JP6462587B2 - 近赤外線消光団 - Google Patents
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Description
しかしながら、FRETを制御機構とした場合においても、有用な近赤外光領域の消光団がないため、FRET型のプローブ開発にも制限がある。従って、近赤外光領域における消光団を開発し、それを利用して様々な近赤外蛍光プローブを開発することは、生命科学の発展において非常に有用である。
[1]下記一般式(I):
(式中、
R1、R2は、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又は炭素数1〜6個のアルコキシ基を示し;
R3aは、ベンゼン環上に存在する1価の置換基を示し;
R3bは、存在する場合はリンカーを介して蛍光色素と結合することができる置換基を示し;
R4、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R8、R9、R10及びR11は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示し;
R12及びR13は、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し;
R14a及びR15aは、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R14b及びR15bは、それぞれ独立に、アルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基を示し;
X及びYは、それぞれ独立に−C(R16)(R17)−、−C(R18)(R19)−C(R20)(R21)−、又は−C(R22)=C(R23)−(式中、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、及びR23は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が1〜6個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示す)を示し;
Zは、珪素原子、ゲルマニウム原子、炭素原子又はスズ原子を示し;
m1及びm2は、それぞれ独立に、0〜4の整数であり、但し、m1+m2は4以下であり:
n1及びn2は、それぞれ独立に、0〜4の整数であり、但し、n1+n2は4以下であり;
s1及びs2は、それぞれ独立に、0〜3の整数であり、但し、s1+s2は3以下である。)
で表される化合物又はその塩。
[2]m2及びn2は、それぞれ独立に、1以上である、[1]に記載の化合物又はその塩。
[3]s2が1以上である、[1]又は[2]に記載の化合物又はその塩。
[4]下記の一般式(I)で表される化合物(式中、R1〜R15b、X、Y、Z、m1、m2、n1、n2、s1及びs2は、上記で定義した通りである)を製造する方法であって、
下記の工程:
(a)下記の一般式(II)で表される化合物(式中、R4〜R7、R12及びR13は、一般式(I)で定義した通りである)を酸性条件下で亜硝酸ナトリウム及びヨウ化カリウムと反応させて下記の一般式(III)で表される化合物(式中、R4〜R7、R12及びR13は、一般式(I)で定義した通りである)を得る工程;
を含む、該製造方法。
[5]前記工程(a)に続いて、
(b−1)前記一般式(III)の化合物を、酢酸パラジウム及びBINAPの存在下で、下記の一般式(IVa)(式中、R8、R9、R14a、X及びm1は、一般式(I)で定義した通りである)、及び一般式(IVb)(式中、R10、R11、R15a、Y及びn1は、一般式(I)で定義した通りである)で表される化合物と反応させて、下記の一般式(V)で表される化合物(式中、R4〜R13、R14a、R15a、m1及びn1は、一般式(I)で定義した通りである)を得る工程
(c)上記の一般式(V)の化合物を、塩化スルホン酸と反応させることにより、下記一般式(VI)で表される化合物(式中、R4〜R14a、R15a、m1、m2、n1及びn2は、一般式(I)で定義した通りであり、R14b、R15bはスルホン基である。)を得る工程;
(d)一般式(VI)の化合物を保護試薬と反応させて、下記一般式(VIa)で表される化合物(式中、R4〜R13、R14a及びR15a、m1、m2、n1及びn2は、一般式(I)で定義した通りであり、(R14b’−L)及び(R15b’−L)は、夫々、R14b及びR15bが保護基Lにより保護された基を示す);
