JP6475668B2 - L−トリプトファン産生能が強化されたエシェリキア属微生物及びこれを用いてl−トリプトファンを産生する方法 - Google Patents
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Description
中でも、最近には、微生物による発酵法が主流をなしており、このときに汎用される微生物は、産業化初期の化学的な突然変異を用いた類似体耐性選別菌株であるが、1990年代に入り、遺伝子組換え技術の眩しい発展と分子レベルの調節機序が明らかにされることに伴い、遺伝子組換え技法を用いた大腸菌とコリネバクテリウム組換え菌株が汎用されている。
微生物によるトリプトファンの産生は、解糖過程(glycolysis)の中間産物であるホスホエノールピルビン酸(PEP:PhospoEnolPyruvate)とペントースリン酸回路の中間物質であるエリトロース−4−リン酸(E4P:Erythrose-4-Phosphate)とが重合反応して得られる3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソン酸−7−リン酸(DAHP:3-DeoxyD-arobino-heptulosonate-7-phosphate)から始まる。次いで、芳香族共通生合成経路を経てコリスミ酸(chorismate)から分岐される生合成経路により産生される。具体的には、トリプトファンは、遺伝子trpEから合成されるアントラニル酸塩合成酵素(anthranilate synthase, EC 4.1.3.27)、遺伝子trpDから合成されるアントラニル酸塩合成酵素(anthranilate synthase, EC 4.1.3.27)とアントラニル酸塩PRPPトランスフェラーゼ(anthranilate PRPP transferase, EC2.4.1.28)、遺伝子trpCから合成されるインドール−3−グリセロールリン酸合成酵素(indole-3-glycerol phosphate synthase, EC 4.1.1.48)とホスホリボシルアントラニル酸塩異性化酵素(phosphoribosylanthranilateisomerase)、遺伝子trpBとtrpAから合成されるトリプトファン合成酵素(tryptophansynthase, EC 4.2.1.20)により合成される。前記反応を媒介する酵素をコードする遺伝子群であるtrpEDCBAは、一つの調節部位を含むオペロン構造として染色体の内部に存在する。
トリプトファンオペロンは、通常、細胞が要求する十分な量のトリプトファンを産生するように活発に転写するが、周りにトリプトファンがあれば、リプレッサ(repressor)がトリプトファンと結合してトリプトファンオペロンが不活性化されるため転写が抑制される。また、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、トリプトファン、ヒスチジンなどのアミノ酸生合成オペロンの場合、減衰機序(attenuation)という別の調節機序を有している(J Bacteriol.(1991) 173,2328-2340)。この減衰機序は、染色体上でプロモータとオペロンの最初の遺伝子との間の領域が有している特異な配列区間において、アミノ酸に乏しい条件下ではmRNAの構造が解読し易い構造に変わって生合成遺伝子の発現を促すが、当該アミノ酸に富んだ条件下では短く転写されたmRNAがヘアピン構造(hairpinstructure)と命名された3次元的構造を形成して解読過程を妨げる機序であることが知られている(J Biol Chem., (1988) 263:609-612)。
L−トリプトファン産生菌株の開発方向は、初期には、最終産物であるトリプトファンにより阻害されるトリプトファン生合成経路酵素のフィードバック阻害を克服したり、トリプトファン生合成酵素の発現強化のために染色体やベクターの形でトリプトファンオペロン遺伝子のコピー数を増やしたりするといったように、代謝過程の酵素合成の強化による効率化が主たる目標であった(Appl. Environ. Microbiol.,(1982)43:289-297; Appl. Microbiol. Biotechnol.,(1993)40:301-305; Trends Biotechnol.,(1996) 14:250-256)。
