも同様であるが、先進国で生活しているイヌでは、一貫してその平均余命の延長が見られる。したがって、がんの世界的負担は、主として老齢化とイヌの個体数の増加のため増え続けている。

イヌ科の動物の個体群におけるがんの罹患率は、１０００００匹のイヌ当たりに２８２．２から９５８の間であると見積もられている（Merlo et al. 2008、Vascellari et al. 2009）。イヌにおいて最も頻度の高い腫瘍は、雌における乳腺腫瘍（全てのがんのうちの７０．５％）、非ホジキンリンパ腫（雌において８．４％および雄において２０．１％）、ならびに皮膚腫瘍（雌において４％および雄において１９．９％）である。更に、欧州獣医癌学会（ＥｕｒｏｐｅａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＯｎｃｏｌｏｇｙ）によれば、１０歳を超えたイヌの５０％は、がんに関連する問題で死ぬという。

獣医がんに対して利用可能な処置の選択肢は、ヒト腫瘍学で利用可能なものと比較してかなり限定されている。

動物腫瘍の処置のための最良の手段はいまだに外科手術である。この方法は、多くの獣医師が利用できるという利点があり、かつ多くの場合に治効の可能性がある。しかしながら、治効のためには外科手術は大胆でなければならない。ところが場合によっては、腫瘍は、大きすぎるか、散らばりすぎているか、または完全に取り除くのに十分に近づくこともできない。全体として治効がないのならば、外科手術は、動物の安楽を改善するためと、その平均余命を延長するための暫定的な解決策にしかなりえない。

放射線療法は、獣医学分野における特定種類のがんの処置のためのもう一つの重要な手段である。それは、脳腫瘍のような外科手術のためにほとんど近づけない腫瘍のために特に関心が持たれている（de Fornel et al. 2007）。更に、ヒトにおける最近の研究では、電離放射線（ＩＲ）が、炎症プロセスの始動を含む腫瘍微小環境における本質的変化の誘発により免疫調節要因として作用し得ることが実証された。更に、機材の費用と入手性は、伴侶動物のために放射線療法に行き着くことを困難にする。

化学療法は、動物腫瘍学においてますます使用されるようになっている（Marconato 2011）。ヒト癌療法における医学の進歩を利用して、ビンクリスチン、シクロホスファミド、カルボプラチン、またはシスプラチンのような分子が伴侶動物の処置のためにますます利用できるようになっている。獣医学の分野において、抗がん剤は、特に造血組織に由来する腫瘍（リンパ腫、白血病）の処置で使用される。例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾンを組み合わせるＣＨＯＰプロトコールは、最近多くのリンパ腫の処置において使用されている（Chun 2009）。化学療法剤は、がんに罹った動物の寿命を数週間から数ヶ月間延長するのに特に有効なことがある（ＣＨＯＰプロトコールで処置したイヌの生存期間中央値は１３ヶ月である）。興味深いことに、ヒト患者によって恐れられる副作用、例えば嘔吐、下痢、脱毛は、伴侶動物においては通常頻度が低い。残念ながら、ほとんどの場合、ペットでは化学療法は治効がなく、そして腫瘍はしばしば処置を免れる。

したがって、ヒト医学と全く同様に、標的療法は獣医学においても進展している。こうして、チロシンキナーゼｃ−ｋｉｔの阻害剤である「マシチニブ」（Gentilini 2010）のような幾つかの薬物が既に診療所で利用できる。免疫療法を含む他の処置は、研究中である（Manley et al. 2011）。これらの免疫療法的処置は全て、宿主の免疫系をがん細胞に対して活性化できることを基礎としている。

宿主の免疫系とがんとの間の関係は動的かつ複雑である。それぞれの種類の腫瘍細胞は、多数の体細胞突然変異と後成的に脱調節された遺伝子を持っており、それらの産物は、免疫細胞によって異種抗原として識別される可能性がある（ＭＵＣ−１、β−カテニン、テロメラーゼ…）（Fridman et al. 2012）。増殖する腫瘍は、ＴＩＬ（腫瘍浸潤性リンパ球）と呼ばれる浸潤性リンパ球を含む。これらのキラー細胞は、インビボ（in vivo）で腫瘍排除にしばしば効果が無いが、インビトロ（in vitro）で、つまりは免疫抑制的腫瘍微小環境の外側では特殊な機能を発揮し得る（Restifo et al. 2012）。これは、腫瘍間質が調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＣ）、可溶性因子、例えばインターロイキン６（ＩＬ−６）、ＩＬ−１０、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および抗腫瘍免疫を下方調節するトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）を含む多くの抑制要素を含むからである（Finn 2008、Hanahan and Weinberg 2011）。したがって、適切な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の選択と、がん関連免疫抑制の迂回は、治療ワクチンを成功させるための２つの重要な点である（Disis et al. 2009）。

がんの臨床診療における積極的ながん免疫療法（がんワクチンとも呼ばれる）の近年の導入は、がん予後における免疫応答の役割を際立たせており、かつヒトおよび伴侶動物の幾つかのがんに対してこのアプローチを拡張することへの関心の高まりをもたらした（Dillman 2011、Topalian et al. 2011）（Jourdier et al. 2003）。

この状況において、動物における寛容の破綻および免疫応答の誘導というチャレンジを克服するであろう、イヌのための革新的ながんワクチン戦略に関する必要性が依然存在する。

本発明者らは、本明細書で、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をベースとする、イヌ用のがんワクチン戦略を提案している。

このように、本発明の一つの主題は、（ｉ）テロメラーゼ触媒活性を失ったイヌＴＥＲＴ、または（ｉｉ）その断片をコードする配列を含む核酸を含む免疫原性組成物である。その核酸は、好ましくはＤＮＡであり、好ましくはプラスミドの形のＤＮＡである。

好ましい一実施形態において、核酸は、テロメラーゼ触媒活性を失ったイヌテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする配列を含み、その際、このイヌＴＥＲＴをコードする配列は、核小体局在性シグナルを更に失っている。

具体的な一実施形態において、核酸は、非イヌＴＥＲＴ抗原性断片を更に含む。

本発明の更なる一つの主題は、（ｉ）テロメラーゼ触媒活性を失ったイヌＴＥＲＴ、または（ｉｉ）その断片をコードする配列を含み、かつ非イヌＴＥＲＴ抗原性断片を更に含んでよい核酸である。

免疫原性組成物または核酸は、テロメラーゼを過剰発現する細胞、例えば異形成細胞または腫瘍細胞に対する、イヌにおける免疫応答の始動に有用である。

免疫原性組成物または核酸は、こうして、イヌにおける腫瘍を、好ましくは皮内経路または筋内経路によって処置するにあたり特に有用である。

そのような処置は、それが腫瘍に対する免疫応答、特に特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答と一緒に細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞応答を始動するので、能動免疫療法またはワクチン療法と呼ぶことができる。

本発明は、新形成を伴うイヌにおけるｄＴＥＲＴ特異的応答の誘導を可能にするため、臨床現場において新形成の免疫療法的処置のために使用することができる。

本発明は、例えば遺伝的素因によってがんのリスクを有する可能性のある健康なイヌ、またはある特定の年齢以降の（例えば１０歳を超える、好ましくは１２歳を超える）健康なイヌにおいてｄＴＥＲＴ特異的応答を誘導し、がんの発症を予防するためにも有用である。