(e−1)上記一般式(VIa)の化合物を、下記一般式(VII)で表される化合物(式中、R1〜R3b、s1及びs2は、一般式(I)で定義した通りであり、Mは、存在する場合はR3bの保護基である)と反応させ、その後、前記保護基Lを脱離し、及び、式(VII)においてMが存在する場合には保護基Mを脱離して、一般式(I)で表される化合物(但し、m2及びn2は1以上であり、R14b、R15bはスルホン基である)を得る工程;
を含む、[4]に記載の製造方法。
[6]前記工程(a)に続いて、
(b−2)前記一般式(III)の化合物を、酢酸パラジウム及びBINAP等のパラジウム触媒の存在下で、下記の一般式(IVc)(式中、R8、R9、R14a及びm1は、一般式(I)で定義した通りであり、Uは、R14b又はR14bに変換可能な置換基を示す)、及び一般式(IVd)(式中R10、R11、R15a及びn1は、一般式(I)で定義した通りであり、Vは、R15b又はR15bに変換可能な置換基を示す)で表される化合物と反応させて、下記の一般式(Va)で表される化合物(式中、R4〜R13、R14a、R15a、m1及びn1は、一般式(I)で定義した通りであり、U及びVは、夫々、一般式(IVc)及び(IVd)で定義した通りである)を得る工程;
(e−2)上記一般式(Va)の化合物を、下記一般式(VII)で表される化合物(式中、R1〜R3b、s1及びs2は、一般式(I)で定義した通りであり、Mは、存在する場合はR3bの保護基である)と反応させ、その後、式(VII)においてMが存在する場合には保護基Mを脱離して、一般式(I)で表される化合物(但し、m2及びn2は1以上である)を得る工程(ここで、U及びVが、夫々、R14bに変換可能な置換基及びR15bに変換可能な置換基である場合には、(e−2)の工程の前、当該工程中又は当該工程の後において、U及びVを、夫々、R14b及びR15bに変換する工程を含んでもよい);
を含む、[4]に記載の製造方法。
[7]前記工程(a)に続いて、
(b−1)前記一般式(III)の化合物を、酢酸パラジウム及びBINAP等のパラジウム触媒の存在下で、下記の一般式(IVa)(式中、R8、R9、R14a及びm1は、一般式(I)で定義した通りである)、及び一般式(IVb)(式中R10、R11、R15a及びn1は、一般式(I)で定義した通りである)で表される化合物と反応させて、下記の一般式(V)で表される化合物(式中、R4〜R13、R14a、R15a、m1及びn1は、一般式(I)で定義した通りである)を得る工程
(e−3)一般式(V)の化合物を、一般式(VII)で表される化合物(式中、R1〜R3b、s1及びs2は、一般式(I)で定義した通りであり、Mは、存在する場合はR3bの保護基である)と反応させ、その後、(VII)においてMが存在する場合には保護基Mを脱離して一般式(I)で表される化合物(但し、n1及びn2は0である)を得る工程;
を含む、[4]に記載の製造方法。
[8]プロトン、金属イオン、活性酸素種、酵素又は低酸素環境などを検出可能な蛍光プローブであって、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の化合物の残基を含む蛍光プローブ。
[9]蛍光標識試薬であって、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の化合物の残基を含む蛍光標識試薬である。
[10][1]〜[3]のいずれか1項に記載の化合物の残基を、存在する場合はリンカーを介して、蛍光色素と結合させた構造を有する化合物を含む蛍光プローブ。
後述するとおり、一般式(I)で表される本発明の化合物又はその塩は、プロトン、金属イオン、活性酸素種、酵素、低酸素環境など(以下、これらを「測定対象物」と呼ぶ場合がある)を特異的に測定するための蛍光プローブの母核構造、又は生体成分の蛍光標識のための蛍光標識試薬の母核構造としても極めて有用である。従って、本発明の一つの側面において、一般式(I)において、s2は1以上であり、存在する場合はリンカーを介して蛍光団と結合することができる置換基を少なくとも1つ有することが好ましい。このような置換基としては、好ましくは、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、イソチオシアネート基、又はアミノ基から選択される。一般式(I)の化合物がこのような置換基を少なくとも1つ有していれば、本発明の化合物に蛍光団を容易に導入することができる。なお、存在する場合はリンカーを介して蛍光団と結合することができる置換基のベンゼン環上の置換位置はいずれの位置でもよい。
