JP6476891B2 - Cellulase production method - Google Patents
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Description
本発明は、セルラーゼの製造法に関する。 The present invention relates to a method for producing cellulase.
従来、発酵法によるＬ−アミノ酸等の目的物質の工業生産においては、炭素源として、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されてきた。しかしながら、近年の人口増や開発途上国の生活レベル向上により、これらの植物由来の可食原料ではなく、植物由来の非可食バイオマス原料の利用について実用化検討が進められている。 Conventionally, in industrial production of target substances such as L-amino acids by fermentation, glucose, fructose, sucrose, waste molasses, starch hydrolysates and the like have been used as carbon sources. However, due to the recent increase in population and the improvement of living standards in developing countries, practical application studies are being made on the use of non-edible biomass materials derived from plants rather than edible materials derived from plants.
このような植物由来の非可食バイオマス原料は、セルロース、ヘミセルロース、リグニン等によって構成されているが、これらの内、セルロースおよびヘミセルロースは、熱や酸などを用いる前処理行程、およびセルラーゼやキシラナーゼ等の糖化酵素による糖化処理行程等を経て、５炭糖および６炭糖へと変換され、発酵の原料として用いることができる（特許文献１、２）。 Such plant-derived non-edible biomass materials are composed of cellulose, hemicellulose, lignin, and the like. Among these, cellulose and hemicellulose are pretreatment steps using heat, acid, etc., cellulase, xylanase, etc. It is converted into pentose and hexose through a saccharification treatment process using saccharifying enzyme, and can be used as a raw material for fermentation (Patent Documents 1 and 2).
糖化酵素としては、各種セルラーゼ生産微生物由来の酵素製剤が利用されている。セルラーゼ生産微生物としては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）やアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）等の糸状菌やクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）等の細菌が知られている。具体的には、例えば、アクレモニウム・セルロリティカス C1株（特許文献３）やアクレモニウム・セルロリティカス CF-2612株（特許文献４）は高いセルラーゼ生産能を有することが知られている。 As saccharifying enzymes, enzyme preparations derived from various cellulase-producing microorganisms are used. As cellulase-producing microorganisms, filamentous fungi such as Trichoderma reesei and Acremonium cellulolyticus, and bacteria such as Clostridium thermocellum are known. Specifically, for example, Acremonium cellulolyticus C1 strain (Patent Document 3) and Acremonium cellulolyticus CF-2612 strain (Patent Document 4) are known to have high cellulase-producing ability.
gna1遺伝子は、Ｇタンパク質のαサブユニットをコードする遺伝子である。クリフォネ２０４Ｌ変異（２０４位のグルタミン残基のロイシン残基への変異）またはＲ１７８Ｃ変異（１７８位のアルギニン残基のシステイン残基への変異）の導入によりGna1タンパク質が恒常的活性型となることが知られている（非特許文献１）。また、トリコデルマ・リーゼイにおいて、gna1遺伝子の欠損により、セルラーゼ遺伝子の１つであるcbh1遺伝子の明条件での転写が抑制され、一方でcbh1遺伝子の暗条件での転写が増大するとの報告がある（非特許文献２）。さらに、トリコデルマ・リーゼイにおいて、Gna1タンパク質へのＱ２０４Ｌ変異の導入により、cbh1遺伝子の明条件での転写が増大するとの報告がある（非特許文献２）。 The gna1 gene is a gene encoding the α subunit of G protein. Introduction of the Kryphone 204L mutation (mutation of glutamine residue at position 204 to leucine residue) or R178C mutation (mutation of arginine residue at position 178 to cysteine residue) may make the Gna1 protein a constitutively active form It is known (Non-Patent Document 1). In Trichoderma reesei, there is a report that transcription of the cbh1 gene, which is one of the cellulase genes, is suppressed in light conditions, while transcription of the cbh1 gene is increased in dark conditions due to deletion of the gna1 gene ( Non-patent document 2). Furthermore, in Trichoderma reesei, there is a report that transcription of the cbh1 gene under bright conditions is increased by introducing the Q204L mutation into the Gna1 protein (Non-patent Document 2).
本発明は、セルラーゼの製造法を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the manufacturing method of a cellulase.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アクレモニウム・セルロリティカスに恒常的活性型Gna1タンパク質をコードする変異型gna1遺伝子を保持させることにより、アクレモニウム・セルロリティカスのセルラーゼ生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have caused Acremonium cellulolyticus to retain the mutant gna1 gene encoding the constitutively active Gna1 protein. The present inventors have found that the ability to produce cellulase from lyticus can be improved.
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）（タラロマイセス・セルロリティカス（Talaromyces cellulolyticus））を培地で培養し、セルラーゼを該培地中に生成蓄積させること、および
該培地よりセルラーゼを回収すること、
を含む、セルラーゼの製造法であって、
前記アクレモニウム・セルロリティカスが、恒常的活性型Ｇｎａ１タンパク質をコードする変異型ｇｎａ１遺伝子を保持するように改変されていることを特徴とする、方法。
［２］
前記恒常的活性型Ｇｎａ１タンパク質が、下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれか又は両方の変異を有するＧｎａ１タンパク質である、前記方法：
（Ａ）野生型Ｇｎａ１タンパク質の１７８位のアルギニン残基がシステイン残基に置換される変異；
（Ｂ）野生型Ｇｎａ１タンパク質の２０４位のグルタミン残基がロイシン残基に置換される変異。
［３］
アクレモニウム・セルロリティカスを培地で培養し、セルラーゼを該培地中に生成蓄積させること、および
該培地よりセルラーゼを回収すること、
を含む、セルラーゼの製造法であって、
前記アクレモニウム・セルロリティカスが、野生型Ｇｎａ１タンパク質の１７８位のアルギニン残基がシステイン残基に置換されたＧｎａ１タンパク質をコードする変異型ｇｎａ１遺伝子を保持するように改変されていることを特徴とする、方法。
［４］
アクレモニウム・セルロリティカスを培地で培養し、セルラーゼを該培地中に生成蓄積させること、および
該培地よりセルラーゼを回収すること、
を含む、セルラーゼの製造法であって、
前記アクレモニウム・セルロリティカスが、野生型Ｇｎａ１タンパク質の２０４位のグルタミン残基がロイシン残基に置換されたＧｎａ１タンパク質をコードする変異型ｇｎａ１遺伝子を保持するように改変されていることを特徴とする、方法。
［５］
前記野生型Ｇｎａ１タンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２１に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、Ｇタンパク質のαサブユニットとしての機能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配
列を含み、且つ、Ｇタンパク質のαサブユニットとしての機能を有するタンパク質。
［６］
前記アクレモニウム・セルロリティカスが、creA遺伝子の発現が低下するように、又は、creA遺伝子が破壊されるように改変されている、前記方法。
［７］
前記アクレモニウム・セルロリティカスが、アクレモニウム・セルロリティカスS6-25株（NITE BP-01685）に由来する改変株である、前記方法。
［８］
植物バイオマスを前処理に供すること、
前記前処理の処理物を、前記方法により得られるセルラーゼを用いた糖化処理に供すること、
前記糖化処理の処理物を含有する培地で目的物質の生産能を有する微生物を培養し、目的物質を該培地中又は該微生物の菌体内に生成蓄積させること、および
該培地又は菌体より目的物質を採取すること、
を含む、目的物質の製造法。
［９］
前記前処理が水熱分解処理である、前記方法。
［１０］
前記目的物質がＬ−アミノ酸である、前記方法。
That is, the present invention can be exemplified as follows.
[1]
Culturing Acremonium cellulolyticus (Talaromyces cellulolyticus) in a medium, producing and accumulating cellulase in the medium, and recovering the cellulase from the medium;
A method for producing cellulase, comprising:
A method wherein the Acremonium cellulolyticus is modified to retain a mutant gna1 gene encoding a constitutively active Gna1 protein.
[2]
The above-mentioned method, wherein the constitutively active Gna1 protein is a Gna1 protein having a mutation in either or both of the following (A) and (B):
(A) a mutation in which the arginine residue at position 178 of the wild-type Gna1 protein is replaced with a cysteine residue;
(B) A mutation in which the glutamine residue at position 204 of the wild-type Gna1 protein is replaced with a leucine residue.
[3]
Culturing Acremonium cellulolyticus in a medium, producing and accumulating cellulase in the medium, and recovering cellulase from the medium;
A method for producing cellulase, comprising:
The Acremonium cellulolyticus is modified to retain a mutant gna1 gene encoding a Gna1 protein in which the arginine residue at position 178 of the wild-type Gna1 protein is replaced with a cysteine residue. how to.
[4]
Culturing Acremonium cellulolyticus in a medium, producing and accumulating cellulase in the medium, and recovering cellulase from the medium;
A method for producing cellulase, comprising:
The Acremonium cellulolyticus is modified to retain a mutant gna1 gene encoding a Gna1 protein in which the glutamine residue at position 204 of the wild-type Gna1 protein is replaced with a leucine residue. how to.
[5]
The method, wherein the wild-type Gna1 protein is a protein described in the following (a), (b), or (c):
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 includes an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, or addition of 1 to 10 amino acid residues, and has a function as an α subunit of G protein. protein;
(C) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and having a function as an α subunit of G protein.
[6]
The method, wherein the Acremonium cellulolyticus is modified so that expression of the creA gene is decreased or the creA gene is disrupted.
[7]
The method, wherein the Acremonium cellulolyticus is a modified strain derived from Acremonium cellulolyticus strain S6-25 (NITE BP-01685).
[8]
Subjecting plant biomass to pretreatment,
Subjecting the pretreated product to a saccharification treatment using cellulase obtained by the method,
Culturing a microorganism having an ability to produce a target substance in a medium containing the processed product of the saccharification treatment, generating and accumulating the target substance in the medium or in the cells of the microorganism, and the target substance from the medium or the fungus body Collecting,
A method for producing a target substance, including
[9]
The method as described above, wherein the pretreatment is a hydrothermal decomposition treatment.
[10]
The method, wherein the target substance is an L-amino acid.
本発明により、アクレモニウム・セルロリティカスのセルラーゼ生産能を向上させることができ、セルラーゼを効率よく製造することができる。そのようにして製造されたセルラーゼにより植物バイオマスを糖化し、糖化液を炭素源として利用してＬ−アミノ酸等の目的物質を製造することができる。 According to the present invention, the cellulase production ability of Acremonium cellulolyticus can be improved, and cellulase can be produced efficiently. Plant biomass can be saccharified with the cellulase thus produced, and a target substance such as L-amino acid can be produced using the saccharified solution as a carbon source.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
＜１＞本発明の微生物
＜１−１＞アクレモニウム・セルロリティカス
本発明の微生物は、変異型gna1遺伝子を保持する（有する）ように改変されたアクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）である。アクレモニウム・セルロリティカスは、タラロマイセス・セルロリティカス（Talaromyces cellulolyticus）とも呼ばれる（FEMS Microbiol. Lett., 2014, 351:32-41）。アクレモニウム・セルロリティカスとしては、C1株（特許文献３）、CF-2612株（特許文献４）、TN株（FERM BP-685）、S6-25株（NITE BP-01685）が挙げられる。なお、上記菌株等のアクレモニウム・セルロリティカス（タラロマイセス・セルロリティカス）に一旦分類された菌株は、将来的に系統分類が変更された場合にも、本発明におけるアクレモニウム・セルロリティカス（タラロマイセス・セルロリティカス）に属するものとして扱うものとする。
<1> Microorganism of the Present Invention <1-1> Acremonium Cellulolyticus The microorganism of the present invention is an Acremonium cellulolyticus modified to hold (have) a mutant gna1 gene. is there. Acremonium cellulolyticus is also called Talaromyces cellulolyticus (FEMS Microbiol. Lett., 2014, 351: 32-41). Examples of Acremonium cellulolyticus include C1 strain (patent document 3), CF-2612 strain (patent document 4), TN strain (FERM BP-685), and S6-25 strain (NITE BP-01685). In addition, the strain once classified into Acremonium cellulolyticus (Talalomyces cellulolyticus) such as the above-mentioned strains, even if the strain classification is changed in the future, Acremonium cellulolyticus ( Talaromyces cerulolyticus).
S6-25株は、2013年8月8日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8 122号室）に原寄託され、2013年11月15日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号NITE BP-01685が付与されている。同株は、TN株（FERM BP-685）より得られた株であり、高いセルラーゼ生産能を有する。 On August 8, 2013, the S6-25 strain was transferred to the Patent Microorganism Depositary Center (Postal Code 292-0818, Kisarazu Kazusa Kamashi 2-2-8 122, Chiba, Japan) on August 8, 2013 The original deposit was made, and on November 15, 2013, the deposit was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty, and the deposit number NITE BP-01685 was assigned. This strain is obtained from the TN strain (FERM BP-685) and has a high cellulase production ability.
＜１−２＞変異型gna1遺伝子の導入
本発明の微生物は、変異型gna1遺伝子を保持する（有する）ように改変されている。「変異型gna1遺伝子を保持する（有する）」ことを、「gna1遺伝子に変異を有する」ともい
う。また、「変異型gna1遺伝子を保持する（有する）」ことを、「変異型Gna1タンパク質を有する」ともいう。本発明の微生物は、変異型gna1遺伝子を保持するようにアクレモニウム・セルロリティカスを改変することによって得ることができる。
<1-2> Introduction of mutant gna1 gene The microorganism of the present invention has been modified to retain (have) the mutant gna1 gene. “Holding (having) the mutant gna1 gene” is also referred to as “having a mutation in the gna1 gene”. “Holding (having) a mutant gna1 gene” is also referred to as “having a mutant Gna1 protein”. The microorganism of the present invention can be obtained by modifying Acremonium cellulolyticus so as to retain the mutant gna1 gene.
以下、gna1遺伝子およびGna1タンパク質について説明する。gna1遺伝子は、Ｇタンパク質のαサブユニットをコードする遺伝子である。本発明において、「特定の変異」を有するGna1タンパク質を「変異型Gna1タンパク質」、それをコードする遺伝子を「変異型gna1遺伝子」ともいう。「変異型gna1遺伝子」は、言い換えると、「特定の変異」を有するgna1遺伝子である。また、本発明において、「特定の変異」を有さないGna1タンパク質を「野生型Gna1タンパク質」、それをコードする遺伝子を「野生型gna1遺伝子」ともいう。「野生型gna1遺伝子」は、言い換えると、「特定の変異」を有さないgna1遺伝子である。なお、ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。「特定の変異」については後述する。 Hereinafter, the gna1 gene and the Gna1 protein will be described. The gna1 gene is a gene encoding the α subunit of G protein. In the present invention, a Gna1 protein having a “specific mutation” is also referred to as a “mutant Gna1 protein”, and a gene encoding it is also referred to as a “mutant gna1 gene”. In other words, the “mutant gna1 gene” is a gna1 gene having a “specific mutation”. In the present invention, a Gna1 protein having no “specific mutation” is also referred to as a “wild-type Gna1 protein”, and a gene encoding it is also referred to as a “wild-type gna1 gene”. In other words, the “wild-type gna1 gene” is a gna1 gene having no “specific mutation”. The “wild type” used here is a description for the sake of distinction from the “mutant type”, and is not limited to those obtained naturally unless it has a “specific mutation”. The “specific mutation” will be described later.
野生型gna1遺伝子としては、例えば、アクレモニウム・セルロリティカスS6-25株のgna1遺伝子が挙げられる。また、野生型Gna1タンパク質としては、例えば、S6-25株のgna1遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。S6-25株のgna1遺伝子の塩基配列を配列番号２０に示す。配列番号２０に示す塩基配列中、エクソン領域は、1〜118位、174〜516位、564〜1120位、および1172〜1215位の領域である。S6-25株のgna1遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。すなわち、野生型gna1遺伝子は、例えば、配列番号２０に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、野生型Gna1タンパク質は、例えば、配列番号２１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。 Examples of the wild type gna1 gene include the gna1 gene of Acremonium cellulolyticus strain S6-25. Examples of the wild type Gna1 protein include a protein encoded by the gna1 gene of S6-25 strain. The nucleotide sequence of the gna1 gene of S6-25 strain is shown in SEQ ID NO: 20. In the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, the exon region is a region of positions 1 to 118, positions 174 to 516, positions 564 to 1120, and positions 1172 to 1215. The amino acid sequence of the protein encoded by the gna1 gene of S6-25 strain is shown in SEQ ID NO: 21. That is, the wild-type gna1 gene may be a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, for example. The wild type Gna1 protein may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, for example. The expression “having an (amino acid or base) sequence” includes the case of “including (amino acid or base) sequence” and the case of “consisting of (amino acid or base) sequence”.
