JP6441906B2 - ヒト凝固因子軽鎖タンパク質及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は生体医療分野に属し、特にヒト凝固因子軽鎖タンパク質及び製薬工業におけるその使用に関する。
グラム陰性細菌は広くグラム染色反応で赤色に染色される細菌を指し、それらは、グラム染色においてグラム陽性細菌とは細胞壁の違いのために相違を示す（陽性細菌は紫色に染色される）。グラム陰性細菌は、大腸菌（Escherichia coli）の他にプロテウス属（Proteus）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、ブルセラ・バシリ（Brucella bacilli）、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、パラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、アシネトバクター属（Acinetobacter）などが代表的である。そのような細菌の病原性は、しばしばそれらの細胞壁中の特定の成分、リポ多糖類（内毒素としても知られている）と密接に関係する。人体では、多糖類は大量のサイトカインの産生及び免疫系の活性化を当該人体に誘発させ、最終的に体内の病原性細菌に対する生来の免疫応答を惹起させる。例えば、発赤及び腫脹は大量のサイトカインの生成及び放出の結果である。
感染巣の除去並びに対症療法及び支持療法に加えて、抗生物質もまたグラム陰性細菌感染の治療時に使用される必要がある。現在では、主として用いられる抗生物質はアミノグリコシド、ベータ-ラクタムなどである。これらの抗生物質は多様なグラム陰性細菌に強力な殺菌作用を有し、さらにまたより長期のポスト抗生物質作用を一般的なグラム陰性杆菌（例えば緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎杆菌及び大腸菌）に対して示す。抗生物質に加えて、例えばプロスタグランジンシンターゼ阻害剤、レバミゾール及びタフトシンのような薬剤もまたグラム陰性細菌感染の治療に有用である。しかしながら、抗生物質の広範囲な適用とともに、臨床医療における抗生物質の濫用は、一剤耐性から多剤耐性へと細菌の薬剤耐性進行をもたらし、したがって代替物として効果的に用いられてきた多くの第二選択抗生物質を無効にさせている。第二に、抗菌薬は細菌を殺滅/抑制しながら内毒素の生成を誘発することがあり、そのことは、当該疾患の治療の難度を高める。したがって、強力な殺滅作用を有する新規な抗生物質が持続的に表れ、進歩的な支持療法が出現しているが、グラム陰性細菌感染によって引き起こされる内毒素血症の治療は、臨床シナリオ、特に20−30％の許容不能な死亡率を有するものではなお難題である。リポ多糖類は、グラム陰性細菌感染後に生じる一連の毒性反応をもたらす主要な病原性因子であると報告されている。抗生物質は良好な細菌排除作用を有するが、それら抗生物質は、血中の遊離リポ多糖類及び当該遊離リポ多糖類で持続的に刺激される標的細胞によって産生される非常に多様な有害サイトカインに対しては作用をもたない。したがって、臨床で抗菌薬を選択するとき、薬剤感受性検査の結果及び内毒素放出を誘発する特性について総合的な配慮が払われるべきである。第三に、リポ多糖類はグラム陰性細菌の細胞壁の表面に存在するので初期タイプの抗生物質の多くはそのような細菌を効果的に抑制することができない。これらの理由から、ここ数年、グラム陰性細菌感染の治療で新規な分野が活発に開拓されつつある。
抗微生物ペプチド（AMP）は抗菌活性を有する短いペプチドを指し、それらの大半は、熱安定性、高アルカリンシティー、及び広域抗菌活性を有する。これまで、約2000を超えるAMPが多様な生物から既に同定されている。これらのAMPは誘発後に合成され、病原体の侵入に対抗する生物の耐性で重要な役割を果たし、生物における非特異的な免疫学的機能のための重要な防御構成成分と考えられる。したがって、グラム陰性細菌に対する新規なAPMの発見は最大の関心事及び努力の甲斐がある課題となっている。
ヒト凝固第VII因子（ヒト第VII因子、hFVII）は、人体で天然に存在するタンパク質であり、約50kDの分子量を有する。その分子は以下の4つのドメインを含む：膜結合N-末端γ-カルボキシグルタミン酸ドメイン（Glaドメイン）、2つの上皮成長因子様ドメイン（EGF1及びEGF2）、及びC-末端セリンプロテアーゼドメイン。前記はまた、高い配列相同性を有するいくつかのアナローグ（例えば凝固第IX因子（ヒト第IX因子、hFIX）、ヒト凝固第X因子（ヒト第X因子、hFX）など）を人体に有する。現在まで、抗菌剤としてヒト凝固第VII、IX、X因子の軽鎖を用いる細菌感染治療についての関連報告、及びグラム陰性細菌によって引き起こされる内毒素血症を治療する医薬の調製に関する報告は存在しない。
ヒト凝固第VII因子（ヒト第VII因子、hFVII）は、人体で天然に存在するタンパク質であり、約50kDの分子量を有する。その分子は以下の4つのドメインを含む：膜結合N-末端γ-カルボキシグルタミン酸ドメイン（Glaドメイン）、2つの上皮成長因子様ドメイン（EGF1及びEGF2）、及びC-末端セリンプロテアーゼドメイン。前記はまた、高い配列相同性を有するいくつかのアナローグ（例えば凝固第IX因子（ヒト第IX因子、hFIX）、ヒト凝固第X因子（ヒト第X因子、hFX）など）を人体に有する。現在まで、抗菌剤としてヒト凝固第VII、IX、X因子の軽鎖を用いる細菌感染治療についての関連報告、及びグラム陰性細菌によって引き起こされる内毒素血症を治療する医薬の調製に関する報告は存在しない。
本発明の目的の1つは、人工的に調製されたヒト凝固因子軽鎖タンパク質を提供することである。本発明の別の目的は、該ヒト凝固因子軽鎖タンパク質がグラム陰性細菌に対し阻害作用を有することを証明し、グラム陰性細菌感染を治療する新規なクラスの医薬、及びグラム陰性細菌によって引き起こされる内毒素血症を治療する医薬を開発することである。
本発明で示されるものは、ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質、配列表の配列番号:1に記載される前記のアミノ酸配列、又は配列番号:1に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質である。配列番号:1に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、該配列表の配列番号:2又は配列番号:3に示される。
また別に、本発明で示されるものは、ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質、配列表の配列番号:2に記載される前記のアミノ酸配列、又は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質である。配列番号:2に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、該配列表の配列番号:1又は配列番号:3に示される。
また別に、本発明で示されるものは、ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質、配列表の配列番号:3に記載される前記のアミノ酸配列、又は配列番号:3に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質である。配列番号:3に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、該配列表の配列番号:1又は配列番号:2に示される。
本発明で示されるものは、ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質、配列表の配列番号:1に記載される前記のアミノ酸配列、又は配列番号:1に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質である。配列番号:1に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、該配列表の配列番号:2又は配列番号:3に示される。
また別に、本発明で示されるものは、ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質、配列表の配列番号:2に記載される前記のアミノ酸配列、又は配列番号:2に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質である。配列番号:2に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、該配列表の配列番号:1又は配列番号:3に示される。
また別に、本発明で示されるものは、ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質、配列表の配列番号:3に記載される前記のアミノ酸配列、又は配列番号:3に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質である。配列番号:3に記載されるアミノ酸配列と50％を超える相同性を有するタンパク質のアミノ酸配列は、該配列表の配列番号:1又は配列番号:2に示される。
