JP6446907B2 - Method to isolate and detect food poisoning bacteria - Google Patents
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Description
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、食中毒原因菌であるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の分離検出方法に関する。 The present invention relates to the field of nucleic acid amplification. More specifically, the present invention relates to a method for separating and detecting Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella that are food poisoning bacteria.
食中毒を予防する上で、食中毒原因菌の保菌者を早期に発見することは重要である。そのため、食品調理従事者に対しては、食中毒原因菌であるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検査が行われている。 In preventing food poisoning, it is important to find a carrier of a food poisoning germ at an early stage. For this reason, food cooks are inspected for Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella that are food poisoning causative bacteria.
従来、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検査は、塗沫培養法により行われてきた。具体的には、検体を所定条件下において培養してある程度まで増殖させた後、検出したい細菌類のみが増殖し得るような選択培地中で培養を行い、増殖によってできたコロニーを観察することによって検出するという方法である。 Conventionally, Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella have been tested by a smear culture method. Specifically, after culturing the specimen under a predetermined condition and growing to a certain extent, culturing in a selective medium that allows only the bacteria to be detected to grow, and observing the colonies formed by the growth It is a method of detecting.
しかしながら、このような従来の方法では、（１）培養工程を経るため、結果が得られるまでに時間がかかる点、（２）検出感度が低い点、及び（３）コロニーの観察結果に基づいて客観的な判定を下すのは難しいため、検出結果の客観性を担保するのが難しい点等の問題点があった。 However, in such a conventional method, based on (1) the culturing step, it takes time until results are obtained, (2) low detection sensitivity, and (3) colony observation results. Since it is difficult to make an objective determination, there are problems such as difficulty in ensuring the objectivity of the detection result.
そこで、これら検出方法の問題点を解決するためにＰＣＲ法を用いた検出方法が開発されてきた。そのひとつが、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌をそれぞれ個別に増幅し、電気泳動あるいは、蛍光インターカレーターを用いた融解曲線解析により検出する方法である（非特許文献１）。この方法では、３菌種をそれぞれ個別に検出することが可能であったが、３回に分けてＰＣＲを実施する必要性がある。 Therefore, detection methods using the PCR method have been developed to solve the problems of these detection methods. One of them is a method in which Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella are individually amplified and detected by electrophoresis or melting curve analysis using a fluorescent intercalator (Non-patent Document 1). In this method, it was possible to individually detect the three bacterial species, but it is necessary to carry out PCR in three steps.
そこで簡便性をより向上させるべく開発された方法が、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種をマルチプレックスＰＣＲ法により増幅する方法であり、マルチプレックスＰＣＲ法にて増幅した増幅産物を検出する方法として、電気泳動により検出する方法（非特許文献２）と蛍光インターカレーターを用いた融解曲線解析により検出する方法（非特許文献３）の２種類が報告されている。これらマルチプレックスＰＣＲにより３菌種を同時に検出することが可能となったため、簡便性が大幅に改善された。 Therefore, a method developed to further improve convenience is a method of amplifying three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella by multiplex PCR, and amplified by multiplex PCR. Two methods have been reported as methods for detecting amplification products: a method for detection by electrophoresis (Non-Patent Document 2) and a method for detection by melting curve analysis using a fluorescent intercalator (Non-Patent Document 3). These multiplex PCRs enable simultaneous detection of three bacterial species, greatly improving convenience.
しかしながら、電気泳動を用いた検出方法では、増幅したサンプルのチューブを一度開け、電気泳動をする必要性があるため、迅速性に欠ける。また、融解曲線解析による検出する方法は３菌種の分離検出ができないため、３菌種の同定ができない点に問題がある。以上のように、操作が簡便・迅速であることに加え、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を分離検出が可能な方法は存在せず、これらの点でさらなる改善の余地が残されている。 However, in the detection method using electrophoresis, it is necessary to open the tube of the amplified sample once and perform electrophoresis. Moreover, since the method of detecting by melting curve analysis cannot separate and detect the three bacterial species, there is a problem in that the three bacterial species cannot be identified. As described above, in addition to simple and rapid operation, there is no method that can separate and detect Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella, and further improvements in these respects. There is room for.
食中毒原因菌であるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌を簡便かつ迅速に検出することが重要であることに加え、３菌種のどの菌を保菌しているかを同定することは、食中毒の予防、保菌者のその後の対応を決める上で重要となる。そのため、本発明が解決しようとする課題は、簡便かつ迅速に検出が可能であることに加え、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を分離検出が可能な方法を提供することである。 To identify salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella that are food poisoning causative and quick, it is important to identify which of the three bacterial species is carried. It is important in preventing food poisoning and deciding the future response of carriers. Therefore, the problem to be solved by the present invention is to provide a method capable of separating and detecting three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella in addition to being capable of simple and rapid detection. It is to be.
本発明者は、上記事情を鑑み、鋭意研究の結果、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種をマルチプレックスＰＣＲにより増幅させた後、蛍光インターカレーターを用いた融解曲線解析において、３菌種をＴｍ値の違いによって分離検出する方法を開発することで本発明の完成に至った。 In view of the above circumstances, the present inventor has conducted intensive PCR, amplified three strains of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella by multiplex PCR, and then analyzed melting curves using a fluorescent intercalator. In the present invention, the present invention has been completed by developing a method for separating and detecting three bacterial species based on differences in Tm values.
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および赤痢菌の３菌種が存在するかを検出する方法であって、かつ、前記３菌種を区別して検出する方法であって、次の（１）および（２）の工程を含む検出方法。
（１）前記３菌種をターゲットとするマルチプレックスＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を融解曲線解析によって検出する工程。
（２）融解曲線分析において、３菌種を増幅産物のＴｍ値の違いによって分離検出する工程。
［２］工程（２）において、前記３菌種のいずれの増幅産物とも異なるＴｍ値を与えるインターナルコントロール（内部標準）を含む、［１］に記載の検出方法。
［３］検査対象が便検体である、［１］または［２］に記載の検出方法。
［４］検査対象がゲノムＤＮＡの分離精製を行っていない便検体である、［３］に記載の検出方法。
［５］検査対象がＸ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体のプール検体である、［３］または［４］に記載の検出方法。
［６］前記Ｘが２０以上である、［５］に記載の検出方法。
［７］工程（１）において、前記３菌種の増幅産物のＴｍ値が互いに１℃以上離れるように設計された３組のプライマーペアをプライマーセットとしてマルチプレックスＰＣＲを行う、［１］から［６］のいずれかに記載の検出方法。
［８］少なくともひとつのプライマーペアが、以下の（ａ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペア、または、前記の（ａ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列に対応する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択される、［７］に記載の検出方法。
（ａ）「配列番号１のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号３のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｂ）「配列番号１のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号４のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｃ）「配列番号１のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号５のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号６のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｄ）「配列番号７のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号８のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号５のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号６のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｅ）「配列番号９のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１０のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号１１のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｆ）「配列番号１３のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１４のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号１５のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１６のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｇ）「配列番号１７のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１８のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号１５のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１６のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｈ）「配列番号１３のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１４のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号１９のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２０のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｉ）「配列番号２１のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｊ）「配列番号２３のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｋ）「配列番号２４のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｌ）「配列番号２１のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２５のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｍ）「配列番号２６のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２５のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｎ）「配列番号２７のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２８のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｏ）「配列番号２９のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号３０のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｐ）「配列番号３１のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号３０のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｑ）「配列番号３２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号３３のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
［９］プライマーセットが、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）の３群の中からそれぞれ１つずつ選択される３つのプライマーペアの組合せである、［７］または［８］に記載の検出方法。
（Ｉ）前記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペア、または、前記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載されている塩基配列に対応する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択される、サルモネラ増幅用プライマーペア
（ＩＩ）前記の（ｅ）から（ｈ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペア、または、前記の（ｅ）から（ｈ）のいずれかに記載されている塩基配列に対応する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択される、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用プライマーペア
（ＩＩＩ）前記の（ｉ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペア、または、前記の（ｉ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列に対応する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択される、赤痢菌増幅用プライマーペア
［１０］インターナルコントロール（内部標準）のＴｍ値がサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの増幅産物のＴｍ値よりも高温である、［２］から［９］のいずれかに記載の検出方法。
［１１］インターナルコントロール（内部標準）のＴｍ値がサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの増幅産物のＴｍ値よりも低温である、［２］から［９］のいずれかに記載の検出方法。
［１２］下記の（Ａ）〜（Ｄ）を含む、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および赤痢菌の３菌種が存在するかを検出し、かつ、前記３菌種を区別して検出するための試薬。
（Ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）［７］−［９］のいずれかに記載のプライマーセット
（Ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、および、
（Ｄ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオンおよびカリウムイオンからなる群のうち１種以上を含む緩衝液
［１３］さらに下記の（Ｅ）を含む、［１２］に記載の試薬。
（Ｅ）蛍光インターカレーター
That is, the present invention has the following configuration.