野生型gna1遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型gna1遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、野生型Gna1タンパク質は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型gna1遺伝子にコードされるタンパク質のバリアントであってもよい。そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。本発明において、「野生型gna1遺伝子」という用語は、上記例示した野生型gna1遺伝子に限られず、その保存的バリアントであって「特定の変異」を有さないものを包含するものとする。同様に、「野生型Gna1タンパク質」という用語は、上記例示した野生型gna1遺伝子にコードされるタンパク質に限られず、その保存的バリアントであって「特定の変異」を有さないものを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した野生型gna1遺伝子や野生型Gna1タンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。 The wild-type gna1 gene may be a variant of the wild-type gna1 gene exemplified above as long as it does not have a “specific mutation” and the original function is maintained. Similarly, the wild-type Gna1 protein may be a variant of the protein encoded by the wild-type gna1 gene exemplified above as long as it does not have a “specific mutation” and the original function is maintained. . Such a variant in which the original function is maintained may be referred to as a “conservative variant”. In the present invention, the term “wild-type gna1 gene” is not limited to the wild-type gna1 gene exemplified above, but includes a conservative variant thereof having no “specific mutation”. Similarly, the term “wild-type Gna1 protein” is not limited to the protein encoded by the wild-type gna1 gene exemplified above, but includes conservative variants thereof that do not have “specific mutation”. And Examples of conservative variants include the above-exemplified wild-type gna1 gene and homologues of wild-type Gna1 protein, and artificially modified variants.
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、野生型gna1遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることであってよい。また、「元の機能が維持されている」とは、野生型Gna1タンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、Ｇタンパク質のαサブユニットとしての機能を有することであってよい。「Ｇタンパク質のαサブユニットとしての機能」とは、具体的には、Ｇタンパク質のβおよびγサブユニットと複合体を形成し、シグナル伝達に関与する機能であってよい。 “The original function is maintained” means that the variant of the gene or protein has a function (activity or property) corresponding to the function (activity or property) of the original gene or protein. That is, “the original function is maintained” may mean that, in the wild-type gna1 gene, a variant of the gene encodes a protein in which the original function is maintained. In addition, the expression “mainly maintaining the original function” may mean that, in the wild-type Gna1 protein, a variant of the protein has a function as an α subunit of the G protein. The “function as the α subunit of the G protein” may specifically be a function that forms a complex with the β and γ subunits of the G protein and participates in signal transduction.
以下、保存的バリアントについて例示する。 Hereinafter, the conservative variant will be exemplified.
野生型gna1遺伝子のホモログは、例えば、上記例示した野生型gna1遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、野生型gna1遺伝子のホモログは、例えば、カビ等の微生物の染色体を鋳型にして、これら公知の野生型gna1遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。 The homologue of the wild-type gna1 gene can be easily obtained from a public database by, for example, a BLAST search or FASTA search using the base sequence of the wild-type gna1 gene exemplified above as a query sequence. In addition, the homologue of the wild-type gna1 gene should be obtained by PCR using, for example, oligonucleotides prepared based on the nucleotide sequence of these known wild-type gna1 genes using a chromosome of a microorganism such as mold as a template. Can do.
野生型gna1遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型Gna1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２１）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。 The wild-type gna1 gene has one or several amino acid sequences (SEQ ID NO: 21) in the wild-type Gna1 protein exemplified above as long as it does not have a “specific mutation” and the original function is maintained. It may be a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids at the position are substituted, deleted, inserted or added. The “one or several” is different depending on the position and type of the protein in the three-dimensional structure of the amino acid residue, and specifically, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, Preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, particularly preferably 1 to 3.
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。 One or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions described above are conservative mutations in which the function of the protein is maintained normally. A typical conservative mutation is a conservative substitution. Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In this case, between Gln and Asn, when it is a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, when it is an acidic amino acid, between Asp and Glu, when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr. Specifically, substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Thr to Ser or Ala, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution from Tyr to His, Phe or Trp, and substitution from Val to Met, Ile or Leu. In addition, amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions as described above include naturally occurring mutations (mutants or variants) such as those based on individual differences or species differences of the organism from which the gene is derived. Also included by
また、野生型gna1遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型Gna1タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２１）全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。 In addition, the wild-type gna1 gene has no “specific mutation” and the entire amino acid sequence (SEQ ID NO: 21) of the wild-type Gna1 protein exemplified above as long as the original function is maintained. It may be a gene encoding a protein having homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more. In the present specification, “homology” means “identity”.
また、野生型gna1遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列（配列番号２０）の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃
、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
In addition, the wild-type gna1 gene does not have a “specific mutation” and can be prepared from a known gene sequence, for example, the base sequence (SEQ ID NO: 20) as long as the original function is maintained. It may be DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence in whole or in part. “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, highly homologous DNAs, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more between DNAs having homology. Is hybridized and DNAs with lower homology do not hybridize with each other, or normal Southern hybridization washing conditions 60 ° C, 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C
0.1 × SSC, 0.1% SDS, more preferably at 68 ° C., salt concentration and temperature corresponding to 0.1 × SSC, 0.1% SDS, and conditions for washing once, preferably 2-3 times.
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上記塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。 As described above, the probe used for the hybridization may be a part of a complementary sequence of a gene. Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared on the basis of a known gene sequence as a primer and a DNA fragment containing the base sequence as a template. For example, a DNA fragment having a length of about 300 bp can be used as the probe. When a DNA fragment having a length of about 300 bp is used as the probe, hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 × SSC, and 0.1% SDS.
また、野生型gna1遺伝子は、上記例示した野生型gna1遺伝子またはその保存的バリアントの塩基配列において、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換した塩基配列を有するものであってもよい。 The wild-type gna1 gene may have a base sequence in which any codon is substituted with an equivalent codon in the base sequence of the wild-type gna1 gene exemplified above or a conservative variant thereof.
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Ｍath. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Ｍol. Biol. 48:443 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877に記載されているような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムが挙げられる。 The percentage sequence identity between two sequences can be determined, for example, using a mathematical algorithm. Non-limiting examples of such mathematical algorithms include Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11 17 algorithm, Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 local homology algorithm, Needleman and Wunsch. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443 453 homology alignment algorithm, Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 A method to search for similarities of 2448, Karlin and Altschul (1993) A modified algorithm of Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, as described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 5877.
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。 A program based on these mathematical algorithms can be used to perform sequence comparison (alignment) to determine sequence identity. The program can be appropriately executed by a computer. Such programs include, but are not limited to, the PC / Gene program CLUSTAL (available from Intelligents, Mountain View, Calif.), The ALIGN program (Version 2.0), and the Wisconsin Genetics Software Package, Version 8 (Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, available from Madison, Wis., USA) GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA. Alignment using these programs can be performed using initial parameters, for example. For the CLUSTAL program, Higgins et al. (1988) Gene 73: 237 244 (1988), Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151 153, Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881 90, Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155 65 and Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24: 307 331.
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST (BLAST 2.0)を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。 In order to obtain a nucleotide sequence having homology with the nucleotide sequence encoding the protein of interest, specifically, for example, a BLAST nucleotide search can be performed with the BLASTN program, score = 100, word length = 12. In order to obtain an amino acid sequence having homology with the protein of interest, specifically, for example, a BLAST protein search can be performed with the BLASTX program, score = 50, word length = 3. Please refer to http://www.ncbi.nlm.nih.gov for BLAST nucleotide search and BLAST protein search. In addition, Gapped BLAST (BLAST 2.0) can be used to obtain an alignment with a gap added for the purpose of comparison. PSI-BLAST (BLAST 2.0) can also be used to perform iterative searches that detect distant relationships between sequences. For Gapped BLAST and PSI-BLAST, see Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. When utilizing BLAST, Gapped BLAST, or PSI-BLAST, for example, the initial parameters of each program (eg, BLASTN for nucleotide sequences, BLASTX for amino acid sequences) can be used. The alignment may be performed manually.
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。 Sequence identity between two sequences is calculated as the percentage of residues that match between the two sequences when the two sequences are aligned for maximum matching.
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、creA遺伝子等の任意の遺伝子やCreAタンパク質等の任意のタンパク質にも準用できる。 In addition, the description regarding the said gene or protein variant is applicable mutatis mutandis to arbitrary proteins, such as creA gene, and CreA protein.
変異型Gna1タンパク質は、上述したような野生型Gna1タンパク質のアミノ酸配列において、「特定の変異」を有する。 The mutant Gna1 protein has a “specific mutation” in the amino acid sequence of the wild-type Gna1 protein as described above.
すなわち、言い換えると、変異型Gna1タンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、上述したアクレモニウム・セルロリティカスS6-25株のGna1タンパク質またはその保存的バリアントと同一であってよい。具体的には、例えば、変異型Gna1タンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型Gna1タンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型Gna1タンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号２１に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。 That is, in other words, the mutant Gna1 protein may be the same as the Gna1 protein of the aforementioned Acremonium cellulolyticus S6-25 strain or a conservative variant thereof except that it has a “specific mutation”. Specifically, for example, the mutant Gna1 protein may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 except that it has a “specific mutation”. Specifically, for example, the mutant Gna1 protein has one or several amino acid substitutions, deletions, insertions or additions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 except that it has a “specific mutation”. It may be a protein having an amino acid sequence comprising Specifically, for example, the mutant Gna1 protein has 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95%, with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, except that it has a “specific mutation”. % Or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more of the protein having an amino acid sequence having a homology.
また、言い換えると、変異型Gna1タンパク質は、上述したアクレモニウム・セルロリティカスS6-25株のGna1タンパク質において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「変異」以外の箇所にさらに保存的変異を含むバリアントであってよい。具体的には、例えば、変異型Gna1タンパク質は、配列番号２１に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。 In other words, the mutant Gna1 protein has a “specific mutation” in the above-mentioned Gna1 protein of Acremonium cellulolyticus S6-25 strain, and is more conservative in places other than the “mutation”. It may be a variant containing a mutation. Specifically, for example, the mutant Gna1 protein has a “specific mutation” in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and further substitution of one or several amino acids at positions other than the “mutation” , A protein having an amino acid sequence containing a deletion, insertion, or addition.
変異型gna1遺伝子は、上記のような変異型Gna1タンパク質をコードする限り、特に制限されない。 The mutant gna1 gene is not particularly limited as long as it encodes the mutant Gna1 protein as described above.
以下、変異型Gna1タンパク質が有する「特定の変異」について説明する。 Hereinafter, the “specific mutation” of the mutant Gna1 protein will be described.
「特定の変異」としては、Gna1タンパク質が恒常的活性型となる変異が挙げられる。 The “specific mutation” includes a mutation in which the Gna1 protein becomes a constitutively active form.
「Gna1タンパク質が恒常的活性型となる」とは、Gna1タンパク質のGTPase活性が消失あるいは低減することにより、Gna1タンパク質がＧタンパク質のβおよびγサブユニットと恒常的に複合体を形成した状態になることを意味する。一般にＧタンパク質がアミノ酸残基の変異により恒常的活性型になり得ることは知られており、微生物のGタンパク質以外にも、例えば、ラットのＧタンパク質Rasにおいて恒常的活性型となる変異が報告されている（Masters SB, et al. J Biol Chem, 1989, 264, 15467-15474.）。 “Gna1 protein becomes a constitutively active form” means that Gna1 protein is constantly in a complex with β and γ subunits of G protein when GTPase activity of Gna1 protein disappears or decreases. Means that. In general, it is known that G protein can be made into a constant active form by mutation of amino acid residues. In addition to microbial G protein, for example, a mutation that becomes a constant active form in rat G protein Ras has been reported. (Masters SB, et al. J Biol Chem, 1989, 264, 15467-15474.).
「特定の変異」として、具体的には、野生型Gna1タンパク質の１７８位のアルギニン残基がシステイン残基に置換される変異（Ｒ１７８Ｃ変異）や、野生型Gna1タンパク質の２０４位のグルタミン残基がロイシン残基に置換される変異（Ｑ２０４Ｌ変異）が挙げられる。変異型Gna1タンパク質は、Ｒ１７８Ｃ変異及びＱ２０４Ｌ変異のいずれか又は両方を有していてよい。Gna1タンパク質は、Ｒ１７８Ｃ変異又はＱ２０４Ｌ変異が導入されることにより恒常的活性型になり得る。 Specific examples of the “specific mutation” include a mutation in which the arginine residue at position 178 of the wild-type Gna1 protein is replaced with a cysteine residue (R178C mutation), and a glutamine residue at position 204 in the wild-type Gna1 protein. Examples include a mutation (Q204L mutation) substituted with a leucine residue. The mutant Gna1 protein may have either or both of the R178C mutation and the Q204L mutation. The Gna1 protein can be made constitutively active by introducing the R178C mutation or the Q204L mutation.
なお、gna1遺伝子における「特定の変異」とは、コードするGna1タンパク質に上記のよ
うな「特定の変異」を生じさせる塩基配列上の変異を意味する。
The “specific mutation” in the gna1 gene means a mutation on the base sequence that causes the “specific mutation” as described above in the encoded Gna1 protein.
アクレモニウム・セルロリティカスS6-25株のGna1タンパク質において、「１７８位のアルギニン残基」とは、具体的には、配列番号２１に示すアミノ酸配列の１７８位のアルギニン残基を指す。また、アクレモニウム・セルロリティカスS6-25株のGna1タンパク質において、「２０４位のグルタミン残基」とは、具体的には、配列番号２１に示すアミノ酸配列の２０４位のグルタミン残基を指す。S6-25株のGna1タンパク質における「１７８位のアルギニン残基」および「２０４位のグルタミン残基」は、それぞれ、配列番号２０に示すgna1遺伝子の塩基配列の６３４位〜６３６位および７１２位〜７１４位のヌクレオチド残基にコードされている。 In the Gna1 protein of Acremonium cellulolyticus S6-25 strain, the “arginine residue at position 178” specifically refers to the arginine residue at position 178 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21. In the Gna1 protein of Acremonium cellulolyticus strain S6-25, the “204th glutamine residue” specifically refers to the 204th glutamine residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21. “Arginine residue at position 178” and “Glutamine residue at position 204” in the Gna1 protein of the S6-25 strain are the positions 634 to 636 and 712 to 714 of the base sequence of the gna1 gene shown in SEQ ID NO: 20, respectively. Is encoded by the nucleotide residue.
本発明において、任意の野生型Gna1タンパク質における「１７８位のアルギニン残基」および「２０４位のグルタミン残基」とは、それぞれ、「配列番号２１に示すアミノ酸配列の１７８位のアルギニン残基」および「配列番号２１に示すアミノ酸配列の２０４位のグルタミン残基」に相当するアミノ酸残基を意味する。これらのアミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがある。例えば、配列番号２１に示すアミノ酸配列からなる野生型Gna1タンパク質において、Ｘ位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残基が欠失した、または挿入された場合、元のＸ位のアミノ酸残基は、それぞれ、Ｎ末端から数えてＸ−１番目またはＸ＋１番目のアミノ酸残基となるが、「配列番号２１に示すアミノ酸配列のＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とみなされる。 In the present invention, “arginine residue at position 178” and “glutamine residue at position 204” in any wild-type Gna1 protein are “arginine residue at position 178 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21” and It means an amino acid residue corresponding to “a glutamine residue at position 204 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21”. The positions of these amino acid residues indicate relative positions, and the positions may be changed by amino acid deletion, insertion, addition and the like. For example, in the wild-type Gna1 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, when one amino acid residue is deleted or inserted at a position N-terminal to the X position, the original amino acid residue at the X position Are X-1 or X + 1-th amino acid residues from the N-terminus, but are regarded as “amino acid residues corresponding to the X-position amino acid residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21”.
任意の野生型Gna1タンパク質のアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「１７８位のアルギニン残基」または「２０４位のグルタミン残基」であるかは、当該任意の野生型Gna1タンパク質のアミノ酸配列と配列番号２１に示すアミノ酸配列とのアライメントを行うことにより決定できる。また、任意の野生型gna1遺伝子の塩基配列において、どのヌクレオチド残基が「１７８位のアルギニン残基」または「２０４位のグルタミン残基」をコードするヌクレオチド残基であるかは、当該任意の野生型gna1遺伝子の塩基配列と配列番号２０に示す塩基配列とのアライメントを行うことにより決定できる。アラインメントについては、上述して配列同一性を決定する際のアラインメントに関する記載を準用できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical
Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
In the amino acid sequence of any wild-type Gna1 protein, which amino acid residue is “arginine residue at position 178” or “glutamine residue at position 204” is the amino acid sequence and sequence of any wild-type Gna1 protein. It can be determined by alignment with the amino acid sequence shown in No. 21. In addition, in the nucleotide sequence of an arbitrary wild-type gna1 gene, which nucleotide residue is a nucleotide residue that encodes “the arginine residue at position 178” or “the glutamine residue at position 204” depends on the arbitrary wild-type gna1 gene. It can be determined by aligning the base sequence of the type gna1 gene with the base sequence shown in SEQ ID NO: 20. Regarding the alignment, the description regarding the alignment when determining the sequence identity as described above can be applied mutatis mutandis. The alignment can be performed using, for example, known gene analysis software. Specific software includes DNASIS from Hitachi Solutions and GENETYX from Genetics (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical).