一般的には、本発明の処置は、健康なイヌ、発がんリスクを有するイヌ、およびがんを呈するイヌにおける長期免疫記憶応答を誘導し得る。

図１Ａは、ｐＤＵＶ５ヌクレオチド配列（配列番号１）、およびイヌＴＥＲＴ（ｄＴＥＲＴ）アミノ酸配列（配列番号２）を含む、相応するアミノ酸配列を示す。プラスミドｐＤＵＶ５は、ほぼ全長のイヌＴＥＲＴヌクレオチド配列をコードしている。タンパク質の触媒部位における３つの主要アミノ酸（ＶＤＤ）をコードするヌクレオチド配列が欠失されている。更に、核小体中への移入を制御する配列（核小体アドレッシングシグナル（Nucleolar addressing signal））（ｄＴＥＲＴタンパク質のＮ末端配列における最初の４７アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）が欠失されている。更に、ヒトユビキチンをコードするＤＮＡ配列が、ｄＴＥＲＴ配列の上流に付加されている。ユビキチンタンパク質の存在は、ｄＴＥＲＴタンパク質のプロテアソームへのアドレッシングを増強し、かつ得られたペプチドのクラスＩ提示を増加させる。しかしながら、ヒトとイヌのユビキチン配列はタンパク質レベルでは同一なので、生物学的な不適合性は存在しない。ｄＴＥＲＴ配列の下流に、インフルエンザのＶ５ペプチドの配列を、そのタンパク質の検出を容易にするために挿入した。ヌクレオチド１〜６サブクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位ヌクレオチド１３〜２４０ユビキチンヌクレオチド２４１〜３４５９イヌＴＥＲＴヌクレオチド２６７０〜２６７１ＶＤＤ残基をコードする９ｂｐの不活性化型欠失ヌクレオチド３４６０〜３５１３Ａ型インフルエンザのＡ２エピトープヌクレオチド３５１４〜３５５５ＳＶ５のＶ５タグヌクレオチド３５５６〜３５６１２つの終止コドンヌクレオチド３５６２〜３５６７サブクローニングのためのＸｂａＩ制限部位図１Ｂは、ｐＣＤＴヌクレオチド配列（配列番号３）、およびネコ／イヌハイブリッド型ＴＥＲＴアミノ酸配列（配列番号４）を含む、相応するアミノ酸配列を示す。プラスミドｐＣＤＴは、ネコＴＥＲＴ配列由来を５４．４％とイヌＴＥＲＴ配列由来を３５．９％含むネコ／イヌハイブリッド型ＴＥＲＴ（ｈｙＴＥＲＴ）をコードする。タンパク質の触媒部位における３つの主要アミノ酸（ＶＤＤ）をコードするヌクレオチド配列が欠失されている。更に、核小体中への移入を制御する配列（核小体アドレッシングシグナル）（ｈｙＴＥＲＴタンパク質のＮ末端配列における最初の４７アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）を欠いている。ヒトユビキチンをコードするＤＮＡ配列が、ｈｙＴＥＲＴ配列の上流に付加されている。ユビキチンタンパク質の存在は、ｈｙＴＥＲＴタンパク質のプロテアソームへのアドレッシングを増強し、かつ得られたペプチドのクラスＩ提示を増加させる。ｈｙＴＥＲＴ配列の下流に、インフルエンザのＶ５ペプチドの配列を、そのタンパク質の検出を容易にするために挿入した。ヌクレオチド１〜６サブクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位ヌクレオチド１３〜２４０ユビキチンヌクレオチド２４１〜１４１３イヌＴＥＲＴ（ＴＥＲＴ配列の３５．９％）ヌクレオチド１４１４〜３３５１ネコＴＥＲＴ（ＴＥＲＴ配列の５４．４％）ヌクレオチド３３５２〜３４５６イヌＴＥＲＴの最後のエキソンヌクレオチド３４５７〜３５１０インフルエンザのＡ２エピトープヌクレオチド３５１１〜３５５２ＳＶ５のＶ５タグヌクレオチド２６６７〜２６６８ＶＤＤ残基をコードする９ｂｐの不活性化型欠失ヌクレオチド３５５３〜３５５８２つの終止コドンヌクレオチド３５５９〜３５６４サブクローニングのためのＸｂａＩ制限部位図２Ａは、ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドであって、その中にイヌＴＥＲＴ核酸配列またはハイブリッド型ＴＥＲＴ核酸配列がクローニングされている発現プラスミドの概略マップを示している。図２Ｂは、イヌＴＥＲＴタンパク質配列（配列番号５）を示している。インビトロ免疫化研究およびイヌＰＢＭＣにおけるＥＬＩｓｐｏｔアッセイのために使用される、１１残基だけ重複しているｄＴＥＲＴの１５量体ペプチドプール（全部で７０個のペプチド）によってカバーされる領域が灰色で示されている。図３は、ｐＤＮＡコンストラクトが安全であることを示している（Ｔｒａｐｅｚｅ）。ｈＴＥＲＴ、ｐＣＤＴ、またはｐＤＵＶ５プラスミドでトランスフェクトしたＣｒＦＫ細胞から得られた溶解産物を、ＴＲＡＰアッセイによってテロメラーゼ活性について分析した。テロメラーゼ活性のレベルは、それぞれのキットで測定されたコントロールテンプレートの活性および野生型ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）の活性と比較した、相対テロメラーゼ活性として示されている。全ての試料は２．１μｇのタンパク質濃度で三重反復で測定した。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）である（**Ｐ＝０．００３２、ｈＴＥＲＴ対ｐＤＵＶ５の対応のない場合のｔ検定）。図４は、ｐＤＵＶ５で免役したマウスが、Ｈ２拘束性イヌＴＥＲＴペプチドに対する特異的インターフェロンγ分泌性ＣＤ８Ｔ細胞応答を開始することを示すグラフである。７週齢の雌のＣ５７／Ｂｌ６マウスを、１００μｇのｐＤＵＶ５プラスミドで皮内的に（ＩＤ）または筋内的に（ＩＭ）（１グループ当たり１０匹のマウス）０日目に免疫し、そして１４日後に追加免疫した。同時に、コントロールマウスに皮内的経路または筋内的経路（１グループ当たり６匹のマウス）を介してＰＢＳを投与した。追加免疫の１０日後に、全てのマウスの脾臓を採取した。脾細胞をＦｉｃｏｌｌを用いて精製し、そして５μｇ／ｍＬの関連のクラスＩペプチド（ｐ５８０、ｐ６２１またはｐ９８７）で１９時間にわたり三重反復で刺激した。スポットを、ビオチンにコンジュゲートされた検出抗体に曝露し、引き続きＡＰ標識ストレプトアビジンおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴの基質溶液に曝露した。結果は、平均±標準偏差である。マンホイットニーのノンパラメトリック検定、*ｐ値＜０．０５、**ｐ値＜０．０１。図５Ａおよび図５Ｂは、ｐＤＵＶ５プラスミドでのマウスの皮内的免疫化または筋内的免疫化が、Ｈ２拘束性のイヌＴＥＲＴペプチドでパルスされた導入標的細胞の排除によってインビボで測定できる、イヌＴＥＲＴ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答をもたらすことを示している。７週齢の雌のＣ５７／Ｂｌ６マウスを、１００μｇのｐＤＵＶ５プラスミドで皮内的に（ＩＤ）または筋内的に（ＩＭ）０日目に免疫し、そして１４日後にプライミングを行った。９日後の追加免疫注射において、Ｈ２拘束性の個々のｄＴＥＲＴペプチド（ｐ９８７もしくはｐ６２１のいずれか）でパルスされた、またはパルスされていない同系脾細胞を、カルボキシフルオレセイン−ジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で、３種の異なる濃度［高＝１μＭ（ｐ６２１）、中＝０．５μＭ（ｐ９８７）および低＝０．１μＭ（パルスされていない）］で標識した。同じ数の、高ＣＦＳＥ標識された、中ＣＦＳＥ標識された、または低ＣＦＳＥ標識された細胞を、ワクチン接種されたマウスに静脈内経路で導入した。１５〜１８時間後に、ペプチドでパルスされた細胞の消失が、脾臓における蛍光活性化セルソーティング分析によって測定された。特異的な細胞溶解のパーセンテージを、ワクチン接種されたマウス対コントロールマウスにおけるパルスされた細胞対パルスされていない細胞の比率を比較することによって計算した。（Ａ）皮内的経路を介して注射されたマウスの脾臓における、ｐ９８７ペプチド（中、Ｍ）、またはｐ６２１ペプチド（高、Ｈ）でパルスされた標的細胞の排除を示すインビボＣＴＬアッセイの例（左のパネル）。１×ＰＢＳを皮内的経路で注射されたコントロールマウスにおいてはそのような消失は観察されない（右のパネル）。Ｈ＝高、Ｍ＝中、Ｌ＝低。（Ｂ）ｐＤＵＶ５による筋内的ワクチン接種または皮内的ワクチン接種の後の、脾臓におけるそれぞれの個々のペプチドに対するそれぞれのマウスについての特異的な細胞溶解のパーセンテージ。水平のバーは、ペプチドごとの、および免疫化経路ごとの細胞溶解の平均パーセンテージを示している。標準偏差もプロットされている。２回の独立した実験（ｎ＝１０個体の動物／グループ）からの代表データ。ダンの多重比較試験を用いたクラスカル−ウォリス分析、ｎｓ：有意差なし。統計学的有意差は、ｐ値＜０．０５に定める。図６Ａおよび図６Ｂは、ｐＣＤＴで免疫化されたマウスにおける、Ｈ２拘束性ｈｙＴＥＲＴペプチドに対する、ＩＦＮγ＋特異的ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞応答を示している。７週齢の雌のマウスを、１００μｇのｐＣＤＴプラスミドまたはＰＢＳのいずれかで皮内的に（ＩＤ）または筋内的に（ＩＭ）０日目に免疫し、そして１４日後に追加免疫した。追加免疫の１０日後に、脾臓を採取した。脾細胞をＦｉｃｏｌｌを用いて精製し、そして５μｇ／ｍＬの関連のペプチドで１９時間にわたり三重反復で刺激した。スポットを、ビオチンにコンジュゲートされた検出抗体に曝露し、引き続きＡＰ標識ストレプトアビジンおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴの基質溶液に曝露した。（Ａ）プラスミドでワクチン接種したグループは、５匹のＣ５７／Ｂｌ６マウスから構成され、かつコントロールグループは、３匹のマウスから構成されていた。脾細胞は、クラスＩペプチドｐ５８０、ｐ６２１、およびｐ９８７で刺激された。結果は、ペプチド特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８Ｔ細胞の度数を示している。（Ｂ）プラスミドでワクチン接種したグループは、９匹の筋内的に免疫されたＢａｌｂ／ｃＢｙマウスおよび５匹の皮内的免役されたＢａｌｂ／ｃＢｙマウスから構成されていた。コントロールグループは、８匹の筋内的に注射されたＢａｌｂ／ｃＢｙマウスおよび４匹の皮内的注射されたＢａｌｂ／ｃＢｙマウスから構成されていた。脾細胞は、クラスＩＩペプチドｐ９５１、ｐ１１０５、ｐ１１０６、およびｐ１１０９で刺激された。結果は、ペプチド特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ４Ｔ細胞の度数を示している。結果は、平均±標準偏差である。マンホイットニーのノンパラメトリック検定、*ｐ値＜０．０５、**ｐ値＜０．０１。図７Ａおよび図７Ｂは、Ｈ２拘束性のハイブリッド型ＴＥＲＴペプチドでパルスされた導入標的細胞の排除によってインビボで測定できる、ｐＣＤＴプラスミドで免疫されたマウスにおける、ｈｙＴＥＲＴ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を示している。７週齢の雌のＣ５７／Ｂｌ６マウスを、１００μｇのｐＣＤＴプラスミドで皮内的または筋内的に０日目に免疫し、そして１４日後にプライミングを行った。９日後の追加免疫注射において、Ｈ２拘束性の個々のｄＴＥＲＴペプチド（ｐ９８７もしくはｐ６２１のいずれか）でパルスされた、またはパルスされていない同系脾細胞を、カルボキシフルオレセイン−ジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で、３種の異なる濃度［高＝１μＭ（ｐ９８７）、中＝０．５μＭ（ｐ６２１）および低＝０．１μＭ（パルスされていない）］で標識した。同じ数の、高ＣＦＳＥ標識された、中ＣＦＳＥ標識された、または低ＣＦＳＥ標識された細胞を、ワクチン接種されたマウスに静脈内経路で導入した。１５〜１８時間後に、ペプチドでパルスされた細胞の消失が、脾臓における蛍光活性化セルソーティング分析によって測定された。特異的な細胞溶解のパーセンテージを、ワクチン接種されたマウス対コントロールマウスにおけるパルスされた細胞対パルスされていない細胞の比率を比較することによって計算した。（Ａ）皮内的経路でｐＣＤＴでワクチン接種されたマウスの脾臓における、ｐ６２１ペプチド（高、Ｈ）、またはｐ９８７ペプチド（中、Ｍ）でパルスされた標的細胞の排除を示すインビボＣＴＬアッセイの例（左のパネル）。１×ＰＢＳを皮内的経路で注射されたコントロールマウスにおいてはそのような消失は観察されない（右のパネル）。（Ｂ）ｐＣＤＴによる筋内的ワクチン接種または皮内的ワクチン接種の後の、脾臓におけるそれぞれの個々のペプチドに対するそれぞれのマウスについての特異的な細胞溶解のパーセンテージ。水平のバーは、ペプチドごとの、および免疫化経路ごとの細胞溶解の平均パーセンテージを示している。標準偏差もプロットされている。２つの独立した実験（ｎ＝１０個体の動物／グループ）からの代表データ。ダンの多重比較試験を用いたクラスカル−ウォリス分析、*ｐ＜０．１、***ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意差なし。統計学的有意差は、ｐ値＜０．０５に定める。図８は、イヌＰＢＭＣにおけるインビトロ免疫化の原理を示している。凍結されたイヌＰＢＭＣを、組換え型イヌＧＭ−ＣＳＦ（ｒｃＧＭ−ＣＳＦ）およびイヌＩＬ−４（ｒｃＩＬ−４）またはヒトＦｌＴ３（ｈＦｌＴ３）リガンドと一緒に２４時間にわたりインキュベートした。成熟刺激因子（ｒｃＴＮＦα、ｈＩＬ−７、およびｒｃＩＬ−１β）を、次いでｄＴＥＲＴの重複しているペプチドプールと一緒に３日間にわたり添加した。１１日間の培養または１８日間の培養を実施し、次いでＴＥＲＴ特異的Ｔ細胞を、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより検出した。図９Ａおよび図９Ｂは、ナイーブなイヌ由来のＰＢＭＣにおけるｄＴＥＲＴ特異的ＩＦＮγ分泌性Ｔ細胞のレパートリーを示している。凍結されたＰＢＭＣを２４時間にわたりｒｃＧＭ−ＣＳＦおよびｒｃＩＬ−４またはｈＦｌＴ３リガンドと一緒にインキュベートし、そしてｄＴＥＲＴの重複しているペプチドプールおよび成熟化サイトカイン（ｒｃＴＮＦα、ｈＩＬ−７、およびｃａＩＬ−１β）で３日間にわたり成熟させ、それらを、１１日の培養または１８日の培養後に採取して、ＥＬＩＳｐｏｔＩＦＮ−γを実施した。結果は、培養の１１日後（Ａ）または１８日後（Ｂ）の１０^６のイヌＰＢＭＣ当たりの、ペプチド特異的ＩＦＮγ産生性Ｔ細胞の度数を示している。図１０Ａおよび図１０Ｂは、ｄＴＥＲＴペプチドの第一のプール（プール６）と、ｄＴＥＲＴペプチドの第二のプール（プール１９）のそれぞれに対する、特異的ＩＦＮγＴ細胞応答の動力学を示している。６匹のナイーブな健康なビーグル犬に、０日目、２９日目、５７日目、および１４２日目に、４００μｇのｐＤＵＶ５のＤＮＡを皮内注射した後にエレクトロポレーションを行った。末梢血を抜き取り、そして単核細胞を、プール６ペプチドまたはプール１９ペプチドのいずれかに属するイヌテロメラーゼ特異的ペプチドについて、Martinuzzi et al., 2011の方法に従って試験した。ＩＦＮγ特異的Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、プール６および１０のｄＴＥＲＴペプチドについて、その全てがベースライン読み取り値を上回って検出された。図１１Ａおよび図１１Ｂは、プール６のｄＴＥＲＴペプチドと、プール１０のｄＴＥＲＴペプチドのそれぞれに対する、特異的ＩＦＮγＴ細胞応答の動力学を示している。５７日目および１４２日目のｐＤＵＶ５のＤＮＡワクチン接種は、古典的な長期記憶応答を示す、つまり急激に上昇し、よりゆっくりと減退する長期記憶応答を示す。図１２は、腫瘍を有するイヌおよび健康なイヌが、ｄＴＥＲＴ特異的Ｔリンパ球を有することを示している（プール４ペプチド）。末梢血を抜き取り、そしてインビトロ刺激プロトコールを、Martinuzzi zt al, 2011に記載されるように実施した。