[1] A method for detecting the presence of three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella, and a method for distinguishing and detecting the three species, A detection method comprising the steps of 1) and (2).
(1) A step of detecting the obtained amplification product by melting curve analysis after performing multiplex PCR targeting the three bacterial species.
(2) In the melting curve analysis, a step of separating and detecting three bacterial species based on the difference in Tm values of the amplification products.
[2] The detection method according to [1], including an internal control (internal standard) that gives a Tm value different from any of the amplification products of the three bacterial species in step (2).
[3] The detection method according to [1] or [2], wherein the test object is a stool specimen.
[4] The detection method according to [3], wherein the test object is a stool specimen that has not been subjected to separation and purification of genomic DNA.
[5] The detection method according to [3] or [4], wherein the test target is a pooled sample of stool samples collected from stool of X species (X represents an integer of 2 or more).
[6] The detection method according to [5], wherein the X is 20 or more.
[7] In the step (1), multiplex PCR is performed using three primer pairs designed so that Tm values of the amplification products of the three bacterial species are separated from each other by 1 ° C. or more. [1] to [1] 6] The detection method according to any one of the above.
[8] The oligonucleotide pair having at least one primer pair having the base sequence described in any of the following (a) to (q), or any one of the above (a) to (q) The detection method according to [7], which is selected from a pair of oligonucleotides having a complementary base sequence corresponding to the base sequence described in 1.
(A) at least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 1” and “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 2”; Oligonucleotide consisting of 15 bases or more "
(B) at least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 1” and “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 2”; Oligonucleotide consisting of 15 bases or more "
(C) at least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 1” and “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 2”, and “of SEQ ID NO: 5 At least one of the group consisting of “an oligonucleotide comprising 15 bases or more” and “an oligonucleotide comprising 15 bases or more of SEQ ID NO: 6” (d) “an oligonucleotide comprising 15 bases or more of SEQ ID NO: 7”; At least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 8”, and “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 5” and “15 bases or more of SEQ ID NO: 6 (E) “15 or more bases of SEQ ID NO: 9” At least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 15 nucleotides or more in SEQ ID NO: 10”, and “an oligonucleotide consisting of 15 nucleotides or more in SEQ ID NO: 11” and “SEQ ID NO: At least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more out of 12” (f) “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more out of SEQ ID NO: 13” and “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more out of SEQ ID NO: 14” At least one of the group consisting of “nucleotide” and at least one of the group consisting of “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 15” and “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 16” 1 type (g) “oligonucleotide consisting of 15 or more bases of SEQ ID NO: 17 At least one of the group consisting of “reotide” and “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 18”, and “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 15” and “of SEQ ID NO: 16 At least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more” (h) “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 13” and “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 14” And at least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 15 or more bases of SEQ ID NO: 19” and “an oligonucleotide consisting of 15 or more bases of SEQ ID NO: 20” ( i) “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 21”, and , "An oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 22"
(J) “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 23” and “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 22”
(K) “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 24” and “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 22”
(L) “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 21” and “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 25”
(M) "an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 26" and "an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 25"
(N) “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 27” and “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 28”
(O) “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 29” and “oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 30”
(P) "an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 31" and "an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 30"
(Q) “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 32” and “an oligonucleotide consisting of 15 bases or more of SEQ ID NO: 33”
[9] The detection method according to [7] or [8], wherein the primer set is a combination of three primer pairs selected one by one from the following three groups (I) to (III): .
(I) A pair of oligonucleotides having the base sequence described in any of (a) to (d) above, or the base sequence described in any of (a) to (d) above Salmonella amplification primer pair selected from a pair of oligonucleotides having a complementary base sequence corresponding to (II) of an oligonucleotide having a base sequence described in any of (e) to (h) above For enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) amplification selected from a pair or a pair of oligonucleotides having a complementary base sequence corresponding to the base sequence described in any of (e) to (h) above Primer pair (III) A pair of oligonucleotides having the base sequence described in any of (i) to (q) above, or (i) above (10) Tm value of Shigella amplification primer pair [10] internal control (internal standard) selected from a pair of oligonucleotides having a complementary base sequence corresponding to the base sequence described in any of (q) The detection method according to any one of [2] to [9], wherein is higher than the Tm value of any amplification product of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), or Shigella.
[11] Any of [2] to [9], wherein the Tm value of the internal control (internal standard) is lower than the Tm value of any amplification product of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), or Shigella The detection method according to.
[12] Detect whether there are three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella including (A) to (D) below, and detect the three species separately Reagent for.
(A) Thermostable DNA polymerase (B) Primer set according to any of [7]-[9] (C) DNA synthesis substrate (deoxynucleotide triphosphate (dNTP)), and
(D) The reagent according to [12], further comprising (E) a buffer [13] containing at least one of the group consisting of magnesium ion, ammonium ion and potassium ion.
(E) Fluorescent intercalator
本発明により、電気泳動することなく、融解曲線解析によってサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を分離検出することが可能となった。これにより、従来よりも、迅速にサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の保菌の有無を検査することができ、さらにこれら３菌種の同定も可能であるため、食中毒原因菌の早期発見、食中毒原因菌の特定につなげることができる。 According to the present invention, it is possible to separate and detect three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella by melting curve analysis without performing electrophoresis. As a result, the presence or absence of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella can be examined more quickly than before, and further, these three species can be identified. It can be linked to discovery and identification of bacteria causing food poisoning.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌をマルチプレックスＰＣＲにて増幅し、融解曲線解析のＴｍ値によって、これら３菌種を分離検出することに特徴がある。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is characterized in that Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella are amplified by multiplex PCR, and these three species are separated and detected by the Tm value of melting curve analysis.
本発明の実施形態のひとつは、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および赤痢菌の３菌種が存在するかを検出する方法であり、かつ、前記３菌種を区別して検出する方法であって、次の（１）および（２）の工程を含む検出方法である。（以下、本明細書では、複数の菌種が存在するかを検出し、かつ、複数の菌種を区別して検出することを、「分離検出」とも呼ぶ。）
（１）前記３菌種をターゲットとするマルチプレックスＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を融解曲線解析によって検出する工程。
（２）融解曲線分析において、３菌種を増幅産物のＴｍ値の違いによって分離検出する工程。
One embodiment of the present invention is a method for detecting the presence of three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella, and a method for distinguishing and detecting the three species. Thus, the detection method includes the following steps (1) and (2). (Hereinafter, detecting in the present specification whether there are a plurality of bacterial species and distinguishing and detecting the plurality of bacterial species is also referred to as “separation detection”.)
(1) A step of detecting the obtained amplification product by melting curve analysis after performing multiplex PCR targeting the three bacterial species.
(2) In the melting curve analysis, a step of separating and detecting three bacterial species based on the difference in Tm values of the amplification products.