配列表の配列番号:1に記載されるアミノ酸配列を有するヒト凝固因子軽鎖タンパク質はLhF VIIと称される。配列表の配列番号:2に記載されるアミノ酸配列を有するヒト凝固因子軽鎖タンパク質はLhF IXと称される。配列表の配列番号:3に記載されるアミノ酸配列を有するヒト凝固因子軽鎖タンパク質はLhF Xと称される。
ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされる上述のタンパク質は原核細胞組換えプラスミドから発現されるか、真核細胞組換えプラスミドから発現されるか、又は化学的合成によって調製される。
本発明で示されるヒト凝固因子軽鎖タンパク質のための組換え原核細胞プラスミド又は真核細胞プラスミドは、配列表の配列番号:4に記載されるヌクレオチド配列又は配列表の配列番号:4に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子を原核細胞ベクター又は真核細胞ベクターと一緒にしてそれぞれ構築される。配列番号:4に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子のヌクレオチド配列は配列表の配列番号:5又は配列番号:6に示される。原核細胞ベクターはpETプラスミド系（pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、及びpET-42a(+)を含む）であり、真核細胞ベクターはpcDNA3.1(+)及びpcDNA3.1(-)である。
ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされる上述のタンパク質は原核細胞組換えプラスミドから発現されるか、真核細胞組換えプラスミドから発現されるか、又は化学的合成によって調製される。
本発明で示されるヒト凝固因子軽鎖タンパク質のための組換え原核細胞プラスミド又は真核細胞プラスミドは、配列表の配列番号:4に記載されるヌクレオチド配列又は配列表の配列番号:4に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子を原核細胞ベクター又は真核細胞ベクターと一緒にしてそれぞれ構築される。配列番号:4に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子のヌクレオチド配列は配列表の配列番号:5又は配列番号:6に示される。原核細胞ベクターはpETプラスミド系（pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、及びpET-42a(+)を含む）であり、真核細胞ベクターはpcDNA3.1(+)及びpcDNA3.1(-)である。
本発明で示されるヒト凝固因子軽鎖タンパク質のための組換え原核細胞プラスミド又は真核細胞プラスミドは、配列表の配列番号:5に記載されるヌクレオチド配列又は配列表の配列番号:5に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子を原核細胞ベクター又は真核細胞ベクターと一緒にしてそれぞれ構築される。配列番号:5に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子のヌクレオチド配列は配列表の配列番号:4又は配列番号:6に示される。原核細胞ベクターはpETプラスミド系（pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、及びpET-42a(+)を含む）であり、真核細胞ベクターはpcDNA3.1(+)及びpcDNA3.1(-)である。
本発明で示されるヒト凝固因子軽鎖タンパク質のための組換え原核細胞プラスミド又は真核細胞プラスミドは、配列表の配列番号:6に記載されるヌクレオチド配列又は配列表の配列番号:6に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子を原核細胞ベクター又は真核細胞ベクターと一緒にしてそれぞれ構築される。配列番号:6に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子のヌクレオチド配列は配列表の配列番号:4又は配列番号:5に示される。原核細胞ベクターはpETプラスミド系（pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、及びpET-42a(+)を含む）であり、真核細胞ベクターはpcDNA3.1(+)及びpcDNA3.1(-)である。
本発明で示されるヒト凝固因子軽鎖タンパク質のための組換え原核細胞プラスミド又は真核細胞プラスミドは、配列表の配列番号:6に記載されるヌクレオチド配列又は配列表の配列番号:6に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子を原核細胞ベクター又は真核細胞ベクターと一緒にしてそれぞれ構築される。配列番号:6に記載されるヌクレオチド配列と50％を超える相同性を有する遺伝子のヌクレオチド配列は配列表の配列番号:4又は配列番号:5に示される。原核細胞ベクターはpETプラスミド系（pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、及びpET-42a(+)を含む）であり、真核細胞ベクターはpcDNA3.1(+)及びpcDNA3.1(-)である。
本発明で用いられる工程は以下の通りである：
（1）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xをコードする遺伝子又は前記と50％を超える相同性を有する遺伝子をPCR反応によって入手する:
（2）上記で増幅した個々の遺伝子をそれぞれ原核細胞ベクター又は真核細胞ベクターに挿入して、組換え原核細胞プラスミド又は真核細胞プラスミドを構築し、続いて得られた組換え原核又は真核細胞プラスミドでコンピテントな細菌を形質転換して培養し、続いて正確に挿入されたフラグメントを含む組換えプラスミドを配列決定によってスクリーニングする：
（3）正確な配列決定の結果を示す組換え原核細胞プラスミドで操作細菌を形質転換して発現させ、発現されたタンパク質を単離及び精製して組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質を入手するか、又は得られた組換え真核細胞プラスミドで哺乳動物細胞をトランスフェクトして培養し、真核細胞発現のために安定な細胞株を樹立し、続いて発現タンパク質を単離及び精製して組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質を入手する；
（4）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質のin vitro抗菌活性をアッセイする；
（5）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質のin vivo抗菌活性をアッセイする；
（6）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質によるリポ多糖類の加水分解を質量分析法による検出に付す；
（7）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質によるリポ多糖類の加水分解を銀染色検出に付す。
該原核細胞ベクターはpETプラスミド系であり（前記はpET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、及びpET-42a(+)などを含む）、該真核細胞ベクターはpcDNA3.1(+)及びpcDNA3.1(-)などである。
ヒト凝固因子軽鎖タンパク質の化学的合成は通常専門企業に外注される。
（1）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xをコードする遺伝子又は前記と50％を超える相同性を有する遺伝子をPCR反応によって入手する:
（2）上記で増幅した個々の遺伝子をそれぞれ原核細胞ベクター又は真核細胞ベクターに挿入して、組換え原核細胞プラスミド又は真核細胞プラスミドを構築し、続いて得られた組換え原核又は真核細胞プラスミドでコンピテントな細菌を形質転換して培養し、続いて正確に挿入されたフラグメントを含む組換えプラスミドを配列決定によってスクリーニングする：
（3）正確な配列決定の結果を示す組換え原核細胞プラスミドで操作細菌を形質転換して発現させ、発現されたタンパク質を単離及び精製して組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質を入手するか、又は得られた組換え真核細胞プラスミドで哺乳動物細胞をトランスフェクトして培養し、真核細胞発現のために安定な細胞株を樹立し、続いて発現タンパク質を単離及び精製して組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質を入手する；
（4）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質のin vitro抗菌活性をアッセイする；