Research, 24 (1), 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198 (2), 327-37. 1987).
変異型gna1遺伝子は、例えば、野生型gna1遺伝子を、コードされるGna1タンパク質が上述した「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。改変の元になる野生型gna1遺伝子は、例えば、野生型gna1遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により、取得できる。また、変異型gna1遺伝子は、野生型gna1遺伝子を介さずに取得することもできる。例えば、化学合成により変異型gna1遺伝子を直接取得してもよい。取得した変異型gna1遺伝子は、さらに改変して利用してもよい。 The mutant gna1 gene can be obtained, for example, by modifying the wild-type gna1 gene so that the encoded Gna1 protein has the above-mentioned “specific mutation”. The wild-type gna1 gene to be modified can be obtained, for example, by cloning from an organism having the wild-type gna1 gene or by chemical synthesis. A mutant gna1 gene can also be obtained without using a wild-type gna1 gene. For example, the mutant gna1 gene may be obtained directly by chemical synthesis. The obtained mutant gna1 gene may be further modified and used.
遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。 The gene can be modified by a known method. For example, a target mutation can be introduced into a target site of DNA by site-specific mutagenesis. As a site-specific mutation method, a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, HA Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, HJ, Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, TA et al., Meth. In Enzymol., 154, 367 ( 1987)).
以下、変異型gna1遺伝子を保持するようにアクレモニウム・セルロリティカスを改変する手法について説明する。 Hereinafter, a technique for modifying Acremonium cellulolyticus so as to retain the mutant gna1 gene will be described.
変異型gna1遺伝子を保持するようにアクレモニウム・セルロリティカスを改変することは、変異型gna1遺伝子をアクレモニウム・セルロリティカスに導入することにより達成できる。また、変異型gna1遺伝子を保持するようにアクレモニウム・セルロリティカスを改変することは、アクレモニウム・セルロリティカスの染色体上のgna1遺伝子に上述した「特定の変異」を導入することによっても達成できる。染色体上の遺伝子への変異導入は、自然変異、変異原処理、または遺伝子工学的手法により達成できる。 Altering Acremonium cellulolyticus to retain the mutant gna1 gene can be achieved by introducing the mutant gna1 gene into Acremonium cellulolyticus. Altering Acremonium cellulolyticus to retain the mutant gna1 gene is also achieved by introducing the above-mentioned “specific mutation” into the gna1 gene on the Acremonium cellulolyticus chromosome. it can. Mutation introduction into a gene on a chromosome can be achieved by natural mutation, mutagen treatment, or genetic engineering techniques.
変異型gna1遺伝子をアクレモニウム・セルロリティカスに導入する手法は特に制限されない。本発明の微生物において、変異型gna1遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカスで機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、gna1遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。アクレモニウム・セルロリティカスで機能するプロモーターとしては、cbh1プロモーター（特開2001-017180）が挙げられる。本発明の微生物は、変異型gna1遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピー有していてもよい。本発明の微生物は、１種類の変異型gna1遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型gna1遺伝子を有していてもよい。 The method for introducing the mutant gna1 gene into Acremonium cellulolyticus is not particularly limited. In the microorganism of the present invention, the mutant gna1 gene only needs to be maintained so that it can be expressed under the control of a promoter that functions in Acremonium cellulolyticus. The promoter may be a host-derived promoter or a heterologous promoter. The promoter may be a native promoter of the gna1 gene or a promoter of another gene. An example of a promoter that functions in Acremonium cellulolyticus is the cbh1 promoter (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-017180). The microorganism of the present invention may have only one copy of the mutant gna1 gene, or may have two or more copies. The microorganism of the present invention may have only one type of mutant gna1 gene or may have two or more types of mutant gna1 genes.
本発明の微生物において、変異型gna1遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。 In the microorganism of the present invention, the mutant gna1 gene may be present on a vector that autonomously replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or may be integrated on the chromosome.
すなわち、変異型gna1遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカスで自律複製するベクターに搭載され、アクレモニウム・セルロリティカスに導入されてよい。具体的には、変異型gna1遺伝子をアクレモニウム・セルロリティカスで自律複製するベクターに組み込み、そうして得られた変異型gna1遺伝子の発現ベクターをアクレモニウム・セルロリティカスに導入することができる。ベクターは、１コピーベクターであってもよく、低コピーベクターであってもよく、多コピーベクターであってもよい。ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を備えていてよい。ベクターは、変異型gna1遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。 That is, the mutant gna1 gene may be mounted on a vector that autonomously replicates in Acremonium cellulolyticus and introduced into Acremonium cellulolyticus. Specifically, the mutant gna1 gene can be incorporated into a vector that autonomously replicates with Acremonium cellulolyticus, and the resulting mutant gna1 gene expression vector can be introduced into Acremonium cellulolyticus . The vector may be a one-copy vector, a low-copy vector, or a multi-copy vector. The vector may be provided with a marker gene for selecting a transformant. The vector may be provided with a promoter and terminator for expressing the mutant gna1 gene.
また、変異型gna1遺伝子は、アクレモニウム・セルロリティカスの染色体に導入されてよい。染色体への遺伝子の導入は、相同組み換えを利用して行うことができる。具体的には、変異型gna1遺伝子を含む組換えＤＮＡでアクレモニウム・セルロリティカスを形質転換し、アクレモニウム・セルロリティカスの染色体上の目的部位と相同組み換えを起こすことにより、変異型gna1遺伝子をアクレモニウム・セルロリティカスの染色体上に導入することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、変異型gna1遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、変異型gna1遺伝子の両端に染色体上の置換対象部位の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡでアクレモニウム・セルロリティカスを形質転換して、置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、置換対象部位を変異型gna1遺伝子に置換することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を備えていてよい。 The mutant gna1 gene may be introduced into the chromosome of Acremonium cellulolyticus. Introduction of a gene into a chromosome can be performed using homologous recombination. Specifically, by transforming Acremonium cellulolyticus with a recombinant DNA containing the mutant gna1 gene and causing homologous recombination with the target site on the chromosome of Acremonium cellulolyticus, the mutant gna1 gene Can be introduced onto the chromosome of Acremonium cellulolyticus. The structure of the recombinant DNA used for homologous recombination is not particularly limited as long as homologous recombination occurs in a desired manner. For example, a linear DNA containing a mutant gna1 gene, which has both upstream and downstream sequences of the site to be replaced on both ends of the mutant gna1 gene, and transforms Acremonium cellulolyticus Then, by causing homologous recombination upstream and downstream of the site to be replaced, the site to be replaced can be replaced with the mutant gna1 gene. The recombinant DNA used for homologous recombination may be provided with a marker gene for selecting a transformant.
マーカー遺伝子は、宿主の栄養要求性等の形質に応じて適宜選択できる。例えば、宿主がpyrF遺伝子またはpyrG遺伝子の変異によりUracil要求性を示す場合、pyrF遺伝子またはpyrG遺伝子をマーカー遺伝子として用いることにより、Uracil要求性の相補（すなわちUracil非要求性）を指標として、目的の改変が導入された株を選抜することができる。また
、マーカー遺伝子としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を用いることができる。
The marker gene can be appropriately selected according to a trait such as auxotrophy of the host. For example, when the host shows Uracil requirement by the mutation of the pyrF gene or the pyrG gene, by using the pyrF gene or the pyrG gene as a marker gene, the complement of Uracil requirement (that is, non-Uracil requirement) is used as an index, and the target Strains introduced with the modification can be selected. As the marker gene, a drug resistance gene such as a hygromycin resistance gene can be used.
形質転換は、例えば、カビや酵母等の真核微生物の形質転換に通常用いられる手法により行うことができる。そのような手法としては、プロトプラスト法が挙げられる。プロトプラスト法は、具体的には、例えば、実施例の（２）に記載の手順により実施することができる。 Transformation can be performed by a technique usually used for transformation of eukaryotic microorganisms such as mold and yeast. An example of such a method is a protoplast method. Specifically, the protoplast method can be carried out, for example, according to the procedure described in Example (2).
本発明の微生物は、野生型gna1遺伝子を有していてもよく、有していなくともよいが、有していないのが好ましい。 The microorganism of the present invention may or may not have the wild-type gna1 gene, but preferably does not have it.
野生型gna1遺伝子を有さないアクレモニウム・セルロリティカスは、染色体上の野生型gna1遺伝子を破壊することにより取得できる。野生型gna1遺伝子の破壊は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、野生型gna1遺伝子のプロモーター領域および／またはコード領域の一部または全部を欠損させることにより野生型gna1遺伝子を破壊できる。また、染色体上の野生型gna1遺伝子を変異型gna1遺伝子で置換することにより、野生型gna1遺伝子を有さず、且つ、変異型gna1遺伝子を有するように改変されたアクレモニウム・セルロリティカスを取得できる。 Acremonium cellulolyticus having no wild-type gna1 gene can be obtained by disrupting the wild-type gna1 gene on the chromosome. The disruption of the wild type gna1 gene can be performed by a known method. Specifically, for example, the wild-type gna1 gene can be disrupted by deleting part or all of the promoter region and / or coding region of the wild-type gna1 gene. In addition, by replacing the wild-type gna1 gene on the chromosome with a mutant gna1 gene, Acremonium cellulolyticus modified to have the mutant gna1 gene without the wild-type gna1 gene is obtained. it can.
＜１−３＞その他の改変
本発明の微生物は、さらに、他の改変を有していてもよい。変異型gna1遺伝子を保持させる改変とその他の改変の実施順序は特に制限されない。他の改変としては、セルラーゼ生産能が向上する改変が挙げられる。他の改変として、具体的には、creA遺伝子にコードされるタンパク質（CreAタンパク質）の活性が低下する改変が挙げられる。すなわち、本発明の微生物は、例えば、CreAタンパク質の活性が低下するように改変されていてよい。より具体的には、本発明の微生物は、例えば、creA遺伝子の発現が低下するように改変されていてもよく、creA遺伝子が破壊されるように改変されていてもよい。creA遺伝子は、カタボライトリプレッションに関与する転写因子をコードする遺伝子である。creA遺伝子は、糸状菌において、セルラーゼの発現に関与していることが知られている（Mol Gen Genet. 1996 Jun 24;251(4):451-60、Biosci Biotechnol Biochem. 1998 Dec;62(12):2364-70）。
<1-3> Other Modifications The microorganism of the present invention may further have other modifications. There is no particular restriction on the order of performing the modification that retains the mutant gna1 gene and other modifications. Other modifications include modifications that improve cellulase production ability. Specific examples of other modifications include modifications that reduce the activity of the protein encoded by the creA gene (CreA protein). That is, the microorganism of the present invention may be modified, for example, so that the activity of CreA protein is reduced. More specifically, the microorganism of the present invention may be modified so that, for example, the expression of the creA gene decreases, or may be modified so that the creA gene is destroyed. The creA gene is a gene encoding a transcription factor involved in catabolite repression. The creA gene is known to be involved in cellulase expression in filamentous fungi (Mol Gen Genet. 1996 Jun 24; 251 (4): 451-60, Biosci Biotechnol Biochem. 1998 Dec; 62 (12 ): 2364-70).
S6-25株のcreA遺伝子の塩基配列を配列番号１９に示す。菌株によってcreA遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、creA遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したcreA遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、CreAタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したcreA遺伝子にコードされるタンパク質のバリアントであってもよい。creA遺伝子やCreAタンパク質のバリアントについては、上述したgna1遺伝子およびGna1タンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。なお、「元の機能が維持されている」とは、CreAタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、カタボライトリプレッションに関与する転写因子としての機能を有することであってよい。 The nucleotide sequence of the creA gene of S6-25 strain is shown in SEQ ID NO: 19. Since there may be a difference in the base sequence of the creA gene depending on the strain, the creA gene may be a variant of the creA gene exemplified above as long as the original function is maintained. Similarly, the CreA protein may be a variant of the protein encoded by the creA gene exemplified above as long as the original function is maintained. Regarding the variants of the creA gene and CreA protein, the above description concerning the conservative variants of the gna1 gene and Gna1 protein can be applied mutatis mutandis. The phrase “the original function is maintained” may mean that, in the CreA protein, the variant of the protein has a function as a transcription factor involved in catabolite repression.
以下に、CreAタンパク質等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。 Hereinafter, a technique for reducing the activity of a protein such as CreA protein will be described.
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺
伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
“Protein activity decreases” means that the activity per cell of the protein is decreased compared to wild-type strains and parental unmodified strains, and the activity is completely lost. including. Specifically, “the activity of the protein is decreased” means that the number of molecules per cell of the protein is decreased and / or the function per molecule of the protein compared to the unmodified strain. Means that it is decreasing. In other words, “activity” in the case of “decrease in protein activity” means not only the catalytic activity of the protein but also the transcription amount (mRNA amount) or translation amount (protein amount) of the gene encoding the protein. May be. Note that “the number of molecules per cell of the protein is decreased” includes a case where the protein does not exist at all. Moreover, “the function per molecule of the protein is reduced” includes the case where the function per molecule of the protein is completely lost. The activity of the protein is not particularly limited as long as it is lower than that of the non-modified strain. For example, it is 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0, compared to the non-modified strain. %.
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して減少することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。 The modification that decreases the activity of the protein is achieved, for example, by decreasing the expression of a gene encoding the protein. “Gene expression decreases” means that the expression level of the gene per cell decreases as compared to an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain. “Gene expression decreases” specifically means that the amount of gene transcription (mRNA amount) decreases and / or the amount of gene translation (protein amount) decreases. Good. “Gene expression decreases” includes the case where the gene is not expressed at all. In addition, “the expression of the gene is reduced” is also referred to as “the expression of the gene is weakened”. Gene expression may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to an unmodified strain.
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子の発現調節配列を改変することにより達成できる。「発現調節配列」とは、プロモーター等の、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列は、例えば、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換してもよい。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、各種誘導型のプロモーターを利用することができる。すなわち、誘導型のプロモーターは、誘導物質の非存在下で、より弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。 The decrease in gene expression may be due to, for example, a decrease in transcription efficiency, a decrease in translation efficiency, or a combination thereof. Reduction of gene expression can be achieved, for example, by modifying gene expression regulatory sequences. “Expression regulatory sequence” is a general term for sites that affect gene expression, such as promoters. The expression regulatory sequence can be determined using, for example, a promoter search vector or gene analysis software such as GENETYX. In the case of modifying the expression control sequence, the expression control sequence is preferably modified by 1 base or more, more preferably 2 bases or more, particularly preferably 3 bases or more. Alternatively, the promoter of the gene on the chromosome may be replaced with a weaker promoter. By “weaker promoter” is meant a promoter whose gene transcription is weaker than the native wild-type promoter. As the weaker promoter, for example, various inducible promoters can be used. That is, an inducible promoter can function as a weaker promoter in the absence of an inducer. Further, part or all of the expression regulatory sequence may be deleted. In addition, reduction of gene expression can be achieved, for example, by manipulating factors involved in expression control. Factors involved in expression control include small molecules (such as inducers and inhibitors) involved in transcription and translation control, proteins (such as transcription factors), nucleic acids (such as siRNA), and the like.
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。 Moreover, the modification that decreases the activity of the protein can be achieved, for example, by destroying a gene encoding the protein. “Gene is disrupted” means that the gene is modified so that it does not produce a normally functioning protein. “Does not produce a protein that functions normally” includes the case where no protein is produced from the same gene, or the case where a protein whose function (activity or property) per molecule is reduced or lost is produced from the same gene. It is.