「マルチプレックスＰＣＲ」とは、同時に複数のターゲットを増幅することが可能な方法であり、複数のターゲットに対するプライマーセットをすべて混合し、ＰＣＲを行うことで実施される。すなわち本発明におけるマルチプレックスＰＣＲとは、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のそれぞれを増幅するためのプライマーをすべて混合し、ひとつの液でＰＣＲを行うことである。 “Multiplex PCR” is a method capable of simultaneously amplifying a plurality of targets, and is performed by mixing all primer sets for a plurality of targets and performing PCR. That is, the multiplex PCR in the present invention is to perform PCR with one solution by mixing all the primers for amplifying Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella.
本発明の特徴は、マルチプレックスＰＣＲ後の融解曲線解析において、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のそれぞれの増幅産物が異なるＴｍ値を与えることで、分離検出が可能になったという点である。融解曲線解析におけるＴｍ値とは、プライマーセットによって増幅した２本鎖ＤＮＡの５０％が、１本鎖になる温度である。すなわち、Ｔｍ値を決定する要因は増幅産物の２本鎖の結合の強さに依存しており、ＧＣ含量や、増幅長等によって左右されるため、増幅するターゲットによってＴｍ値を変えることが可能である。 The feature of the present invention is that, in the melting curve analysis after multiplex PCR, each amplification product of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella gave different Tm values, so that separation and detection became possible. Is a point. The Tm value in the melting curve analysis is a temperature at which 50% of the double-stranded DNA amplified by the primer set becomes a single strand. In other words, the factor that determines the Tm value depends on the strength of the double-stranded bond of the amplification product, and depends on the GC content, amplification length, etc., so the Tm value can be changed depending on the target to be amplified. It is.
本発明においてサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を増幅するためのプライマーセットは、３菌種のＴｍ値に差異が生じるように設計すればよく、より好ましくは、互いのＴｍ値にそれぞれ１℃以上、より好ましくは２℃以上、より好ましくは、３℃以上の差異が生じるようにプライマーを設計すればよい。この各増幅産物のＴｍ値は、各リアルタイムＰＣＲ装置、解析ソフトウェアにより求められる。 In the present invention, the primer set for amplifying three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella may be designed so that the Tm values of the three species differ, and more preferably, Primers may be designed so that there is a difference in Tm value of 1 ° C. or more, more preferably 2 ° C. or more, more preferably 3 ° C. or more. The Tm value of each amplification product is determined by each real-time PCR apparatus and analysis software.
プライマーについては、３菌種でＴｍ値に差異が生じるように設計する以外は限定されないが、増幅されるＤＮＡ断片の長さは、例えば２０〜１０００塩基、より好ましくは５０〜７００塩基、さらに好ましくは１００〜５００塩基が挙げられる。さらに、本発明におけるプライマーの長さとしては、好ましくは１３〜３５塩基であり、より好ましくは１６塩基以上であり、また、３０塩基以下が好ましい。 The primer is not limited except that the Tm value is designed to be different among the three bacterial species, but the length of the DNA fragment to be amplified is, for example, 20 to 1000 bases, more preferably 50 to 700 bases, still more preferably. Includes 100 to 500 bases. Furthermore, the length of the primer in the present invention is preferably 13 to 35 bases, more preferably 16 bases or more, and 30 bases or less.
また本発明に使用するプライマーセットは、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの群も検出できるようにするために、多くの群に共通の遺伝子を増幅しうるプライマーセットを用いることが好ましい。 The primer set used in the present invention uses a primer set capable of amplifying genes common to many groups so that any group of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella can be detected. It is preferable.
例えば、サルモネラとしては２菌種（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、及びＳ． ｂｏｎｇｏｒｉ）、６亜種、並びに血清型２５０１種が知られている。サルモネラを検出しようとする場合、細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡの遺伝子を増幅しうるプライマーセットを用いることが好ましい。 For example, as Salmonella, 2 bacterial species (S. enterica and S. bongori), 6 subspecies, and 2501 serotypes are known. When detecting Salmonella, it is preferable to use a primer set capable of amplifying the gene of the cell-invasive protein invA.
例えば、Ｏ−１５７をはじめとする腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）としてはベロ毒素としてＶＴ１、並びにＶＴ２、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ、及びＶＴ２ｖｐが知られている。腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）を検出しようとする場合、ＶＴ１及びＶＴ２の遺伝子をそれぞれ増幅しうるプライマーセットを用いることが好ましい。 For example, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) including O-157 is known as VT1, VT2, VT2vha, VT2vhb, and VT2vp as verotoxins. When detecting enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), it is preferable to use a primer set capable of amplifying VT1 and VT2 genes.
例えば、赤痢菌としてはＡ〜Ｄ群（Ａ群として１３種血清型；Ｂ群として６種血清型；Ｃ群として１８種血清型；Ｄ１群として１種血清型）が知られている。赤痢菌を検出しようとする場合、病原性因子ｉｐａＨの遺伝子を増幅しうるプライマーセットを用いることが好ましい。 For example, A to D groups (13 serotypes as group A; 6 serotypes as group B; 18 serotypes as group C; 1 serotype as group D1) are known as Shigella. When trying to detect Shigella, it is preferable to use a primer set that can amplify the gene of pathogenic factor ipaH.
サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの群も検出できるようにする方法として、複数のプライマーを使用することが可能である。例えば、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）を増幅するために、ＶＴ１増幅用のプライマーセットとＶＴ２増幅用のプライマーセットの計４本を腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）を増幅するためのプライマーセットとして使用することができる。 As a method for enabling detection of any group of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella, a plurality of primers can be used. For example, in order to amplify enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), a total of four primer sets for VT1 amplification and VT2 amplification are used as a primer set for amplifying enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). be able to.
また、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの群も検出できるようにするために縮重プライマーを使用することもできる。縮重プライマーを使用することで、いずれの群において可能性のある塩基配列をすべて含むようなプライマーを設計することが可能となる。 A degenerate primer can also be used to enable detection of any group of Salmonella, enterohemorrhagic E. coli (EHEC), and Shigella. By using degenerate primers, it is possible to design a primer that includes all possible base sequences in any group.
前記の条件を満たす、サルモネラを対象として増幅するためのプライマーペアとして、下記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアが挙げられる。
（ａ）配列番号１と配列番号２とからなる群のうち少なくとも１種、および、配列番号３
（ｂ）配列番号１と配列番号２とからなる群のうち少なくとも１種、および、配列番号４
（ｃ）配列番号１と配列番号２とからなる群のうち少なくとも１種、および、配列番号５と配列番号６とからなる群のうち少なくとも１種
（ｄ）配列番号７と配列番号８とからなる群のうち少なくとも１種、および、配列番号５と配列番号６とからなる群のうち少なくとも１種
As a primer pair for amplifying Salmonella that satisfies the above conditions, a pair of oligonucleotides having a base sequence described in any of the following (a) to (d) can be mentioned.
(A) at least one of the group consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3
(B) at least one of the group consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 4
(C) at least one of the group consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and at least one of the group consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 (d) from SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 And at least one of the group consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6
前記の条件を満たす腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）を対象として増幅するためのプライマーペアとして、下記の（ｅ）から（ｈ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアが挙げられる。
（ｅ）配列番号９と配列番号１０とからなる群のうち少なくとも１種、および、配列番号１１と配列番号１２とからなる群のうち少なくとも１種
（ｆ）配列番号１３と配列番号１４とからなる群のうち少なくとも１種、および、配列番号１５と配列番号１６とからなる群のうち少なくとも１種
（ｇ）配列番号１７と配列番号１８とからなる群のうち少なくとも１種、および、配列番号１５と配列番号１６とからなる群のうち少なくとも１種
（ｈ）配列番号１３と配列番号１４とからなる群のうち少なくとも１種、および、配列番号１９と配列番号２０とからなる群のうち少なくとも１種
Examples of a primer pair for amplifying enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) satisfying the above conditions include a pair of oligonucleotides having a base sequence described in any of (e) to (h) below: It is done.