L−トリプトファンの産生能を微生物に与えるための方法としては、大きく、化学的な突然変異によりトリプトファン類似体もしくは中間産物であるアントラニル酸塩に耐性を有するように選別する方法や、遺伝工学的な方法により改変する方法が挙げられる。化学的な突然変異を用いたケースとしては、大韓民国登録特許第1987−0001813号、大韓民国登録特許第0949312号などが挙げられ、遺伝工学的な方法を用いたケースとしては、芳香族アミノ酸経路に入ってくる生合成を増加させるためにトランスケトラーゼ(transketolase)をコードするtktA遺伝子や、ガラクトースパーミアーゼ(galactosepermease)をコードするgalP遺伝子を強化してエリトロース−4−リン酸(E4P:Erythrose-4-Phosphate)やホスホエノールピルビン酸(PEP:PhospoEnolPyruvate)の供給をそれぞれ増加させ、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソン酸−7−リン酸(DAHP:3-DeoxyD-arobino-heptulosonate-7-phosphate)合成酵素のフィードバック阻害を解除して芳香族経路を強化するような戦略を導入した菌株(TrendsBiotechnol.,(1996)14:250-256, MicrobialCell Factories (2009) 8:19)、あるいは、トリプトファンオペロン遺伝子をベクター若しくは染色体の内部にさらに導入した菌株(Appl. Environ. Microbiol.,(1982) 43:289-297, Appl. Microbiol. Biotechnol.,(1993)40:301-305)などが挙げられ、種々のアプローチがある。
しかしながら、生合成酵素のフィードバック阻害を解除するとともにトリプトファンオペロンを導入しても、オペロン遺伝子の転写レベルで抑制及び減衰などの調節機序が存在するため、当該遺伝子を強化した分だけトリプトファンの歩留まりが増加しないという難点があった。
本発明の目的は、トリプトファンオペロンの抑制及び減衰調節が解除され、アントラニル酸塩の蓄積が低減されるように変形された、L−トリプトファンの産生能が強化されたエシェリキア属微生物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記エシェリキア属微生物を用いてL−トリプトファンを産生する方法を提供することである。
発明は、また、前記組換えエシェリキア属微生物を培養する段階を含むことを特徴とするL−トリプトファンの産生方法を提供する。
本発明は、内在的トリプトファンオペロンにおいて、配列番号1の塩基配列を有する発現調節部位のうち配列番号2の塩基配列を有するリーダペプチド(leader peptide)の全体又は一部が欠損された、L−トリプトファンの産生能が強化された組換えエシェリキア属微生物を提供する。
本発明で使用可能なL−トリプトファン産生微生物は、L−トリプトファン産生能を有する微生物であれば、原核微生物のいずれも含む。例えば、エシェリキア(Escherichia)属、エルウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物菌株が挙げられる。好ましくは、エシェリキア属に属する微生物であり、さらに好ましくは、大腸菌である。特に好ましくは、前記大腸菌は、アントラニル酸塩合成酵素(trpE)、アントラニル酸塩PRPPトランスフェラーゼ(trpD)、ホスホリボシルアントラニル酸塩異性化酵素(trpC)、トリプトファン合成酵素(trpA、trpB)などのトリプトファン生合成酵素の活性が強化されながらフィードバック解除形の3−デオキシ−D−アラビノヘプツロソン酸−7−リン酸合成酵素(aroG)を用い、3−デヒドロキナ酸塩合成酵素(aroB)、シキミ酸脱水素酵素(aroE)、シキミ酸リン酸化酵素(aroL)、5−エノール酸ピルビルシキミ酸−3−リン酸合成酵素(aroA)、コリスミ酸合成酵素(aroC)などの芳香族生合成経路の酵素活性が強化され、トリプトファン生合成経路の中間物質であるセリンとPRPPの供給を強化するためにホスホグリセリン酸脱水素酵素(serA)若しくはケトール転移酵素(tktA)の活性が強化され、芳香族経路の他の枝であるプレフェン酸脱水酵素、コリスミ酸ムターゼ(pheA)若しくはプレフェン酸脱水素酵素、コリスミ酸ムターゼ(tyrA)とトリプトファンを分解したり再流入したりするトリプトファン加水分解酵素(tnaA)、トリプトファントランスポータ(tnaB、mtr)の活性が除去される。