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。遺伝子の前後の配列には、例えば、遺伝子の発現制御領域が含まれてよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。creA遺伝子の場合、具体的には、例えば、配列番号１９の３２６２〜４５０９位に相当する部分を欠損させることにより、同遺伝子
を破壊することができる。
Gene disruption can be achieved, for example, by deleting part or all of the coding region of the gene on the chromosome. Furthermore, the entire gene including the sequences before and after the gene on the chromosome may be deleted. The sequence before and after the gene may include, for example, a gene expression control region. The region to be deleted may be any region such as an N-terminal region, an internal region, or a C-terminal region as long as a decrease in protein activity can be achieved. Usually, the longer region to be deleted can surely inactivate the gene. Moreover, it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the region to be deleted do not match. In the case of the creA gene, specifically, for example, the gene can be destroyed by deleting the portion corresponding to positions 3262-4509 of SEQ ID NO: 19.
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。 In addition, gene disruption is, for example, introducing an amino acid substitution (missense mutation) into a coding region of a gene on a chromosome, introducing a stop codon (nonsense mutation), or adding or deleting 1 to 2 bases. It can also be achieved by introducing a frameshift mutation (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839 (1991)).
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、マーカー遺伝子やセルラーゼ生産に有用な遺伝子が挙げられる。 In addition, gene disruption can be achieved, for example, by inserting another sequence into the coding region of the gene on the chromosome. The insertion site may be any region of the gene, but the longer the inserted sequence, the more reliably the gene can be inactivated. Moreover, it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the insertion site do not match. Other sequences are not particularly limited as long as they reduce or eliminate the activity of the encoded protein, and examples thereof include marker genes and genes useful for cellulase production.
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。 Modifying a gene on a chromosome as described above includes, for example, deleting a partial sequence of the gene and preparing a deleted gene modified so as not to produce a normally functioning protein. The host is transformed with the recombinant DNA containing, and the homologous recombination is caused between the deletion type gene and the wild type gene on the chromosome, thereby replacing the wild type gene on the chromosome with the deletion type gene. Can be achieved. At this time, the recombinant DNA can be easily manipulated by including a marker gene in accordance with a trait such as auxotrophy of the host. Even if the protein encoded by the deletion-type gene is produced, it has a three-dimensional structure different from that of the wild-type protein, and its function is reduced or lost.
相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、任意の配列を含む線状ＤＮＡであって、当該任意の配列の両端に染色体上の置換対象部位の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで置換対象部位を当該任意の配列に置換することができる。当該任意の配列としては、例えば、マーカー遺伝子を含む配列を用いることができる。 The structure of the recombinant DNA used for homologous recombination is not particularly limited as long as homologous recombination occurs in a desired manner. For example, a linear DNA containing an arbitrary sequence, the host being transformed with a linear DNA each having upstream and downstream sequences of the replacement target site on the chromosome at both ends of the arbitrary sequence, and the replacement target site By causing homologous recombination upstream and downstream, respectively, the site to be replaced can be replaced with the arbitrary sequence in one step. As the arbitrary sequence, for example, a sequence containing a marker gene can be used.
マーカー遺伝子は、宿主の栄養要求性等の形質に応じて適宜選択できる。例えば、宿主がpyrF遺伝子またはpyrG遺伝子の変異によりUracil要求性を示す場合、pyrF遺伝子またはpyrG遺伝子をマーカー遺伝子として用いることにより、Uracil要求性の相補（すなわちUracil非要求性）を指標として、目的の改変が導入された株を選抜することができる。また、マーカー遺伝子としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を用いることができる。 The marker gene can be appropriately selected according to a trait such as auxotrophy of the host. For example, when the host shows Uracil requirement by the mutation of the pyrF gene or the pyrG gene, by using the pyrF gene or the pyrG gene as a marker gene, the complement of Uracil requirement (that is, non-Uracil requirement) is used as an index, and the target Strains introduced with the modification can be selected. As the marker gene, a drug resistance gene such as a hygromycin resistance gene can be used.
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。 Further, the modification that decreases the activity of the protein may be performed by, for example, a mutation treatment. Mutation treatments include X-ray irradiation, ultraviolet irradiation, and N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethylmethanesulfonate (EMS), and methylmethanesulfonate (MMS). ) And the like.
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。CreAタンパク質の活性は、例えば、カタボライトリプレッションの程度を測定することにより、測定できる。カタボライトリプレッションの程度は、例えば、グルコースを炭素源として含む培養条件でのセルラーゼ生産を測定することにより、測定することができる。すなわち、CreAタンパク質の活性が低下したことは、具体的には、例えば、グルコースを炭素源として含む培養条件でのセルラーゼ生産の向上を指標として、確認できる。 The decrease in protein activity can be confirmed by measuring the activity of the protein. The activity of CreA protein can be measured, for example, by measuring the degree of catabolite repression. The degree of catabolite repression can be measured, for example, by measuring cellulase production under culture conditions containing glucose as a carbon source. That is, the decrease in the activity of the CreA protein can be confirmed specifically using, for example, an improvement in cellulase production under culture conditions containing glucose as a carbon source as an index.
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。 The decrease in the activity of the protein can also be confirmed by confirming that the expression of the gene encoding the protein has decreased. The decrease in gene expression can be confirmed by confirming that the transcription amount of the gene has decreased, or confirming that the amount of protein expressed from the gene has decreased.
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。 Confirmation that the amount of gene transcription has been reduced can be confirmed by comparing the amount of mRNA transcribed from the same gene with an unmodified strain. Examples of methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR and the like (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). The amount of mRNA may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to the unmodified strain.
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。 Confirmation that the amount of protein has decreased can be performed by Western blotting using an antibody (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). The amount of protein may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to the unmodified strain.
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。 Whether or not a gene has been destroyed can be confirmed by determining part or all of the base sequence, restriction enzyme map, full length, etc. of the gene according to the means used for the destruction.
形質転換は、例えば、カビや酵母等の真核微生物の形質転換に通常用いられる手法により行うことができる。そのような手法としては、プロトプラスト法が挙げられる。プロトプラスト法は、具体的には、例えば、実施例の（２）に記載の手順により実施することができる。 Transformation can be performed by a technique usually used for transformation of eukaryotic microorganisms such as mold and yeast. An example of such a method is a protoplast method. Specifically, the protoplast method can be carried out, for example, according to the procedure described in Example (2).
＜２＞セルラーゼの製造方法
本発明の微生物を利用して、セルラーゼを製造することができる。すなわち、本発明は、本発明の微生物を培地で培養し、セルラーゼを該培地中に生成蓄積させること、および該培地よりセルラーゼを回収することを含む、セルラーゼの製造法を提供する。
<2> Cellulase Production Method Cellulase can be produced using the microorganism of the present invention. That is, the present invention provides a method for producing cellulase, comprising culturing the microorganism of the present invention in a medium, producing and accumulating cellulase in the medium, and recovering cellulase from the medium.
使用する培地は、本発明の微生物が増殖でき、セルラーゼが生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定することができる。具体的な培地組成については、例えば、アクレモニウム・セルロリティカスに関する既報（特開2003-135052、特開2008-271826、特開2008-271927等）に記載の培地組成や、トリコデルマ・リーゼイ等のその他各種セルラーゼ生産微生物用の培地組成を参照することができる。 The medium to be used is not particularly limited as long as the microorganism of the present invention can grow and cellulase is produced. As the medium, for example, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, a phosphate source, a sulfur source, and other components selected from various organic components and inorganic components as necessary can be used. A person skilled in the art can appropriately set the type and concentration of the medium components. For specific medium composition, for example, the medium composition described in the previous reports on Acremonium cellulolyticus (JP 2003-135052, JP 2008-271826, JP 2008-271927, etc.), Trichoderma reesei etc. Other medium composition for cellulase-producing microorganisms can be referred to.
炭素源は、本発明の微生物が資化してセルラーゼを生成し得るものであれば、特に限定されない。セルラーゼ生産量の観点から、一般的に、セルロース系基質を炭素源として用いるのが好ましい。セルロース系基質として、具体的には、例えば、微結晶セルロース（アビセル）、ろ紙、古紙、パルプ、木材、稲わら、麦わら、籾殻、米ぬか、小麦ふすま、サトウキビバガス、コーヒー粕、茶粕が挙げられる。セルロース系基質は、水熱分解処理、酸処理、アルカリ処理、蒸煮、爆砕、粉砕等の前処理に供してから炭素源として利用してもよい。市販の好適なセルロース系基質としては、ソルカフロック（International Fiber Corp, North Tonawanda, NY, U.S.A）が挙げられる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、セロビオース等の糖類も好適に用いることができる。また、セルロース系基質とそれ以外の炭素源とを併用してもよい。例えば、アクレモニウム・セルロリティカスについて、セルロース系基質と、ラクトースを含有する原料とを併用することで、効率的
にセルラーゼを生産できることが報告されている（特開2008-271826）。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
The carbon source is not particularly limited as long as the microorganism of the present invention can be assimilated to produce cellulase. From the viewpoint of cellulase production, it is generally preferable to use a cellulosic substrate as a carbon source. Specific examples of the cellulosic substrate include microcrystalline cellulose (Avicel), filter paper, waste paper, pulp, wood, rice straw, straw, rice husk, rice bran, wheat bran, sugar cane bagasse, coffee lees, and tea lees. . The cellulosic substrate may be used as a carbon source after being subjected to pretreatment such as hydrothermal decomposition treatment, acid treatment, alkali treatment, steaming, explosion, and pulverization. A suitable commercially available cellulosic substrate includes Solcaflock (International Fiber Corp, North Tonawanda, NY, USA). As the carbon source, saccharides such as glucose, lactose, cellobiose and the like can also be suitably used. In addition, a cellulosic substrate and other carbon sources may be used in combination. For example, it has been reported that for Acremonium cellulolyticus, cellulase can be efficiently produced by using a cellulosic substrate in combination with a raw material containing lactose (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-271826). As the carbon source, one type of carbon source may be used, or two or more types of carbon sources may be used in combination.
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。 Specific examples of the nitrogen source include ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, meat extract, corn steep liquor, and soy protein degradation product, ammonia, and urea. Can be mentioned. As the nitrogen source, one kind of nitrogen source may be used, or two or more kinds of nitrogen sources may be used in combination.
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。 Specific examples of the phosphoric acid source include phosphates such as potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate, and phosphate polymers such as pyrophosphoric acid. As the phosphoric acid source, one type of phosphoric acid source may be used, or two or more types of phosphoric acid sources may be used in combination.
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。 Specific examples of the sulfur source include inorganic sulfur compounds such as sulfate, thiosulfate, and sulfite, and sulfur-containing amino acids such as cysteine, cystine, and glutathione. As the sulfur source, one kind of sulfur source may be used, or two or more kinds of sulfur sources may be used in combination.
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。 Other various organic and inorganic components include, for example, inorganic salts such as sodium chloride and potassium chloride; trace metals such as iron, manganese, magnesium and calcium; vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6 and nicotine Examples include vitamins such as acid, nicotinamide, and vitamin B12; amino acids; nucleic acids; and organic components such as peptone, casamino acid, yeast extract, and soybean protein degradation products containing these. As other various organic components and inorganic components, one component may be used, or two or more components may be used in combination.
培養条件は、本発明の微生物が増殖でき、セルラーゼが生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、糸状菌等の微生物の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。具体的な培養条件については、例えば、アクレモニウム・セルロリティカスに関する既報（特開2003-135052、特開2008-271826、特開2008-271927等）に記載の培養条件や、トリコデルマ・リーゼイ等のその他各種セルラーゼ生産微生物用の培養条件を参照することができる。 The culture conditions are not particularly limited as long as the microorganism of the present invention can grow and cellulase is produced. The culture can be performed, for example, under normal conditions used for culturing microorganisms such as filamentous fungi. Specific culture conditions include, for example, the culture conditions described in the previous reports on Acremonium cellulolyticus (JP 2003-135052, JP 2008-271826, JP 2008-271927, etc.), Trichoderma reesei etc. Other culture conditions for cellulase producing microorganisms can be referred to.
培養は、例えば、液体培地を用いて、通気培養または振盪培養により、好気的に行うことができる。培養温度は、例えば、15〜43℃であってよい。培養期間は、例えば、2時間〜20日であってよい。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。また、培養は、前培養と本培養とに分けて実施してもよい。例えば、前培養を寒天培地等の固体培地上で行い、本培養を液体培地で行ってもよい。 The culture can be performed aerobically, for example, by aeration culture or shaking culture using a liquid medium. The culture temperature may be, for example, 15 to 43 ° C. The culture period may be, for example, 2 hours to 20 days. The culture can be performed by batch culture, fed-batch culture, continuous culture, or a combination thereof. Moreover, you may implement culture | cultivation by dividing into preculture and main culture. For example, pre-culture may be performed on a solid medium such as an agar medium, and main culture may be performed on a liquid medium.
上記のようにして本発明の微生物を培養することにより、培地中にセルラーゼが生成蓄積する。 Cellulase is produced and accumulated in the medium by culturing the microorganism of the present invention as described above.
本発明において、「セルラーゼ」とは、セルロースに含まれるグリコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素の総称である。セルラーゼとしては、エンド型セルラーゼ（エンドグルカナーゼ；EC 3.2.1.4）、エキソ型セルラーゼ（セロビオヒドロラーゼ；EC 3.2.1.91）、セロビアーゼ（β−グルコシダーゼ；EC 3.2.1.21）が挙げられる。また、セルラーゼは、活性測定に用いられる基質に応じて、アビセラーゼ、フィルターペーパーセルラーゼ（ＦＰアーゼ）、カルボキシメチルセルラーゼ（ＣＭＣアーゼ）等とも呼ばれる。 In the present invention, “cellulase” is a general term for enzymes that catalyze a reaction of hydrolyzing a glycosidic bond contained in cellulose. Examples of the cellulase include endo-type cellulase (endoglucanase; EC 3.2.1.4), exo-type cellulase (cellobiohydrolase; EC 3.2.1.91), and cellobiase (β-glucosidase; EC 3.2.1.21). Cellulase is also called avicelase, filter paper cellulase (FPase), carboxymethyl cellulase (CMCase), etc., depending on the substrate used for activity measurement.
セルラーゼが生産されたことは、例えば、培養上清等の適当な画分のセルラーゼ活性を測定することにより確認できる。セルラーゼ活性は、公知の手法により測定することができる。具体的には、例えば、微結晶セルロース（アビセル）やろ紙等のセルロースを基質として酵素反応を行い、生成する還元糖量を指標として、アビセラーゼ活性（アビセル分解活性）やＦＰアーゼ活性（ろ紙分解活性）等の基質に対応したセルラーゼ活性を算出することができる。還元糖量は、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法やソモギーネルソン法等の公知の手法により測定することができる。アビセル分解活性やろ紙分解活性は、具体的には、例えば、実施例の（４）に記載の手法により測定することができる。 The production of cellulase can be confirmed, for example, by measuring the cellulase activity of an appropriate fraction such as a culture supernatant. Cellulase activity can be measured by a known method. Specifically, for example, an enzyme reaction is carried out using cellulose such as microcrystalline cellulose (Avicel) or filter paper as a substrate, and the amount of reducing sugar produced is used as an index to determine avicelase activity (Avicel degradation activity) or FPase activity (filter paper degradation activity). The cellulase activity corresponding to a substrate such as) can be calculated. The amount of reducing sugar can be measured by a known method such as the dinitrosalicylic acid (DNS) method or the Somogy Nelson method. Specifically, the Avicel decomposition activity and the filter paper decomposition activity can be measured, for example, by the method described in Example (4).
生産されたセルラーゼは、セルラーゼを含む適当な画分として回収することができる。そのような画分としては、培養物や培養上清が挙げられる。また、セルラーゼは、所望の程度に分離精製されてもよい。セルラーゼは、例えば、菌体等の固形分を遠心分離等により培養物から除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらの組み合わせにより分離精製することができる。なお、培地中には、セルラーゼとともに、他の酵素、例えば、キシラナーゼ、キシロビアーゼ（β−キシロシダーゼ）、アラビノフラノシダーゼ等のヘミセルラーゼ、も生成蓄積し得る。セルラーゼは、そのような他の酵素との混合物として回収されてもよく、そのような他の酵素と分離して回収されてもよい。 The produced cellulase can be recovered as an appropriate fraction containing cellulase. Such fractions include cultures and culture supernatants. Cellulase may be separated and purified to a desired degree. Cellulase, for example, after removing solids such as bacterial cells from the culture by centrifugation, etc., salting out, ethanol precipitation, ultrafiltration, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, Separation and purification can be performed by a known appropriate method such as medium-high pressure liquid chromatography, reverse phase chromatography, hydrophobic chromatography, or a combination thereof. In the medium, cellulase and other enzymes such as xylanase, xylobiase (β-xylosidase), arabinofuranosidase and other hemicellulases can be produced and accumulated. Cellulase may be recovered as a mixture with such other enzymes, or may be recovered separately from such other enzymes.