(E) at least one of the group consisting of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, and at least one of the group consisting of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 (f) from SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 And at least one of the groups consisting of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 (g) at least one of the groups consisting of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 15 and at least one of the group consisting of SEQ ID NO: 16 (h) at least one of the group consisting of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14, and at least among the group consisting of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 1 type
前記の条件を満たす赤痢菌を対象として増幅するためのプライマーペアとして、下記の（ｉ）〜（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアが挙げられる。
（ｉ）配列番号２１、および、配列番号２２
（ｊ）配列番号２３、および、配列番号２２
（ｋ）配列番号２４、および、配列番号２２
（ｌ）配列番号２１、および、配列番号２５
（ｍ）配列番号２６、および、配列番号２５
（ｎ）配列番号２７、および、配列番号２８
（ｏ）配列番号２９、および、配列番号３０
（ｐ）配列番号３１、および、配列番号３０
（ｑ）配列番号３２、および、配列番号３３
As a primer pair for amplifying Shigella that satisfies the above conditions, a pair of oligonucleotides having a base sequence described in any of the following (i) to (q) can be mentioned.
(I) SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22
(J) SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 22
(K) SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 22
(L) SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 25
(M) SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 25
(N) SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28
(O) SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30
(P) SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 30
(Q) SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33
前記の３菌種のそれぞれを対象として増幅するためのプライマーペアは、前記の（ａ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列に対応する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択されるものであってもよい。 The primer pair for amplifying each of the three bacterial species is a pair of oligonucleotides having a complementary base sequence corresponding to the base sequence described in any of (a) to (q) above. May be selected.
また、前記の３菌種のそれぞれを対象として増幅するためのプライマーペアは、その少なくとも一つが、前記の（ａ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列の一部分から構成されていてもよい。たとえば、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および赤痢菌のうち少なくとも１組のプライマーペアにおいて、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーが、各配列番号のうち１５塩基以上、より好ましくは１８ 塩基以上からなるオリゴヌクレオチドから構成されていればよい。
別の言い方をすると、配列番号１から３３に記載されている塩基配列のうち一番長いものは２３塩基、一番短いものは１６塩基であるが、前記のフォワードプライマーまたはリバースプライマーの長さは、各塩基配列で示される配列の全長を有することが最も好ましい。前記「塩基配列の一部分」については、全長が１５塩基未満とならない範囲内であれば、その配列の連続性を維持する前提で、少なくともいずれかの末端を欠いてもよい。その場合の塩基配列の長さは、長いほうが好ましい。例えば配列番号１であれば１５塩基以上であれば良いが、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、より好ましくは１９塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２１塩基以上、より好ましくは２２塩基以上、最も好ましくは２３塩基である。また、例えば配列番号２３であれば１５塩基以上であれば良いが、好ましくは１６塩基である。
さらに、前記の３菌種のそれぞれを対象として増幅するためのプライマーペアは、前記のいずれかに記載されている塩基配列を含めば、いずれかの末端に数塩基が付加されていてもよい。いずれかの末端に塩基を付加することで、プライマーの全長が、１８塩基以上となることが好ましく、より好ましくは、２０塩基以上、より好ましくは、２３塩基以上となることが好ましい。この場合、プライマー全長の上限は、３５塩基であることが好ましく、さらに好ましくは３２塩基、さらに好ましくは３０塩基である。
Further, at least one of the primer pairs for amplifying each of the above three bacterial species is composed of a part of the base sequence described in any one of (a) to (q) above. May be. For example, in at least one primer pair of Salmonella, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella, the forward primer and / or the reverse primer consists of 15 bases or more, more preferably 18 bases or more of each SEQ ID NO: What is necessary is just to be comprised from the oligonucleotide.
In other words, the longest of the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 33 is 23 bases and the shortest is 16 bases. The length of the forward primer or reverse primer is as follows. Most preferably, it has the full length of the sequence represented by each base sequence. As long as the “part of the base sequence” is within a range in which the total length is not less than 15 bases, at least one of the ends may be missing on the premise of maintaining the continuity of the sequence. In that case, the length of the base sequence is preferably longer. For example, in the case of SEQ ID NO: 1, it may be 15 bases or more, more preferably 16 bases or more, more preferably 17 bases or more, more preferably 18 bases or more, more preferably 19 bases or more, more preferably 20 bases or more. More preferably 21 bases or more, more preferably 22 bases or more, and most preferably 23 bases. For example, in the case of SEQ ID NO: 23, it may be 15 bases or more, preferably 16 bases.
Furthermore, the primer pair for amplifying each of the above three bacterial species may have several bases added to either end, as long as it includes the base sequence described in any of the above. By adding a base to any terminal, the total length of the primer is preferably 18 bases or more, more preferably 20 bases or more, and more preferably 23 bases or more. In this case, the upper limit of the total primer length is preferably 35 bases, more preferably 32 bases, and even more preferably 30 bases.
本発明の３菌種の分離検出方法においては、少なくとも１菌種を対象とした増幅のために前記のプライマーペアのいずれかを用いることができる。サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種からひとつずつ選択される組み合わせを使用することがより好ましい。また、使用するプライマーは、変異に対応するために、配列番号１〜配列番号３３に示す配列の数塩基の置換が含まれていてもよい。ここでいう数塩基とは、１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは４塩基以下、より好ましくは３塩基以下、より好ましくは２塩基以下、より好ましくは１塩基以下である。 In the method for separating and detecting three bacterial species of the present invention, any of the above primer pairs can be used for amplification targeting at least one bacterial species. More preferably, a combination selected from Salmonella, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella is selected one by one. Further, the primer to be used may contain substitution of several bases of the sequences shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 33 in order to cope with the mutation. The term “several bases” as used herein refers to 10 bases or less, more preferably 5 bases or less, more preferably 4 bases or less, more preferably 3 bases or less, more preferably 2 bases or less, more preferably 1 base or less.
本発明に用いるプライマー濃度は限定されず、適宜調整すればよいが、ピークが高くなる増幅産物を与えるプライマー比を下げ、ピークのバランスを揃えることが好ましい。また、必要であればプライマーの濃度を通常のＰＣＲを行う場合よりも高濃度とする。 The primer concentration used in the present invention is not limited and may be adjusted as appropriate. However, it is preferable to lower the primer ratio that gives an amplification product that increases the peak and to balance the peak. If necessary, the concentration of the primer is set higher than that in the case of performing normal PCR.
本発明では偽陰性発生を防止させるためにインターナルコントロール（内部標準）を含むことがより好ましい。陰性の場合、インターナルコントロール（内部標準）の増幅のみが認められ、ＰＣＲが成功したことを確認することができる。一方、ＰＣＲの阻害や試薬の添加忘れが発生した場合は、インターナルコントロール（内部標準）の増幅が認められないため、ＰＣＲが失敗したことが確認できる。 In the present invention, it is more preferable to include an internal control (internal standard) in order to prevent the occurrence of false negatives. In the negative case, only the amplification of the internal control (internal standard) is observed, and it can be confirmed that PCR was successful. On the other hand, when PCR inhibition or forgetting to add a reagent occurs, amplification of the internal control (internal standard) is not recognized, so it can be confirmed that PCR has failed.
インターナルコントロール（内部標準）は、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種のＴｍ値と異なれば、特に限定されない。インターナルコントロール（内部標準）のＴｍ値は、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの増幅産物とも異なるＴｍ値を与えるものであればよく、たとえば３菌種すべてのＴｍ値に対して、それより低温であっても、高温であってもよい。また、３菌種のいずれかの中間でもよい。 The internal control (internal standard) is not particularly limited as long as it differs from the Tm values of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella. The Tm value of the internal control (internal standard) may be any Tm value different from any of the amplification products of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella. On the other hand, the temperature may be lower or higher. Moreover, the intermediate | middle of either of three bacterial species may be sufficient.