R4及びR5は、それぞれ独立に、水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、R4及びR5がともに水素原子である場合、又はR4及びR5がともに塩素原子又はフッ素原子である場合がより好ましい。
また、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、R6及びR7がともに水素原子である場合、又はR6及びR7がともに塩素原子又はフッ素原子である場合がより好ましい。
また、本発明のより好ましい実施形態においては、m2及びn2は1以上の整数であり、R14b及びR15bの少なくとも1つの組み合わせがアルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基である。
本発明の一般式(I)の化合物は、例えば以下の方法により合成することができる。ここで、一般式(I)においてm2及びn2が1以上である化合物は合成スキーム1により、m2及びn2が0である化合物(化合物(Ia)ともいう)は合成スキーム2により、合成することができる。なお、以下の合成法においては、一般式(I)のR8とR10、R9とR11、XとY、R14aとR15a、R14aとR15b、m1とn1は同一である。
一般式(II)の化合物(式中、R4〜R7、R12及びR13は、一般式(I)で定義した通りである)を、塩酸等の酸性水溶液と有機溶媒の混合溶媒に溶解し、0℃程度に冷却し、そこへ、1〜2当量のNaNO2水溶液を滴下し、所定時間撹拌後、1〜10当量のヨウ化カリウムの水溶液を添加して反応させることにより、一般式(III)の化合物(式中、R4〜R7、R12及びR13は、一般式(I)で定義した通りである)を合成することができる。
一般式(III)の化合物をトルエン等の有機溶媒に溶解し、一般式(IVa)の化合物(式中、R8、R9、R14a及びm1は、一般式(I)で定義した通りである)を1〜2当量及びCsCO3を添加した後、アルゴン雰囲気下で、BINAP及び酢酸パラジウムを添加し、100℃程度の温度で所定時間反応させることにより、一般式(V)の化合物(式中、R4〜R13、R14a、R15a、m1及びm2は、一般式(I)で定義した通りである)を合成することができる。
なお、一般式(VIa)の化合物とともに、一般式(IVb)の化合物(式中、R10、R11、R15a及びn1は、一般式(I)で定義した通りである)を加えて反応させる、もしくは、(IVa)と反応後、中間体を粗精製し、再度(IVb)と同条件で反応させることで、一般式(I)のR8とR10、R9とR11、XとY、R14aとR15a、R14aとR15b、m1とn1が同一でない化合物を合成することもできる。
一般式(V)の化合物をクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、氷浴上で0℃程度に冷却した後、塩化スルホン酸と反応させることにより一般式(VI)の化合物(式中、R4〜R15b、m1、m2、n1及びn2は、一般式(I)で定義した通りである)を合成することができる。
一般式(V)の化合物をイソプロパノールなどのアルコール系溶媒に溶解し、スルホン酸基などのイオン性基を保護する試薬(例えば、オルト蟻酸トリイソプロピル等)を1〜10当量添加し、60〜80℃で所定時間反応させることにより、一般式(VIa)の化合物を合成することができる。
一般式(VII)の化合物(式中、R1〜R3、s1及びs2は、一般式(I)で定義したとおりであり、Mは、存在する場合はR3bの保護基である。保護基としては、例えば、t−ブチル基、オキサゾリン基が挙げられる)の2〜10当量を脱水THFなどの有機溶媒に溶解し、アルゴン雰囲気下で、2〜10当量のsec−ブチルリチウムTHF溶液を添加、その後一般式(VIa)の化合物のTHF溶液を添加し、所定時間加熱還流した後、室温に戻して塩酸溶液等を加え、更に所定時間加熱還流することにより、一般式(I)の化合物(但し、m2及びn2は1以上であり、R14b、R15bはスルホン基である)を合成することができる。
ここで、R3bの保護基Mが存在する場合には、塩酸溶液等を加え、加熱還流することにより、保護基Mを脱離する。
一般式(III)の化合物をトルエン等の有機溶媒に溶解し、一般式(IVc)の化合物(式中、R8、R9、R14a及びm1は、一般式(I)で定義した通りであり、Uは、R14b又はR14bに変換可能な置換基を示す)1〜2当量及び一般式(IVd)の化合物(式中R10、R11、R15a及びn1は、一般式(I)で定義した通りであり、Vは、R15b又はR15bに変換可能な置換基を示す)1〜2当量及びCsCO3を添加した後、アルゴン雰囲気下で、BINAP及び酢酸パラジウムを添加し、100℃程度の温度で所定時間反応させることにより、一般式(Va)の化合物(式中、R4〜R13、R14a、R15a、m1及びn1は、一般式(I)で定義した通りであり、U及びVは、夫々、一般式(IVc)及び(IVd)で定義した通りである)を合成することができる。