さらに好ましくは、本発明による組換え大腸菌CA04−2004(受託番号KCCM11246P)である。
前記「リーダペプチド(leader peptide)」という用語は、遺伝子開始コドン上流の先導配列によりコードされる低分子量のペプチドを意味し、好ましくは、配列番号2に記載されている塩基配列を有する。これにより発現されるポリペプチドは、配列番号4に記載されているアミノ酸配列を有する。このリーダペプチドは、トリプトファンの濃度が高ければ、ヘアピン構造を形成することにより、内在的減衰調節因子の構造形成を促して転写を終結する。
本発明は、また、配列番号3の塩基配列を有する内在的減衰調節因子(attenuator)の全体又は一部がさらに欠損されてL−トリプトファンの産生能が強化されたことを特徴とする組換えエシェリキア属微生物を提供する。
前記「内在的減衰調節因子(endogeneousattenuator)」という用語は、減衰機序を引き起こす発現調節部位のうちプロモータ及びリーダペプチドを除く配列番号3の塩基配列を有する領域を意味する。
本発明は、さらに、アントラニル酸塩合成酵素をコードするtrpE遺伝子を除くトリプトファン生合成遺伝子群trpDCBAによりコードされたタンパク質の活性がさらに強化されたことを特徴とする組換えエシェリキア属微生物を提供する。
遺伝子の発現を強化する方法としては、1)染色体内又は細胞内のコピー数を増加する方法、2)染色体の自己プロモータをより強力な形の外来プロモータに置換したり活性が強化された形に変形したりする方法が挙げられる。
一方、前記使用可能な外来プロモータとしては、trc、lac、tacなど公知のプロモータが挙げられるが、これに制限されるものではない。また、染色体の自己プロモータをより強力な形に変形するために、上述したように、リーダペプチドの全体又は一部を欠損させてさらに内在的減衰調節因子の全体又は一部を欠損させてもよいが、これに制限されるものではない。
本発明の好適な態様において、本発明は、内在的トリプトファンオペロンにおいて、配列番号1の塩基配列を有する発現調節部位のうち配列番号2の塩基配列を有するリーダペプチド(leader peptide)の全体又は一部が欠損され、配列番号3の塩基配列を有する内在的減衰調節因子(attenuator)の全体又は一部が欠損されてL−トリプトファンの産生能が強化され、さらに、アントラニル酸塩合成酵素をコードするtrpE遺伝子を除くトリプトファン生合成遺伝子群trpDCBAの発現を強化してトリプトファンオペロンがコードするタンパク質の活性が強化されて、L−トリプトファン産生能が強化された組換えエシェリキア属微生物を培養する段階を含む方法を提供する。
このとき、炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物、糖アルコール、グリセロール、ピルビン酸、乳酸及びクエン酸などのアルコール及び有機酸、グルタミン酸、メチオニン及びリシンなどのアミノ酸などが挙げられ、澱粉加水分解物、糖みつ、廃糖みつ、米糠、キャッサバ、サトウキビ残渣及びトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができる。好ましくは、前記有機栄養源は、グルコース及び殺菌された前処理糖みつ(すなわち、還元糖に転換された糖みつ)などの炭水化物であり、その他の適正量の炭素源を制限なしに様々に用いることができる。
前記培地には、リン源(phosphorus sources)としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又は対応するナトリウム含有塩が含まれる。
無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン及び炭酸カルシウムなどが挙げられ、これらに加えて、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加することができる。