インターナルコントロール（内部標準）として、検査対象に含まれないターゲットとそのターゲットを増幅するためのプライマーセットを用いればよい。また、インターナルコントロール用にプライマーを別に添加せず、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌増幅用プライマーを用いて増幅した場合に３菌種とは異なるＴｍ値を与えるテンプレートのみを添加し、インターナルコントロール（内部標準）としてもよい。 As an internal control (internal standard), a target not included in the test target and a primer set for amplifying the target may be used. In addition, without adding a primer for internal control, only a template that gives a Tm value different from those of the three bacterial species when amplified using Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella amplification primers is added. However, internal control (internal standard) may be used.
本発明の３菌種の分離検出方法において、マルチプレックスＰＣＲ反応時の組成は、Ｔｍ値の異なる増幅産物を与える特異的プライマー以外の組成成分は、特に限定されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も限定されるものではない。前記組成成分として、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ合成基質（たとえば、１種類以上のデオキシヌクレオチド三リン酸または、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体）、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。 In the method for separating and detecting the three bacterial species of the present invention, the composition component in the multiplex PCR reaction is not particularly limited except for specific primers that give amplification products having different Tm values, and conventionally known components can be mentioned. The ratio is not limited. As the composition component, at least one selected from the group consisting of a heat-resistant DNA polymerase, a DNA synthesis substrate (for example, one or more types of deoxynucleotide triphosphates or derivatives of deoxynucleotide triphosphates), a buffer, and a salt. It is preferable to contain.
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されず、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体的には、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。 The thermostable DNA polymerase is not particularly limited, and a conventionally known thermostable bacteria-derived polymerase can be used. Specifically, Taq DNA polymerase and Tth DNA polymerase belonging to family A (PolI type), KOD DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Pwo DNA polymerase, Ultimate DNA polymerase, PrimeSTAR (registered trademark) belonging to family B (α type) Examples include DNA polymerase. The thermostable DNA polymerase may be a mutant having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, added or inserted in the amino acid sequence, and is not particularly limited.
緩衝剤としては、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。
また、反応バッファー中には、１．０〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭ程度の濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
また、必要に応じて、界面活性剤を含んでいてもよい。
Examples of buffering agents include Tris (TRIS), Tricine (TRICINE), Bis-Tricine (BIS-TRICINE), Hepes (HEPES), Mops (MOPS), Tes (TES), Tapes (TAPS), Pipes (PIPES). ), And caps (CAPS), but are not particularly limited.
The reaction buffer preferably contains Mg 2+ at a concentration of about 1.0 to 5 mM, preferably about 1.5 to 2.5 mM. Furthermore, KCl may be included.
Moreover, you may contain surfactant as needed.
さらに、反応バッファー中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で添加すればよい。 Furthermore, the reaction buffer may contain albumin, glycerol, heparin, trehalose, betaine and the like. What is necessary is just to add these addition ratios in the range which does not inhibit PCR reaction.
本発明は、融解曲線解析のＴｍ値によって、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を検出することに特徴がある。そのため、増幅産物の検出には、蛍光インターカレーターの添加が必要である。この蛍光インターカレーターの添加は、ＰＣＲ反応液にあらかじめ添加してもよく、ＰＣＲ後添加してもよいが、簡便さの観点からＰＣＲ反応液にあらかじめ添加しておくことが好ましい。 The present invention is characterized by detecting three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella by the Tm value of melting curve analysis. Therefore, the addition of a fluorescent intercalator is necessary for detection of the amplification product. The fluorescent intercalator may be added to the PCR reaction solution in advance or after the PCR, but it is preferably added to the PCR reaction solution in advance from the viewpoint of simplicity.
蛍光インターカレーターとは、二本鎖ＤＮＡに挿入（インターカレート）することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに挿入して蛍光を発する色素である。 A fluorescent intercalator is any molecule that binds to a nucleic acid in a reversible, non-covalent manner by insertion (intercalation) into double-stranded DNA, thereby indicating the presence and quantity of the nucleic acid. Point to. In general, an intercalator is a dye that emits fluorescence when inserted into double-stranded DNA.
多数のインターカレーターが当技術分野で公知である。例えば、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＢＯＢＯおよびＰＯＰＯ）、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＥＲ、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標） ＤＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯＸ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ヨウ化プロピジウム、Ａｃｒｉｄｉｎｅ ｏｒａｎｇｅ、７−アミノ−アクチノマイシン Ｄ、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標） ＧＲ、ＳＹＴＯ（登録商標）９， ＳＹＴＯ（登録商標）１０、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１４、ＳＹＴＯ（登録商標）８２、ＦＵＮ−１などが挙げられるが、特に限定されるものではない。 A number of intercalators are known in the art. For example, Ethidium bromide, cyanine dyes (eg, TOTO (registered trademark), YOYO (registered trademark), BOBO and POPO), SYBR (registered trademark) Green I, SYBR (registered trademark) Green ER, SYBR (registered trademark) Green Gold , SYBR (R) DX, PicoGreen (R), LCGreen (R), EvaGreen (R), SYTOX (R) Green, ResoLight, propidium iodide, Acidine orange, 7-amino-actinomycin D, CyQUANT (registered trademark) GR, SYTO (registered trademark) 9, SYTO (registered trademark) 10, SYTO (registered trademark) 13, SYTO (registered trademark) 14, SYTO (registered trademark) 2, etc. FUN-1, and the like, but not particularly limited.
本発明におけるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌を分離検出するためには、融解曲線解析が可能な機器を使用する。融解曲線解析を実施可能な機器として、リアルタイムＰＣＲ機器が挙げられるが限定されるものではない。具体例としては、ロッシュ・ダイアグノスティック社のライトサイクラー（登録商標）、アプライドバイオシステム社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００ / ７７００、７５００ / ７５００ ＦＡＳＴ リアルタイムＰＣＲシステム、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム、ＳｔｅｐＯｎｅ / ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム、キアゲン社のＲｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ、タカラバイオ社のＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド社のＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎ、ＣＦＸ３８４ Ｔｏｕｃｈ、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ、アジレント・テクノロジー社のＭｘ３０００Ｐ、Ｍｘ３００５Ｐ、Ｍｘ４０００等が挙げられる。また、ＰＣＲ反応については、上記のリアルタイムＰＣＲ機器を使用してもよいが、融解曲線解析と独立して、サーマルサイクラーを使用してもよい。 In order to separate and detect Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella in the present invention, an instrument capable of melting curve analysis is used. A device capable of performing a melting curve analysis includes, but is not limited to, a real-time PCR device. Specific examples include Light Cycler (registered trademark) of Roche Diagnostics, ABI PRISM (registered trademark) 7000/7700, 7500/7500 FAST real-time PCR system, 7900HT Fast real-time PCR system, StepOne / StepOnePlus real-time PCR system, Qiagen's Rotor Gene, Takara Bio's Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System, Bio-Rad's MiniOpticon, CFX384 Touch, CFX96 000M Is mentioned. As for the PCR reaction, the above-mentioned real-time PCR apparatus may be used, but a thermal cycler may be used independently of the melting curve analysis.
ＰＣＲにおける温度サイクルは、使用するプライマーに応じて適宜設定することができる。また、融解曲線解析については、取得するデータの温度範囲は、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌、インターナルコントロール（内部標準）を含む場合はインターナルコントロール（内部標準）のＴｍ値の範囲内であればよく、温度上昇速度（データポイント数）等は、各リアルタイムＰＣＲ装置に適した条件を設定すればよい。 The temperature cycle in PCR can be appropriately set according to the primers used. In addition, for melting curve analysis, the temperature range of the acquired data is Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Shigella, internal control (internal standard) Tm value of internal control (internal standard) The temperature rise rate (number of data points) and the like may be set to conditions suitable for each real-time PCR apparatus.