回収したセルラーゼは、適宜、製剤化してもよい。剤形は特に制限されず、セルラーゼの使用用途等の諸条件に応じて適宜設定することができる。剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤が挙げられる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の薬理学的に許容される添加剤を使用することができる。 The recovered cellulase may be formulated as appropriate. The dosage form is not particularly limited, and can be appropriately set according to various conditions such as the use application of cellulase. Examples of the dosage form include solutions, suspensions, powders, tablets, pills, and capsules. In formulation, for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, flavoring agents, fragrances, diluents, surfactants and other pharmacologically acceptable additives. Can be used.
このようにして得られるセルラーゼを、「本発明のセルラーゼ」ともいう。 The cellulase thus obtained is also referred to as “cellulase of the present invention”.
＜３＞セルラーゼの利用
本発明のセルラーゼは、セルロースの分解に利用できる。例えば、本発明のセルラーゼを利用して植物バイオマスに含まれるセルロース成分を糖化することにより、グルコースを含有する糖化液が得られる。
<3> Use of Cellulase The cellulase of the present invention can be used for the decomposition of cellulose. For example, a saccharified solution containing glucose can be obtained by saccharifying a cellulose component contained in plant biomass using the cellulase of the present invention.
また、本発明のセルラーゼがキシラナーゼ等のヘミセルラーゼ活性を有する場合には、本発明のセルラーゼは、ヘミセルロースの分解にも利用できる。例えば、本発明のセルラーゼを利用して植物バイオマスに含まれるヘミセルロース成分を糖化することにより、キシロースやアラビノースを含有する糖化液が得られる。 In addition, when the cellulase of the present invention has hemicellulase activity such as xylanase, the cellulase of the present invention can also be used for degradation of hemicellulose. For example, a saccharified solution containing xylose or arabinose can be obtained by saccharifying hemicellulose components contained in plant biomass using the cellulase of the present invention.
このようにして得られた糖化液は、例えば、炭素源として微生物の培養に利用することができる。さらに、一態様においては、微生物を培養することにより、所望の目的物質を製造することができる。すなわち、本発明は、例えば、植物バイオマスを本発明のセルラーゼを用いた糖化処理に供すること、前記糖化処理の処理物（糖化液）を含有する培地で目的物質の生産能を有する微生物を培養し、目的物質を該培地中又は該微生物の菌体内に生成蓄積させること、および該培地又は菌体より目的物質を採取することを含む、目的物質の製造法を提供する。 The saccharified solution thus obtained can be used, for example, as a carbon source for culturing microorganisms. Furthermore, in one aspect, a desired target substance can be produced by culturing a microorganism. That is, the present invention includes, for example, subjecting plant biomass to a saccharification treatment using the cellulase of the present invention, and culturing a microorganism capable of producing a target substance in a medium containing the processed product (saccharified solution) of the saccharification treatment. The present invention provides a method for producing a target substance, which comprises producing and accumulating the target substance in the medium or in the cells of the microorganism, and collecting the target substance from the medium or the fungus body.
植物バイオマスとしては、木質系バイオマスや草本系バイオマスが挙げられる。植物バイオマスとして、具体的には、例えば、稲わら、麦わら、籾殻、サトウキビバガス、オイ
ルパーム空果房、コーンストーバ、コーンコブ、スイッチグラス、エリアンサス、ネピアグラス、廃木材が挙げられる。
Examples of plant biomass include woody biomass and herbaceous biomass. Specific examples of plant biomass include rice straw, straw, rice husk, sugar cane bagasse, oil palm empty fruit bunch, corn stover, corn cob, switchgrass, Eliansus, napiergrass, and waste wood.
植物バイオマスは、そのまま、あるいは適宜、前処理に供してから、糖化処理に供してよい。すなわち、目的物質の製造法は、糖化処理前に、植物バイオマスを前処理に供することを含んでいてもよい。前処理としては、水熱分解処理、酸処理、アルカリ処理、蒸煮、爆砕、粉砕が挙げられる。これらの中では、水熱分解処理が好ましい。これらの前処理は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。例えば、植物バイオマスは、５ｍｍ以下に粉砕して、水熱分解処理に供してもよい。 The plant biomass may be subjected to saccharification treatment after being subjected to pretreatment as it is or appropriately. That is, the method for producing a target substance may include subjecting plant biomass to pretreatment before saccharification treatment. Examples of the pretreatment include hydrothermal decomposition treatment, acid treatment, alkali treatment, steaming, explosion, and pulverization. Among these, hydrothermal decomposition treatment is preferable. These pretreatments may be used alone or in combination. For example, plant biomass may be pulverized to 5 mm or less and subjected to hydrothermal decomposition treatment.
水熱分解処理は、例えば、好ましくは１７５〜２４０℃、より好ましくは２００〜２３０℃の加圧熱水を用いて行うことができる。植物バイオマスは、一般的に、セルロース、ヘミセルロース、リグニン等の成分で構成されるが、ヘミセルロース成分は約１４０℃以上で、セルロースは約２３０℃以上で、リグニン成分は約１４０℃以上で溶解する。よって、セルロース成分と他の成分とを十分に分離するためには、上記範囲の温度で水熱分解処理を行うのが好ましい。水熱分解処理の反応圧力は、反応系が加圧熱水の状態となるよう、各温度の水の飽和蒸気圧より更に０．１〜０．５ＭＰａ高い圧力とするのが好ましい。水熱分解処理の反応時間は、例えば、通常２０分以下、好ましくは３〜１５分であってよい。水熱分解処理は、１回行われてもよく、２回またはそれ以上行われてもよい。水熱分解処理が２回またはそれ以上行われる場合、各回の水熱分解処理の実施条件は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。上記のような水熱分解処理は、植物バイオマスを加圧熱水と対向接触させることにより行うことができる。このような処理は、例えば、特許第４４３６４２９号公報、特許４５２４３５１号公報、又は特許第４４２７５８３号公報に記載された装置を用いて行うことができる。植物バイオマスの水熱分解処理によって、リグニン成分及びヘミセルロース成分は植物バイオマスから熱水中に移行し、セルロース成分は固形分として残る。水熱分解処理後、必要により熱水と固形分とを分離し、糖化を行えばよい。 The hydrothermal decomposition treatment can be performed using, for example, pressurized hot water of preferably 175 to 240 ° C, more preferably 200 to 230 ° C. Plant biomass is generally composed of components such as cellulose, hemicellulose, and lignin. The hemicellulose component is dissolved at about 140 ° C or higher, the cellulose is about 230 ° C or higher, and the lignin component is dissolved at about 140 ° C or higher. Therefore, in order to sufficiently separate the cellulose component from other components, it is preferable to perform the hydrothermal decomposition treatment at a temperature in the above range. The reaction pressure of the hydrothermal decomposition treatment is preferably set to a pressure that is 0.1 to 0.5 MPa higher than the saturated vapor pressure of water at each temperature so that the reaction system is in a pressurized hot water state. The reaction time of the hydrothermal decomposition treatment is, for example, usually 20 minutes or less, preferably 3 to 15 minutes. The hydrothermal decomposition treatment may be performed once, or may be performed twice or more. When the hydrothermal decomposition treatment is performed twice or more, the implementation conditions for each hydrothermal decomposition treatment may or may not be the same. The hydrothermal decomposition treatment as described above can be performed by bringing plant biomass into contact with pressurized hot water. Such a process can be performed using, for example, an apparatus described in Japanese Patent No. 4436429, Japanese Patent No. 4524351, or Japanese Patent No. 4427583. By the hydrothermal decomposition treatment of the plant biomass, the lignin component and the hemicellulose component are transferred from the plant biomass into the hot water, and the cellulose component remains as a solid content. After the hydrothermal decomposition treatment, hot water and solids may be separated and saccharified if necessary.
酸処理は、植物バイオマスと酸を接触させることにより行うことができる。酸処理に用いられる酸としては、例えば、硫酸、硝酸、塩酸が挙げられる。中でも、硫酸が好ましい。酸処理における酸の濃度は、例えば、０．１〜１５重量％、好ましくは０．５〜５重量％であってよい。酸処理の反応温度は、例えば、１００〜３００℃、好ましくは１２０〜２５０℃であってよい。酸処理の反応時間は、例えば、１秒〜６０分であってよい。酸処理の回数は特に制限されず、酸処理は、１回行われてもよく、２回またはそれ以上行われてもよい。酸処理が２回またはそれ以上行われる場合、各回の酸処理の実施条件は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。酸処理においては、一般的に、ヘミセルロース成分が先に加水分解される。よって、酸処理によって、例えば、ヘミセルロース由来のキシロースを多く含む液体画分と、セルロース成分を多く含む固形画分が得られ得る。酸処理後、必要により中和や固液分離等の処理を行い、糖化を行えばよい。中和は、適当なアルカリを用いて実施できる。中和に用いられるアルカリとしては、例えば、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の１価のアルカリや、水酸化カルシウム等の２価以上のアルカリが挙げられる。中でも、例えば塩の析出を防止する観点から、１価のアルカリが好ましい場合があり得る。 The acid treatment can be performed by contacting plant biomass with an acid. Examples of the acid used for the acid treatment include sulfuric acid, nitric acid, and hydrochloric acid. Of these, sulfuric acid is preferred. The acid concentration in the acid treatment may be, for example, 0.1 to 15% by weight, preferably 0.5 to 5% by weight. The reaction temperature of the acid treatment may be, for example, 100 to 300 ° C, preferably 120 to 250 ° C. The reaction time of the acid treatment may be, for example, 1 second to 60 minutes. The number of acid treatments is not particularly limited, and the acid treatment may be performed once, or may be performed twice or more. When the acid treatment is performed twice or more, the conditions for performing the acid treatment each time may or may not be the same. In acid treatment, the hemicellulose component is generally hydrolyzed first. Therefore, by acid treatment, for example, a liquid fraction containing a large amount of xylose derived from hemicellulose and a solid fraction containing a large amount of cellulose component can be obtained. After the acid treatment, saccharification may be performed by performing a treatment such as neutralization or solid-liquid separation if necessary. Neutralization can be carried out using a suitable alkali. Examples of the alkali used for neutralization include monovalent alkalis such as ammonia, sodium hydroxide, and potassium hydroxide, and divalent or higher alkalis such as calcium hydroxide. Among them, for example, from the viewpoint of preventing salt precipitation, a monovalent alkali may be preferable.
アルカリ処理は、植物バイオマスとアルカリを接触させることにより行うことができる。アルカリ処理に用いられるアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、アンモニアが挙げられる。ルカリ処理におけるアルカリの濃度は、例えば、０．１〜６０重量％であってよい。アルカリ処理の反応温度は、例えば、１００〜２００℃、好ましくは１１０〜１８０℃であってよい。また、アンモニアを用いる場合の処理条件としては、特開２００８−１６１１２５や特開２００８−５３５６６４に記載の条件が挙げ
られる。アルカリ処理の回数は特に制限されず、アルカリ処理は、１回行われてもよく、２回またはそれ以上行われてもよい。アルカリ処理が２回またはそれ以上行われる場合、各回のアルカリ処理の実施条件は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。アルカリ処理後、必要により中和や固液分離等の処理を行い、糖化を行えばよい。中和は、適当な酸を用いて実施できる。中和に用いられる酸としては、例えば、硝酸や塩酸等の１価の酸や、硫酸やリン酸等の２価以上の酸が挙げられる。中でも、例えば塩の析出を防止する観点から、１価の酸が好ましい場合があり得る。
The alkali treatment can be performed by bringing plant biomass and alkali into contact. Examples of the alkali used for the alkali treatment include sodium hydroxide, calcium hydroxide, and ammonia. The concentration of alkali in the Lucari treatment may be, for example, 0.1 to 60% by weight. The reaction temperature of the alkali treatment may be, for example, 100 to 200 ° C, preferably 110 to 180 ° C. Examples of the treatment conditions when ammonia is used include the conditions described in JP2008-161125A and JP2008-535664A. The number of alkali treatments is not particularly limited, and the alkali treatment may be performed once, or may be performed twice or more. When the alkali treatment is performed twice or more, the execution conditions of the alkali treatment each time may or may not be the same. After the alkali treatment, neutralization or solid-liquid separation may be performed as necessary to carry out saccharification. Neutralization can be carried out using a suitable acid. Examples of the acid used for neutralization include monovalent acids such as nitric acid and hydrochloric acid, and divalent or higher acids such as sulfuric acid and phosphoric acid. Among these, for example, from the viewpoint of preventing salt precipitation, a monovalent acid may be preferable.
糖化反応は、水や緩衝液等の適当な水性溶媒中で行うことができる。反応条件は、例えば、公知のセルラーゼ等の糖化酵素の反応条件を参照して、または予備実験に基づき、適宜設定することができる。反応温度は、例えば、通常5〜95℃であってよい。ｐＨは、例えば、通常1〜11であってよい。酵素量は、例えば、基質固形量1 g当り、0.001〜10 gであってよい。反応時間は、例えば、通常12〜144時間であってよい。酵素反応は、静置で行ってもよく、撹拌しながら行ってもよい。糖化反応には、本発明のセルラーゼを単独で用いてもよく、他の糖化酵素を併用してもよい。 The saccharification reaction can be performed in an appropriate aqueous solvent such as water or a buffer solution. The reaction conditions can be appropriately set with reference to, for example, known reaction conditions for saccharifying enzymes such as cellulase or based on preliminary experiments. The reaction temperature may be, for example, usually 5 to 95 ° C. The pH may typically be 1-11, for example. The enzyme amount may be, for example, 0.001 to 10 g per 1 g of the substrate solid amount. The reaction time may usually be 12 to 144 hours, for example. The enzyme reaction may be performed by standing or may be performed with stirring. In the saccharification reaction, the cellulase of the present invention may be used alone or in combination with other saccharifying enzymes.
セルロース成分とヘミセルロース成分は、片方のみを糖化してもよく、両方を糖化してもよい。例えば、セルロース成分とヘミセルロース成分とが分離されている場合、片方を選択して糖化することができる。また、両方を糖化する場合、セルロース成分とヘミセルロース成分は、それぞれ別個に糖化されてもよく、まとめて糖化されてもよい。セルロース成分の糖化液とヘミセルロース成分の糖化液は、それぞれ単独で炭素源として利用されてもよく、組み合わせて炭素源として利用されてもよい。 Only one of the cellulose component and the hemicellulose component may be saccharified, or both may be saccharified. For example, when the cellulose component and the hemicellulose component are separated, one of them can be selected and saccharified. Moreover, when saccharifying both, a cellulose component and a hemicellulose component may be saccharified separately, respectively, and may be saccharified collectively. The saccharified solution of the cellulose component and the saccharified solution of the hemicellulose component may be used alone as a carbon source, or may be used in combination as a carbon source.
上記のようにして得られた糖化液は、そのまま、あるいは適宜、濃縮、希釈、乾燥、分画、精製等の処理に供してから、炭素源として微生物の培養に利用することができる。例えば、糖化により生成したグルコースやキシロース等の成分を所望の程度に分離精製して炭素源として用いてもよい。 The saccharified solution obtained as described above can be used as it is for the cultivation of microorganisms as a carbon source after being subjected to treatments such as concentration, dilution, drying, fractionation and purification as it is or appropriately. For example, components such as glucose and xylose produced by saccharification may be separated and purified to a desired extent and used as a carbon source.
培養される微生物は特に制限されない。微生物としては、酵母等の真核生物、細菌等の原核生物が挙げられる。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属酵母が挙げられる。細菌としては、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌が挙げられる。腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア（Escherichia）属細菌、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）等のパントエア（Pantoea）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、エルビニア（Erwinia）属細菌、フォトラブダス（Photorhabdus）属細菌、プロビデンシア（Providencia）属細菌、サルモネラ（Salmonella）属細菌、モルガネラ（Morganella）属細菌が挙げられる。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバム）（Corynebacterium glutamicum（Brevibacterium flavum））やコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes（Corynebacterium stationis））等のコリネバクテリウム属／ブレビバクテリウム属細菌が挙げられる。 The microorganism to be cultured is not particularly limited. Examples of the microorganism include eukaryotes such as yeast and prokaryotes such as bacteria. Examples of the yeast include Saccharomyces yeasts such as Saccharomyces cerevisiae. Examples of bacteria include bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae and coryneform bacteria. As bacteria belonging to Enterobacteriaceae, Escherichia coli and other Escherichia bacteria, Pantoea ananatis and other Pantoea bacteria, Enterobacter bacteria, Klebsiella bacteria, Serratia bacteria, Erwinia bacteria, Photorhabdus bacteria, Providencia bacteria, Salmonella bacteria, Morganella bacteria Is mentioned. Examples of coryneform bacteria include Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) and Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis). Corynebacterium / Brevibacterium spp.