ここで、U、VのR14b又はR15bに変換可能な置換基としては、例えば、カルボニル基、ハロゲン基、リン酸エステル基、スルホン酸エステル基が挙げられる。
一般式(VII)の化合物(式中、R1〜R3、s1及びs2は、一般式(I)で定義したとおりであり、Mは、存在する場合はR3bの保護基である。保護基としては、例えば、t−ブチル基、オキサゾリン基が挙げられる)を2〜10当量脱水THFなどの有機溶媒に溶解し、アルゴン雰囲気下で、2〜10当量のsec−ブチルリチウムを添加後、一般式(Va)の化合物のTHF溶液を添加し所定時間加熱還流した後、室温に戻して塩酸溶液等を加え、更に所定時間加熱還流することにより、一般式(I)の化合物(但し、m2及びn2は1以上である)を合成することができる。
ここで、R3bの保護基Mが存在する場合には、工程(e−1)に記載した方法と同様にして保護基Mを脱離する。
また、U及びVが、夫々、R14bに変換可能な置換基及びR15bに変換可能な置換基である場合には、(e−2)の工程の前、当該工程中又は当該工程の後において、U及びVを、夫々、R14b及びR15bに変換する工程を含んでもよい。R14b及びR15bに変換するには、例えば、エステル保護基の加水分解反応などがある。
一般式(VII)の化合物を2〜10当量、脱水THFなどの有機溶媒に溶解し、アルゴン雰囲気下で、2〜10当量のsec−ブチルリチウムTHF溶液を添加し、その後一般式(V)の化合物のTHF溶液を添加し、所定時間加熱還流した後、室温に戻して塩酸溶液等を加え、更に所定時間加熱還流することにより、一般式(Ia)の化合物を合成することができる。
ここで、R3bの保護基Mが存在する場合には、工程(e−1)に記載した方法と同様にして保護基Mを脱離する。
従って、本発明の一つの実施態様は、プロトン、金属イオン、活性酸素種、酵素又は低酸素環境などを検出可能な蛍光プローブであって、一般式(I)で表される化合物の残基を含む蛍光プローブである。
また、本発明のもう一つ別の実施態様は、蛍光標識試薬であって、一般式(I)で表される化合物の残基を含む蛍光標識試薬である。
本明細書において「残基」の用語は、一般式(I)で表される化合物から1個又は2個以上の水素原子を除いた残りの化学構造を意味している。
また、本発明のもう一つ別の側面は、一般式(I)で表される化合物の残基を、存在する場合はリンカーを介して、蛍光色素と結合させた構造を有する化合物を含む蛍光標識試薬である。
R3bの少なくとも1つがこのような置換基であれば、本発明の化合物に蛍光団を容易に導入することができる。
また、本発明の一般式(I)で表される化合物を含む蛍光プローブは、活性酸素種、例えば、H2O2、−OCl、ONOO−、O2 −、ヒドロキシラジカルの測定に好適に用いることができる。
以下の合成スキーム3により、比較化合物1を合成した。
NH2−Si−キサントン(228mg、0.85mmol)を2NHCl水溶液4mLとアセトニトリル4mLに溶解し、氷浴上で0℃に冷却した。そこに、水1mLに溶解させたNaNO2(140mg、1.70mmol)を撹拌しながら滴下した。30分間撹拌後、水2mLに溶解させたKI(2.82g、8.50mmol)を激しく撹拌しながら滴下した。1時間撹拌後、飽和亜硫酸ナトリウム水溶液を加え、CH2Cl2を用いて化合物を抽出し、有機層の溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、CH2Cl2)にて精製し、I−Si−キサントン(72mg、収率17%)を得た。
I−Si−キサントン(60mg、0.12mmol)を50mLシュレンク管に入れ、トルエン10mLに溶解させた。そこに、インドリン(28mg、0.24mmol)とCs2CO3(78mg、0.24mmol)を添加し、脱気後、アルゴン置換した。アルゴン雰囲気下で、BINAP(7.4mg、0.01mmol)とPd(OAC)2(2.6mg、0.01mmol)を添加し、100℃で一晩撹拌した。濾過後、溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、CH2Cl2/ヘキサン=8/2)にて精製し、インドリン−Si−キサントン(31mg、収率54%)を得た。
1Mの比較化合物1についてPBS、メタノール、DMFおよびクロロホルムの溶液(共溶媒としてそれぞれ0.1%のDMSOを含有)について、吸収スペクトル及び蛍光スペクトル(励起波長760nm)を測定した。その結果を図1に示す。また、比較化合物1について得られた光物理特性を表1に示す。