本発明の分離検出方法は、食中毒原因菌であるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を検出することが目的であるため、検査対象は特に限定されないが、保菌者を早期に発見の観点では、便検体を使用することが好ましい。たとえば、検便検体を使用することができる。検便検体とは、便から採取された便検体をいう。便検体の採取方法等は、特に限定されないが、例えば便の一部を掻き取ることによって得ることができる。検便検体は、検便のために採取されたものを用いることができる。 The separation detection method of the present invention is intended to detect Salmonella, which is a food poisoning causative bacterium, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella, so the test target is not particularly limited. From the viewpoint of early detection, it is preferable to use a stool specimen. For example, a stool specimen can be used. A stool specimen refers to a stool specimen collected from a stool. The method for collecting a stool specimen is not particularly limited, and can be obtained, for example, by scraping a part of the stool. Samples collected for stool can be used as stool samples.
本発明において便検体は特に限定されない。例えば、哺乳類の便から採取された便検体が挙げられる。哺乳類としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等を挙げることができる。また、本発明が適用される便検体は、保存などの目的で、ＤＮＡの破壊が抑えられていることを前提に、希釈・濾過・その他の物理化学的処理が施されたものであってもよい。 In the present invention, the stool specimen is not particularly limited. For example, a stool specimen collected from a mammalian stool can be mentioned. Although it does not specifically limit as a mammal, For example, a human, a cow, a pig, a dog, a cat etc. can be mentioned. Further, the stool specimen to which the present invention is applied may have been subjected to dilution, filtration, and other physicochemical treatment on the premise that DNA destruction is suppressed for the purpose of storage and the like. Good.
本発明は、この便検体から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートして増幅することができる。このゲノムＤＮＡの分離精製は、限定されるものではないが、商業的に入手可能なＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ −Ｇｅｎｏｍｅ−（ＴＯＹＯＢＯ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ）、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（プロメガ）、ＦｌｅｘｉＧｅｎｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ（キアゲン）等を用いることができる。 In the present invention, genomic DNA extracted from the stool specimen can be amplified as a template. The separation and purification of this genomic DNA is not limited, but commercially available MagExtractor-Genome- (TOYOBO), NucleoSpin (registered trademark) Tissue (Takara Bio), Wizard (registered trademark) Genomic DNA Purification Kit (Promega), FlexiGene DNA Kit (Qiagen) and the like can be used.
本発明では前述の通り、抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いることができるが、検査の簡便性、迅速性の観点から、ゲノムＤＮＡの分離精製を行っていない便検体を使用することが好ましい。例えば、便検体をそのまま懸濁させた溶液を熱処理、遠心分離後、上清をテンプレートとする方法が挙げられる。 In the present invention, as described above, the extracted genomic DNA can be used as a template, but it is preferable to use a stool specimen that has not been subjected to separation and purification of genomic DNA from the viewpoint of ease of testing and rapidity. For example, a method in which a solution in which a stool specimen is suspended as it is is heat-treated and centrifuged, and then the supernatant is used as a template.
さらに、多検体の検査が必要な場合は、便検体としてプール検体を用いることがより好ましい。本発明において、プール検体とは、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された便検体からなるものである。 Furthermore, when multiple specimen tests are required, it is more preferable to use a pool specimen as a stool specimen. In the present invention, the pool sample is composed of stool samples collected from stools of X types (X represents an integer of 2 or more).
ここでいうＸ種の便とは、Ｘ種の個体が***したそれぞれの便であってもよいし、同一個体が***したＸ種の便であってもよい。Ｘについては、特に限定されないが、検出しようとするサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種の検出率（１００個の便から採取された便検体のうち、１個の便検体においてその細菌類が検出されるとき、検出率が１％であるとする。）に基づいて最適な数を設定することができる。例えば便検体としてヒトの便から採取された便検体を用い、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検出率が約０．０５％であったとする。この場合、１０００種の便から採取された検便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、これら３菌種が検出される確率は、１０００（検体）×０．０５％＝５０％となる。したがって、順次別々のプール検体を入れ替えて検出をすると、２回に１回の確率で３菌種が検出されることになる。同じ場合に、１００種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、２０回に１回の確率で３菌種が検出されることになる。同じ場合に、１０種の便から採取された便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、２００回に１回の確率で３菌種が検出されることになる。順次別々のプール検体を入れ替えて検出をする場合、どの程度の確率でサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌が検出されれば作業を効率的に進めることができるかを考慮して、プール検体に含まれる便検体の種類を決定することができる。通常は、数十回に１回の確率で３菌種が検出されるようにするのが好ましい。そのため、好ましくは、Ｘが２０以上、より好ましくは３０以上であり、より好ましくは ４０以上であり、より好ましくは５０以上である。 The X-type stool referred to here may be each stool excreted by the X-type individual, or may be X-type stool excreted by the same individual. X is not particularly limited, but the detection rate of Salmonella to be detected, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Shigella species (of one stool sample out of 100 stool samples) When the bacteria are detected in the sample, the detection rate is assumed to be 1%). For example, a stool sample collected from human stool is used as a stool sample, and the detection rate of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella is about 0.05%. In this case, if detection is performed using a pooled specimen made of stool specimens collected from 1000 types of stool, the probability that these three bacterial species will be detected is 1000 (sample) × 0.05% = 50%. . Therefore, when different pool samples are sequentially replaced and detected, three bacterial species are detected with a probability of once every two times. In the same case, if detection is performed using a pooled sample made of stool samples collected from 100 types of stool, three bacterial species are detected with a probability of once in 20 times. In the same case, if detection is carried out using a pooled sample consisting of stool samples collected from 10 types of stool, three bacterial species will be detected with a probability of once in 200 times. Considering the probability of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Shigella can be efficiently proceeded when detecting by sequentially replacing different pool specimens, The type of stool specimen contained in the pool specimen can be determined. Usually, it is preferable to detect three bacterial species with a probability of once every several tens of times. Therefore, X is preferably 20 or more, more preferably 30 or more, more preferably 40 or more, and more preferably 50 or more.
ＰＣＲに用いる検便検体の添加割合は、適切にＰＣＲが行われればよく特に限定されないが、例えば、１〜２０ｖ／ｖ％の範囲内で適宜調整することができる。 The addition ratio of the stool specimen used for PCR is not particularly limited as long as PCR is appropriately performed. For example, it can be appropriately adjusted within a range of 1 to 20 v / v%.
本発明の実施形態のひとつは、以下の（Ａ）〜（Ｄ）を含む、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および赤痢菌の３菌種の分離検出試薬であり、さらに（Ｅ）を含む試薬であってもよい。
（Ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および赤痢菌の３菌種の増幅産物のＴｍ値が互いに１℃以上離れるように設計された３組のプライマーペアからなるプライマーセット
（Ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、および、
（Ｄ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオンおよびカリウムイオンからなる群のうち１種以上を含む緩衝液
（Ｅ）蛍光インターカレーター
One of the embodiments of the present invention is a reagent for separating and detecting Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella, which includes the following (A) to (D), and further includes (E): It may be a reagent.
(A) Thermostable DNA polymerase (B) Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and three primer pairs designed so that the Tm values of the amplification products of three species of Shigella are separated from each other by 1 ° C or more Primer set (C) DNA synthesis substrate (deoxynucleotide triphosphate (dNTP)), and
(D) Buffer solution containing one or more of the group consisting of magnesium ion, ammonium ion and potassium ion (E) Fluorescent intercalator
本発明の試薬の組成に関しては前記（Ｂ）を用いること以外には特に限定されない。たとえば、本発明の方法のところで説明・例示したとおりである。 The composition of the reagent of the present invention is not particularly limited except that (B) is used. For example, as described and exemplified in the method of the present invention.
また、本発明の試薬の形態に関しても特に限定されない。たとえば、キットの形態であってもよく、キットの形態は特に限定されない。
前記キットは、１つの組成物に上記で説明した分離検出方法を実施するために必要なすべての物質を含むものであっても良いし、２種類以上の複数の組成物を組合せたものであって、使用時に適宜混合することで分離検出方法を実施するための反応液を調製できるよう構成されているものであっても良い。その際に各組成物の構成は溶液であっても固形物（粉末、凍結乾燥品など）であっても良い。固形物の場合は使用時に精製水または予め調製された別の溶液組成物に溶解して調製できるよう構成されていれば良い。
Moreover, it does not specifically limit regarding the form of the reagent of this invention. For example, the form of a kit may be sufficient and the form of a kit is not specifically limited.