定義
テロメラーゼは、ＲＮＡ鋳型と、テロメラーゼ活性の主要決定因である「テロメラーゼ逆転写酵素」（ＴＥＲＴ）と呼ばれる逆転写酵素を含むタンパク質成分とからなる。特に記載がない限り、本明細書においては、用語「テロメラーゼ」はＴＥＲＴを指す。

本発明において、用語「イヌＴＥＲＴ」は、任意のイエイヌ（カニス・ファミリアリス（Canis familiaris）またはカニス・ルプス・ファミリアリス（Canis lupus familiaris）とも呼ばれる）のＴＥＲＴ配列を指す。イヌＴＥＲＴのｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１０３１６３０（ＸＭ＿５４５１９１）で入手できる。イヌＴＥＲＴアミノ酸配列は、配列番号５として示されている。

本発明は、任意のヒトまたは非ヒトの哺乳動物、例えばネコ由来であってよい非イヌのテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）配列を使用することもできる。用語「ネコＴＥＲＴ」は、任意のイエネコ（フェリス・カトゥス（Felis catus）またはフェリス・シルベストリス・カトゥス（Felis silvestris catus）とも呼ばれる）のＴＥＲＴ配列を指す。ネコＴＥＲＴ遺伝子（２３７ｂｐのｍＲＮＡ）の部分分子クローニングは、Yazawa et al. 2003によって報告されている。本発明者らは本明細書でより長いフェリス・カトゥスのＴＥＲＴの配列を提供する。相応するアミノ酸配列は、配列番号７として示されている。

「テロメラーゼ触媒活性」は、テロメラーゼ逆転写酵素としてのＴＥＲＴの活性を指す。用語「テロメラーゼ触媒活性を失った」とは、核酸配列が、不活性な突然変異ＴＥＲＴをコードすることを意味する。

用語「ハイブリッド」または「キメラ」型のアミノ酸またはヌクレオチド配列とは、配列の一部が、ある動物種に由来し、かつ配列の少なくとも別の部分が、異種個体のものである、すなわち少なくとも１種の他の動物種に由来することを意味する。

タンパク質に関しては、用語「断片」は、少なくとも１０アミノ酸の断片、好ましくは少なくとも２０アミノ酸の断片、更に好ましくは少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０アミノ酸断片を指すことが好ましい。

本発明の文脈において、用語「抗原性断片」は、動物におけるＴ細胞応答、好ましくは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導する１つまたは幾つかのエピトープを含むアミノ酸配列を指す。エピトープは、Ｔ細胞受容体または特異抗体に結合し、かつ一般的に約３アミノ酸残基から約３０アミノ酸残基を含み、好ましくはクラスＩのＭＨＣエピトープに関する限りでは８もしくは９アミノ酸を含み、かつクラスＩＩのＭＨＣエピトープに関する限りでは１１から２５アミノ酸を含む特異的部位である。

用語「免疫原性」とは、そう呼ばれる組成物またはコンストラクトが、投与（好ましくはイヌにおいて）に際して免疫応答を誘導できることを意味する。対象における「免疫応答」は、抗原に対しての、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性および細胞性の免疫応答の発生を指す。「体液性免疫応答」は、抗体によって媒介される免疫応答を指す。「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球によって媒介される免疫応答を指す。それは、活性化されたＴ細胞によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、および類似の分子の産生を含む。免疫応答は、当技術分野で公知の、体液性免疫応答を特異的にモニタリングするための標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して測定することができる。本発明の文脈において、免疫応答は、好ましくは、細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞および／またはＣＤ４Ｔ細胞の刺激または増殖を含む。

本明細書で使用される場合に、用語「処置」または「療法」は、治療的処置を含む。より具体的には、治療的処置は、症状の緩和、改善、および／または除去、軽減および／または安定化（例えばより進んだ段階へと進行しないこと）、ならびに腫瘍もしくは異形成、またはそれらの症状の進行の遅延のいずれかを指す。

本明細書で使用される場合に、用語「予防」または「予防する」は、前駆症状の、すなわち特定の症状が生ずる前に疾患の始まりを示すことがある何らかの変調もしくは初期症状（または一連の症状）の、緩和、改善、および／または除去、軽減および／または安定化（例えばより進んだ段階へと進行しないこと）を指す。「テロメラーゼを過剰発現する」細胞は、テロメラーゼを、例えば突然変異もしくは感染に際して発現するが、通常の条件下では普通発現しない対象中の細胞を指すか、または通常条件と比較してより高いレベルのテロメラーゼを（例えば突然変異もしくは感染に際して）発現する対象中の細胞を指す。好ましくは、テロメラーゼを過剰発現する細胞は、少なくとも５％の、少なくとも１０％の、少なくとも２０％の、３０％の、４０％の、５０％の、６０％の、７０％の、８０％の、またはそれより高い発現の増加を示す。

核酸コンストラクト
本明細書において、（ｉ）テロメラーゼ触媒活性を失ったイヌテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、または（ｉｉ）その断片をコードする配列を含む核酸が提供される。

核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよいが、ＤＮＡが好ましく、二本鎖ＤＮＡが更に好ましい。

第一の安全策として、ＴＥＲＴ配列は、テロメラーゼ触媒活性を失っている。好ましい一実施形態において、イヌＴＥＲＴをコードする配列は、触媒活性の不活性化をもたらす突然変異を含む。用語「突然変異」は、１つまたは幾つかのアミノ酸の置換、１つまたは幾つかのアミノ酸の欠失、および／または１つまたは幾つかのアミノ酸の挿入を含む。好ましくは、配列は、欠失を示し、好ましくは図１Ａまたは図１Ｂに示されるように、アミノ酸ＶＤＤの欠失を示す。

第二の安全策として、イヌＴＥＲＴをコードする配列は、核小体局在性シグナルを更に失っていてよい。この核小体局在性シグナルは、ＴＥＲＴの酵素活性と相関している。このシグナルは、ＴＥＲＴ配列のＮ末端にある４７個のＮ末端アミノ酸に相当する。

好ましくは、イヌＴＥＲＴをコードする配列は、全長イヌＴＥＲＴ配列に対して４７個のＮ末端アミノ酸を欠失している。

アミノ酸ＶＤＤと４７個のＮ末端アミノ酸を欠失しているイヌＴＥＲＴ配列は、配列番号６として示されている。

具体的な一実施形態において、核酸は、好ましくはイヌＴＥＲＴの４７個のＮ末端アミノ酸が欠失された配列の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％に相当する、イヌＴＥＲＴ配列、またはその断片だけをコードすることができる。

好ましくは、核酸は、配列番号５または配列番号６を含むか、または前記配列番号からなるイヌＴＥＲＴアミノ酸配列をコードする。

核酸は、非イヌＴＥＲＴ抗原性断片を更にコードすることができる。この実施形態は、自己抗原に対する寛容の破壊を助け、かつイヌにおける免疫記憶応答と一緒に効果的な免疫応答を誘導するために好ましい。１つ以上の非イヌＴＥＲＴ断片の存在は、有利には、抗腫瘍免疫性に助力を提供し、かつＴｈ１サイトカインと呼ばれる特定のサイトカインを分泌することによって潜在的な調節を逆転する、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のある一定のサブタイプを保証する。

イヌＴＥＲＴ配列および非イヌＴＥＲＴ配列またはその断片は、好ましくは融合されて、ハイブリッド型タンパク質またはキメラ型タンパク質として発現される。その一方で、イヌＴＥＲＴ配列および非イヌＴＥＲＴ配列またはその断片は分離されてよいが、同じベクター、例えば同じプラスミドで運ばれてよい。

好ましくは、非イヌＴＥＲＴ抗原性断片は、イヌＴＥＲＴ配列にない断片、またはイヌＴＥＲＴ配列から、それが触媒活性の損失もしくは核小体局在性シグナルの損失を補わない程度まで除去された断片に相当する。