比較化合物1にスルホン基を導入した化合物(比較化合物2)を以下の合成スキームによる合成した。
1Mの比較化合物2のPBS溶液(共溶媒として0.1%のDMSOを含有)について、吸収スペクトルを測定した。その結果を図2に示す。図2より、スルホン基の導入により吸収波長に変化は見られず、近赤外光領域の消光団として十分な吸収波長を有していることが分かる。
しかしながら、比較化合物2の吸収スペクトルの経時変化を観察したところ、図3に示すように、水中では徐々に吸収の減少が観察され、水中での不安定性が示唆された。ここで、400nm以上の波長に消光団の吸収の減少に伴う新たな吸収の増大が観察されなかったことから、キサンテン環9位への水分子の求核付加反応が起こっていると考えられる。
SO3iPr−インドリン−Si−キサントンから、以下の合成スキームにより本発明の化合物1及び2を合成した。
化合物1及び2のPBS溶液(共溶媒として0.1%のDMSOを含有)について、吸収スペクトルの経時変化を測定した。その結果を図4a及び図4bに示す。
図4で示すように、化合物1及び2は共に水中での吸収の減少は観察されなかった。この結果より、キサンテン環9位に結合したベンゼン環のオルト位に置換基を導入することで、キサンテン環9位への求核攻撃を抑え、化合物の水中での安定が向上したと考えられる。
SO3H−インドリン−Si−キサントンから以下の合成スキームにより化合物3を合成した。
a) 2-(4-bromo-3,5-dimethoxyphenyl)-4,4-dimethyl-4,5-dihydrooxazole, sec-BuLi, THF, 60 °C, ii) 2N HClaq, acetone, reflux, 2 days, y. 60%
アルゴン置換下、2−(4−ブロモ−3,5−ジメトキシフェニル)−4,4−ジメチル−4,5−ジヒドロオキサゾール(65mg、0.21mmol)を脱水THF5mLに溶解させ、−78℃に冷却した。その後、撹拌しながら1Msec−BuLiTHF溶液を210μL添加した。30分撹拌後、SO3iPr−インドリン−Si−キサントン(30mg、0.042 mmol)を脱水THF5mLに溶解させ、添加した。添加後室温に戻し、60℃に加熱し、2時間撹拌した。撹拌後、6NHCl溶液を加え、2時間加熱還流を行い、有機溶媒を減圧留去した後に、HPLCで精製し、化合物3(2,6−diOMe−SO3Hインドリン−Si−QSY21 COOH)(20mg、0.025mmol、収率60%)を得た。
MMPプローブの調製
化合物3を用いて、生体内での血中滞留性が6時間程度は確認されているPEG11をC末端に結合させたプローブを合成し、動物個体への応用を検討した(Zhu, L., et al, Theranostics, 2011, 1, 18-27)。また、本プローブにおいてはN末端側に蛍光団(Dy720)を結合させた。リンカーは広範なMMPにより認識されると考えられている配列であるPLGVRGを使用した。また、コントロールとして同時にD体のアミノ酸を用いたプローブを合成した。
MMPプローブの構造と合成スキームを以下に示す。
tert−ブチル(35−アミノ−3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33−ウンデカオキサペンタトリアコンチル)カルバメート(1g、1.56mmol)を無水酢酸2mL、ピリジン2mLの混合溶媒に溶解させ、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、トリフルオロ酢酸2mLを添加し、4時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、N−(35−アミノ−3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33−ウンデカオキサペンタトリアコンチル)アセトアミド(1.2g、quant)を得た。HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 587.3755; found, 687.3708 (-4.7 mmu).
a) DY730-SE, DIEA, DMF, crude; b) TFA, triethylsilane, H2O, crude ; c) SulfoSiQSY780-SE, DIEA, DMF, y.7% (in 3steps); d) 3, HATU, DIEA, DMF, y.51%.