微生物を培養することにより目的物質を製造する場合、目的物質の生産能を有する微生物を用いる。目的物質は特に制限されない。目的物質としては、Ｌ−アミノ酸が挙げられる。本発明においては、１種の目的物質が製造されてもよく、２種またはそれ以上の目的物質が製造されてもよい。 When a target substance is produced by culturing a microorganism, a microorganism having the ability to produce the target substance is used. The target substance is not particularly limited. Examples of the target substance include L-amino acids. In the present invention, one kind of target substance may be produced, or two or more kinds of target substances may be produced.
Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン等の塩基性アミノ酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン
、Ｌ−ロイシン、グリシン等の脂肪族アミノ酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、Ｌ−プロリン等の環式アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン等の芳香族アミノ酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン等の含硫アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。
Examples of L-amino acids include basic amino acids such as L-lysine, L-ornithine, L-arginine, L-histidine and L-citrulline, L-isoleucine, L-alanine, L-valine, L-leucine and glycine. Aliphatic amino acids, amino acids which are hydroxymonoaminocarboxylic acids such as L-threonine and L-serine, cyclic amino acids such as L-proline, aromatic amino acids such as L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan, L- Examples thereof include sulfur-containing amino acids such as cysteine, L-cystine and L-methionine, acidic amino acids such as L-glutamic acid and L-aspartic acid, and amino acids having an amide group in the side chain such as L-glutamine and L-asparagine.
目的物質の生産能を有する微生物は、本来的に目的物質の生産能を有するものであってもよく、目的物質の生産能を有するように改変されたものであってもよい。目的物質の生産能を有する微生物は、例えば、上記のような微生物に目的物質の生産能を付与することにより、または、上記のような微生物の目的物質の生産能を増強することにより、取得できる。 The microorganism having the target substance-producing ability may be inherently capable of producing the target substance, or may be modified so as to have the target substance-producing ability. A microorganism having the ability to produce a target substance can be obtained, for example, by imparting the ability to produce the target substance to the microorganism as described above, or by enhancing the ability to produce the target substance of the microorganism as described above. .
例えば、Ｌ−アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。また、Ｌ−アミノ酸生産能の付与または増強は、目的のＬ−アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素（目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含む）の活性を低下させること、Ｌ−アミノ酸の排出能を増強すること、等の改変によっても行うことができる。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、活性の増強や低下等の改変を受ける酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、酵素活性の増強や低下等の改変とが組み合わされてもよい。 For example, L-amino acid-producing ability can be imparted or enhanced by a method that has been conventionally employed for breeding amino acid-producing bacteria such as coryneform bacteria or Escherichia bacteria (Amino Acid Fermentation, Society Publishing Center, Inc.). , May 30, 1986, first edition issued, see pages 77-100). Examples of such methods include acquisition of auxotrophic mutants, acquisition of L-amino acid analog-resistant strains, acquisition of metabolic control mutants, and recombination with enhanced activity of L-amino acid biosynthetic enzymes. The creation of stocks. The addition or enhancement of L-amino acid-producing ability is an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of the target L-amino acid to produce a compound other than the target L-amino acid (involved in the decomposition of the target amino acid) And the like, and the like, and the like, and the like. In the breeding of L-amino acid-producing bacteria, the auxotrophy, analog resistance, metabolic control mutation and other properties imparted may be single, or two or more. In addition, in the breeding of L-amino acid-producing bacteria, enzymes that undergo modification such as enhancement or reduction of activity may be used alone or in combination of two or more. Furthermore, imparting properties such as auxotrophy, analog resistance, and metabolic control mutation may be combined with alterations such as enhancement and reduction of enzyme activity.
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。 An auxotrophic mutant, an analog-resistant mutant, or a metabolically controlled mutant having L-amino acid production ability is subjected to normal mutation treatment of a parent strain or a wild strain, and among the obtained mutants, an auxotrophic, analog It can be obtained by selecting those that show tolerance or metabolic control mutations and have the ability to produce L-amino acids. Examples of normal mutation treatment include irradiation with X-rays and ultraviolet rays, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methanesulfonate (EMS), methylmethanesulfonate (MMS) and the like. Treatment with a mutagen is included.
酵素活性の増強や低下等の改変は、遺伝子工学的手法により行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現を増強することにより行うことができる。また、酵素活性の低下は、例えば、同酵素をコードする遺伝子を破壊することにより行うことができる。 Modifications such as enhancement and reduction of enzyme activity can be performed by genetic engineering techniques. Enhancing enzyme activity can be performed, for example, by enhancing expression of a gene encoding the enzyme. In addition, the enzyme activity can be reduced, for example, by destroying a gene encoding the enzyme.
その他の目的物質の生産能を有する微生物も、公知の手法を参照して育種することができる。 Microorganisms having the ability to produce other target substances can also be bred with reference to known techniques.
培養は、上記のようにして得られた糖化液を含有する培地を用いること以外は、細菌等の微生物の培養に用いられる通常の条件、例えば、細菌等の微生物による目的物質の生産に用いられる通常の条件、で実施することができる。培地組成や培養条件は、使用する微生物の種類や製造する目的物質の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。 Culturing is performed under the usual conditions used for culturing microorganisms such as bacteria, for example, for production of a target substance by microorganisms such as bacteria, except that a medium containing a saccharified solution obtained as described above is used. It can be carried out under normal conditions. The medium composition and culture conditions may be appropriately set according to various conditions such as the type of microorganism used and the type of target substance to be produced.
培養は、例えば、糖化液に加えて、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する適当な培地を用いて行う
ことができる。すなわち、糖化液は、唯一炭素源（sole carbon source）として利用されてもよく、他の炭素源と併用されてもよい。他の炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。糖化液と他の炭素源とを併用する場合の、それらの比率は特に制限されない。炭素源以外の成分としては、上述したような窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分が挙げられる。また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。
In the cultivation, for example, in addition to the saccharified solution, an appropriate medium containing components selected from a carbon source, a nitrogen source, a phosphate source, a sulfur source, and other various organic and inorganic components as necessary is used. It can be carried out. That is, the saccharified solution may be used only as a sole carbon source or may be used in combination with other carbon sources. Specific examples of other carbon sources include glucose, fructose, sucrose, lactose, galactose, xylose, arabinose, molasses, starch hydrolysate and other sugars, acetic acid, fumaric acid, citric acid, succinic acid, apple Examples thereof include organic acids such as acids, alcohols such as glycerol, crude glycerol, and ethanol, and fatty acids. The ratio in particular when using a saccharified liquid and another carbon source together is not restrict | limited. Examples of components other than the carbon source include a nitrogen source, a phosphoric acid source, a sulfur source, and other various organic and inorganic components as described above. In addition, when an auxotrophic mutant strain that requires an amino acid or the like for growth is used, it is preferable to supplement nutrients required for the medium.
培養は、例えば、液体培地を用いて、通気培養または振盪培養により、好気的に行うことができる。培養温度は、例えば、25℃〜40℃であってよい。培養期間は、例えば、12〜200時間であってよい。培養ｐＨは、例えば、4〜9に制御されてよい。ｐＨ調整には、アンモニアガスやアンモニア水、およびその他の適当な無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質を使用することができる。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。また、培養は、前培養と本培養とに分けて実施してもよい。 The culture can be performed aerobically, for example, by aeration culture or shaking culture using a liquid medium. The culture temperature may be, for example, 25 ° C to 40 ° C. The culture period may be, for example, 12 to 200 hours. The culture pH may be controlled to 4-9, for example. For the pH adjustment, ammonia gas, aqueous ammonia, and other suitable inorganic or organic acidic or alkaline substances can be used. The culture can be performed by batch culture, fed-batch culture, continuous culture, or a combination thereof. Moreover, you may implement culture | cultivation by dividing into preculture and main culture.
目的物質が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。 Generation of the target substance can be confirmed by a known method used for detection or identification of the compound. Examples of such a method include HPLC, LC / MS, GC / MS, and NMR. These methods can be used in appropriate combination.
生成した目的物質の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内に目的物質が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによって目的物質を回収することができる。目的物質は、所望の程度に精製されてよい。回収される目的物質は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、本発明において、「目的物質」という用語は、特記しない限り、フリー体の目的物質、その塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。Ｌ−リジンは、例えば、フリー体のＬ−リジン、Ｌ−リジン硫酸塩、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−リジン炭酸塩、またはそれらの混合物であってもよい。また、Ｌ−グルタミン酸は、例えば、フリー体のＬ−グルタミン酸、Ｌ―グルタミン酸ナトリウム（monosodium L-glutamate；ＭＳＧ）、Ｌ−グルタミン酸アンモニウム塩（monoammonium L-glutamate）、またはそれらの混合物であってもよい。 The produced target substance can be recovered by a known method used for separation and purification of compounds. Examples of such a method include an ion exchange resin method, a membrane treatment method, a precipitation method, and a crystallization method. These methods can be used in appropriate combination. In addition, when the target substance accumulates in the microbial cells, for example, the microbial cells are crushed by ultrasonic waves, etc., and the target substance is removed from the supernatant obtained by removing the microbial cells by centrifugation by an ion exchange resin method or the like. It can be recovered. The target substance may be purified to the desired degree. The target substance to be recovered may be a free form, a salt thereof, or a mixture thereof. That is, in the present invention, the term “target substance” may mean a free target substance, a salt thereof, or a mixture thereof, unless otherwise specified. Examples of the salt include sulfate, hydrochloride, carbonate, ammonium salt, sodium salt, and potassium salt. L-lysine may be, for example, free L-lysine, L-lysine sulfate, L-lysine hydrochloride, L-lysine carbonate, or a mixture thereof. The L-glutamic acid may be, for example, free L-glutamic acid, sodium L-glutamate (MSG), ammonium L-glutamate (monoammonium L-glutamate), or a mixture thereof. .
また、目的物質が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出した目的物質は、培地中に溶解している目的物質を晶析した後に、併せて単離してもよい。 In addition, when the target substance precipitates in the medium, it can be recovered by centrifugation or filtration. Further, the target substance precipitated in the medium may be isolated together after crystallization of the target substance dissolved in the medium.
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to the examples.
（１）遺伝子組み換え用親株の作成
Acremonium cellulolyticus S6-25株（NITE BP-01685。以下、S6-25株と記載）を親株として、以下の手順で遺伝子組み換え用の親株F09株を作成した。
(1) Creation of parent strain for genetic recombination
Using the Acremonium cellulolyticus S6-25 strain (NITE BP-01685, hereinafter referred to as S6-25 strain) as a parent strain, a parent strain F09 strain for gene recombination was prepared by the following procedure.
S6-25株を、5 g/L ソルカフロック（International Fiber Corp, North Tonawanda, NY, U. S. A）、24 g/L KH2PO4、5 g/L (NH4)2SO4 、2 g/L Urea、1.2 g/L MgSO4・7H2O、0.01 g/L ZnSO4・7H2O、0.01 g/L MnSO4・5H2O、0.01 g/L CuSO4・5H2O、20 g/L Bacto agarを含む培地に接種し、30℃で培養を行った。寒天培地上に形成させたコロニーの端付近をストローで打ち抜いて得られたアガーディスク１個を、40 g/L ソルカフロック、10 g/L Bacto peptone、6 g/L KNO3、2 g/L Urea、1.6 g/L KCl、1.2 g/L MgSO4・7H2O、12 g/L KH2PO4を含む培地（pH4.0）に接種し、30℃、220 rpmで10〜11日間旋回培養を行なった。次に、培養液5 mLをガラス濾過器（ポアサイズ：40〜100μm）で濾過し、残存するソルカフロックおよび長い菌糸を除去した。得られた濾過液を遠心（5000 rpmで3分間）して菌糸を回収し、得られた菌糸を0.1 % Tween80、0.05 % MgSO4・7H2O、0.5 % NaClを含む溶液に懸濁し、懸濁液を遠心（5000 rpmで3分間）する洗浄操作を２回行った。洗浄後の菌体懸濁液の濁度（OD 660 nm）が1.0になるように適宜希釈し、1 mLをペトリディッシュ（底部径約35 mm）に分注し、15 Wの殺菌灯を用いて紫外線を照射した。照射後の菌体懸濁液を適宜希釈し、1.2 g/L 5-fluoroorotic acid、1 g/L Uracil、1 g/L Uridineを含む最少培地（10 g/L Glucose、10 mM NH4Cl、10 mM KH2PO4、7 mM KCl、2 mM MgSO4、0.06 mg/L H3BO3、0.26 mg/L (NH4)6Mo7O24・4H2O、1 mg/L FeCl3・6H2O、0.4 mg/L CuSO4・5H2O、0.08 mg/L MnCl2、2 mg/L ZnCl2、20g/L Bacto Agar）に播種し、30℃で培養を行った。5-fluoroorotic acidはUracil生合成経路の中間体のアナログであり、Uracil生合成経路が正常に機能している株に対して毒性を示す。よって、5-fluoroorotic acidを含む培地で選択することで、Uracil生合成経路に変異が入り機能しなくなった株を取得することができる。5-fluoroorotic acidを含む培地で生育した変異株を、1 g/L Uracil、1 g/L
Uridineを含む最少培地とこれらを含まない最少培地に植え継ぎ、1 g/L Uracil、1 g/L Uridineを含む最少培地でのみ生育した株をF09株とした。5-fluoroorotic acid耐性を示す株ではpyrF遺伝子またはpyrG遺伝子に変異が入り機能しなくなっている可能性が高い。そこで、F09株の染色体上のこれら領域について塩基配列の決定を行った。その結果、F09株では、pyrF遺伝子（配列番号１８）の629番目の塩基がAからGに変化しており、この変異によりpyrF遺伝子産物が機能しなくなっていると推察された。
S6-25 strain, 5 g / L Solkaflock (International Fiber Corp, North Tonawanda, NY, USA), 24 g / L KH 2 PO 4 , 5 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 g / L Urea, 1.2 g / L MgSO 4・ 7H 2 O, 0.01 g / L ZnSO 4・ 7H 2 O, 0.01 g / L MnSO 4・ 5H 2 O, 0.01 g / L CuSO 4・ 5H 2 O, 20 g / The medium containing L Bacto agar was inoculated and cultured at 30 ° C. One agar disc obtained by punching the vicinity of the end of the colony formed on the agar medium with a straw, 40 g / L solka floc, 10 g / L Bacto peptone, 6 g / L KNO 3 , 2 g / L Inoculate medium (pH 4.0) containing Urea, 1.6 g / L KCl, 1.2 g / L MgSO 4 · 7H 2 O, 12 g / L KH 2 PO 4 and swirl at 30 ° C, 220 rpm for 10-11 days Culture was performed. Next, 5 mL of the culture solution was filtered with a glass filter (pore size: 40 to 100 μm) to remove the remaining solka floc and long mycelia. The resulting filtrate mycelia were collected by centrifugation (3 min at 5000 rpm) and the resulting mycelia 0.1% Tween80,0.05% MgSO 4 · 7H 2 O, suspended in a solution containing 0.5% NaCl, suspended The washing operation of centrifuging the suspension (5000 rpm for 3 minutes) was performed twice. Dilute appropriately so that the turbidity (OD 660 nm) of the cell suspension after washing becomes 1.0, dispense 1 mL into a Petri dish (bottom diameter: about 35 mm), and use a 15 W germicidal lamp. And irradiated with ultraviolet rays. Dilute the suspension of cells after irradiation as appropriate, and use minimal medium (10 g / L Glucose, 10 mM NH 4 Cl, 10 g / L 5-fluoroorotic acid, 1 g / L Uracil, 1 g / L Uridine, 10 mM KH 2 PO 4 , 7 mM KCl, 2 mM MgSO 4 , 0.06 mg / LH 3 BO 3 , 0.26 mg / L (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24・ 4H 2 O, 1 mg / L FeCl 3・ 6H 2 O, 0.4 mg / L CuSO 4 .5H 2 O, 0.08 mg / L MnCl 2 , 2 mg / L ZnCl 2 , 20 g / L Bacto Agar) and cultured at 30 ° C. 5-fluoroorotic acid is an intermediate analog of the Uracil biosynthetic pathway and is toxic to strains in which the Uracil biosynthetic pathway functions normally. Therefore, by selecting with a medium containing 5-fluoroorotic acid, it is possible to obtain a strain that has entered the Uracil biosynthetic pathway and has become nonfunctional. Mutant strains grown in a medium containing 5-fluoroorotic acid, 1 g / L Uracil, 1 g / L
The F09 strain was defined as a strain that was transferred to a minimal medium containing Uridine and a minimal medium not containing these and grown only in a minimal medium containing 1 g / L Uracil and 1 g / L Uridine. In strains exhibiting resistance to 5-fluoroorotic acid, there is a high possibility that the pyrF gene or the pyrG gene is mutated and no longer functions. Therefore, the nucleotide sequence of these regions on the chromosome of F09 strain was determined. As a result, in the F09 strain, the 629th base of the pyrF gene (SEQ ID NO: 18) was changed from A to G, and it was speculated that this mutation caused the pyrF gene product to stop functioning.