イヌＴＥＲＴ配列またはその断片は、核酸、プラスミド、または他のベクターにおいて、全てのＴＥＲＴ配列の少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％を表すことができる。

好ましい一実施形態において、イヌＴＥＲＴ配列または断片は、ハイブリッド型またはキメラ型のＴＥＲＴタンパク質の少なくとも９０％を表すことができる。

もう一つの好ましい実施形態において、イヌＴＥＲＴ配列または断片は、ハイブリッド型またはキメラ型のＴＥＲＴタンパク質の少なくとも６０％を表す。

非イヌＴＥＲＴ抗原性断片は、好ましくはネコＴＥＲＴ配列に由来する。

非イヌＴＥＲＴ抗原性断片は、有利には樹状細胞によってプロセシングされ、それによりＣＤ４Ｔ細胞ヘルプを生ずる。

好ましい一実施形態においては、本発明は、配列番号２、４、５または６からなる群から選択されるタンパク質配列をコードする核酸を使用する。

そのような核酸は、配列番号１もしくは３、または配列番号１のヌクレオチド２４１〜３４５９、または配列番号３のヌクレオチド２４１〜１４１３もしくは２４１〜１４０７、あるいはヌクレオチド３３５２〜３４５６もしくは３２９８〜３４５６からなる群から選択される配列を含んでよい。

具体的な一実施形態においては、核酸は、ＴＥＲＴタンパク質のプロテアソームへのアドレッシングを増強し、かつ得られたペプチドのクラスＩ提示を増加させるタンパク質を更にコードし得る。前記タンパク質は、好ましくはユビキチンであってよいか、または任意のシャペロンタンパク質、例えばカルレティキュリンであってよい。

遺伝子コンストラクト、免疫原性組成物、および投与
好ましくは、核酸は、本明細書で定義されるポリヌクレオチド配列、および宿主細胞もしくは宿主生物におけるタンパク質産物の発現（例えば転写および翻訳）を可能にする調節配列（例えば適切な１種以上のプロモーター、１種以上のエンハンサー、１種以上のターミネーター等）を含む遺伝子コンストラクトである。

本発明の遺伝子コンストラクトは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、かつ好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本発明の遺伝子コンストラクトは、意図された宿主細胞または宿主生物の形質転換に適した形態、意図された宿主細胞のゲノムＤＮＡ中への組み込みに適した形態、または意図された宿主生物における独立した複製、保守および／または遺伝に適した形態であってもよい。例えば、本発明の遺伝子コンストラクトは、ベクター、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクターなどのベクターまたはトランスポゾンの形であってもよい。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわちインビトロおよび／またはインビボで（例えば適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現系において）発現をもたらし得るベクターであってよい。

好ましいが制限されるものでない一態様において、本発明の遺伝子コンストラクトは、ｉ）本発明の少なくとも１つの核酸であって、ｉｉ）１つ以上の調節エレメント、例えばプロモーターおよび適宜、適切なターミネーター、ならびに適宜、またｉｉｉ）遺伝子コンストラクトの１つ以上の更なるエレメント、例えば３’−ＵＴＲもしくは５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／リポーター遺伝子、および／または形質転換もしくは組み込み（の効率）を容易にし得るか、または高め得るエレメントに作動可能に連結された前記核酸を含む。

具体的な一実施形態においては、遺伝子コンストラクトは、核酸ポリマーを制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなどのプロモーターを含むプラスミド中にクローニングすることによって製造できる。好ましい一実施形態において、ＴＥＲＴ核酸配列は、ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド（図２Ａを参照）中に挿入される。

他のベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび麻疹ウイルスベクターを含む。

前記核酸またはベクターを含む組成物を製造することができる。この組成物は免疫原性である。組成物は、イヌに投与するのに適した（すなわち非毒性、および必要であれば滅菌の）担体または賦形剤を含んでよい。そのような賦形剤は、医薬品用媒体、等張剤、安定化剤、または任意のアジュバントとして働く液体、半固体、もしくは固体の希釈剤を含む。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を含んでよい。等張剤は、なかでも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。安定剤は、なかでもアルブミンを含む。当技術分野で公知の任意のアジュバントを、オイルベースのアジュバント、例えばフロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバント、ミコレートベースのアジュバント、細菌性リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン、プロテオグリカン、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥデキストラン、中性オイル（例えばミグリオール）、植物性オイル（例えばアラキスオイル）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールを含んでいるワクチン組成物において使用してよい。

核酸または組成物は直接的に投与できるか、または核酸または組成物は、投与の前にリポソーム中にパッケージされるか、もしくはコロイド状金粒子上に被覆されてもよい。ＤＮＡワクチンをリポソーム中にパッケージするための技術は、当技術分野で公知であり、例えばMurray, 1991から公知である。同様に、ネイキッドＤＮＡを金粒子上に被覆するための技術は、Yang, 1992において教示され、かつウイルスベクターを使用したタンパク質の発現のための技術は、Adolph, 1996に見出される。

遺伝的免疫化のために、ワクチン組成物は、好ましくは皮内的に、皮下的に、または筋内で、注射によって、またはガス駆動式粒子衝撃によって投与され、そして宿主生物中の免疫応答を刺激するのに有効な量で送達される。本発明の好ましい一実施形態においては、投与は、注射ステップに加えて、本明細書では用語「エレクトロトランスファー」によっても表されるエレクトロポレーションステップを含む（Mir 2008、Sardesai and Weiner 2011に記載される）。

組成物は、血液または骨髄由来細胞へと、リポソームトランスフェクション、粒子衝撃またはウイルス導入（同時培養技術を含む）を使用してエクスビボで投与することもできる。次いで処理された細胞は、免疫化されるべき対象中に再導入して戻される。

必要とされる材料の量はそれぞれの個々のコンストラクトの免疫原性に依存するであろうことと、その量を先験的に予想できないことが理解されるであろうが、任意の所定のコンストラクトについての適切な投与量を決定する方法は簡単である。具体的には、約５〜３０μｇまたは好ましくは２０〜２５μｇで始め、例えば約５００μｇまで高まる一連の大きさの投与量は、相応する種に投与され、そして生ずる免疫応答は、例えばＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔアッセイ（実験部に記載される）によって、クロム放出アッセイを使用してＣＴＬ応答を検出することによって、またはサイトカイン放出アッセイを使用してＣＤ４Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）応答を検出することによって観察される。

好ましい一実施形態においては、ワクチン接種計画は、１〜３回の注射を含み、好ましくはそれが３週間後または４週間後に繰り返される。

具体的な一実施形態において、ワクチン接種スケジュールは、１または２回の注射に引き続き、３週間または４週間後に３〜５回の注射を少なくとも１サイクル行うことから構成され得る。

もう一つの実施形態において、プライマー投与は、１〜３回の注射から構成され、それに引き続き、例えば１年毎に、または２年毎に、少なくとも１回のブースター投与が行われる。

腫瘍の予防および処置
前記の核酸または免疫原性組成物は、イヌにおける腫瘍の予防または処置のための方法で有用である。

イヌにおける腫瘍の予防または処置のための方法であって、前記核酸または免疫原性組成物の有効量をそれを必要とするイヌにおいて投与することを含む前記方法が記載される。前記核酸または免疫原性組成物は、イヌにおける免疫応答を誘導するのに十分な量で投与される。

腫瘍は、細胞の任意の望まれない増殖であり得、特に良性腫瘍または悪性腫瘍、殊にがんであり得る。

がんは、転移段階を含む任意の進行段階であってよい。しかしながら、がんは転移にまでは進行していないことが好ましい。

具体的には、腫瘍は、膀胱がん、脳腫瘍、肝臓腫瘍、乳腺腫瘍および癌腫、マスト細胞腫瘍、悪性組織球増殖症および組織球肉腫、扁平上皮細胞癌腫、血管肉腫、リンパ腫、特にＢ細胞リンパ腫、黒色腫、骨腫瘍（骨肉腫）、精巣腫瘍からなる群から選択することができる。

具体的な一実施形態において、本発明によるワクチン接種は、化学療法、放射線療法または外科手術を含む慣用の療法と組み合わせることができる。ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−２のような免疫調節分子であるアジュバントと組み合わせることも有用であると考えられる。

図面および実施例は本発明を説明するものであって、その範囲を制限するものではない。

本発明者らは、イヌＴＥＲＴの不活性化形をコードするＤＮＡワクチンおよびネコ／イヌハイブリッド型ＴＥＲＴをコードするＤＮＡワクチンを構築し（実施例１）、そしてそれらの機能性、安全性、および免疫原性を評価した。

本発明者らは、それらのプラスミドが、トランスフェクション後に、哺乳動物細胞においてインビトロで正しくプロセシングされ、そしてプラスミドの発現産物（ＴＥＲＴタンパク質）が適切に発現されることを実証した。更に、酵素活性は検出されず、かつＴＥＲＴタンパク質は、トランスフェクトされた細胞の核小体を除いて見出され、それは該コンストラクトの安全性の証拠である（実施例２）。

その際、それらのプラスミドは、免疫原性であり、かつマウスにおいて特異的で効果的なＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞を導き出すことが見出された（実施例３）。

実施例１：ＤＮＡプラスミドの構築
全てのコンストラクトにおいて、ＴＥＲＴ配列の上流には、ヒトユビキチンをコードするＤＮＡ配列がある。ユビキチンの存在は、ＴＥＲＴタンパク質のプロテアソームへのアドレッシングを高め、かつ得られたＴＥＲＴペプチドのクラスＩ提示経路を増加させることとなる。ＴＥＲＴ配列の下流には、例えばウェスタンブロットまたは組織化学による融合タンパク質の将来的な精製または検出を容易にするために、インフルエンザタンパク質Ｖ５の配列がある。ＴＥＲＴタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、核小体移入シグナルをコードするＮ末端領域における４７のアミノ酸を欠失している。更に、タンパク質酵素活性を阻害するために、ＴＥＲＴの触媒部位における３つのアミノ酸（ＶＤＤ）が除去されている。

ｐＤＵＶ５は、イヌＴＥＲＴヌクレオチド配列の全長のうちＮ末端の４７のアミノ酸を欠いた配列（図１Ａ）をコードし、ｐＣＤＴは、ネコＴＥＲＴ配列の５４．４％およびイヌＴＥＲＴ配列の３５．９％をコードしている（図１Ｂ）。

全てのＴＥＲＴのＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ（ルクセンブルク、デュドランジュ）から合成されたものである。次いでそれらの配列は、ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＡＳ（フランス、サン・トーバン）によって供給されるｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミド中に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を使用してクローニングした（図２Ａを参照）。プラスミドは、使用するまで１×ＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍＬの濃度で−２０℃で貯蔵した。バックボーンプラスミドは、ウェスタンブロットおよびＴｒａｐアッセイ実験のために空ベクターとして使用した。そのベクターは、遺伝子導入タンパク質ＤＮＡ配列（ＴＥＲＴ）を失ったｐｃＤＮＡ３．１バックボーンプラスミドからなる。