さらに、培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を添加して気泡生成を抑制してもよい。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体を注入してもよい。嫌気及び微好気状態を維持するために気体を注入しなくてもよく、若しくは、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよい。
本発明の前記培養段階で産生されたL−アミノ酸は、さらに精製又は回収する段階を含んでいてもよく、前記精製又は回収に際しては、本発明の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式又は流加式培養方法などにより当該分野で周知の好適な方法を用いて培養液から目的とするL−アミノ酸を精製又は回収することができる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
図1に示すように、プロモータ(P)、リーダペプチド(L)及び減衰調節因子(A)からなるトリプトファンオペロンの発現調節部位のうちリーダペプチド(L)をコードする遺伝子であるtrpLが欠損された発現調節部位(以下、「DtrpL」と称する;図1におけるCに相当する)を増幅するために、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection:ATCC)から購買した大腸菌W3110菌株の染色体(GenBank accessionnumber AC000091)を鋳型として重合酵素連鎖反応(Polymerase ChainReaction;以下、「PCR法」と称する。)により増幅した。
5’TTAGGTACCGGCGCACTCCCGTTCTGGATA3’(配列番号11)
プライマー2
5’ACTGCCCGTTGTCGATACCCTTTTTACGT3’(配列番号12)
プライマー3
5’TCGACAACGGGCAGTGTATTCACCATG3’(配列番号13)
プライマー4
5’AATGATATCTGTTATTCTCTAATTTTGTT3’(配列番号14)
プライマー5
5’AATGATATCACCCTTTTTACGTGAACTTG3’(配列番号15)
上述した実施例1に従い作製されたpCL−DtrpL−GFP、pCL−Dtrp_att−GFP及びpCL−Ptrp−GFPベクターを野生型菌株である大腸菌W3110とトリプトファン産生菌株である大腸菌KCCM10812Pに形質転換方法によりそれぞれ導入した後にGFPの強度を測定した。
具体的には、250mlのフラスコに準備された25mlのM9培地(0.5%グルコース及び2g/L酵母抽出物を添加し、KCCM10812の場合には0.1g/Lチロシン、0.1g/Lフェニルアラニンをさらに添加する)に菌体を1/100(v/v)接種し、37℃で培養して当該ODから遠心分離により菌体を回収し、回収された菌体は1xTEで1回洗浄してGFPの測定に用いた。GFPの測定は、Synergy HTマルチモード・マイクロプレーン・リーダー(米国バイオテック社製)を用いて行った。
測定結果を表1に示す。OD1とOD3は、それぞれ培養液を適正な希釈濃度に希釈した後、島津社(Shimadzu)のUVミニ−1240(UV mini-1240)吸光計を用いて600nmで測定したOD値を示す。
実施例2の結果に基づいて、トリプトファンオペロン遺伝子をベクターの形に強化する大腸菌を作製するために、母菌株である大腸菌KCCM10812Pの染色体を鋳型としてプライマー6及びプライマー7を用いて上記のPCR法により6564bpの断片を増幅した(配列番号9)。
5’CCCGATATCATGCAAACACAAAAACCGAC3’(配列番号16)
プライマー7
5’GGGAAGCTTAAAGGATCCGTGGGATTAACTGCGCGTCGCCGCTTT3’(配列番号17)
上述した実施例1に従い作製されたpCL−Dtrp_att−GFP、pCL−DtrpL−GFP、pCL−Ptrp_GFPベクターのGFP領域をtrpDCBAに置換するベクターを作製するために、pCLDtrp_att−GFP、pCL−DtrpL−GFP、pCL−Ptrp_GFPベクターをEcoRVとHindIIIで処理してGFP部分を除去した4291bpに作製した。
次いで、トリプトファンオペロンのうちtrpDCBA遺伝子をベクターの形に強化する大腸菌を作製するために、母菌株である大腸菌KCCM10812P染色体を鋳型としてプライマー7及びプライマー8を用いて上記のPCR法により5002bpの断片を増幅した(配列番号10)。