（5）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質のin vivo抗菌活性をアッセイする；
（6）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質によるリポ多糖類の加水分解を質量分析法による検出に付す；
（7）組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質によるリポ多糖類の加水分解を銀染色検出に付す。
該原核細胞ベクターはpETプラスミド系であり（前記はpET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、及びpET-42a(+)などを含む）、該真核細胞ベクターはpcDNA3.1(+)及びpcDNA3.1(-)などである。
ヒト凝固因子軽鎖タンパク質の化学的合成は通常専門企業に外注される。
本発明で示されるタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xは、グラム陰性細菌のリポ多糖類（内毒素（グラム陰性細菌外膜の主要成分）としても知られている）を加水分解し、細胞構造を破壊し、それによって殺菌作用を示すことができる。一方で、該軽鎖タンパク質は組織因子と非常に強く結合することが示された。身体が損傷されると、大量の組織因子が創傷で暴露され、前記はしたがって軽鎖タンパク質が創傷で凝集して標的誘導静菌作用を発揮することを可能にする。グラム陰性細菌を阻害するin vitro活性のアッセイは、タンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xはグラム陰性細菌に対し顕著な阻害性作用を有することを示す。大腸菌DH5α、大腸菌BL21、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、 シトロバクター・ジベルスス（Citrobacter diversus）、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）に対する該タンパク質の最小阻害濃度（MIC）は以下の通りである：
タンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xのin vivo抗菌活性におけるアッセイは、タンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xは動物でグラム陰性細菌に対し顕著な阻害作用を有し、さらに致死用量の緑膿菌を感染させたマウスを100％の生存率で14日間維持できることを示す。さらにまた、緑膿菌を感染させなかったマウスはいずれも該タンパク質注射後に生存し、本発明で示されるタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xはそれ自体、低免疫原性及び低毒性有することを示している。
本発明で示されるタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xは、グラム陰性細菌のリポ多糖類（実施例12及び13で分かるように内毒素としても知られている）を加水分解でき、さらにリポ多糖類は、内毒素血症を引き起こす主要な病原性因子であるので、これらのタンパク質をグラム陰性細菌によって生じる内毒素血症を治療する医薬の調製で用いることができる。
本発明で示されるタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xは、グラム陰性細菌のリポ多糖類（実施例12及び13で分かるように内毒素としても知られている）を加水分解でき、さらにリポ多糖類は、内毒素血症を引き起こす主要な病原性因子であるので、これらのタンパク質をグラム陰性細菌によって生じる内毒素血症を治療する医薬の調製で用いることができる。
本発明は以下の有益な作用を有する：
1．本発明で提供される人工的に調製されたヒト凝固因子軽鎖タンパク質は、グラム陰性細菌の外膜を加水分解し、細胞構造の安定性を破壊し、グラム陰性細菌に対し顕著な阻害作用を有し、したがってグラム陰性細菌感染によって生じる疾患を治療する新規なクラスの治療薬を提供できる。
2．本発明で提供される人工的に調製されたヒト凝固因子軽鎖タンパク質は、グラム陰性細菌のリポ多糖類（内毒素としても知られている）を加水分解し、したがってグラム陰性細菌によって生じる内毒素血症を治療する新規なクラスの治療薬を提供できる。
3．本発明で提供される人工的に調製されたヒト凝固因子軽鎖タンパク質は、創傷部位のグラム陰性細菌に対して、組織因子との結合により媒介される該創傷部位における標的誘導局在によって優れた標的誘導殺菌作用を示すことができ、新規な標的誘導抗菌薬の調製における使用が期待され得る。
4．ヒト凝固第VII、IX、及びX因子の軽鎖タンパク質は人体で天然かつ固有の成分であり、本発明の静菌性ドメインとしての軽鎖タンパク質の使用は該医薬の免疫原性を効果的に低下させることができる。
5．組換えヒト凝固因子軽鎖タンパク質は、遺伝子操作技術を介して直接的に大腸菌細胞で適切に発現させることができるので、製造経費が低く、工業生産に適している。
1．本発明で提供される人工的に調製されたヒト凝固因子軽鎖タンパク質は、グラム陰性細菌の外膜を加水分解し、細胞構造の安定性を破壊し、グラム陰性細菌に対し顕著な阻害作用を有し、したがってグラム陰性細菌感染によって生じる疾患を治療する新規なクラスの治療薬を提供できる。
2．本発明で提供される人工的に調製されたヒト凝固因子軽鎖タンパク質は、グラム陰性細菌のリポ多糖類（内毒素としても知られている）を加水分解し、したがってグラム陰性細菌によって生じる内毒素血症を治療する新規なクラスの治療薬を提供できる。
3．本発明で提供される人工的に調製されたヒト凝固因子軽鎖タンパク質は、創傷部位のグラム陰性細菌に対して、組織因子との結合により媒介される該創傷部位における標的誘導局在によって優れた標的誘導殺菌作用を示すことができ、新規な標的誘導抗菌薬の調製における使用が期待され得る。
4．ヒト凝固第VII、IX、及びX因子の軽鎖タンパク質は人体で天然かつ固有の成分であり、本発明の静菌性ドメインとしての軽鎖タンパク質の使用は該医薬の免疫原性を効果的に低下させることができる。
5．組換えヒト凝固因子軽鎖タンパク質は、遺伝子操作技術を介して直接的に大腸菌細胞で適切に発現させることができるので、製造経費が低く、工業生産に適している。
本発明を実施例と関連させて下記でさらに詳述する。以下に記載する実施例では、特別な実験条件は特段には記載されず、実施例は、当業者に周知の通常の条件、例えば以下の文献に記載の条件及び実験工程にしたがうか（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al (Ed.), New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989；An Conventional Manual for Laboratory Animals (National Center for Standard Laboratory Animals, November, 2004)；及び, and a Manual of Basic Technique, 5th Edition (John Wiley & Sons, Inc., 2005)、又は製造業者の推奨する条件及び実験工程にしたがう。
［実施例１］
組換えタンパク質LhF VIIをコードする遺伝子の入手
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）：
組換えタンパク質LhF VIIをコードする遺伝子の入手
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）：
2．PCR増幅系
鋳型としてヒト凝固第VII因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。NcoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー1の配列に導入し、さらにXhoI制限部位をプライマー2の配列に導入した。増幅後、ヒト凝固第VII因子軽鎖のコード配列を含む497bpのDNAフラグメントを得た。PCR反応系（50μL）は以下の通りであった：
脱イオン水：31.5μL
5ｘ反応緩衝液：10μL
dNTPミックス：4μL
プライマー1（10 mM）：1μL
プライマー2（10 mM）：1μL
ヒト凝固第VII因子のCDS領域を含むプラスミド（100ng/μL）：2μL
プライムスター（PrimeStar）DNAポリメラーゼ：0.5μL
3．PCR増幅の反応条件
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼ（Takaraから購入）の指示を参考に設定された：98℃で2分の前変性、以下の30サイクル（98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で50秒の伸長）に続いて72℃で4分の伸長。
4．増幅生成物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し（図1参照）、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従って回収した。