DY730−SE(20mg)とペプチドリンカー(20mg)をDMF2mLに溶解させ、そこにDIEAを3滴滴下後、4時間室温で撹拌した。それを減圧留去後、TFA2mL、トリエチルシラン10μL、水10μLの混合溶媒に溶解させ、2時間室温で撹拌した。それを減圧留去後、HPLCで粗精製を行った。目的物の分画を凍結乾燥し、得られた固体をDMF1mLに溶解させ、sulfoSiQSY0−SE(5.2mg)を添加し、DIEA3滴滴下後、室温で4時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、HPLCで精製し、中間体(5mg、収率7%)LRMS (ESI+): 1120 [M]2+を得た。これをDMF2mLに溶解させ、N−(35−アミノ−3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33−ウンデカオキサペンタトリアコンチル)アセトアミド(15mg、)を添加し、HATU(38mg)添加後、室温で6時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、HPLCで精製し、MMPプローブ(3.2mg、収率51%)を得た。LRMS (ESI+): 1404 [M]2+
a) DY730-SE, DIEA, DMF, crude; b) TFA, triethylsilane, H2O, crude; c) SulfoSiQSY780-SE, DIEA, DMF, y.7% (3steps); d) PEG11, HATU, DIEA, DMF, y.87%.
DY730−SE(20mg)とコントロールペプチドリンカー(20mg)をDMF2mLに溶解させ、そこにDIEAを3滴滴下後、4時間室温で撹拌した。それを減圧留去後、TFA2mL、トリエチルシラン10μL、水10μLの混合溶媒に溶解させ、2時間室温で撹拌した。それを減圧留去後、HPLCで粗精製を行った。目的物の分画を凍結乾燥し、得られた固体をDMF1mLに溶解させ、sulfoSiQSY0-SE(5.2 mg, )を添加し、DIEA3滴滴下後、室温で4時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、HPLCで精製し、中間体(5.2 mg、収率7%)を得た。LRMS (ESI+): 995 [M]2+これをDMF2mLに溶解させ、N−(35−アミノ−3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33−ウンデカオキサペンタトリアコンチル)アセトアミド(15mg)を添加し、HATU(38mg)添加後、室温で6時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、HPLCで精製し、コントロールMMPプローブ(5.4mg、収率87%)を得た。
LRMS (ESI+): 853 [M+H]3+.
(1)MMPプローブを用いた酵素反応の観察
MMPプローブ(Si−QSY780)がMMPによって切断されることをin vitroで確認した。
MMPプローブのTCN緩衝液及びTCNB緩衝液(いずれも共溶媒として0.1%DMSOを含有、プローブの最終濃度:1μM)について、酵素反応前後での吸収及び蛍光スペクトルを図5(MMP−14)及び図7(MMP−9)に示す(各図において左側の図は吸収スペクトルを右側の図は蛍光スペクトルを示す)。酵素反応は、MMP−14(MT1−MMP)触媒ドメイン(5μg)(図6)または、MMP−9触媒ドメイン(5μg)(図7)を添加し、2日間培養して行った。励起波長は720nmである。
図6及び図7で、酵素反応後に蛍光強度が増大しており、MMPによりプローブが切断されたことが示される。
MMPプローブ(Si−QSY780)を用いて、以下のプロトコルにより培養細胞でのイメージングを行った。
プロトコル
・HT−1080細胞を5×105細胞/mLで8チャンバーに撒き、2日間培養
・PBSで洗浄後、HBSSに置換
・プローブを1μMになるように添加
・6時間培養
・撮像(IX71(オリンパス))
図8で示されるように、細胞外液、および細胞内での蛍光上昇が観察され、コントロールとの有意差は認められた。
本発明の蛍光プローブがin vivoイメージングに応用可能であることを示すために、合成したMMPプローブ(Si−QSY780)を用いてin vivoでのMMP活性の検出を行った。モデルとしてはHT−1080細胞を左下肢に皮下注射して作製した皮下腫瘍モデルマウスでの検討を以下のプロトコルに基づき行った。
プロトコル
・HT−1080細胞をBALBnu/nuマウス(雌6週齢)の皮下に1000000細胞/100μL打ち込み、腫瘍を作製
・麻酔下でプローブ100μMを100μL尾静注により投与
・各時間で撮像
また、図10は、MMPプローブ(n=5)又はコントロール(n=5)を腫瘍組織に静注したときの、組織におけるMMPプローブ又はコントロールの蛍光強度の経時変化(左図)及びMMPプローブ又はコントロールの蛍光強度比(Tumor/Muscle)の経時変化(右図)を示す。