5’AAAGATATCATGGCTGACATTCTGCTGCT3’(配列番号18)
大腸菌内で低いコピー数で発現される代表的なベクターは、pCC1BAC(米国エピセンター社製)である。このベクターを用いてトリプトファンオペロン遺伝子を低いコピー数で発現させるために、上述した実施例3と4に従い作製されたpCL−Dtrp_att−trpEDCBA、pCL−DtrpL−trpEDCBA、pCL−Ptrp_trpEDCBAとpCL−Dtrp_att−trpDCBA、pCL−DtrpL−trpDCBA、pCL−Ptrp_trpDCBAベクターを制限酵素HindIIIで切断した。
導入された菌株は、LBCm固体培地(LB+クロラムフェニコール寒天平板)に塗抹してCm耐性を有する菌体を対象に確認を行い、pBAC−Dtrp_att−trpEDCBA、pBAC−DtrpL−trpEDCBA、pBAC−Ptrp_trpEDCBAとpBAC−Dtrp_att−trpDCBA、pBAC−DtrpL−trpDCBA、pBAC−Ptrp_trpDCBAベクターを作製した。
野生型大腸菌W3110菌株からトリプトファン産生菌株に近い菌株を作製するためにコリスミ酸ムターゼ(chorismate mutase)/プレフェン酸脱水酵素(prephenate dehydratase、CM−PDT)をコードするpheA遺伝子(NCBI gene ID:12934467)を相同組換えによる欠失により不活性化させた。CM−PDTは、コリスミ酸(chorismate)からフェニルアラニン(phenylalanine)を生成する最初の段階にある酵素であり、pheA遺伝子欠損はフェニルアラニン生合成経路を抑制するのに用いられた。このために、Datsenko KAらにより開発されたラムダレッドリコンビナーゼ(lambda Redrecombinase)を利用した突然変異作製法であるワンステップ弱化方法を用いた(One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Datsenko KA, Wanner BL., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun6;97(12):6640-5)。遺伝子内部への挿入を確認するためのマーカーとしては、pUCprmfmloxPのクロラムフェニコール遺伝子を用いた(大韓民国公開特許:2009−0075549)。
前記pheA遺伝子の一部分とpUCprmfmloxPベクターのクロラムフェニコール(Chloramphenicol)耐性遺伝子の一部の塩基配列を有するプライマー9及びプライマー10を用いて、ベクターpUCprmfmloxPを鋳型とするPCR法により約1200bpの遺伝子断片を増幅した。
5’−GGCCTCCCAAATCGGGGGGCCTTTTTTATTGATAACAAAAAGGCAACACTAGGTGACACTATAGAACGCG−3’(配列番号19)
プライマー10
5’−AACAGCCCAATACCTTCATTGAACGGGTGATTTCCCCTAACTCTTTCAATTAGTGGATCTGATGGGTACC−3’(配列番号20)
5’−GAATGGGAGGCGTTTCGTCGTGTGAAACAGAATGCGAAGACGAACAATAAGGCCTCCCAAATCGGGGGGC−3’(配列番号21)
プライマー12
5−GGCACCTTTTCATCAGGTTGGATCAACAGGCACTACGTTCTCACTTGGGTAACAGCCCAATACCTTCATT−3’(配列番号22)
5’−TTGAGTGTATCGCCAACGCG−3’(配列番号23)
プライマー14
5’−AAAGCCGCGTGTTATTGCGT−3’(配列番号24)
前記実施例6に従い作製された大腸菌W3110trpΔ1菌株からトリプトファン分解酵素(tryptophanase)をコードするtnaAとトリプトファンインポータ(importer)をコードするtnaB遺伝子のオペロン形であるtnaAB(NCBIgene ID:12933600、12933602)遺伝子を相同組換えにより欠失させた。前記欠損によりトリプトファンが生成された後に分解される経路を遮断し、生成されて培地内に分泌されたトリプトファンの細胞内への再移動を防いでトリプトファン産生菌株の特性を与えることができる。このために、実施例6の方法と同様にして、前記tnaAB遺伝子の一部分とpUCprmfmloxP遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子の一部の塩基配列を有するプライマー15及びプライマー16を用いてベクターpUCprmfmloxPを鋳型としてPCR法により約1200bpの遺伝子断片を増幅した。さらに、前記PCR増幅により得られたDNA断片は、実施例6の方法と同様にして、プライマー17及びプライマー18を用いたPCR法により1300bpの遺伝子断片を増幅した