鋳型としてヒト凝固第VII因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。NcoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー1の配列に導入し、さらにXhoI制限部位をプライマー2の配列に導入した。増幅後、ヒト凝固第VII因子軽鎖のコード配列を含む497bpのDNAフラグメントを得た。PCR反応系（50μL）は以下の通りであった：
脱イオン水：31.5μL
5ｘ反応緩衝液：10μL
dNTPミックス：4μL
プライマー1（10 mM）：1μL
プライマー2（10 mM）：1μL
ヒト凝固第VII因子のCDS領域を含むプラスミド（100ng/μL）：2μL
プライムスター（PrimeStar）DNAポリメラーゼ：0.5μL
3．PCR増幅の反応条件
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼ（Takaraから購入）の指示を参考に設定された：98℃で2分の前変性、以下の30サイクル（98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で50秒の伸長）に続いて72℃で4分の伸長。
4．増幅生成物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し（図1参照）、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従って回収した。
［実施例２］
組換えタンパク質LhF IXをコードする遺伝子の入手
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）：
組換えタンパク質LhF IXをコードする遺伝子の入手
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）：
2．PCR増幅系
鋳型としてヒト凝固第IX因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。NcoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー1の配列に導入し、さらにXhoI制限部位をプライマー2の配列に導入した。増幅後、ヒト凝固第IX因子軽鎖のコード配列を含む476bpのDNAフラグメントを得た。PCR反応系（50μL）は以下の通りであった：
脱イオン水：31.5μL
5ｘ反応緩衝液：10μL
dNTPミックス：4μL
プライマー1（10 mM）：1μL
プライマー2（10 mM）：1μL
ヒト凝固第IX因子のCDS領域を含むプラスミド（100ng/μL）：2μL
プライムスターDNAポリメラーゼ：0.5μL
3．PCR増幅の反応条件
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼの指示を参考に設定された：98℃で2分の前変性、以下の30サイクル（98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で50秒の伸長）に続いて72℃で4分の伸長。
4．増幅生成物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し（図2参照）、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従って回収した。
鋳型としてヒト凝固第IX因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。NcoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー1の配列に導入し、さらにXhoI制限部位をプライマー2の配列に導入した。増幅後、ヒト凝固第IX因子軽鎖のコード配列を含む476bpのDNAフラグメントを得た。PCR反応系（50μL）は以下の通りであった：
脱イオン水：31.5μL
5ｘ反応緩衝液：10μL
dNTPミックス：4μL
プライマー1（10 mM）：1μL
プライマー2（10 mM）：1μL
ヒト凝固第IX因子のCDS領域を含むプラスミド（100ng/μL）：2μL
プライムスターDNAポリメラーゼ：0.5μL
3．PCR増幅の反応条件
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼの指示を参考に設定された：98℃で2分の前変性、以下の30サイクル（98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で50秒の伸長）に続いて72℃で4分の伸長。
4．増幅生成物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し（図2参照）、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従って回収した。
［実施例３］
組換えタンパク質LhF Xをコードする遺伝子の入手
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）：
組換えタンパク質LhF Xをコードする遺伝子の入手
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）：
2．PCR増幅系
鋳型としてヒト凝固第X因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。NcoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー1の配列に導入し、さらにXhoI制限部位をプライマー2の配列に導入した。増幅後、ヒト凝固第X因子軽鎖のコード配列を含む458bpのDNAフラグメントを得た。PCR反応系（50μL）は以下の通りであった：
脱イオン水：31.5μL
5ｘ反応緩衝液：10μL
dNTPミックス：4μL
プライマー1（10 mM）：1μL
プライマー2（10 mM）：1μL
ヒト凝固第IX因子のCDS領域を含むプラスミド（100ng/μL）：2μL
プライムスターDNAポリメラーゼ：0.5μL
鋳型としてヒト凝固第X因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。NcoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー1の配列に導入し、さらにXhoI制限部位をプライマー2の配列に導入した。増幅後、ヒト凝固第X因子軽鎖のコード配列を含む458bpのDNAフラグメントを得た。PCR反応系（50μL）は以下の通りであった：
脱イオン水：31.5μL
5ｘ反応緩衝液：10μL
dNTPミックス：4μL
プライマー1（10 mM）：1μL
プライマー2（10 mM）：1μL
ヒト凝固第IX因子のCDS領域を含むプラスミド（100ng/μL）：2μL
プライムスターDNAポリメラーゼ：0.5μL
3．PCR増幅の反応条件
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼの指示を参考に設定された：98℃で2分の前変性、以下の30サイクル（98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で50秒の伸長）に続いて72℃で4分の伸長。
4．増幅生成物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し（図3参照）、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従って回収した。
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼの指示を参考に設定された：98℃で2分の前変性、以下の30サイクル（98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で50秒の伸長）に続いて72℃で4分の伸長。
4．増幅生成物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し（図3参照）、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従って回収した。
［実施例４］
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX及びLhF Xを発現する組換え原核細胞プラスミドの構築
1．遺伝子フラグメントの前処理及び原核細胞発現ベクター
実施例1でクローニングしたLhF VII遺伝子、実施例2でクローニングしたLhF IX遺伝子、実施例3でクローニングしたLhF X遺伝子、及び原核細胞発現ベクターpET19b（Novagenの製品）を個々に制限エンドヌクレアーゼNcoI及びXhoI（両方ともTakara又はFermentasから購入）を用い37℃で一晩二重消化した。反応系は以下のように設定された:
二重消化完了後、反応生成物を1％アガロースゲル電気泳動で分析し、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従ってゲル画像化系から紫外線ランプの下で回収した。
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX及びLhF Xを発現する組換え原核細胞プラスミドの構築
1．遺伝子フラグメントの前処理及び原核細胞発現ベクター
実施例1でクローニングしたLhF VII遺伝子、実施例2でクローニングしたLhF IX遺伝子、実施例3でクローニングしたLhF X遺伝子、及び原核細胞発現ベクターpET19b（Novagenの製品）を個々に制限エンドヌクレアーゼNcoI及びXhoI（両方ともTakara又はFermentasから購入）を用い37℃で一晩二重消化した。反応系は以下のように設定された:
二重消化完了後、反応生成物を1％アガロースゲル電気泳動で分析し、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従ってゲル画像化系から紫外線ランプの下で回収した。
2．LhF VII、LhF IX及びLhF X遺伝子と原核細胞発現ベクターpET19bとの連結及び形質転換
（1）上記工程で入手したLhF VII、LhF IX及びLhF X遺伝子フラグメント並びに原核細胞ベクターフラグメントを大雑把に定量し、続いて遺伝子フラグメントの分子数と原核細胞ベクターの分子数の比を3:1とする連結反応の原則に従い連結に付した。連結反応系は以下のように整えた:
（2）全連結反応をT4リガーゼの（Fermentasから購入）の作用下にて16℃で一晩進行させた。上記で増幅させた3つの遺伝子フラグメントの各々を原核細胞発現ベクターpET19bに挿入した。組換え原核細胞プラスミドの構造は図4−6に模式的に示した。
（3）連結生成物の各々により大腸菌Top10（Invitrogen社から購入）のコンピテント細胞（文献（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）にしたがって調製）を形質転換した。連結生成物による形質転換手順の主要な工程は以下の通りである:
1）1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた100μLの大腸菌Top10コンピテント細胞に5μLの連結生成物をピペットで加える。陰性コントロールは、1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた100μLの大腸菌Top10コンピテント細胞である；
2）チューブを氷上に30分間置いた；
3）コンピテント細胞に金属浴で42℃にて90秒のショックを与えた；
4）チューブを氷浴に迅速に移して2分間冷却した；
5）900μLのSOC培地（10gペプトン、5gの酵母抽出物、0.5g NaCl、0.186g KC1、0.95g MgCl2、ddH2Oに溶解して体積を980mLにし、オートクレーブして室温に冷却してから20％の無菌的グルコース水溶液を添加）を添加し、氷上に置いた；
6）チューブを180rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートした；
7）細菌懸濁物を4000ｘgで3分間遠心分離し、200μLの上清を残して過剰な培地を除去した。200μLの残留上清を用いて細菌を再懸濁した；
8）再懸濁した形質転換体を固形LB培地（0.1g/mLのアンピシリンを含む）に均質にプレートし37℃の定常温度のインキュベータで一晩インキュベートした。
（1）上記工程で入手したLhF VII、LhF IX及びLhF X遺伝子フラグメント並びに原核細胞ベクターフラグメントを大雑把に定量し、続いて遺伝子フラグメントの分子数と原核細胞ベクターの分子数の比を3:1とする連結反応の原則に従い連結に付した。連結反応系は以下のように整えた:
（3）連結生成物の各々により大腸菌Top10（Invitrogen社から購入）のコンピテント細胞（文献（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）にしたがって調製）を形質転換した。連結生成物による形質転換手順の主要な工程は以下の通りである:
1）1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた100μLの大腸菌Top10コンピテント細胞に5μLの連結生成物をピペットで加える。陰性コントロールは、1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた100μLの大腸菌Top10コンピテント細胞である；
2）チューブを氷上に30分間置いた；
3）コンピテント細胞に金属浴で42℃にて90秒のショックを与えた；
4）チューブを氷浴に迅速に移して2分間冷却した；
5）900μLのSOC培地（10gペプトン、5gの酵母抽出物、0.5g NaCl、0.186g KC1、0.95g MgCl2、ddH2Oに溶解して体積を980mLにし、オートクレーブして室温に冷却してから20％の無菌的グルコース水溶液を添加）を添加し、氷上に置いた；
6）チューブを180rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートした；
7）細菌懸濁物を4000ｘgで3分間遠心分離し、200μLの上清を残して過剰な培地を除去した。200μLの残留上清を用いて細菌を再懸濁した；
8）再懸濁した形質転換体を固形LB培地（0.1g/mLのアンピシリンを含む）に均質にプレートし37℃の定常温度のインキュベータで一晩インキュベートした。
3．組換えプラスミドの同定
上記に記載の形質転換大腸菌Top10の単一クローンを摘みとり少量中で培養し、プラスミド抽出キット（OMEGAから購入）を用いてプラスミド抽出に付し、続いて同定のためにNcoI/XhoIによる二重消化を実施した。二重消化生成物をゲル電気泳動によって同定した。3つの組換えプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化フラグメントの同定のための電気泳動図は図7−9に示されている。酵素消化によって生じた2つのバンドのサイズは予想される生成物のサイズと一致し、問題のプラスミドの構築の成功を示した。
二重消化によって正しいものと認定されたプラスミドを、挿入された融合遺伝子フラグメントの配列決定のために北京ゲノミクスインスチチュートに送った。正しい配列決定結果を示すLhF VII遺伝子を含む組換え原核細胞プラスミドはpET19blhf VIIと称され、LhF IX遺伝子を含む組換え原核細胞プラスミドはpET19blhf IXと称され、LhF X遺伝子を含む組換え原核細胞プラスミドはpET19blhf Xと称される。
上記に記載の形質転換大腸菌Top10の単一クローンを摘みとり少量中で培養し、プラスミド抽出キット（OMEGAから購入）を用いてプラスミド抽出に付し、続いて同定のためにNcoI/XhoIによる二重消化を実施した。二重消化生成物をゲル電気泳動によって同定した。3つの組換えプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化フラグメントの同定のための電気泳動図は図7−9に示されている。酵素消化によって生じた2つのバンドのサイズは予想される生成物のサイズと一致し、問題のプラスミドの構築の成功を示した。
二重消化によって正しいものと認定されたプラスミドを、挿入された融合遺伝子フラグメントの配列決定のために北京ゲノミクスインスチチュートに送った。正しい配列決定結果を示すLhF VII遺伝子を含む組換え原核細胞プラスミドはpET19blhf VIIと称され、LhF IX遺伝子を含む組換え原核細胞プラスミドはpET19blhf IXと称され、LhF X遺伝子を含む組換え原核細胞プラスミドはpET19blhf Xと称される。
［実施例５］
組換え原核細胞プラスミドの大腸菌での発現
1．実施例4で構築した組換えプラスミドpET19blhf VII、pET19blhf IX及びpET19blhf Xの各々で大腸菌BL21(DE3)（Invitrogenから購入）を形質転換した。単一クローンをLB培地（0.1g/mLのアンピシリンを含む）に摘みとり、約0.6のOD600まで185rpmで振盪しながら37℃でインキュベートした。1mLの細菌懸濁物を採取し-20℃で凍結した。続いてIPTG（イソプロピル-p-D-チオガラクトシド）を残りの細菌懸濁物に0.8mMの最終濃度で添加した。インキュベーションを6時間進行させ、1mLの細菌懸濁物を採取して-20℃で凍結した。
2．上記記載のIPTG誘導前及び誘導後のサンプルをSDS-PAGE電気泳動（スタッキングゲル5％及び分離ゲル12％）によってアッセイし、問題のタンパク質の発現を分析した。大腸菌における3つの組換えプラスミドによる組換えタンパク質の誘導性発現についてのSDS-PAGE分析図は図10−12にそれぞれ示される。結果は、タンパク質が正常に発現されることを示した。