（２）creA遺伝子の破壊
F09株を親株として、以下の手順により、creA遺伝子（配列番号１９）を破壊し、セルラーゼ生産が向上する株の取得を試みた。creA遺伝子は、カタボライトリプレッションに関与する転写因子をコードする遺伝子である。creA遺伝子は、糸状菌において、セルラーゼの発現に関与していることが知られている（Mol Gen Genet. 1996 Jun 24;251(4):451-60、Biosci Biotechnol Biochem. 1998 Dec;62(12):2364-70）。。
(2) creA gene disruption
Using the F09 strain as a parent strain, the following procedure was used to disrupt the creA gene (SEQ ID NO: 19), and an attempt was made to obtain a strain with improved cellulase production. The creA gene is a gene encoding a transcription factor involved in catabolite repression. The creA gene is known to be involved in cellulase expression in filamentous fungi (Mol Gen Genet. 1996 Jun 24; 251 (4): 451-60, Biosci Biotechnol Biochem. 1998 Dec; 62 (12 ): 2364-70). .
はじめに、A. cellulolyticusのcreA遺伝子上流領域とcreA遺伝子の一部、ハイグロマイシン（Hygromycin）耐性遺伝子、creA遺伝子下流領域の順に連結された配列を有するcreA破壊用DNA断片を以下の手順に従って作成した。A. cellulolyticusのゲノムDNAを鋳型として、プライマーP1とP2（配列番号１および２）を用いたPCRによりcreA遺伝子の上流領域とcreA遺伝子の一部を、プライマーP3とP4（配列番号３および４）を用いたPCRによりcreA遺伝子の下流領域を、それぞれ増幅した。また、ハイグロマイシン耐性遺伝子が搭載されたpcDNA3.1/Hygro(+)（LifeTechnologies）を鋳型として、プライマーP5とP6（配列番号５および６）を用いたPCRにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子を増幅した。PCR産物はWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いて精製した。精製したPCR産物をIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ）によりキット付属のpUCプラスミドに組み込み連結した。反応物でE. coli JM109を形質転換し、LB寒天培地（100 mg/L アンピシリンを含む）で37℃一晩培養することでコロニーを形成させた。得られた形質転換体からWizard Plus Miniprep System（Promega）を用いcreA破壊用DNA断片が組み込まれたpUC-creA::hygプラスミドを得た。pUC-creA::hygプラスミドを鋳型として、プライマーP1とP4（配列番号１および４）を用いたPCRにより、creA破壊用DNA断片を増幅し、エタノール
沈殿により濃縮および精製した。
First, a creA disrupting DNA fragment having a sequence in which an upstream region of creA gene of A. cellulolyticus, a part of the creA gene, a hygromycin resistance gene, and a downstream region of the creA gene were ligated in this order was prepared. Using the genomic DNA of A. cellulolyticus as a template, PCR using primers P1 and P2 (SEQ ID NOs: 1 and 2) was performed to detect the upstream region of the creA gene and a part of the creA gene, and primers P3 and P4 (SEQ ID NOs: 3 and 4) The downstream region of the creA gene was amplified by PCR using The hygromycin resistance gene was amplified by PCR using primers P5 and P6 (SEQ ID NOs: 5 and 6) using pcDNA3.1 / Hygro (+) (Life Technologies) loaded with the hygromycin resistance gene as a template. The PCR product was purified using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). The purified PCR product was incorporated into the pUC plasmid attached to the kit using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) and ligated. E. coli JM109 was transformed with the reaction product, and colonies were formed by culturing overnight at 37 ° C. on LB agar medium (containing 100 mg / L ampicillin). A pUC-creA :: hyg plasmid incorporating a DNA fragment for creA disruption was obtained from the resulting transformant using Wizard Plus Miniprep System (Promega). The creA disruption DNA fragment was amplified by PCR using primers p1 and P4 (SEQ ID NOs: 1 and 4) using the pUC-creA :: hyg plasmid as a template, and concentrated and purified by ethanol precipitation.
F09株を12 g/L Potato Dextrose Broth（Difco）、20 g/L Bacto Agar（Difco）を含む培地に接種し、30℃で培養を行った。寒天培地上に形成させたコロニーの端付近をストローで打ち抜いて得られたアガーディスク１個を、24 g/L Potato Dextrose Brothを含む培地に接種し、30℃、220 rpmで2日間旋回培養した。菌体を遠心分離（5000 rpm、5分間）で回収し、10g/L Yatalase（タカラバイオ）、10 mM KH2PO4、0.8 M NaClを含む溶液（pH6.0）を30 mL加え振とうしながら30℃で2時間反応させ、細胞壁を消化しプロトプラスト化した。ガラスフィルターで残渣を除いた後、遠心分離（2000 rpm、10分間）でプロトプラストを回収し、1.2 M Sorbitol、10 mM CaCl2を含むTris-HCl緩衝液（pH7.5）にて1 mLに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。200 μlのプロトプラスト溶液に、creA破壊用精製DNA 10 mgと、400 g/L PEG4000、10mM CaCl2を含むTris-HCl緩衝液（pH7.5）を50 μl加え、氷上で30分間放置した。その後さらに1 mLの400 g/L PEG4000、10mM CaCl2を含むTris-HCl緩衝液（pH7.5）を加えて混合し、室温で15分間放置し形質転換を行った。遠心分離（2000 rpm、10分間）で回収したプロトプラストを、1 g/L Uracil、1 g/L Uridine、および1 M Sucroseを含む最少培地に播種し、30℃で1日間培養した後、0.5 g/L Hygromycin B、24 g/L Potato Dextrose Broth、7 g/L Bacto Agarを含む培地を重層し、さらに30℃で3日間培養することでハイグロマイシン耐性株を選抜した。出現したコロニーを0.5
g/L Hygromycin Bを含む最少培地に接種し、30℃で4日間培養した後、creA遺伝子領域の一部（配列番号１９の３２６２〜４５０９位）がHygromycin耐性遺伝子で置換されていることを確認し、F09由来creA破壊株を得た。
The F09 strain was inoculated into a medium containing 12 g / L Potato Dextrose Broth (Difco) and 20 g / L Bacto Agar (Difco) and cultured at 30 ° C. One agar disk obtained by punching the vicinity of the end of the colony formed on the agar medium with a straw was inoculated into a medium containing 24 g / L Potato Dextrose Broth and swirled at 30 ° C and 220 rpm for 2 days. . The cells are collected by centrifugation (5000 rpm, 5 minutes), and 30 mL of a solution (pH 6.0) containing 10 g / L Yatalase (Takara Bio), 10 mM KH 2 PO 4 , 0.8 M NaCl is added and shaken. The reaction was carried out at 30 ° C. for 2 hours to digest the cell wall and protoplast it. After removing the residue with a glass filter, the protoplasts are collected by centrifugation (2000 rpm, 10 minutes) and suspended in 1 mL with Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1.2 M Sorbitol and 10 mM CaCl 2. A cloudy protoplast solution was prepared. 50 μl of Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 10 mg of creA-disrupted purified DNA, 400 g / L PEG4000, and 10 mM CaCl 2 was added to 200 μl of protoplast solution, and left on ice for 30 minutes. Thereafter, Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 mL of 400 g / L PEG4000 and 10 mM CaCl 2 was added and mixed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes for transformation. Protoplasts recovered by centrifugation (2000 rpm, 10 minutes) are seeded in a minimal medium containing 1 g / L Uracil, 1 g / L Uridine, and 1 M Sucrose, cultured at 30 ° C for 1 day, and then 0.5 g A medium containing / L Hygromycin B, 24 g / L Potato Dextrose Broth, and 7 g / L Bacto Agar was overlaid, and further cultured at 30 ° C. for 3 days to select a hygromycin resistant strain. 0.5 colonies appeared
After inoculating a minimal medium containing g / L Hygromycin B and culturing at 30 ° C for 4 days, it was confirmed that part of the creA gene region (positions 3262-4509 of SEQ ID NO: 19) was replaced with the Hygromycin resistance gene. As a result, an F09-derived creA-disrupted strain was obtained.
（３）Gna1変異の導入
F09由来creA破壊株を親株として、以下の手順により、gna1遺伝子（配列番号２０）に対し恒常的活性型変異（R178C変異およびQ204L変異）を導入した株（Gna1恒常的活性型変異導入株）を構築した。
(3) Introduction of Gna1 mutation
Using a F09-derived creA-disrupted strain as a parent strain, a strain in which a constant active mutation (R178C mutation and Q204L mutation) is introduced into the gna1 gene (SEQ ID NO: 20) by the following procedure (Gna1 constant active mutation-introduced strain) It was constructed.
はじめに、Gna1変異導入用DNA断片（R178C変異導入用およびQ204L変異導入用の2種）の作成を行った。gna1遺伝子の上流4 kbから下流4 kbまでの領域を、A. cellulolyticusのゲノムDNAを鋳型として、プライマーP7とP8（配列番号７および８）を用いたPCRにより増幅した。PCR産物を、（２）と同様の手順により、In-Fusion HD Cloning Kitを用いてキット付属のpUCプラスミドに組み込みpUC-gna1±4kbプラスミドを得た。pUC-gna1±4kbプラスミドを鋳型として、プライマーP9とP10（配列番号９および１０）を用いたPCRにより、gna1遺伝子の下流1kbの地点で開裂したpUC-gna1±4kbプラスミドを増幅した。A. cellulolyticusのゲノムDNAを鋳型として、プライマーP11とP12（配列番号１１および１２）を用いたPCRにより、pyrF遺伝子とその周辺配列を含むDNA断片を増幅した。開裂したpUC-gna1±4kbプラスミドとpyrF遺伝子とその周辺配列を含むDNA断片とを混合して、（２）と同様の手順により、In-Fusion HD Cloning Kitを用いて連結し、gna1遺伝子の下流1kbpの位置にマーカー遺伝子であるpyrF遺伝子が挿入された配列を含むpUC-gna1-pyrFプラスミドを得た。次に、pUC-gna1-pyrFプラスミドを鋳型として、R178C変異導入にはプライマーP13とP14（配列番号１３および１４）を、Q204L変異導入にはプライマーP15とP16（配列番号１５および１６）を用いたPCRにより、プラスミド全体を増幅した。鋳型プラスミドを除去するためにPCR産物に制限酵素DpnＩを添加し37℃で1時間処理した後、E. coli JM109に形質転換しLB寒天培地（100 mg/L アンピシリンを含む）で37℃一晩培養することでコロニーを形成させた。（２）と同様の手順で形質転換体からプラスミドを抽出し、意図した変異が導入されていることを塩基配列を決定することにより確認した後、R178C変異が導入されたプラスミドをpUC-gna1_RC-pyrF、Q204L変異が導入されたプラスミドをpUC-gna1_QL-pyrFとした。これらプラスミドを鋳型に、プライマーP17とP8（配列番号１７および８）を用いたPCRにより、R178C変異導入用DNA断片およびQ204L変異導入用DNA断片を増幅し、（２）と同様の手順で精製および濃縮を行った。 First, DNA fragments for Gna1 mutagenesis (two types for R178C mutagenesis and Q204L mutagenesis) were prepared. A region from 4 kb upstream to 4 kb downstream of the gna1 gene was amplified by PCR using primers P7 and P8 (SEQ ID NOs: 7 and 8) using A. cellulolyticus genomic DNA as a template. The PCR product was incorporated into the pUC plasmid attached to the kit using the In-Fusion HD Cloning Kit by the same procedure as in (2) to obtain a pUC-gna1 ± 4 kb plasmid. Using the pUC-gna1 ± 4 kb plasmid as a template, the pUC-gna1 ± 4 kb plasmid cleaved at the 1 kb downstream of the gna1 gene was amplified by PCR using primers P9 and P10 (SEQ ID NOs: 9 and 10). A DNA fragment containing the pyrF gene and its peripheral sequence was amplified by PCR using primers P11 and P12 (SEQ ID NOs: 11 and 12) using A. cellulolyticus genomic DNA as a template. Mix the cleaved pUC-gna1 ± 4kb plasmid with the pyrF gene and a DNA fragment containing its peripheral sequence and link them using the In-Fusion HD Cloning Kit in the same manner as in (2), downstream of the gna1 gene. A pUC-gna1-pyrF plasmid containing a sequence in which the marker gene pyrF gene was inserted at the 1 kbp position was obtained. Next, using pUC-gna1-pyrF plasmid as a template, primers P13 and P14 (SEQ ID NOs: 13 and 14) were used for R178C mutation introduction, and primers P15 and P16 (SEQ ID NOs: 15 and 16) were used for Q204L mutation introduction. The entire plasmid was amplified by PCR. In order to remove the template plasmid, the restriction enzyme DpnI was added to the PCR product and treated at 37 ° C for 1 hour, then transformed into E. coli JM109 and transformed to LB agar medium (containing 100 mg / L ampicillin) at 37 ° C overnight. Colonies were formed by culturing. After extracting the plasmid from the transformant by the same procedure as (2) and confirming that the intended mutation has been introduced by determining the nucleotide sequence, the plasmid into which the R178C mutation was introduced was pUC-gna1_RC- The plasmid into which the pyrF and Q204L mutations were introduced was designated as pUC-gna1_QL-pyrF. Using these plasmids as templates, the R178C mutagenesis DNA fragment and the Q204L mutagenesis DNA fragment were amplified by PCR using primers P17 and P8 (SEQ ID NOs: 17 and 8), and purified and purified in the same manner as in (2). Concentration was performed.
次に（２）に記載の手法によりF09由来creA破壊株のプロトプラスト溶液を調製し、先に作成したGna1変異導入用精製DNA断片（R178C変異導入用とQ204L変異導入用の2種）を用い（２）と同様の手順で形質転換を行った。遠心分離（2000 rpm、10分間）で回収したプロトプラストを1 M Sucroseを含む最少培地に播種し、30℃で4日間培養することで、Uracilを含まない培地で生育できる株を選抜した。出現したコロニーを最少培地に接種し30℃で4日間培養した後、gna1遺伝子の塩基配列を決定し目的の変異が導入されていることを確認し、Gna1恒常的活性型変異導入株を得た。 Next, prepare a protoplast solution of F09-derived creA-disrupted strain by the method described in (2), and use the previously prepared purified DNA fragments for Gna1 mutation introduction (two types for R178C mutation introduction and Q204L mutation introduction) ( Transformation was performed in the same procedure as 2). Protoplasts recovered by centrifugation (2000 rpm, 10 minutes) were inoculated on a minimal medium containing 1 M Sucrose and cultured at 30 ° C. for 4 days to select a strain capable of growing on a medium not containing Uracil. After inoculating the emerged colony in a minimal medium and culturing at 30 ° C for 4 days, the base sequence of the gna1 gene was determined to confirm that the target mutation was introduced, and a Gna1 constitutively active mutation-introduced strain was obtained. .
（４）Gna1恒常的活性型変異導入株のジャー培養とセルラーゼ活性評価
Gna1恒常的活性型変異導入株2種について、Cellobioseによるセルラーゼ誘導条件にてジャー培養を行い、培養上清中のセルラーゼ活性を評価した。
(4) Jar culture and cellulase activity evaluation of Gna1 constitutively active mutant
Two types of Gna1 constitutively active mutation-introduced strains were subjected to jar culture under conditions for inducing cellulase by Cellobiose, and cellulase activity in the culture supernatant was evaluated.