5’−TTAGCCAAATTTAGGTAACACGTTAAAGACGTTGCCGAACCAGCACAAAAAGGTGACACTATAGAACGCG−3’(配列番号25)
プライマー16
5’−ATGAAGGATTATGTAATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGTAGTGGATCTGATGGGTACC−3’(配列番号26)
プライマー17
5’−TGATTTCCTGAGAGGCAAGAAGCCAGCGAATGGCTGGCTTCTTGAAGGATTTAGCCAAATTTAGGTAACA−3’(配列番号27)
プライマー18
5’−AATCGGTATAGCAGATGTAATATTCACAGGGATCACTGTAATTAAAATAAATGAAGGATTATGTAATGGA−3’(配列番号28)
5’−CGGGATAAAGTAAAACCAGG−3’(配列番号29)
プライマー20
5’−CGGCGAAGGTAAGTTGATGA−3’(配列番号30)
上述した実施例3、4及び5に従い作製されたベクターを導入した大腸菌の効果の評価を、実施例6及び7に従い作製されたW3110trpΔ2を母菌株として用い、グルコースを炭素源として用いて行った。
力価の評価のために菌体を白金耳で接種した後、LB固体培地で一晩培養し、下記表2に示す組成からなる25mlのフラスコ力価培地に一白金耳ずつ接種した。菌株の接種後に37℃、200rpmで48時間培養し、それから得られた結果を表3に示す。全ての結果は、3つのフラスコ結果の平均値で示す。
実施例3、実施例4及び実施例5に従い作製されたベクターを下記表5のように組み合わせ、トリプトファン産生菌株である母菌株の大腸菌KCCM10812Pに導入してグルコースを炭素源として用いて力価評価を行った。実施例8の結果から明らかなように、トリプトファンオペロンの強化とともに、trpDCBAの強化も重要であると認められ、トリプトファンを産生する産生菌株における効果を検証しようとした。
力価の評価のために菌体を白金耳で接種した後、LB固体培地で一晩培養し、下記表4に示す組成からなる25mlのフラスコ力価培地に一白金耳ずつ接種した。菌株の接種後に37℃、200rpmで48時間培養し、それから得られた結果を表5に示す。全ての結果は、3つのフラスコ結果の平均値で示す。
**48時間測定値
実施例9における結果に基づいて、染色体内トリプトファン生合成遺伝子群trpDCBAのコピー数を増加するためにベクターを作製した。
実施例5で言及されたpCL−Dtrp_att−trpDCBAからDtrp_att−trpDCBA領域を制限酵素EcoRI及びBamHIで切断して、同じ制限酵素で切断したpINT17EにライゲーションすることによりpINT17E−Patt−trpDCBAを得た。次いで、これをトリプトファン産生菌株として母菌株である大腸菌KCCM10812Pに導入してトリプトファン生合成遺伝子群trpDCBAのコピー数を増加するために、実施例6でのように、Datsenko KAらにより開発されたラムダレッドリコンビナーゼ(lambda Red recombinase)を利用した突然変異作製法であるワンステップ不活性化方法に用いられるpKD46を用いた。遺伝子内部への挿入を確認するためのマーカーとしては、pUCprmfmloxPのクロラムフェニコール遺伝子を用いた。先ず、pKD46を導入した母菌株にpINT17E−Patt−trpDCBAを形質転換した後、37℃で1日〜2日間培養してコロニーを得た。得られたコロニーを対象に、染色体内部に正常に挿入されたか否かをプライマー21及びプライマー22を用いてPCR法により約2000bpの断片を増幅して確認した。
5’TATTTGCTGTCACGAGCAGG3’(配列番号31)
プライマー22
5’AGTTCCGGCATACAACCGGCTT3’(配列番号32)