3．問題のタンパク質のウェスタンブロットによる同定。ゲル上のタンパク質をニトロセルロースフィルター膜（GE）に電気的に移動させた。前記電気移動膜を振盪インキュベータでブロッキング溶液（約5％脱脂粉乳を含むPBST）により室温で2時間ブロックした。続いて、FVII、FIX及びFXに対するマウスモノクローナル抗体（Santaの製品）の希釈物をそれぞれ添加し、4℃で一晩インキュベートした。十分に洗浄した後、酵素標識二次抗体（ヤギ抗マウスIgG）を添加し振盪インキュベータで室温にて2時間インキュベートした。十分に洗浄した後、ECL（Thermo）反応溶液を添加して5分間インキュベートし、ブロットをフィルムに暴露して可視化した。3つの組換えタンパク質の誘導性発現の分析及び同定のためのウェスタンブロット画像は図13−15にそれぞれ示されている。
結果は、IPTG誘導後に融合タンパク質が明瞭に発現されることを示している。LhF VII を発現する株はLhF VII-pET19bBL21-(DE3)と称され、LhF IXを発現する株はLhF IX-pET19bBL21-(DE3)と称され、さらにLhF Xを発現する株はLhF X-pET19bBL21-(DE3)と称される。
組換え原核細胞プラスミドの大腸菌での発現
1．実施例4で構築した組換えプラスミドpET19blhf VII、pET19blhf IX及びpET19blhf Xの各々で大腸菌BL21(DE3)（Invitrogenから購入）を形質転換した。単一クローンをLB培地（0.1g/mLのアンピシリンを含む）に摘みとり、約0.6のOD600まで185rpmで振盪しながら37℃でインキュベートした。1mLの細菌懸濁物を採取し-20℃で凍結した。続いてIPTG（イソプロピル-p-D-チオガラクトシド）を残りの細菌懸濁物に0.8mMの最終濃度で添加した。インキュベーションを6時間進行させ、1mLの細菌懸濁物を採取して-20℃で凍結した。
2．上記記載のIPTG誘導前及び誘導後のサンプルをSDS-PAGE電気泳動（スタッキングゲル5％及び分離ゲル12％）によってアッセイし、問題のタンパク質の発現を分析した。大腸菌における3つの組換えプラスミドによる組換えタンパク質の誘導性発現についてのSDS-PAGE分析図は図10−12にそれぞれ示される。結果は、タンパク質が正常に発現されることを示した。
3．問題のタンパク質のウェスタンブロットによる同定。ゲル上のタンパク質をニトロセルロースフィルター膜（GE）に電気的に移動させた。前記電気移動膜を振盪インキュベータでブロッキング溶液（約5％脱脂粉乳を含むPBST）により室温で2時間ブロックした。続いて、FVII、FIX及びFXに対するマウスモノクローナル抗体（Santaの製品）の希釈物をそれぞれ添加し、4℃で一晩インキュベートした。十分に洗浄した後、酵素標識二次抗体（ヤギ抗マウスIgG）を添加し振盪インキュベータで室温にて2時間インキュベートした。十分に洗浄した後、ECL（Thermo）反応溶液を添加して5分間インキュベートし、ブロットをフィルムに暴露して可視化した。3つの組換えタンパク質の誘導性発現の分析及び同定のためのウェスタンブロット画像は図13−15にそれぞれ示されている。
結果は、IPTG誘導後に融合タンパク質が明瞭に発現されることを示している。LhF VII を発現する株はLhF VII-pET19bBL21-(DE3)と称され、LhF IXを発現する株はLhF IX-pET19bBL21-(DE3)と称され、さらにLhF Xを発現する株はLhF X-pET19bBL21-(DE3)と称される。
［実施例６］
アフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの精製
1．細菌LhF VII-pET19bBL21-(DE3)、LhF IX-pET19bBL21-(DE3)、及びLhF X-pET19bBL21-(DE3)を実施例5の方法にしたがって大規模に培養し、IPTGの添加によって誘導し、続いて175rpmで振盪しながら18℃で一晩培養した。
2．上記に記載の細菌懸濁物を4000ｘgで3分間遠心分離して細菌を収集した。細菌ペレットをEW緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、1mM DTT、0.1mM PMSF（pH 7.4））で再懸濁して洗浄した。細菌懸濁物を4000ｘgで3分間遠心分離し上清を廃棄した。再度、細菌ペレットを10mLのEW緩衝液に再懸濁した。
3．細菌を超音波処理により破壊した（パワー：300W、超音波処理持続時間：10秒、間隔：10秒、超音波処理の合計時間：3分、氷浴中で実施）。超音波処理の完了後、細菌懸濁物を48400ｘgで30分間4℃にて遠心分離した。上清を収集して氷上に置いた。
4．クロマトグラフィーカラムをCo2+精製系（Talon Metal Affinity Resin, Clontech 社の製品）の指示にしたがってプレロードし、サンプルをロードした。カラムを10mLのEW緩衝液で2回洗浄し、さらにタンパク質不純物を10mMのイミダゾール溶液で洗い流した。最後に、タンパク質を100mMのイミダゾールで溶出させた。アフィニティークロマトグラフィーによって精製した3つの組換えタンパク質の分析及び同定のためのSDS-PAGE画像はそれぞれ図16−18に示される。
5．問題のタンパク質を含む溶離液を限外ろ過し、トリス-Cl緩衝液（pH7.4）を緩衝液交換及び濃縮のために用いた。限外ろ過後に、高濃度の組換えタンパク質（すなわちLhF VII、LhF IX、及びLhF X）を入手できる。1リットルの発現細菌懸濁物から90％を超える純度を有する15mgの問題のタンパク質を入手できることがタンパク質量から示された。
アフィニティークロマトグラフィーによる組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの精製
1．細菌LhF VII-pET19bBL21-(DE3)、LhF IX-pET19bBL21-(DE3)、及びLhF X-pET19bBL21-(DE3)を実施例5の方法にしたがって大規模に培養し、IPTGの添加によって誘導し、続いて175rpmで振盪しながら18℃で一晩培養した。
2．上記に記載の細菌懸濁物を4000ｘgで3分間遠心分離して細菌を収集した。細菌ペレットをEW緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、1mM DTT、0.1mM PMSF（pH 7.4））で再懸濁して洗浄した。細菌懸濁物を4000ｘgで3分間遠心分離し上清を廃棄した。再度、細菌ペレットを10mLのEW緩衝液に再懸濁した。
3．細菌を超音波処理により破壊した（パワー：300W、超音波処理持続時間：10秒、間隔：10秒、超音波処理の合計時間：3分、氷浴中で実施）。超音波処理の完了後、細菌懸濁物を48400ｘgで30分間4℃にて遠心分離した。上清を収集して氷上に置いた。
4．クロマトグラフィーカラムをCo2+精製系（Talon Metal Affinity Resin, Clontech 社の製品）の指示にしたがってプレロードし、サンプルをロードした。カラムを10mLのEW緩衝液で2回洗浄し、さらにタンパク質不純物を10mMのイミダゾール溶液で洗い流した。最後に、タンパク質を100mMのイミダゾールで溶出させた。アフィニティークロマトグラフィーによって精製した3つの組換えタンパク質の分析及び同定のためのSDS-PAGE画像はそれぞれ図16−18に示される。
5．問題のタンパク質を含む溶離液を限外ろ過し、トリス-Cl緩衝液（pH7.4）を緩衝液交換及び濃縮のために用いた。限外ろ過後に、高濃度の組換えタンパク質（すなわちLhF VII、LhF IX、及びLhF X）を入手できる。1リットルの発現細菌懸濁物から90％を超える純度を有する15mgの問題のタンパク質を入手できることがタンパク質量から示された。
［実施例７］
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xを発現する組換え真核細胞プラスミドの構築
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）。
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xを発現する組換え真核細胞プラスミドの構築
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）。
2．PCR増幅系
鋳型としてヒト凝固第VII因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。BamHI制限部位及びKozak配列をプライマー1の配列に導入し、XhoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー2の配列に導入した。鋳型としてヒト凝固第IX因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー3及び4によりPCR増幅を実施した。BamHI制限部位、Kozak配列及びシグナルペプチド配列をプライマー3の配列に導入し、XhoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー4の配列に導入した。鋳型としてヒト凝固第X因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー5及び6によりPCR増幅を実施した。BamHI制限部位、Kozak配列及びシグナルペプチド配列をプライマー5の配列に導入し、XhoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー6の配列に導入した。