＜ジャー培養（Cellobiose誘導）＞
Gna1恒常的活性型変異導入株および親株であるF09株由来creA破壊株を、12 g/L Potato
Dextrose Broth（Difco）、20 g/L Bacto Agar（Difco）を含む培地に接種し、30℃で培養を行った。寒天培地上に形成させたコロニーの端付近をストローで打ち抜いて得られたアガーディスク１個を、20 mL の20 g/L グルコース、24 g/L KH2PO4、5 g/L (NH4)2SO4、2 g/L Urea、1.2 g/L MgSO4・7H2O、0.01 g/L ZnSO4・7H2O、0.01 g/L MnSO4・5H2O、0.01 g/L CuSO4・5H2O、1 g/L Corn steep liquor（C4648, SIGMA）、1 g/L Tween 80、1 g/L Uracil、1 g/L Uridineを含む液体培地に接種し、30℃、220 rpmで5日間旋回培養にて前培養を行なった。次に、15mLの前培養液を、300mLの15 g/L グルコース、12 g/L KH2PO4、10 g/L (NH4)2SO4、1.2 g/L MgSO4・7H2O、0.01 g/L ZnSO4・7H2O、0.01 g/L MnSO4・5H2O、0.01 g/L CuSO4・5H2O、5 g/L Corn steep liquor、1 g/L Tween 80、0.5 ml/L ディスホームGD（日油）、1.6g/L Uracil、1.6g/L Uridineを含む液体培地に接種し、培養温度を30℃、通気量を1/2 vvmとし、撹拌により溶存酸素濃度を6%以上に、アンモニアガスを用いて培養pH を5に制御しながら78時間の流加培養を行った。流加液の組成は360 g/L Glucose、60 g/L Cellobiose、0.5 ml/L ディスホームGDとし、培養22時間目から連続的に流加した。培養終了時の培養液を遠心分離（15000 rpmで5分間）して得た上清をセルラーゼ活性の測定用試料とした。セルラーゼ活性としては、微結晶セルロース（アビセル）の分解活性とろ紙の分解活性を、それぞれ以下の手順で測定した。これら結果を表１に示す。
<Jar culture (Cellobiose induction)>
Gna1 constitutively active mutagenesis strain and parent strain F09 strain-derived creA-disrupted strain
The medium containing Dextrose Broth (Difco) and 20 g / L Bacto Agar (Difco) was inoculated and cultured at 30 ° C. One agar disk obtained by punching the vicinity of the end of the colony formed on the agar medium with a straw was added to 20 mL of 20 g / L glucose, 24 g / L KH 2 PO 4 , 5 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 g / L Urea, 1.2 g / L MgSO 4・ 7H 2 O, 0.01 g / L ZnSO 4・ 7H 2 O, 0.01 g / L MnSO 4・ 5H 2 O, 0.01 g / L CuSO 4・ Inoculate liquid medium containing 5H 2 O, 1 g / L Corn steep liquor (C4648, SIGMA), 1 g / L Tween 80, 1 g / L Uracil, 1 g / L Uridine, 30 ° C, 220 rpm Pre-culture was performed by swirling culture for 5 days. Next, 15 mL of the preculture was added to 300 mL of 15 g / L glucose, 12 g / L KH 2 PO 4 , 10 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 1.2 g / L MgSO 4 .7H 2 O, 0.01 g / L ZnSO 4・ 7H 2 O, 0.01 g / L MnSO 4・ 5H 2 O, 0.01 g / L CuSO 4・ 5H 2 O, 5 g / L Corn steep liquor, 1 g / L Tween 80, 0.5 ml / L Dishome GD (NOF), 1.6g / L Uracil, 1.6g / L Uridine is inoculated into liquid medium, culture temperature is 30 ℃, aeration is 1/2 vvm, and dissolved oxygen concentration is increased by stirring. The fed-batch culture was performed for 78 hours while controlling the culture pH to 5 using ammonia gas to 6% or more. The composition of the feed solution was 360 g / L Glucose, 60 g / L Cellobiose, and 0.5 ml / L, Disturbed GD, which were continuously fed from the 22nd hour of culture. The supernatant obtained by centrifuging the culture solution at the end of the culture (15000 rpm for 5 minutes) was used as a sample for measuring cellulase activity. As cellulase activity, microcrystalline cellulose (Avicel) degradation activity and filter paper degradation activity were measured by the following procedures, respectively. These results are shown in Table 1.
Cellobiose誘導条件下での培養上清についてセルラーゼ活性を測定した結果、Gna1恒常的活性型変異導入株の培養上清のセルラーゼ活性は、親株と比べて、アビセル分解活性はR178C変異導入株で約2.2倍、Q204L変異導入株で約1.8倍、ろ紙分解活性はR178C変異導入株で約1.8倍、Q204L変異導入株で約1.6倍に向上していた。このことから、Gna1恒常的活性型変異導入により高いセルラーゼ生産能が得られることが示された。 As a result of measuring the cellulase activity of the culture supernatant under the Cellobiose induction condition, the cellulase activity of the culture supernatant of the Gna1 constitutively active mutation-introduced strain was about 2.2 times that of the R178C mutation-introduced strain. The Q204L mutation-introduced strain was about 1.8 times, and the filter paper degradation activity was about 1.8-fold in the R178C mutation-introduced strain, and the Q204L mutation-introduced strain was about 1.6-fold. From this, it was shown that high cellulase production ability can be obtained by Gna1 constitutively active mutation introduction.
＜アビセル分解活性（U/mL）＞
0.4 mgのアビセル（Cellulose microcrystalline, 1.02331.0500, MERCK）を含む20μl
の反応液（30 mM CaCl2、50 mM 酢酸緩衝液、pH 5.5）に、適宜希釈した等量の試料を加え、50℃で16時間反応を行った。なお、反応を行わないサンプルを用意し、ブランクとした。次に100 μlのDNS溶液（1 % ジニトロサリチル酸、20 % 酒石酸ナトリウム・カリウム、0.05 % 亜硫酸ナトリウム、1 % 水酸化ナトリウム）を加え、95℃で5分間反応後、4℃まで冷却した。反応後の溶液を混合し、MultiScreen-HVプレート（Merck Millipore）に全量を移し、遠心ろ過（2000 rpmで10分間）し、ろ液を回収した。その後、ろ液の540 nmの吸光度を測定し、ブランクの値を差し引き、吸光度の増加量を算出した。次に、段階的に希釈したグルコースの濃度と540 nmの吸光度で作成した検量線を用いて、反応溶液中に生成された還元糖量をグルコース換算で算出した。同様の操作を異なる希釈率の試料で行い、希釈率とグルコース生成量の検量線を作成し、0.08 mgのグルコースに相当する還元糖を生成するのに必要な試料の希釈率を求め、希釈前の培養上清のアビセル分解活性（U/mL）を算出した。活性単位は、1分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素活性を「1 U」とした。
<Avicel degradation activity (U / mL)>
20 μl containing 0.4 mg Avicel (Cellulose microcrystalline, 1.02331.0500, MERCK)
An equal amount of an appropriately diluted sample was added to the reaction solution (30 mM CaCl 2 , 50 mM acetate buffer, pH 5.5) and reacted at 50 ° C. for 16 hours. In addition, the sample which does not react was prepared and it was set as the blank. Next, 100 μl of DNS solution (1% dinitrosalicylic acid, 20% sodium potassium potassium tartrate, 0.05% sodium sulfite, 1% sodium hydroxide) was added, reacted at 95 ° C. for 5 minutes, and then cooled to 4 ° C. The solution after the reaction was mixed, the whole amount was transferred to a MultiScreen-HV plate (Merck Millipore), and centrifugal filtration (2000 rpm for 10 minutes) was performed to collect the filtrate. Thereafter, the absorbance at 540 nm of the filtrate was measured, and the blank value was subtracted to calculate the amount of increase in absorbance. Next, the amount of reducing sugar produced in the reaction solution was calculated in terms of glucose using a calibration curve prepared with the concentration of glucose diluted stepwise and the absorbance at 540 nm. Perform the same operation on samples with different dilution ratios, create a calibration curve for the dilution ratio and glucose production amount, determine the dilution ratio of the sample necessary to produce reducing sugar equivalent to 0.08 mg of glucose, and The Avicel degradation activity (U / mL) of the culture supernatant was calculated. The activity unit was defined as “1 U”, which is an enzyme activity that produces a reducing sugar corresponding to 1 μmol of glucose per minute.
＜ろ紙分解活性（FPU/mL）＞
6 mm×10 mmに裁断したろ紙（Whatman No. 1、GE Healthcare）を含む100μlのクエン酸緩衝液（50 mM、pH 5.0）に、50μlの適宜希釈した試料を加え、50℃で1時間反応を行った。なお、反応を行わないサンプルを用意し、ブランクとした。次に300 μlのDNS溶液を加え、95℃で5分間反応後、氷上で5分間冷却した。反応後の溶液を混合し、遠心（12000 rpmで5分間）し、100μlの上清を回収した。その後、上清の540 nmの吸光度を測定し、ブランクの値を差し引き、吸光度の増加量を算出した。次に、段階的に希釈したグルコース濃度と540 nmの吸光度で作成した検量線を用いて、反応溶液中に生成された還元糖量をグルコース換算で算出した。同様の操作を異なる希釈率の試料で行い、希釈率とグルコース生成量の検量線を作成し、0.2 mgのグルコースに相当する還元糖を生成するのに必要な試料の希釈率を求め、希釈前の試料のろ紙分解活性（FPU/mL）を算出した。活性単位は、1分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素活性を「1 U」とした。
<Filter paper decomposition activity (FPU / mL)>
Add 50 μl of appropriately diluted sample to 100 μl citrate buffer (50 mM, pH 5.0) containing filter paper (Whatman No. 1, GE Healthcare) cut to 6 mm x 10 mm, and react at 50 ° C for 1 hour Went. In addition, the sample which does not react was prepared and it was set as the blank. Next, 300 μl of DNS solution was added, reacted at 95 ° C. for 5 minutes, and then cooled on ice for 5 minutes. The solution after the reaction was mixed and centrifuged (5 minutes at 12000 rpm), and 100 μl of the supernatant was collected. Thereafter, the absorbance of the supernatant at 540 nm was measured, and the blank value was subtracted to calculate the amount of increase in absorbance. Next, the amount of reducing sugar produced in the reaction solution was calculated in terms of glucose using a calibration curve prepared with the glucose concentration diluted stepwise and the absorbance at 540 nm. Perform the same operation on samples with different dilution ratios, create a calibration curve for the dilution ratio and glucose production amount, determine the dilution ratio of the sample necessary to produce reducing sugar equivalent to 0.2 mg glucose, and The filter paper decomposition activity (FPU / mL) of the sample was calculated. The activity unit was defined as “1 U”, which is an enzyme activity that produces a reducing sugar corresponding to 1 μmol of glucose per minute.
（５）セルラーゼ誘導能が不十分な炭素源を用いたジャー培養とセルラーゼ活性評価
Gna1恒常的活性型変異導入株2種について、安価ではあるがセルラーゼ誘導能が低い炭素源である水熱処理バガスを用いてジャー培養を行い、培養上清中のセルラーゼ活性を評価した。
(5) Jar culture using cell sources with insufficient cellulase induction ability and cellulase activity evaluation
Two types of Gna1 constitutively active mutation-introduced strains were subjected to jar culture using hydrothermal bagasse, which is a low-cost but low cellulase-inducing ability, and the cellulase activity in the culture supernatant was evaluated.
＜水熱処理バガスの調製＞
バガスはカッティングミル（SM100, Retsch、スクリーン0.75 mm）を用いて粉砕した。バガスと水を7％（w/v）で混合して一晩浸漬させた後、バッチ式小型水熱処理装置（070-07013, オーエムラボテック）で水熱処理を行った。水熱処理は、攪拌速度を200 rpmで一定とし、200℃で15分行った。水熱処理後の水熱処理スラリーは、濾紙（5C, Advantec）を用いた吸引ろ過で固液分離し、水で洗浄した。得られた固形分を水熱処理バガスとした。
<Preparation of hydrothermal bagasse>
The bagasse was pulverized using a cutting mill (SM100, Retsch, screen 0.75 mm). After bagasse and water were mixed at 7% (w / v) and soaked overnight, hydrothermal treatment was performed with a batch-type small hydrothermal treatment device (070-07013, OM Lab Tech). Hydrothermal treatment was performed at 200 ° C. for 15 minutes with a constant stirring speed of 200 rpm. The hydrothermally treated slurry after hydrothermal treatment was separated into solid and liquid by suction filtration using a filter paper (5C, Advantec) and washed with water. The obtained solid content was designated as hydrothermal bagasse.
＜ジャー培養（水熱処理バガス使用）＞
以下の点を除き、（４）と同様の方法でジャー培養を行った。流加液はCellobioseを含まないものを用い、さらに水熱処理バガスを培養22時間目と48時間目に湿重量で1.3 gずつ添加した。培養後、（４）に記載した方法でアビセル分解活性およびろ紙分解活性を測定した。R178C変異導入株の結果を表２に示す。
<Jar culture (using hydrothermal bagasse)>
Except for the following points, jar culture was performed in the same manner as in (4). The feed solution used did not contain Cellobiose, and further hydrothermally treated bagasse was added in 1.3 g wet weights at 22 and 48 hours of culture. After culturing, the Avicel degradation activity and filter paper degradation activity were measured by the method described in (4). Table 2 shows the results of the R178C mutation-introduced strain.
＜配列表の説明＞
配列番号１〜１７：プライマー
配列番号１８：Acremonium cellulolyticus S6-25株のpyrF遺伝子の塩基配列
配列番号１９：Acremonium cellulolyticus S6-25株のcreA遺伝子の塩基配列
配列番号２０：Acremonium cellulolyticus S6-25株のgna1遺伝子の塩基配列
配列番号２１：Acremonium cellulolyticus S6-25株のGna1タンパク質のアミノ酸配列
<Explanation of Sequence Listing>
SEQ ID NO: 1 to 17: Primer SEQ ID NO: 18: Base sequence of pyrF gene of Acremonium cellulolyticus S6-25 strain SEQ ID NO: 19: Base sequence of creA gene of Acremonium cellulolyticus S6-25 strain SEQ ID NO: 20: Acremonium cellulolyticus S6-25 strain gna1 gene base sequence SEQ ID NO: 21: amino acid sequence of Gna1 protein of Acremonium cellulolyticus S6-25
Claims (7)
該培地よりセルラーゼを回収すること、
を含む、セルラーゼの製造法であって、
前記アクレモニウム・セルロリティカスが、恒常的活性型Ｇｎａ１タンパク質をコードする変異型ｇｎａ１遺伝子を保持するように改変されていることを特徴とし、
前記恒常的活性型Ｇｎａ１タンパク質が、下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれか又は両方の変異を有するＧｎａ１タンパク質である、方法：
（Ａ）野生型Ｇｎａ１タンパク質の１７８位のアルギニン残基がシステイン残基に置換される変異；
（Ｂ）野生型Ｇｎａ１タンパク質の２０４位のグルタミン残基がロイシン残基に置換される変異。 Culturing Acremonium cellulolyticus (Talaromyces cellulolyticus) in a medium, producing and accumulating cellulase in the medium, and recovering the cellulase from the medium;
A method for producing cellulase, comprising:
The Acremonium cellulolyticus is modified to retain a mutant gna1 gene encoding a constitutively active Gna1 protein,
The method in which the constitutively active Gna1 protein is a Gna1 protein having a mutation in either or both of the following (A) and (B):
(A) a mutation in which the arginine residue at position 178 of the wild-type Gna1 protein is replaced with a cysteine residue;
(B) A mutation in which the glutamine residue at position 204 of the wild-type Gna1 protein is replaced with a leucine residue.
（ａ）配列番号２１に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２１に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、Ｇタンパク質のαサブユニットとしての機能を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２１に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、Ｇタンパク質のαサブユニットとしての機能を有するタンパク質。 The method according to claim 1 , wherein the wild-type Gna1 protein is a protein described in the following (a), (b), or (c):
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21;
(B) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 includes an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, or addition of 1 to 10 amino acid residues, and has a function as an α subunit of G protein. protein;
(C) a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21, and having a function as an α subunit of G protein.
植物バイオマスを前処理に供すること、
前記前処理の処理物を、前記製造したセルラーゼを用いた糖化処理に供すること、
前記糖化処理の処理物を含有する培地で目的物質の生産能を有する微生物を培養し、目的物質を該培地中又は該微生物の菌体内に生成蓄積させること、および
該培地又は菌体より目的物質を採取すること、
を含む、目的物質の製造法。 Producing cellulase by the method according to any one of claims 1 to 4,
Subjecting plant biomass to pretreatment,
Subjecting the pretreated product to a saccharification treatment using the produced cellulase,
Culturing a microorganism having an ability to produce a target substance in a medium containing the processed product of the saccharification treatment, generating and accumulating the target substance in the medium or in the cells of the microorganism, and the target substance from the medium or the fungus body Collecting,
A method for producing a target substance, including
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