実施例２：プラスミドの機能性および安全性
２．１．材料および方法
細胞培養
トランスフェクションアッセイおよび免疫蛍光実験のために使用されたヒト２９３Ｔ細胞系統は、サイモン・ウェイン−ホブソン教授（パスツール研究所）の好意により提供された。ＴＲＡＰアッセイのために使用されたＣｒＦＫ（Ｃｒａｎｄａｌｌ−Ｒｅｅｓｅネコ腎臓）細胞は、Ｊ．リチャードソン教授（エコール・ヴェテリネール・ドゥ・メゾン・アルフォール）の好意により提供された。細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２で、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％のピルビン酸ナトリウム、１％のペニシリン−ストレプトマイシンピルベート、および０．１％のβ−メルカプトエタノールを補充した培地において増殖させた。培養培地の全ての成分は、ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＡＳ（フランス、サン・トーバン）から購入した。

トランスフェクションアッセイ
２９３Ｔ細胞のトランスフェクションは、ｐＣＤＴまたはｐＤＵＶ５プラスミドのいずれかでＪｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）トランスフェクションキット（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳＡ、フランス、イルキルシュ）を使用して製造元の指示に従って実施した。６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり４０００００個のＨｅＬａ細胞または２９３Ｔ細胞を２ｍＬのＤＭＥＭ培養培地中に撒き、トランスフェクション前に３７℃、５％のＣＯ_２で２４時間培養した。それぞれのウェルにつき、２μｇのそれぞれのプラスミドを２００μＬのｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）バッファー中で希釈したもの、またはそれぞれ４μＬのｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）剤だけしか有さない２００μＬのｊｅｔＰＲＩＭＥ（登録商標）バッファーを、細胞上に滴下した。トランスフェクション媒体は、４時間後に除去し、そして２ｍＬのＤＭＥＭ培養培地によって置き換えた。細胞は３７℃、５％ＣＯ_２に置き、そして分析のために２４時間後に回収した。

ウェスタンブロット
トランスフェクトさせた２９３Ｔ細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（完全にＥＤＴＡ不含、ロシュ・ダイアグノスティックス、米国、インディアナポリス）を含有する放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）溶解バッファー（ＲＩＰＡバッファー、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈｃｈｉｍｉｅＳＡＲＬ、フランス、サン・カンタン・ファラヴィエ）を用いて氷上で１０〜２０分にわたり溶解させた。次いで、懸濁液を、細胞砕片の除去のために、１４０００ｒｐｍで４℃で１５分間遠心分離した。上清を収集し、ブラッドフォード法を使用してタンパク質濃度を測定した。タンパク質試料を、９５℃で５分間変性させ、Ｎｕ−ＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン、米国、カールスバッド）で分離し、ＰＶＤＦ膜（ｉＢｌｏｔ（登録商標）ｔｒａｎｓｆｅｒｓｔａｃｋ、インビトロジェン、米国、カールスバッド）へとｉＢｌｏｔ（登録商標）装置（インビトロジェン、米国、カールスバッド）を使用して移した。膜は約６０ｋＤａのカットであった。まず、上方部の膜を抗Ｖ５抗体（インビトロジェン、米国、カールスバッド）でプロービングし、その一方で他の部分は、抗βアクチン抗体（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈｃｈｉｍｉｅＳＡＲＬ、フランス、サン・カンタン・ファラヴィエ）でプロービングし、次いで試料を、ＥＣＬ（強化された化学発光）の抗マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体（ＧＥヘルスケア、フランス、ヴェリジー）によって曝露した。イムノブロットシグナルは、両者ともＧＥヘルスケア（英国、バッキンガムシア）から購入した製品である１８×２４のフィルムと相応するカセットを使用して明らかにした。

免疫蛍光および顕微鏡検査
ヒト２９３Ｔ細胞を、８ウェルのＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバースライド（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈｃｈｉｍｉｅＳＡＲＬ、フランス、サン・カンタン・ファラヴィエ）上に２００μＬの培養培地中で２０・１０^３細胞／ウェルで撒き、３７℃で一晩インキュベートした。翌日に、培養培地を破棄した。１μｇのｐＣＤＴまたはＰＵＦ２プラスミドのいずれか、５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ（ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＡＳ、フランス、サン・トーバン）および２．５μＬのＦｕｇｅｎｅＨＤ（ＰｒｏｍｅｇａＦｒａｎｃｅ、フランス、シャルボニエール・レ・バン）を含有する１０μＬの混合溶液を、相応するチャンバーに添加した。コントロールとして、２０・１０^３個のＨｅＬａ細胞を、プラスミドを含まない同じ混合物１０μＬと一緒にインキュベートした。チャンバースライドを、インキュベーター中で２４時間放置した。トランスフェクトさせた２９３Ｔ細胞を、１×ＰＢＳで慎重に洗浄し、そして２００μＬの２％ＰＦＡを各ウェルへと＋４℃で１０分にわたり加えて、細胞を固定し、そして透過性にさせた。次いでウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の１×ＰＢＳで２回洗浄し、そして２９３Ｔ細胞を室温で２００μＬのブロッキング溶液（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、３％ＢＳＡ、１０％ヤギ血清）と一緒に３０分間インキュベートした。最後に、ウェルを室温で一次マウス抗Ｖ５抗体（ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＡＳ、フランス、サン・トーバン）をブロッキング溶液中で１／２００で希釈したものと一緒に僅かに撹拌しつつ１．５時間にわたりインキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の１×ＰＢＳ中で３回洗浄した後に、二次ヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）抗体（ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＡＳ、フランス、サン・トーバン）をブロッキング溶液で希釈（１／５００）したものを、それらのウェルの中に入れ、光を避けて僅かに撹拌しつつ室温で４５分間置いた。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてウェルにＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）マウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、英国、ピーターバラ）をマウントした。スライドを、画像処理および解析システム（Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ、ＣａｒｌＺｅｉｓＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇＧｍｂＨ、ドイツ、イェーナ）を備えた蛍光顕微鏡（ＡｘｉｏｏｂｓｅｒｖｅｒＺ１、ＣａｒｌＺｅｉｓＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇＧｍｂＨ、ドイツ、イェーナ）を用いて解析した。

ＴＲＡＰアッセイ
テロメラーゼ活性を、テロメラーゼ活性の定量的測定のための測光酵素イムノアッセイによって、テロメリックリピート増幅プロトコール（ＴＲＡＰ）（Yang et al, 2002）を利用して測定した。ＣｒＦＫ（ＣｒａｎｄｅｌｌＲｅｅｓネコ腎臓）テロメラーゼ陰性細胞（Yazawa et al., 2003）に、ｐＤＵＶ５またはｐＣＤＴＴＥＲＴコンストラクトをコードするプラスミドをトランスフェクトさせた。ポジティブコントロールとして、ＣｒＦＫ細胞に、野生型ヒトＴＥＲＴ（全活性）をコードするプラスミドをトランスフェクトさせた。簡潔には、トランスフェクションの２４時間後に、ＣｒＦＫ細胞を機械的スクレイピングにより採取し、次いで１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、そして３０００ｇで４℃における５分間の遠心分離によってペレット化させた。テロメラーゼ活性は、ＴＲＡＰ−ＥＬＩＳＡアッセイによってＴｅｌｏＴＡＧＧＧテロメラーゼＰＣＲＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット（ロシュ・ダイアグノスティックス、ドイツ）を使用して製造元の指示に従って評価した。細胞抽出物におけるタンパク質濃度は、ブラッドフォード法（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）によって測定した。３マイクロリットルの細胞抽出物（２．１μｇ、０．２１μｇ、０．０２１μｇに相当）を、キットで提供されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物中でインキュベートした。サイクルプログラムは、２５℃で３０分のプライマー伸長で行い、次いでその混合物を、９４℃で３０秒の変性、５０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で９０秒の重合、および７２℃で１０分の最終伸長からなる３０サイクルのＰＣＲにかけた。２．５μｌの増幅産物を、ＥＬＩＳＡのために製造元の指示に従って使用した。それぞれのウェルの４５０ｎｍでの吸光度（６９０ｎｍの参照波長で）を、ＤｙｎｅｘＭＲＸＲｅｖｅｌａｔｉｏｎおよびＤｙｎｅｘＭＲＸＲｅｖｅｌａｔｉｏｎＴＣ９６ＷｅｌｌＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒを使用して測定した。

テロメラーゼ活性は、キットのマニュアルに指示される通りに、１００の相対テロメラーゼ活性（ＲＴＡ）を表す０．１ａｍｏｌのテロメア反復配列のコントロールテンプレートと比較して計算した。不活性化された試料および溶解バッファーはネガティブコントロールとして用いた。

２．２．結果
ＴＥＲＴをコードする新たなプラスミドは、トランスフェクション後にインビトロで機能性を示す
新たなプラスミドコンストラクトの機能性は、ｐＣＤＴまたはｐＤＵＶ５でインビトロでトランスフェクトされた細胞の全タンパク質ライセート中のプラスミドでコードされたＴＥＲＴタンパク質の存在によって示される。本発明者らは、ｐＣＤＴまたはｐＤＵＶ５でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞プラスミド（トランスフェクションの２４時間後）の全タンパク質ライセートに対するウェスタンブロット分析を行った。それぞれのプラスミドによってコードされたＴＥＲＴタンパク質配列はＶ５タンパク質配列でタグ付けされているので、当該融合タンパク質の存在を明らかにするために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合された抗Ｖ５抗体を使用した。

トランスフェクションの２４時間後にｐＣＤＴまたはｐＤＵＶ５でトランスフェクトされた細胞のタンパク質ライセート中で高度に陽性のＶ５特異的シグナルが検出された。検出されたタンパク質バンドのサイズは、分子量１２３ｋＤａのプラスミドによってコードされる異なるＴＥＲＴタンパク質に相当する。更に、未処理の細胞または空のプラスミドでトランスフェクトされた細胞においてはＶ５特異的シグナルは検出されなかった。本発明者らは、ｐＤＵＶ５およびｐＣＤＴプラスミドが、トランスフェクション後に、哺乳動物細胞においてインビトロで正しくプロセシングされ、そしてプラスミドの発現産物（ＴＥＲＴタンパク質）が適切に発現されることを実証した。

ＴＥＲＴをコードする新たなプラスミドは、インビトロでトランスフェクトした後に細胞発現が核小体から排除される非機能的酵素を発現する
酵素活性の不在を試験するために、ＴＲＡＰｅｚｅアッセイを行った。図３によって概説されるように、ｐＤＵＶ５またはｐＣＤＴでトランスフェクトされた細胞からのタンパク質ライセートは、いかなるテロメラーゼ活性も示さない。ポジティブコントロールとして、ネイティブなヒトＴＥＲＴ（ｈＴＥＲＴ）でトランスフェクトされたＣｒＦＫ細胞からのタンパク質抽出物を使用した。このように、本発明者らは、ｐＣＤＴまたはｐＤＵＶ５プラスミドのいずれかによってコードされるＴＥＲＴタンパク質が、インビトロでのトランスフェクション後にいかなる機能的な酵素活性も示さないことを実証した。