PCR増幅は実施例1を参考に実施した。
3．組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの真核細胞発現用組換えプラスミドの構築
実施例7でクローニングした遺伝子フラグメントLhF VII、LhF IX及びLhF X、並びにpcDNA3.1(+)（Novagenの製品）を個々にエンドヌクレアーゼBamHI及びXhoI（両方ともTaKaRa Fermentasから購入）で二重消化した。反応系は実施例4を参考にして整えた。真核細胞発現ベクターとの遺伝子の連結、組換えプラスミドによる形質転換及び前記の同定のための工程は実施例4を参考にした。
最終的に、正確な配列決定結果を示すLhF VII遺伝子を含む組換えプラスミドをpcDNA3.1-LhF VIIと称し、LhF IX遺伝子を含む組換えプラスミドをpcDNA3.1-LhF IXと称し、LhF X遺伝子を含む組換えプラスミドをpcDNA3.1-LhF Xと称する。
鋳型としてヒト凝固第VII因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。BamHI制限部位及びKozak配列をプライマー1の配列に導入し、XhoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー2の配列に導入した。鋳型としてヒト凝固第IX因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー3及び4によりPCR増幅を実施した。BamHI制限部位、Kozak配列及びシグナルペプチド配列をプライマー3の配列に導入し、XhoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー4の配列に導入した。鋳型としてヒト凝固第X因子（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）のCDS領域を含むプラスミドを用いプライマー5及び6によりPCR増幅を実施した。BamHI制限部位、Kozak配列及びシグナルペプチド配列をプライマー5の配列に導入し、XhoI制限部位及びタンパク質精製用Hisｘ6タグをプライマー6の配列に導入した。
PCR増幅は実施例1を参考に実施した。
3．組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの真核細胞発現用組換えプラスミドの構築
実施例7でクローニングした遺伝子フラグメントLhF VII、LhF IX及びLhF X、並びにpcDNA3.1(+)（Novagenの製品）を個々にエンドヌクレアーゼBamHI及びXhoI（両方ともTaKaRa Fermentasから購入）で二重消化した。反応系は実施例4を参考にして整えた。真核細胞発現ベクターとの遺伝子の連結、組換えプラスミドによる形質転換及び前記の同定のための工程は実施例4を参考にした。
最終的に、正確な配列決定結果を示すLhF VII遺伝子を含む組換えプラスミドをpcDNA3.1-LhF VIIと称し、LhF IX遺伝子を含む組換えプラスミドをpcDNA3.1-LhF IXと称し、LhF X遺伝子を含む組換えプラスミドをpcDNA3.1-LhF Xと称する。
［実施例８］
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX及びLhF Xを発現する安定な細胞株の構築
1．細胞の調製
10％FBS（ウシ胎児血清、Hiclonyから購入）を補充したα-MEM完全培養液（Hiclonyから購入）でDG44細胞（ATCCから購入）を培養した（α-MEMはL-グルタミン、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む）。トランスフェクションの前日に、DG44細胞を4ｘ105細胞/mLで6ウェルプレートにウェル当たり2mLでシードした。
2．細胞のトランスフェクション
リポフェクタミン(商標)（LipofectamineTM）2000キットの指示にしたがい、リポソームを用いて細胞にトランスフェクトした。詳細な工程は以下の通りである:
1）細胞培養液を無血清α-MEM培養液と取替える（2mL/ウェル）。
2）真核細胞組換えプラスミドpcDNA3.1-LhF VII、pcDNA3.1-LhF IX、及びpcDNA3.1-LhF X（合計量4.0μg）を個々に250μLのOpti-MEMと混合し、一方、10μLのリポ2000（lipo2000）を250μLのOpti-MEMと混合して5分間インキュベートした。
3）2つの溶液をよく混合し、20分間インキュベートした。リポソーム複合物を細胞とともにウェルに添加し、穏やかに混合し、インキュベータに置き、37℃で培養した。
4）5時間後、培養液を10％FBS補充α-MEM完全培養液と取替えた。
3．陽性細胞クローンのスクリーニング及び増量
組換えプラスミドによるトランスフェクションの24時間後に、細胞を1：2000の比率で100mmのペトリ皿に移した。スクリーニングのために、G418（Gibcoから購入）を最終濃度800μg/mLで添加した。空ベクターをトランスフェクトした細胞又はトランスフェクションを実施しなかった細胞をコントロールとして用いた。15日後、単一コロニーを24ウェルプレートに摘みとって培養し、細胞がコンフルエンシーに達したら6ウェルプレート、100mmペトリ皿に連続的に移して培養を増量させた。細胞のコンフルエンシーが90％になったとき、1：4の割合のFBSと10％DMSO（Gibcoから購入）中で細胞を凍結した。
4．陽性細胞クローンの同定
摘みとった陽性細胞クローンをゲノムPCR及びRT-PCRによって同定した。問題のフラグメントは、融合遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれていること、及び機能的mRNAが転写されることを示す両技術で増幅させることができた。入手した安定な細胞株は、それぞれDG44-LhF VII、DG44-LhF IX、及びDG44-LhF Xと称された。
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX及びLhF Xを発現する安定な細胞株の構築
1．細胞の調製
10％FBS（ウシ胎児血清、Hiclonyから購入）を補充したα-MEM完全培養液（Hiclonyから購入）でDG44細胞（ATCCから購入）を培養した（α-MEMはL-グルタミン、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む）。トランスフェクションの前日に、DG44細胞を4ｘ105細胞/mLで6ウェルプレートにウェル当たり2mLでシードした。
2．細胞のトランスフェクション
リポフェクタミン(商標)（LipofectamineTM）2000キットの指示にしたがい、リポソームを用いて細胞にトランスフェクトした。詳細な工程は以下の通りである:
1）細胞培養液を無血清α-MEM培養液と取替える（2mL/ウェル）。
2）真核細胞組換えプラスミドpcDNA3.1-LhF VII、pcDNA3.1-LhF IX、及びpcDNA3.1-LhF X（合計量4.0μg）を個々に250μLのOpti-MEMと混合し、一方、10μLのリポ2000（lipo2000）を250μLのOpti-MEMと混合して5分間インキュベートした。
3）2つの溶液をよく混合し、20分間インキュベートした。リポソーム複合物を細胞とともにウェルに添加し、穏やかに混合し、インキュベータに置き、37℃で培養した。
4）5時間後、培養液を10％FBS補充α-MEM完全培養液と取替えた。
3．陽性細胞クローンのスクリーニング及び増量
組換えプラスミドによるトランスフェクションの24時間後に、細胞を1：2000の比率で100mmのペトリ皿に移した。スクリーニングのために、G418（Gibcoから購入）を最終濃度800μg/mLで添加した。空ベクターをトランスフェクトした細胞又はトランスフェクションを実施しなかった細胞をコントロールとして用いた。15日後、単一コロニーを24ウェルプレートに摘みとって培養し、細胞がコンフルエンシーに達したら6ウェルプレート、100mmペトリ皿に連続的に移して培養を増量させた。細胞のコンフルエンシーが90％になったとき、1：4の割合のFBSと10％DMSO（Gibcoから購入）中で細胞を凍結した。
4．陽性細胞クローンの同定
摘みとった陽性細胞クローンをゲノムPCR及びRT-PCRによって同定した。問題のフラグメントは、融合遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれていること、及び機能的mRNAが転写されることを示す両技術で増幅させることができた。入手した安定な細胞株は、それぞれDG44-LhF VII、DG44-LhF IX、及びDG44-LhF Xと称された。
［実施例９］
組換え真核細胞プラスミドによって発現される組換えタンパク質Lhf VII、LhF IX、及びLhF Xの収集
1．細胞DG44-LhF VII、DG44-LhF IX、DG44-LhF Xを、400μg/mLのG418を補充した10％FBS含有α-MEM完全培養液でそれぞれ培養し、10プレートに継代した。