5’TAATACGACTCACTATAGGG3’(配列番号33)
プライマー24
5’CTGTTGGGCGGAAAAATGAC3’(配列番号34)
プライマー25
5’TGATCGCCAGGGTGCCGACG3’(配列番号35)
プライマー26
5’CCCTATAGTGAGTCGTATTA3’(配列番号36)
実施例10に記述されている方法に従い、トリプトファン産生菌株である大腸菌KCCM10812PにtrpDCBAをさらに導入して、トリプトファン生合成経路の一部の酵素の活性が強化されたKCCM10812P/trpDCBAの力価の評価をグルコースを炭素源として用いて行った。
力価の評価のために菌体を白金耳で接種した後、LB固体培地で一晩培養し、下記表4に示す組成からなる25mlのフラスコ力価培地に一白金耳ずつ接種した。菌株の接種後に37℃、200rpmで48時間培養し、それから得られた結果を表6に示す。全ての結果は、3つのフラスコ結果の平均値で示す。
**48時間測定値
また、L−トリプトファン濃度の場合、それぞれ10%、13%増加する結果が得られた。表6に示すように、trpDCBAのコピーを増加したときにグルコースの消耗速度がやや下がる場合もあるが、全体的に見たとき、トリプトファン生合成遺伝子群の強化がL−トリプトファン濃度の増加とアントラニル酸塩濃度の低減に良好な影響を及ぼすことを確認した。
[受託番号]
寄託機関名:韓国微生物保存センター(国外)
受託番号:KCCM11246P
受託日:20111229
Claims (7)
- 野生型のエシェリキア属微生物の産生能に比較して、強化されたL-トリプトファン産生能を持つ組換えエシェリキア属微生物であって、
該組換えエシェリキア属微生物は、染色体のトリプトファンオペロンにおいて配列番号1に示される塩基配列を含む発現調節部位のうち配列番号2に示される塩基配列の全体又は一部が欠損することのみによって修飾されたものであり、
該組換えエシェリキア属微生物は、野生型エシェリキア属微生物と比較してトリプトファンオペロン遺伝子の発現を増大させるために、トリプトファンオペロンの遺伝子である、trpEを除く、trpD、trpC、trpB、及びtrpAが形質転換されたものであり、及び
該組換えエシェリキア属微生物は野生型エシェリキア属微生物と比較してtrpE遺伝子の発現が増大されていないものであるか若しくはtrpE遺伝子によってコードされるアントラニル酸塩合成酵素の活性が増大されてないものである、組換えエシェリキア属微生物。 - 組換えエシェリキア属微生物は染色体のトリプトファンオペロンにおいて、配列番号1の塩基配列を含む発現調節部位のうち配列番号3に示される塩基配列の全体又は一部が欠損するようにさらに変形されたものである、請求項1に記載の組換えエシェリキア属微生物。
- trpD遺伝子が、配列番号37に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、trpC遺伝子が、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、trpB遺伝子が、配列番号39に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、及び
trpA遺伝子が、配列番号40に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項2に記載の組換えエシェリキア属微生物。 - 組換えエシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項1に記載の組換えエシェリキア属微生物。
- L−トリプトファン産生に適した条件下で請求項1に記載の組換えエシェリキア属微生物を培養する工程を含む、L−トリプトファンの産生方法。
- 組換えエシェリキア属微生物は、染色体のトリプトファンオペロンにおいて、配列番号1の塩基配列を含む発現調節部位のうち配列番号3に示される塩基配列の全体又は一部が欠損するようにさらに変形されたものである、請求項5に記載のL−トリプトファンの産生方法。
- 組換えエシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項5に記載のL−トリプトファンの産生方法。
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