The kit may contain all the substances necessary for carrying out the separation detection method described above in one composition, or a combination of two or more types of compositions. In addition, it may be configured such that a reaction liquid for carrying out the separation detection method can be prepared by mixing appropriately at the time of use. In this case, the composition of each composition may be a solution or a solid (powder, lyophilized product, etc.). In the case of a solid material, it may be configured so that it can be prepared by dissolving in purified water or another solution composition prepared in advance.
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, based on an Example, this invention is demonstrated more concretely. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例１：サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の分離検出
サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種のＴｍ値が異なるように配列番号１から配列番号３３に示すプライマーを設計した。また、偽陽性を防ぐため、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種よりもＴｍ値が高温になるインターナルコントロール増幅用プライマー（配列番号３４、配列番号３５）と、Ｔｍ値が低温になるインターナルコントロール増幅用プライマー（配列番号３６、３７）を設計した。このインターナルコントロール増幅用プライマーは、ｐＢＲ３２２をテンプレートとする。
Example 1: Separation and detection of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Shigella Bacteria From SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 33 so that Tm values of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella are different. The primers shown were designed. In addition, in order to prevent false positives, internal control amplification primers (SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35) having a Tm value higher than those of the three species Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella, Tm Primers for internal control amplification (SEQ ID NOs: 36 and 37) were designed to reduce the value. This internal control amplification primer uses pBR322 as a template.
本実施例に用いたプライマーセットの組み合わせを表１、表２、表３に示す。表１では、インターナルコントロールとしてＴｍ値が３菌種よりも高温であり、かつ腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用プライマーとして、配列番号９、１０、１１、１２を用いた場合である。 Tables 1, 2 and 3 show combinations of primer sets used in this example. In Table 1, the Tm value is higher than that of the three bacterial species as an internal control, and SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12 are used as primers for intestinal hemorrhagic Escherichia coli (EHEC) amplification.
表２では、インターナルコントロールとしてＴｍ値が３菌種よりも高温であるが、表１とは異なり、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用プライマーも変えたプライマーセットである。 In Table 2, the Tm value is higher than that of the three bacterial species as an internal control, but unlike Table 1, it is a primer set in which the enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) amplification primer is also changed.
表３では、インターナルコントロールとしてＴｍ値が３菌種よりも低温であるプライマーセットである。 In Table 3, it is a primer set whose Tm value is a temperature lower than three microbial species as an internal control.
本実施例では、ＰＣＲ試薬としてＢｌｅｎｄ Ｔａｑ −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）、蛍光インターカレーターとして、ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を使用した。また、表１、２、３に記載のプライマー濃度は、それぞれの菌を検出するプライマー濃度が１．２μＭとなるように各プライマーで均等に分配し添加した。すなわち、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌を検出するプライマーセットとして、ＰＣＲ反応液に３．６μＭのプライマーが含まれることになる。また、インターナルコントロール増幅用プライマー濃度は、フォワードプライマー、リバースプライマーそれぞれ０．５μＭとし、テンプレートとして、２．５μＭ/μＬのｐＢＲ３２２を添加した。 In this example, Blend Taq-Plus- (TOYOBO) was used as a PCR reagent, and EvaGreen (Biotium) was used as a fluorescent intercalator. The primer concentrations shown in Tables 1, 2, and 3 were evenly distributed and added so that the primer concentration for detecting each bacterium was 1.2 μM. That is, as a primer set for detecting Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella, 3.6 μM of primer is included in the PCR reaction solution. The primer concentration for internal control amplification was 0.5 μM each for the forward primer and the reverse primer, and 2.5 μM / μL of pBR322 was added as a template.
本実施例では上記ＰＣＲ反応液を２０μＬ系にて調製した。この２０μＬの反応液に、検査対象としてサルモネラ、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、赤痢菌１００コピーをスパイクした陰性糞便を１０％になるように水で懸濁、９５℃、５分熱処理し遠心上清液を２μＬ添加した。また、陰性糞便の熱処理遠心上清液についても同様に２０μＬ反応系に２μＬ添加した。 In this example, the PCR reaction solution was prepared in a 20 μL system. Suspend Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli O157, and negative stool spiked with 100 copies of Shigella in 10% of this reaction solution in water to 10%, heat-treat at 95 ° C for 5 minutes, and centrifuge supernatant 2 μL was added. Similarly, 2 μL of the negative stool heat-treated centrifugal supernatant was added to the 20 μL reaction system.
調製したサンプルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎにて、９４℃、２分の初期変性の後、変性：９４℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、３０秒を４０サイクル繰り返すＰＣＲを実施後、融解曲線解析を０．５℃／Ｓｔｅｐにて実施した。 The prepared sample was subjected to an initial denaturation at 94 ° C. for 2 minutes in Bio-Rad MiniOpticon, followed by 40 cycles of denaturation: 94 ° C., 10 seconds, annealing: 55 ° C., 15 seconds, extension: 68 ° C., 30 seconds. After performing PCR, melting curve analysis was performed at 0.5 ° C./Step.
これらの結果を図１、２、３、４に示す。プライマーセット１から３５のいずれのプライマーセットを使用した場合でも、Ｔｍ値がサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種で異なるように設計すれば、３菌種の分離検出が可能であることを確認することができた。 These results are shown in FIGS. Even if any primer set from primer set 1 to 35 is used, if the Tm value is designed to be different for Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella, three species can be separated and detected. I was able to confirm that it was possible.
実施例２：陽性検体を用いた３菌種の分離検出
本実施例では、表１に示すプライマーセット６、表３に示すプライマーセット３１、３２を用いて、陽性実検体を実施例１に記載のＰＣＲ反応液、サイクル条件にて検査した。検査対象は、陽性実検体を１０％程度になるように水で懸濁し、懸濁液を９５℃、５分熱処理し、遠心分離後、上清を使用した。また、コントロールとして、糞便の代わりに、精製したサルモネラ、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、赤痢菌ゲノムＤＮＡ１００コピーを鋳型として増幅を実施した。
Example 2: Separation and detection of three bacterial species using positive samples In this example, positive actual samples are described in Example 1 using primer set 6 shown in Table 1 and primer sets 31 and 32 shown in Table 3. The PCR reaction solution was tested under cycle conditions. As a test object, a positive real specimen was suspended in water so as to be about 10%, the suspension was heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, centrifuged, and the supernatant was used. As a control, amplification was performed using purified Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli O157, and Shigella genomic DNA 100 copies as a template instead of feces.
これらの結果を図５に示す。その結果、糞便添加なしのゲノムＤＮＡで分離検出が可能であり、糞便を含む陽性実検体でも３菌種の分離検出が可能であることが示された。この結果より、３菌種がＴｍ値によって分離検出が可能なプライマーセットを設計すれば、検便陽性検体から３菌種を分離検出が可能であることが確認できた。 These results are shown in FIG. As a result, it was shown that separation and detection can be performed with genomic DNA without the addition of feces, and that separation and detection of three bacterial species can be performed even with positive real specimens containing feces. From this result, it was confirmed that if a primer set capable of separating and detecting three bacterial species based on the Tm value was designed, it was possible to separate and detect three bacterial species from a stool-positive sample.