本発明者らは、更に、２つのプラスミドの発現産物の細胞内の所在を調査した。この目的のために、インビトロ免疫蛍光アッセイを実施した。簡潔には、ｐＣＤＴまたはｐＤＵＶ５での２９３Ｔ細胞のインビトロでのトランスフェクションの２４時間後に、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ標識された二次抗体に結合された抗Ｖ５抗体を、細胞内のＴＥＲＴタンパク質の検出のために使用した。ネイティブなヒトＴＥＲＴをコードするプラスミドでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞で観察されたのとは対照的に、ｐＣＤＴおよびｐＤＵＶ５にコードされるＴＥＲＴは細胞核小体内部で検出されなかった。

結論として言えば、本発明者らは、ｐＤＵＶ５およびｐＣＤＴプラスミドでのインビトロでのトランスフェクションの後に、第一に、ＴＥＲＴタンパク質発現が核小体から排除されること、そして第二に、これらの発現産物がいかなる酵素活性も示さないことを実証した。これらの２つの判断基準は、プラスミドの安全性を確立し、該プラスミドをインビボでのワクチン接種に使用することを好都合にする。

実施例３：インビボでの免疫応答
３．１．材料および方法
マウス
雌のＢａｌｂ／ｃＢｙマウスおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６〜８週齢）をＪａｎｖｉｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フランス、サン・ベルトヴァン）から購入した。動物を、パスツール研究所の特定病原不在（ＳｐｅｃｉｆｉｃＰａｔｈｏｇｅｎＦｒｅｅ）動物施設に収容した。マウスを皮内（ＩＤ）または筋内（ＩＭ）での免疫化の前に、１×リン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ、ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＡＳ、フランス、サン・トーバン）中の２％キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ、バイエル・サンテ、フランス、ロス）および８％のケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎ１０００、メリアル、フランス、リオン）の混合溶液で、個々の動物の体重および麻酔期間に応じて麻酔をかけた（腹腔内経路）。全ての動物を、良好な動物診療に厳密に従って取り扱い、パリのパスツール研究所の地元の動物実験倫理委員会のガイドラインに従った。

Ｈ２拘束性ペプチド
マウスの研究（ＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔ）で使用されるＴＥＲＴペプチドを、マウスのクラスＩのＭＨＣ、Ｈ２Ｋ^ｂ、Ｈ２Ｄ^ｂまたはマウスのクラスＩＩのＨ２−ＩＡ^ｄに結合するためにオンラインで利用できる４つのアルゴリズム：Ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）、Ｂｉｍａｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｃｉｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＮｅｔＭＨＣｐａｎおよびＳＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｍａｉｎ／）を使用してインシリコでのエピトープ予測によって予測した。

全ての合成ペプチドは、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ（英国、オックスフォード）から凍結乾燥状態（９０％を上回る純度）で購入した。凍結乾燥されたペプチドを、滅菌水中に２ｍｇ／ｍＬで溶解させ、そして使用前に３５μＬのアリコートで−２０℃で貯蔵した。ペプチド配列およびＨ２拘束の詳細を第１表に示す。

マウス免疫化およびインビボエレクトロポレーション
皮内（ＩＤ）での免疫化は、脇腹の下方部でインスリン用ニードル（Ｕ−１００、２９ＧＸ１／２’’−０．３３×１２ｍｍ、ベルギー、テルモ）を用いて剃毛後に行った。剃毛後に、免疫化処置の間およびその後に、紅斑は観察されなかった。筋内免疫化（ＩＭ）を、前脛骨筋中で、またインスリン用ニードルＵ−１００を用いて実施した。それぞれの動物に、１００μｇのＤＮＡに相当するｐＣＤＴまたはｐＤＵＶ５のいずれかのプライミング用量を、ワクチン経路とは無関係に投与した。全ての動物を、プライミング１４日後に同じ量のプラスミドおよび同じ免疫化経路を使用して追加免疫した。皮内的ワクチン接種直後に、侵襲性ニードル電極（６×４×２、４７−００５０、ＢＴＸ、米国）を、注射部位が２つのニードル列（２つのニードル列は０．４ｃｍ離れている）の間に位置するように皮膚中に挿入した。異なる電圧の２つのパルスをかけた（ＨＶ−ＬＶ）：ＨＶ＝１１２５Ｖ／ｃｍ（２パルス、５０μｓ−０．２μｓパルス間隔）およびＬＶ＝２５０Ｖ／ｃｍ（８パルス、１００Ｖ−１０ｍｓ−２０ｍｓパルス間隔）。筋内的免疫化の直後に、筋肉注射箇所を超音波ゲル（ＬａｂｏＦＨ、ｂｌｕｅｃｏｎｔａｃｔｇｅｌ、ＮＭＭｅｄｉｃａｌ、フランス）で覆い、ピンセット電極（０．５ｃｍ間隔、ｔｗｅｅｚｅｒｔｒｏｄｅ７ｍｍ、ＢＴＸＩ４５−０４８８、米国）によって取り囲み、そして皮膚エレクトロポレーションと同じパラメータを使用して電圧を印加した。Ａｇｉｌｅｐｕｌｓｅ（登録商標）ｉｎｖｉｖｏｓｙｓｔｅｍというエレクトロポレーターを全ての実験のために使用した（ＢＴＸ、米国）。それぞれの免疫化経路（筋内的、皮内的）について、コントロールマウスを、同じ手順で同じ容量の１×ＰＢＳを使用して処理した。

ＩＦＮγＥＬｉｓｐｏｔアッセイ
簡潔には、ＰＶＤＦマイクロプレート（ＩＦＮ−γ Ｅｌｉｓｐｏｔｋｉｔ、Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ａｂｃｙｓｓ、フランス、１０×９６試験、ｒｅｆ．８６２．０３１．０１０Ｐ）を、捕捉抗体（抗マウスＩＦＮ−γ）で一晩被覆し、ＰＢＳ２％ミルクでブロッキングした。ｐＤＮＡ免疫化されたマウスからの脾臓をすりつぶし、細胞懸濁液を７０ｍｍナイロンメッシュ（ＣｅｌｌＳｔｒａｉｎｅｒ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランス）を通して濾過した。Ｆｉｃｏｌｌで精製された脾臓細胞（ＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍ、Ｅｕｒｏｂｉｏ、フランス）を、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＡｕｔｏＴ４Ｐｌｕｓカウンター（Ｏｚｙｍｅ、フランス）を使用して計数し、そしてプレートに３部で２×１０^５または４×１０^５細胞／ウェルで添加し、そして５μｇ／ｍｌのｄＴＥＲＴまたはｈｙＴＥＲＴ関連ペプチドまたはコンカナバリンＡ（１０μｇ／ｍｌ）で刺激するか、または血清不含の培養培地で模擬刺激を行った。１９時間後に、スポットを、ビオチンにコンジュゲートされた検出抗体に曝露し、引き続きＡＰ標識ストレプトアビジンおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴの基質溶液に曝露した。スポットを、ＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔＥＬＩｓｐｏｔカウンターおよびソフトウェア（ＣＴＬ、ドイツ）を使用して計数した。

イヌＴＥＲＴペプチドプール
大多数のペプチドは、１５残基長であった。数個は１４アミノ酸長である。

プール２
PQKPGAARRMRRLPA, GAARRMRRLPARYWR, RMRRLPARYWRMRPL, LPARYWRMRPLFQEL, YWRMRPLFQELLGNH, RPLFQELLGNHARCP , QELLGNHARCPYRAL, GNHARCPYRALLRTH, RCPYRALLRTHCPLR, RALLRTHCPLRAMAA, RTHCPLRAMAAKEGS, PLRAMAAKEGSGNQA, MAAKEGSGNQAHRGV, EGSGNQAHRGVGICP, NQAHRGVGICPLERP, RGVGICPLERPVAAP, ICPLERPVAAPQEQT, PQKPGAARRMRRLPA

プール４
AKLSLQELTWKMKVR, LQELTWKMKVRDCTW, TWKMKVRDCTWLHGN, KVRDCTWLHGNPGAC, CTWLHGNPGACCVPA, HGNPGACCVPAAEHR, GACCVPAAEHRRREE, VPAAEHRRREEILAR, EHRRREEILARFLVL, REEILARFLVLVDGH, LARFLVLVDGHIYVV, LVLVDGHIYVVKLLR, DGHIYVVKLLRSFFY, YVVKLLRSFFYVTET, LLRSFFYVTETTFQK, FFYVTETTFQKNRLF, TETTFQKNRLFFYRK, FQKNRLFFYRKSVW

プール６
EGGPPGTRPTTPAWH, PGTRPTTPAWHPYPG, PTTPAWHPYPGPQGV, AWHPYPGPQGVPHDP, YPGPQGVPHDPAHPE, QGVPHDPAHPETKRF, HDPAHPETKRFLYCS, HPETKRFLYCSGGRE, KRFLYCSGGRERLRP, YCSGGRERLRPSFLL, GRERLRPSFLLSALP, LRPSFLLSALPPTLS, FLLSALPPTLSGARK, ALPPTLSGARKLVET

プール１０
DCTWLHGNPGACCVP, LHGNPGACCVPAAEH, PGACCVPAAEHRRRE, CVPAAEHRRREEILA, AEHRRREEILARFLV, RREEILARFLVLVDG, ILARFLVLVDGHIYV, FLVLVDGHIYVVKLL, VDGHIYVVKLLRSFF, IYVVKLLRSFFYVTE, KLLRSFFYVTETTFQ, SFFYVTETTFQKNRL, VTETTFQKNRLFFYR, TFQKNRLFFYRKSVW

プール１９
QLPFNQPVRKNPSFF, NQPVRKNPSFFLRVI, RKNPSFFLRVIADTA, SFFLRVIADTASCCY, RVIADTASCCYSLLK, DTASCCYSLLKARNA, CCYSLLKARNAGLSL, LLKARNAGLSLGAKG, RNAGLSLGAKGASGL, LSLGAKGASGLFPSE, AKGASGLFPSEAARW, SGLFPSEAARWLCLH, PSEAARWLCLHAFL, ARWLCLHAFLLKLAH