プローブとコントロールでの有意差はあり、2時間以内にはMMP活性が確認できるようになっている。コントロールの蛍光が上昇しているのは、腫瘍部位だけでなく全身の蛍光値が上昇しているため、長時間滞留しているプローブが非特異的に切断されるなどして蛍光が上昇していると考えられる。
これらの結果から、実際に本発明の化合物は動物個体におけるイメージングに応用可能であることが示された。
Claims (10)
- 下記一般式(I):
(式中、
R1、R2は、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又は炭素数1〜6個のアルコキシ基を示し;
R3aは、ベンゼン環上に存在する1価の置換基を示し;
R3bは、存在する場合はリンカーを介して蛍光色素と結合することができる置換基を示し;
R4、R5、R6及びR7は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R8、R9、R10及びR11は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示し;
R12及びR13は、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し;
R14a及びR15aは、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R14b及びR15bは、それぞれ独立に、アルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基を示し;
X及びYは、それぞれ独立に−C(R16)(R17)−、−C(R18)(R19)−C(R20)(R21)−、又は−C(R22)=C(R23)−(式中、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、及びR23は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が1〜6個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示す)を示し;
Zは、珪素原子、ゲルマニウム原子、炭素原子又はスズ原子を示し;
m1及びm2は、それぞれ独立に、0〜4の整数であり、但し、m1+m2は4以下であり:
n1及びn2は、それぞれ独立に、0〜4の整数であり、但し、n1+n2は4以下であり;
s1及びs2は、それぞれ独立に、0〜3の整数であり、但し、s1+s2は3以下である。)
で表される化合物又はその塩。 - m2及びn2は、それぞれ独立に、1以上である、請求項1に記載の化合物又はその塩。
- s2が1以上である、請求項1又は2に記載の化合物又はその塩。
- 下記の一般式(I):
(式中、
R 1 、R 2 は、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又は炭素数1〜6個のアルコキシ基を示し;
R 3a は、ベンゼン環上に存在する1価の置換基を示し;
R 3b は、存在する場合はリンカーを介して蛍光色素と結合することができる置換基を示し;
R 4 、R 5 、R 6 及びR 7 は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R 8 、R 9 、R 10 及びR 11 は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1〜6個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示し;
R 12 及びR 13 は、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又はアリール基を示し;
R 14a 及びR 15a は、それぞれ独立に、炭素数1〜6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R 14b 及びR 15b は、それぞれ独立に、アルコキシ基、アルキルアミノ基、スルホン基、リン酸基又はカルボキシル基を示し;
X及びYは、それぞれ独立に−C(R 16 )(R 17 )−、−C(R 18 )(R 19 )−C(R 20 )(R 21 )−、又は−C(R 22 )=C(R 23 )−(式中、R 16 、R 17 、R 18 、R 19 、R 20 、R 21 、R 22 、及びR 23 は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数が1〜6個のアルキル基、水酸基又はハロゲン原子を示す)を示し;
Zは、珪素原子、ゲルマニウム原子、炭素原子又はスズ原子を示し;
m1及びm2は、それぞれ独立に、0〜4の整数であり、但し、m1+m2は4以下であり:
n1及びn2は、それぞれ独立に、0〜4の整数であり、但し、n1+n2は4以下であり;
s1及びs2は、それぞれ独立に、0〜3の整数であり、但し、s1+s2は3以下である。)
で表される化合物を製造する方法であって、
下記の工程:
(a)下記の一般式(II)で表される化合物(式中、R4〜R7、R12及びR13は、一般式(I)で定義した通りである)を酸性条件下で亜硝酸ナトリウム及びヨウ化カリウムと反応させて下記の一般式(III)で表される化合物(式中、R4〜R7、R12及びR13は、一般式(I)で定義した通りである)を得る工程;