実施例３：プール糞便を用いた３菌種の分離検出
実施例３では、陽性実検体を１検体含むプール糞便について、実施例１に記載のＰＣＲ反応液、サイクル条件にて検査した。プライマーは、表１に示すプライマーセット６、表３に示すプライマーセット３１、３２を使用した。プール糞便は、採便管内の糞便少量を、滅菌水（1ｍＬ程度）の入った試験管に懸濁したものを採便管毎に調製し、２０個と５０個の検便検体をそれぞれ等量ずつ（数μＬ程度）1本のチューブにプールした検便検体を、９５℃、５分熱処理し、遠心分離後の上清を使用した。
Example 3 Separation and Detection of Three Bacterial Species Using Pool Feces In Example 3, pool feces containing one positive real sample were examined using the PCR reaction solution and cycle conditions described in Example 1. As the primer, primer set 6 shown in Table 1 and primer sets 31 and 32 shown in Table 3 were used. Pool stool is prepared by suspending a small amount of stool in a stool collection tube in a test tube containing sterilized water (about 1 mL) for each stool collection tube. The stool specimen pooled in one tube (about several μL) was heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, and the supernatant after centrifugation was used.
これらの結果を図６に示す。その結果、Ｔｍ値によってサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種の分離検出が可能な方法を用いれば、プール糞便に対しても同様な結果が得られ、より簡便、迅速に多検体のサンプルを検査できることが示された。 These results are shown in FIG. As a result, similar results can be obtained for pooled stool by using a method that allows separation and detection of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella by the Tm value. It has been shown that multiple samples can be tested.
本発明により、より簡便、迅速に食中毒原因菌のサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌を検出するだけでなく、３菌種の分離検出も可能となった。このことから、簡便、迅速に３菌種のどの菌を保菌しているかを同定することができるため、食中毒の予防、保菌者のその後の対応を決める上で有意義である。さらに、本発明では、検便検体を検査対象とするだけでなく、プール糞便からの検出が可能であるため、より多検体を迅速に検査することが可能である。そのため、プール糞便から３菌種の分離検出を行うことで、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の保菌者スクリーニングに応用することができる。 According to the present invention, not only Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella, which are food poisoning causative bacteria, can be detected more easily and quickly, but also the separation and detection of three bacterial species can be performed. From this, it is possible to easily and quickly identify which of the three bacterial species is carried, which is meaningful in preventing food poisoning and determining the subsequent response of the carrier. Furthermore, according to the present invention, not only the stool specimen but also the detection from the pooled stool is possible, so that more specimens can be examined more quickly. Therefore, by separating and detecting three bacterial species from pool feces, it can be applied to carrier screening for Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella.
Claims (12)
（１）前記３菌種をターゲットとする少なくとも３組のプライマーペアをプライマーセットとして用いるマルチプレックスＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を融解曲線解析によって検出する工程であって、少なくとも１つのプライマーペアが、以下の（ａ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペア、または、前記の（ａ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列に対応する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択される、工程：
（ａ）「配列番号１のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号３のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｂ）「配列番号１のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号４のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｃ）「配列番号１のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号５のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号６のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｄ）「配列番号７のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号８のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号５のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号６のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｅ）「配列番号９のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１０のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号１１のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１２のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｆ）「配列番号１３のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１４のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号１５のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１６のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｇ）「配列番号１７のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１８のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号１５のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１６のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｈ）「配列番号１３のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号１４のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号１９のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２０のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種
（ｉ）「配列番号２１のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２２のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｊ）「配列番号２３のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２２のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｋ）「配列番号２４のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２２のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｌ）「配列番号２１のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２５のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｍ）「配列番号２６のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２５のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｎ）「配列番号２７のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号２８のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｏ）「配列番号２９のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号３０のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｐ）「配列番号３１のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号３０のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（ｑ）「配列番号３２のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号３３のうち１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」
（２）融解曲線分析において、３菌種を増幅産物のＴｍ値の違いによって分離検出する工程。 A method for detecting the presence of three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella, and a method for distinguishing and detecting the three species, comprising the following (1) and A detection method comprising the step (2).
(1) A step of performing multiplex PCR using at least three primer pairs targeting the three bacterial species as a primer set, and then detecting the obtained amplification product by melting curve analysis , comprising at least one The primer pair is an oligonucleotide pair having the base sequence described in any of (a) to (q) below, or the base described in any of (a) to (q) above Selected from a pair of oligonucleotides having complementary base sequences corresponding to the sequence:
(A) at least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 1” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 2,” and “of SEQ ID NO: 3 Oligonucleotide consisting of 18 bases or more "
(B) at least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 1” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 2”; Oligonucleotide consisting of 18 bases or more "
(C) at least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 1” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 2”; At least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide comprising 18 bases or more” and “an oligonucleotide comprising 18 bases or more of SEQ ID NO: 6”.
(D) at least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 7” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 8”; At least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide comprising 18 bases or more” and “an oligonucleotide comprising 18 bases or more of SEQ ID NO: 6”.
(E) at least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 9” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 10”; At least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide comprising 18 bases or more” and “an oligonucleotide comprising 18 bases or more of SEQ ID NO: 12”.
(F) at least one of the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 13” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 14”; At least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide comprising 18 bases or more” and “an oligonucleotide comprising 18 bases or more of SEQ ID NO: 16”.
(G) at least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 18 or more bases of SEQ ID NO: 17” and “oligonucleotide consisting of 18 or more bases of SEQ ID NO: 18”; At least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide comprising 18 bases or more” and “an oligonucleotide comprising 18 bases or more of SEQ ID NO: 16”.
(H) at least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 13” and “oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 14”; At least one selected from the group consisting of “an oligonucleotide comprising 18 bases or more” and “an oligonucleotide comprising 18 bases or more of SEQ ID NO: 20”.
(I) “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 21” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 22”
(J) “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 23” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 22”
(K) "an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 24" and "an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 22"
(L) “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 21” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 25”
(M) “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 26” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 25”
(N) “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 27” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 28”
(O) “oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 29” and “oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 30”
(P) "an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 31" and "an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 30"
(Q) “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 32” and “an oligonucleotide consisting of 18 bases or more of SEQ ID NO: 33”
(2) In the melting curve analysis, a step of separating and detecting three bacterial species based on the difference in Tm values of the amplification products.
（Ｉ）前記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペア、または、前記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載されている塩基配列に対応する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択される、サルモネラ増幅用プライマーペア
（ＩＩ）前記の（ｅ）から（ｈ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペア、または、前記の（ｅ）から（ｈ）のいずれかに記載されている塩基配列に対応する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択される、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用プライマーペア
（ＩＩＩ）前記の（ｉ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペア、または、前記の（ｉ）から（ｑ）のいずれかに記載されている塩基配列に対応する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドのペアから選択される、赤痢菌増幅用プライマーペア The detection method according to any one of claims 1 to 7, wherein the primer set is a combination of three primer pairs each selected one by one from the following three groups (I) to (III).
(I) A pair of oligonucleotides having the base sequence described in any of (a) to (d) above, or the base sequence described in any of (a) to (d) above A primer pair for amplification of Salmonella selected from a pair of oligonucleotides having a complementary base sequence corresponding to (II) of an oligonucleotide having a base sequence described in any of (e) to (h) above For enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) amplification selected from a pair or a pair of oligonucleotides having a complementary base sequence corresponding to the base sequence described in any of (e) to (h) above Primer pair (III) A pair of oligonucleotides having the base sequence described in any one of (i) to (q) above, or the above (i) Luo (q) any selected oligonucleotide pair having a complementary base sequence corresponding to the nucleotide sequence described in, Shigella amplification primers pairs
（Ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）請求項１、７又は８のいずれかに記載のプライマーセット
（Ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、および、
（Ｄ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオンおよびカリウムイオンからなる群のうち１種以上を含む緩衝液 A reagent for detecting the presence of three species of Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella, including the following (A) to (D), and distinguishing and detecting the three species .
(A) thermostable DNA polymerase (B) primer set according to any of claims 1, 7 or 8 , (C) a DNA synthesis substrate (deoxynucleotide triphosphate (dNTP)), and
(D) Buffer solution containing one or more of the group consisting of magnesium ion, ammonium ion and potassium ion
（Ｅ）蛍光インターカレーター Furthermore, the reagent of Claim 11 containing the following (E).
(E) Fluorescent intercalator
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