インビボでの細胞傷害性アッセイ
簡潔には、標的細胞調製のために、ナイーブなＣ５７／Ｂｌ６マウス由来の脾臓細胞を、高濃度（５μＭ）、中濃度（１μＭ）または低濃度（０．２μＭ）のＣＦＳＥを含有する１×ＰＢＳ中で標識した（ＶｙｂｒａｎｔＣＦＤＡ−ＳＥｃｅｌｌ−ｔｒａｃｅｒｋｉｔ；ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＡＳ、フランス、サン・トーバン）。５μＭおよび１μＭのＣＦＳＥで標識した脾臓細胞を、２種の異なるＨ２ペプチドで５μｇ／ｍｌにおいて１時間３０分にわたり室温でパルスした。ペプチド９８７および６２１を、ＣＦＳＥで高濃度標識されたナイーブな脾臓細胞とＣＦＳＥで中濃度標識されたナイーブな脾臓細胞のそれぞれのパルスのために使用した。ＣＦＳＥで低濃度標識された脾臓細胞はパルスさせずにおいた。ｐＣＤＴまたはｐＤＵＶ５で事前に免役したそれぞれのマウスに、追加免疫注射の１０日後に、それぞれの分画からの同数の細胞を含む１０^７個のＣＦＳＥ標識された細胞混合物を眼窩後方の静脈を通じて投与した。１５〜１８時間後に、脾臓由来の単細胞懸濁液を、フローサイトメトリーによってＭＡＣＳＱＵＡＮＴ（登録商標）サイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｉ、ドイツ）で分析した。

ペプチドでパルスされた細胞の消失は、ｐＤＮＡで免疫化されたマウスとコントロール（１×ＰＢＳ注射された）マウスとにおいて、パルスされた集団（高／中（high/medium）ＣＦＳＥの蛍光強度）のパルスされていない集団（低（low）ＣＦＳＥの蛍光強度）に対する比率を比較することによって測定した。試験動物当たりの特異的殺傷率は、以下の計算に従って確立した：
［１−［平均（ＣＦＳＥ^ｌｏｗＰＢＳ／ＣＦＳＥ^{ｈｉｇｈ／ｍｅｄｉｕｍ}ＰＢＳ）／（ＣＦＳＥ^ｌｏｗｐＤＮＡ／ＣＦＳＥ^{ｈｉｇｈ／ｍｅｄｉｕｍ}ｐＤＮＡ）］］×１００

統計分析およびデータ処理
Ｐｒｉｓｍ−５ソフトウェアを、データ処理、解析および図形表示のために使用した。データは、平均±標準偏差として表される。ＥｌｉＳＰＯＴアッセイの統計分析のために、本発明者らは、マンホイットニーのノンパラメトリック検定を使用し、そしてインビボでの細胞傷害性アッセイのために、ダンの多重比較試験を用いたクラスカル−ウォリス分析を使用した。有意差は、ｐ値＜０．０５に定めた。

３．２．結果
ｐＤＵＶ５は、マウスにおける皮内的もしくは筋内的免疫化およびエレクトロポレーションの後に、強力な細胞傷害性のＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導する
本発明者らは、ｐＤＵＶ５プラスミドというＤＮＡプラスミドがマウスにおいて効果的な細胞免疫応答（ＣＤ８）を顕現できるかどうかを評価した。この目的のために、９〜１０匹のＣ５７−Ｂｌ／６マウスの異なるグループに、ｐＤＵＶ５を皮内的にまたは筋内的に注射した直後にエレクトロポレーションをした。２週間後に、マウスに同じプロトコールで追加免疫注射を投与した。ブーストの１０日後に、マウス脾臓を採取し、そして誘導された免疫応答を、表１に記載されるＨ２拘束性ペプチドを使用したＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを介してモニタリングした。マウスＭＨＣクラスＩに拘束性のイヌＴＥＲＴペプチドを、材料と方法の節に記載したようにインシリコで予測した。図４に示されるように、ｄＴＥＲＴ特異的ＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ８Ｔ細胞の度数におけるコントロールマウスと比較しての大きな増加は、皮内的におよび筋内的にワクチン接種された動物の脾臓において観察された。これは、３つのペプチドのうち２つ（ｐ６２１およびｐ９８７）について観察された（ｐ＜０．０５）。２つの投与経路の間に有意差は認められなかった。

ｐＤＵＶ５コンストラクトは、マウスにおけるｄＴＥＲＴ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を促進することができる。本発明者らは、次に、これらの特異的Ｔ細胞が腫瘍細胞の攻撃に必要であろうインビボでの機能的細胞傷害活性を示すことを望んだ。ｐＤＵＶ５免疫化によって惹起されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答のインビボでの細胞溶解強度を測定するために、本発明者らは、インビボでの細胞傷害性試験を、カルボキシフルオレセイン−ジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識されたペプチドでパルスされた脾臓細胞を標的細胞として使用して実施した。前記のように皮内的または筋内的な経路を介してｐＤＵＶ５でのプライムおよび追加免疫ワクチン接種を受けたか、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で模擬免疫化された７週齢のＣ５７／Ｂｌ６マウスに、１０^７個の標的細胞を静注した。標的細胞は、ＣＦＳＥの３種の異なる濃度で別々に標識され、かつ個々のペプチド（ｐ６２１またはｐ９８７）でパルスされたか、または内部コントロールとしてパルスさせずにおいたナイーブな類似遺伝子系マウスからの脾臓細胞であった。１５〜１８時間後に、脾臓細胞が得られ、コントロール対免疫化されたマウスにおけるペプチドでパルスされた細胞の消失を、蛍光活性化セルソーティングによって定量化した。

結果は、マウスはインシリコで予測された２つのエピトープに対してＣＴＬを発生することを示している（図５Ａおよび５Ｂ）。ペプチド６２１は、最も強いインビボでの細胞溶解をもたらす。結果は、ＩＦＮ−γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイと一致した（図４）。２つの免疫化経路の間に有意差は認められなかった。

ｐＣＤＴは、マウスにおける皮内的もしくは筋内的免疫化およびエレクトロポレーションの後に、特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答と共に強力な細胞傷害性のＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導する
抗腫瘍免疫応答における細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞の重要性に鑑みて、本発明者らは、プラスミドｐＣＤＴがそのような免疫応答をインビボで促進できるかどうかを評価した。こうして、９〜１０匹のＣ５７−Ｂｌ／６マウスの異なるグループを、ｐＣＤＴによって該プラスミドの皮内的または筋内的注射によって免役した直後にエレクトロポレーションを行った。２週間後に、マウスに同じプロトコールで追加免疫注射を投与した。追加免疫の１０日後に、マウス脾臓を採取し、そして誘導された免疫応答を、表１に記載されるＨ２拘束性ペプチドを使用したＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを介してモニタリングした。

マウスＭＨＣクラスＩに拘束性のｈｙＴＥＲＴペプチドを、材料と方法の節に記載したようにインシリコで予測した。図６Ａに示されるように、ｈｙＴＥＲＴ特異的ＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ８Ｔ細胞の度数におけるコントロールマウスと比較しての大きな増加は、皮内的におよび筋内的にワクチン接種された動物の脾臓において観察された。これは、３つのクラスＩ拘束性ペプチドのうち２つについて観察された（ｐ６２１およびｐ９８７、ｐ＜０．０５）。特異的ＣＤ８Ｔ細胞の度数において、ペプチドｐ９２１とｐ９８７の両方について筋内的および皮内的経路の間で有意差は認められなかった。

本発明者らは、更に、ｈｙＴＥＲＴ拘束性ＣＤ４Ｔ細胞応答を調査した。この目的のために、９〜１０匹のＢａｌｂ／Ｃマウスを、ｐＣＤＴによって皮内的または筋内的注射によって免役した直後にエレクトロポレーションを行い、そしてＣＤ４特異的Ｔ細胞応答を、脾臓において前記の通りｈｙＴＥＲＴＩＡ^ｄ拘束性ペプチドを使用してモニタリングした（インシリコ予測）。Ｂａｌｂ／Ｃマウスを選択したのは、このマウス系統は良好なＣＤ４Ｔ細胞応答を発することが知られているからである。図６Ｂに示されるように、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した場合に、ｈｙＴＥＲＴ特異的ＩＦＮ−γ分泌性ＣＤ４Ｔ細胞の度数における、１×ＰＢＳを注射したコントロールマウスと比較しての大きな増加は、皮内的におよび筋内的にワクチン接種されたＢａｌｂ／Ｃマウスの脾臓において観察された。これは３つのクラスＩ拘束性ペプチドのうち２つについて観察された（ｐ１１０６およびｐ１１０５、ｐ１１０６については皮内的経路の場合にｐ＜０．０５であり、かつ筋内的経路の場合にｐ＜０．００１であり、そして１１０５については皮内的経路の場合に有意差はなく、かつ筋内的経路の場合にｐ＜０．０１である）。特異的ＣＤ４Ｔ細胞の度数において、ペプチドｐ１１０５とｐ１１０６の両方について筋内的および皮内的経路の間で有意差は認められなかった。

このように、ｐＣＤＴコンストラクトは、マウスにおけるｈｙＴＥＲＴ特異的ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞の増殖を促進することができる。本発明者らは、次に、ｈｙＴＥＲＴ特異的ＣＤ８Ｔ細胞が腫瘍細胞の破壊に必要であろうインビボでの機能的細胞傷害活性を示すことを望んだ。ｐＣＤＴ免疫化によって惹起されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答のインビボでの細胞溶解性強度を測定するために、本発明者らは、インビボでの細胞傷害性試験を、カルボキシフルオレセイン−ジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識されたペプチドでパルスされた脾臓細胞を標的細胞として使用して実施した。前記のように皮内的または筋内的な経路を介してｐＣＤＴでのプライムおよび追加免疫ワクチン接種を受けたか、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で模擬免疫化された７週齢のＣ５７／Ｂｌ６マウスに、１０^７個の標的細胞を静注した。標的細胞は、ＣＦＳＥの３種の異なる濃度で別々に標識され、かつ個々のペプチド（ｐ６２１またはｐ９８７）でパルスされたか、または内部コントロールとしてパルスさせずにおいたナイーブな類似遺伝子系マウスからの脾臓細胞であった。１５〜１８時間後に、脾臓細胞が得られ、コントロール対免疫化されたマウスにおけるペプチドでパルスされた細胞の消失を、蛍光活性化セルソーティングによって定量化した。

結果は、マウスがインシリコで予測された２つのペプチドｐ６２１およびｐ９８７に対してＣＴＬを発生することを示している。ペプチド９８７は、最も強いインビボでの細胞溶解をもたらす。結果は、ＩＦＮ−γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイからの結果と一致した（図６Ａ）。ｐ６２１について、細胞溶解の平均パーセントは、ｐＣＤＴが皮内的経路を介して注射された場合に僅かに優れていたが（皮内での平均＝７．７％対筋内での平均＝０．２％）、２つの免疫化の経路の間に有意差は認められなかったということは言及するに値することである。