を含む、該製造方法。 - 前記工程(a)に続いて、
(b−1)前記一般式(III)の化合物を、酢酸パラジウム及びBINAPの存在下で、下記の一般式(IVa)(式中、R8、R9、R14a、X及びm1は、一般式(I)で定義した通りである)、及び一般式(IVb)(式中、R10、R11、R15a、Y及びn1は、一般式(I)で定義した通りである)で表される化合物と反応させて、下記の一般式(V)で表される化合物(式中、R4〜R13、R14a、R15a、m1及びn1は、一般式(I)で定義した通りである)を得る工程
(c)上記の一般式(V)の化合物を、塩化スルホン酸と反応させることにより、下記一般式(VI)で表される化合物(式中、R4〜R14a、R15a、m1、m2、n1及びn2は、一般式(I)で定義した通りであり、R14b、R15bはスルホン基である。)を得る工程;
(d)一般式(VI)の化合物を保護試薬と反応させて、下記一般式(VIa)で表される化合物(式中、R4〜R13、R14a及びR15a、m1、m2、n1及びn2は、一般式(I)で定義した通りであり、(R14b’−L)及び(R15b’−L)は、夫々、R14b及びR15bが保護基Lにより保護された基を示す)を得る工程;
(e−1)上記一般式(VIa)の化合物を、下記一般式(VII)で表される化合物(式中、R1〜R3b、s1及びs2は、一般式(I)で定義した通りであり、Mは、存在する場合はR3bの保護基である)と反応させ、その後、前記保護基Lを脱離し、及び、式(VII)においてMが存在する場合には保護基Mを脱離して、一般式(I)で表される化合物(但し、m2及びn2は1以上であり、R14b、R15bはスルホン基である)を得る工程;
を含む、請求項4に記載の製造方法。 - 前記工程(a)に続いて、
(b−2)前記一般式(III)の化合物を、酢酸パラジウム及びBINAP等のパラジウム触媒の存在下で、下記の一般式(IVc)(式中、R8、R9、R14a及びm1は、一般式(I)で定義した通りであり、Uは、R14b又はR14bに変換可能な置換基を示す)、及び一般式(IVd)(式中R10、R11、R15a及びn1は、一般式(I)で定義した通りであり、Vは、R15b又はR15bに変換可能な置換基を示す)で表される化合物と反応させて、下記の一般式(Va)で表される化合物(式中、R4〜R13、R14a、R15a、m1及びn1は、一般式(I)で定義した通りであり、U及びVは、夫々、一般式(IVc)及び(IVd)で定義した通りである)を得る工程;
(e−2)上記一般式(Va)の化合物を、下記一般式(VII)で表される化合物(式中、R1〜R3b、s1及びs2は、一般式(I)で定義した通りであり、Mは、存在する場合はR3bの保護基である)と反応させ、その後、式(VII)においてMが存在する場合には保護基Mを脱離して、一般式(I)で表される化合物(但し、m2及びn2は1以上である)を得る工程(ここで、U及びVが、夫々、R14bに変換可能な置換基及びR15bに変換可能な置換基である場合には、(e−2)の工程の前、当該工程中又は当該工程の後において、U及びVを、夫々、R14b及びR15bに変換する工程を含んでもよい);
を含む、請求項4に記載の製造方法。 - 前記工程(a)に続いて、
(b−1)前記一般式(III)の化合物を、酢酸パラジウム及びBINAP等のパラジウム触媒の存在下で、下記の一般式(IVa)(式中、R8、R9、R14a及びm1は、一般式(I)で定義した通りである)、及び一般式(IVb)(式中R10、R11、R15a及びn1は、一般式(I)で定義した通りである)で表される化合物と反応させて、下記の一般式(V)で表される化合物(式中、R4〜R13、R14a、R15a、m1及びn1は、一般式(I)で定義した通りである)を得る工程
(e−3)一般式(V)の化合物を、一般式(VII)で表される化合物(式中、R1〜R3b、s1及びs2は、一般式(I)で定義した通りであり、Mは、存在する場合はR3bの保護基である)と反応させ、その後、(VII)においてMが存在する場合には保護基Mを脱離して一般式(I)で表される化合物(但し、n1及びn2は0である)を得る工程;
を含む、請求項4に記載の製造方法。 - プロトン、金属イオン、活性酸素種、酵素又は低酸素環境を検出可能な蛍光プローブであって、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物とR 3b の置換基、及び存在する場合はリンカーを介して結合した蛍光色素を含む蛍光プローブ。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物とR 3b の置換基、及び存在する場合はリンカーを介して結合した蛍光色素を含む蛍光標識試薬。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物とR 3b の置換基、及び存在する場合はリンカーを介して、蛍光色素と結合させた構造を有する化合物を含む蛍光プローブ。
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