実施例４：イヌＴＥＲＴ特異的Ｔ細胞のレパートリー
４．１．材料および方法
イヌＴＥＲＴペプチドライブラリー
凍結乾燥されたｄＴＥＲＴペプチド（純度＞９０％）を、ＪＰＴＰｅｐｔｉｄｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ドイツ、ベルリン）から購入した。それぞれのペプチドを、供給元の推奨に従って、使用前に、蒸留したＨ_２Ｏ、５％ＤＭＳＯ中で２ｍｇ／ｍＬで再懸濁し、使用前に−２０℃で凍らせたままにした。イヌＴＥＲＴペプチドの三分の一（アミノ酸２８１〜５７１）を使用して、１１アミノ酸が重複していて、かつ図３に示されるようにイヌＴＥＲＴのこの配列を回復する１５アミノ酸のペプチド７０個を合成した。４つのペプチドプールを、インビトロ実験とイヌにおけるＥＬＩｓｐｏｔアッセイのために使用した。

イヌ血液産物
イヌ血液試料は、Ｂｏｕｒｇｅｌａｔ研究所（Ｍａｒｃｙｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、フランス）から購入した。その血液試料は、その施設の倫理ガイドラインに従って収容し、給餌し、かつ世話をした健康な４年齢のビーグル犬から採取した。ヘパリン化された血液試料を、１×ＰＢＳ（ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳＡＳ、フランス、サン・トーバン）中に４倍希釈した。希釈された試料を、次いでＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（Ｅｕｒｏｂｉｏ、フランス、クールタブフ）上に成層し、そして２２００ｒｐｍで（室温で）３０分にわたり中断なく遠心分離した。イヌＰＢＭＣを採集し、そして１０％ＤＭＳＯ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈｃｈｉｍｉｅＳＡＲＬ、フランス、サン・カンタン・ファラヴィエ）を加えたウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＰＡＡＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＧｍｂＨ、オーストリア、パッシング）中で使用前に液体窒素中で貯蔵した。

イヌＰＢＭＣにおけるインビトロ免疫化アッセイ
０日目に、イヌの凍らせたＰＢＭＣを戻し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ＡｕｔｏＴ４Ｐｌｕｓカウンター（Ｏｚｙｍｅ、フランス）を使用して計数し、そして２部または３部で１０^６細胞／ｍＬで４８ウェルの平底プレート（ＢＤ、フランス）中でＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１００ｎｇ／ｍＬのｃａＧＭ−ＣＳＦおよび５ｎｇ／ｍＬのｃａＩＬ−４（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）または５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌＴ３Ｌ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）を補充した培地においてプレーティングした。細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベーター中で培養した。

２４時間後（１日目）に、以下の試薬：５０ｎｇ／ｍＬのｒｃＴＮＦα、２０ｎｇ／ｍＬのｒｃＩＬ１−β（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含む成熟刺激因子を加えた。ペプチドのプールも添加した。それぞれのペプチドのために使用した最終濃度は１０μｇ／ｍＬであった。コントロールウェルには成熟サイトカインのカクテルだけでペプチドを入れなかった。３日目に、培養培地を破棄し、そして新たなＡＩＭ−Ｖを添加した。新たなＡＩＭ−Ｖを試験の日まで３日おきに添加した。培養の開始の１１日後または１８日後に、細胞を回収し、新たなＡＩＭ−Ｖ培地中で洗浄し、そしてＥＬＩｓｐｏｔアッセイのために使用した。

簡潔には、細胞を、ＡＩＭＶ−５またはＡＩＭＶだけにおいて４つのペプチドのプール（各ペプチド５μｇ／ｍＬ）でプレーティングした。コンカナバリンＡ（１０μｇ／ｍｌ）および組換え型のイヌＩＦＮ−γ（１６ｎｇ／ｍＬ）をポジティブコントロールウェル（weel）のために使用した。２４時間後に、スポットを、ビオチンにコンジュゲートされた検出抗体に曝露し、引き続きＡＰ標識ストレプトアビジンおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴの基質溶液に曝露した。スポットを、ＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔＥＬＩｓｐｏｔカウンターおよびソフトウェア（ＣＴＬ、ドイツ）を使用して計数した。

４．２．結果
本発明のワクチン技術の妥当性を強調するために、本発明者らは、目的の種、すなわちイヌにおける事前に存在していたイヌＴＥＲＴ特異的Ｔ細胞のレパートリーの存在を裏付けることを望んだ。

本発明者らは、ｄＴＥＲＴ特異的Ｔ細胞応答が、ｒｃＧＭ−ＣＳＦとｒｃＩＬ−４のどちらかと一緒に２４時間にわたりインキュベートするか、またはｈＦｌｔ３リガンドと一緒にインキュベートするのに続き、成熟刺激因子（ｒｃＩＬ１β、ｒｃＴＮＦαおよびＩＬ−７）を与え、そして更に２４時間にわたりペプチド刺激を与え、そして１１日もしくは１８日のインビトロ細胞増殖を行ったＰＢＭＣにおいて増強され得るかどうかを調査した。この技術は、ヒトＰＢＭＣについてＭａｌｌｏｎｅとその同僚によって記載されており、インビトロ免疫化（Martinuzzi et al. 2011）と呼ばれている。この実験の原理は、図８に表されている。特異的Ｔ細胞を刺激するために、イヌＴＥＲＴタンパク質の三分の一を回復する１５量体の重複しているペプチド（図３）を、それぞれ１７または１８個のペプチドを含むプールにおいて使用した。

培養開始の１１日後または１８日後に、引き続き細胞をイヌＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴプレート中に移して５μｇ／ｍＬのそれぞれのペプチドのプールと一緒に２４時間置いた。本発明者らは、培地で刺激されたＰＢＭＣと比較して、培養１１日後に、プール２／ｒｃＧＭＣＳＦ＋ｒｃＩＬ−４と一緒でのｄＴＥＲＴ特異的ＩＦＮ−γ分泌性Ｔ細胞の度数における３倍の増加と、プール４／ＦｌＴ−３Ｌと一緒での２倍の増加に注目した（図９Ａ）。更に、ｄＴＥＲＴ特異的ＩＦＮ−γ分泌性Ｔ細胞の度数における４倍の増加は、培養培地で刺激されたＰＢＭＣと比較して、プール４／Ｆｌｔ−３Ｌと一緒で、培養１８日後に観察された（図９Ｂ）。

これらの結果は、ナイーブな実験イヌの末梢血においてイヌＴＥＲＴ特異的ＩＦＮ−γ分泌性Ｔ細胞のレパートリーの天然に存在するレパートリーの存在を裏付けている。

実施例５：ｐＤＵＶ５でワクチン接種されたイヌにおけるインビボでの特異的細胞性免疫応答
６匹のナイーブなビーグル犬に、ワクチン接種および１００〜４００μｇ／ｋｇの筋内的な後ワクチン接種の１５〜２０分前に、２．５ｍｇ／ｋｇ（静脈内）ｉｍａｌｇｅｎｅおよび２０〜８０μｇ／ｋｇ（静脈内）ｄｏｒｂｅｎｅの局所麻酔を受けさせた。それらの犬に、４００μｇのｐＤＵＶ５ＤＮＡを皮内注射した後にエレクトロポレーションを行った。ｐＤＵ５ＤＮＡは、０日目、２９日目、５７日目および１４２日目にエレクトロポレーションを行った。末梢血を抜き取り、そして単核細胞を、プール６またはプール１９のいずれかに属するイヌテロメラーゼ特異的ペプチドについて、Martinuzzi et al., 2011の方法に従って試験した。

図１０Ａおよび１０Ｂは、ＩＦＮγ特異的Ｔ細胞応答が検出されたことを示している。図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、５７日目および１４２日目のｐＤＵＶ５ＤＮＡワクチン接種は、古典的な長期記憶応答を示す、つまり急激に上昇し、よりゆっくりと減退する長期記憶応答を示す。

実施例６：新形成を伴う動物における特異的ｄＴＥＲＴＴ細胞応答
ｐＤＵＶ５ＤＮＡエレクトロポレーションが新形成を伴う動物において特異的ｄＴＥＲＴＴ細胞応答を誘導し得ることを示すために、５匹の新形成を伴う飼い犬とコントロールとしての３匹の飼い犬を使用した。それらの病気の動物は広範に異なる腫瘍を引き起こしていた。以下の表２を参照のこと。

末梢血を抜き取り、そしてインビトロ刺激プロトコールを、実施例４およびMartinuzzi zt al., 2011に記載されるように、プール４ペプチドを使用して実施した。

図１２に見られるように、培地コントロールよりも良好な特異的ペプチド応答は全ての動物について同定された。これは、その免疫学的レパートリーが、新形成によって減損されず、偏らず、または抑制されないことを意味する。後の知見は特に重要であり、それは、病気の犬においてある程度の免疫抑制または過剰のＴｒｅｇ誘導があったとしても、それにもかかわらず本発明のワクチン接種は、Ｔ細胞応答を誘導できることを示している。

参考資料
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Claims

テロメラーゼ触媒活性を失ったイヌテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、をコードする配列、ここで、イヌＴＥＲＴが、テロメラーゼ触媒活性の不活性化をもたらすアミノ酸ＶＤＤを欠失し、全長イヌＴＥＲＴ配列に対してＮ末端の４７個のアミノ酸を更に欠失している、
を含む核酸を含む、テロメラーゼを過剰発現する細胞に対する、イヌにおける免疫応答の始動における使用のための免疫原性組成物であって、
核酸が、ユビキチンを更にコードするものであり、
組成物が、皮内経路によって投与されるものである、
免疫原性組成物。
核酸が、ＤＮＡである、請求項１に記載の使用のための免疫原性組成物。
核酸が、配列番号６を含むか、または配列番号６からなるタンパク質をコードする、請求項２に記載の免疫原性組成物。
核酸が、配列番号２からなるタンパク質配列をコードする、請求項２に記載の使用のための免疫原性組成物。
核酸が、配列番号１、または配列番号１のヌクレオチド２４１〜３４５９からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の使用のための免疫原性組成物。
イヌにおける腫瘍の予防または処置における使用のための、請求項１から５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
請求項６に記載のイヌにおける腫瘍の予防または処置における使用のための、免疫原性組成物であって、腫瘍が、膀胱がん、脳腫瘍、乳腺腫瘍および癌腫、マスト細胞腫瘍、悪性組織球増殖症および組織球肉腫、扁平上皮細胞癌腫、血管肉腫、リンパ腫、特にＢ細胞リンパ腫、黒色腫、骨肉腫、精巣腫瘍からなる群から選択される、免疫原性組成物。
エレクトロポレーションによって投与される、請求項１から７のいずれか１項に記載の使用のための免疫原性組成物。
イヌが腫瘍を発症するリスクにある、請求項１から８のいずれか１項に記載の使用のための免疫原性組成物。
イヌが健康であるが高齢である、請求項９に記載の使用のための免疫原性組成物。
長期記憶免疫応答を誘導する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の使用のための免疫原性組成物。