2．各プレートの細胞が90％を超えるコンフルエンシーに達したときに、10％FBS含有α-MEM完全培養液をCHO無血清培養液と取替え、さらにビタミンK（Sigma）を最終濃度1μg/mLで補充した。
3．培養3日後に、培養上清を収集して遠心分離した。細胞ペレットを廃棄した。PEG20000（Merck）により上清を5倍濃縮し、コバルトイオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、SDS-PAGE及びウェスタンブロットによって確認した。全ての工程は実施例6の工程を参考にした。
組換え真核細胞プラスミドによって発現される組換えタンパク質Lhf VII、LhF IX、及びLhF Xの収集
1．細胞DG44-LhF VII、DG44-LhF IX、DG44-LhF Xを、400μg/mLのG418を補充した10％FBS含有α-MEM完全培養液でそれぞれ培養し、10プレートに継代した。
2．各プレートの細胞が90％を超えるコンフルエンシーに達したときに、10％FBS含有α-MEM完全培養液をCHO無血清培養液と取替え、さらにビタミンK（Sigma）を最終濃度1μg/mLで補充した。
3．培養3日後に、培養上清を収集して遠心分離した。細胞ペレットを廃棄した。PEG20000（Merck）により上清を5倍濃縮し、コバルトイオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、SDS-PAGE及びウェスタンブロットによって確認した。全ての工程は実施例6の工程を参考にした。
［実施例１０］
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの抗菌活性の検出
1．大腸菌DH5αを例にとった。大腸菌DH5αをLB固形培地上でストリーキングして培養した。続いて、典型的なクローンを摘みとり、通常のLB液体培地に接種し、185rpmで振盪しながら対数増殖期（OD600が約0.5）に達するまで37℃で培養した。細菌培養を4000ｘgで3分間遠心分離し、上清を廃棄し菌体を新しいLB培地に再懸濁した。
2．上記に記載の細菌懸濁物を希釈し、96ウェルプレートにウェル当たり100μLの総体積及び5ｘ105CFU/mLの細菌数で接種した。
3．組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xを、最高のタンパク質濃度のウェルの最終タンパク質濃度が50μg/mLとなるように個々に上記に記載のウェルに添加した。この最終濃度に基づいて、50、25及び12.5μg/mLから成るタンパク質濃度勾配が得られるまで２倍連続希釈を実施した。3列のウェルを当該各濃度勾配について整えた。一方、無細菌のブランクウェル及び細菌のみの無タンパク質ウェルを各グループにつき3列準備した。
4．上記に記載の96ウェルプレートを37℃の振盪インキュベータに置き、175rpmで振盪しながら培養した。サンプルを30分毎に採取し、600nmの波長の吸収値を紫外線分光光度計下で決定し、阻害曲線を作成した。MICの判定：培養8時間後に、増殖を裸眼で観察するか、又は紫外線分光光度計下で600nmの波長で判定される最小阻害濃度MICは、細菌の増殖がない組換えタンパク質の最低濃度と定義される。
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xで処理された大腸菌DF5αの増殖曲線は図22−24に示される。図22−24から、組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF XはDH5αの増殖に顕著な阻害作用を有すること、及び組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xに対するMICはそれぞれ25μg/mLであることを知ることができる。
5．グラム陰性細菌、例えば大腸菌BL21、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、セラチア・マルセッセンスの増殖における組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの作用を、大腸菌DH5αに対する試験と同じ方法で試験した。これらの細菌に対するMICを下記の表に列挙した。
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの抗菌活性の検出
1．大腸菌DH5αを例にとった。大腸菌DH5αをLB固形培地上でストリーキングして培養した。続いて、典型的なクローンを摘みとり、通常のLB液体培地に接種し、185rpmで振盪しながら対数増殖期（OD600が約0.5）に達するまで37℃で培養した。細菌培養を4000ｘgで3分間遠心分離し、上清を廃棄し菌体を新しいLB培地に再懸濁した。
2．上記に記載の細菌懸濁物を希釈し、96ウェルプレートにウェル当たり100μLの総体積及び5ｘ105CFU/mLの細菌数で接種した。
3．組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xを、最高のタンパク質濃度のウェルの最終タンパク質濃度が50μg/mLとなるように個々に上記に記載のウェルに添加した。この最終濃度に基づいて、50、25及び12.5μg/mLから成るタンパク質濃度勾配が得られるまで２倍連続希釈を実施した。3列のウェルを当該各濃度勾配について整えた。一方、無細菌のブランクウェル及び細菌のみの無タンパク質ウェルを各グループにつき3列準備した。
4．上記に記載の96ウェルプレートを37℃の振盪インキュベータに置き、175rpmで振盪しながら培養した。サンプルを30分毎に採取し、600nmの波長の吸収値を紫外線分光光度計下で決定し、阻害曲線を作成した。MICの判定：培養8時間後に、増殖を裸眼で観察するか、又は紫外線分光光度計下で600nmの波長で判定される最小阻害濃度MICは、細菌の増殖がない組換えタンパク質の最低濃度と定義される。
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xで処理された大腸菌DF5αの増殖曲線は図22−24に示される。図22−24から、組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF XはDH5αの増殖に顕著な阻害作用を有すること、及び組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xに対するMICはそれぞれ25μg/mLであることを知ることができる。
5．グラム陰性細菌、例えば大腸菌BL21、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、セラチア・マルセッセンスの増殖における組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの作用を、大腸菌DH5αに対する試験と同じ方法で試験した。これらの細菌に対するMICを下記の表に列挙した。
［実施例１１］
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの抗菌活性の決定
1．実験動物はオスのBALB/Cマウスであり（体重は約18−22g、Sichuan Universityから入手）、8匹/グループで11グループに割り当て、そのうちの3グループは実験グループであり、残りは種々のコントロールグループである。
2．緑膿菌の細菌懸濁物（Sichuan Universityから入手）をLB固形培地上でストリーキングし、37℃で一晩（約12時間）振盪しながら培養し、続いて4000ｘgで3分間遠心分離した。上清を廃棄し、細菌ペレットを先で使用するために生理学的食塩水に再懸濁した。
3．無菌操作にしたがって、組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xを個々に100μg/mLの濃度のサンプルに生理学的食塩水で処方し、先で使用するために氷上で維持した。
4．ペニシリン及びメロペネムを個々に無菌生理学的食塩水に溶解し、60kgの成人の体表面積を基準にしてオスBALB/Cマウスで臨床的に同等な用量に換算した。ペニシリンの臨床的に同等な用量は9.1mg/動物で、メロペネムのそれは1.5mg/動物である。
5．致死用量の緑膿菌を含む細菌懸濁物を、個々の実験動物グループ及び3つのコントロールグループのオスのBALB/Cマウスの腹腔内に500μL/動物の投与量で注射した。
6．3つの実験グループのオスBALB/Cマウスに細菌を30分感染させた後、第一の実験グループのマウスに組換えタンパク質LhF VII（50μg/動物）を尾から、第二の実験グループのマウスに組換えタンパク質LhF IX（100μg/動物）を尾から、第三の実験グループのマウスに組換えタンパク質LhF X（100μg/動物）を尾から投与した。3つのコントロールグループのオスBALB/Cマウスに細菌を30分感染させた後、第一及び第二のコントロールグループのマウスにペニシリン（9.1mg/動物）及びメロペネム（1.5mg/動物）をそれぞれ尾から投与し、第三のコントロールグループのマウスには投与しなかった。残りのコントロールグループ（すなわち第四、第五、第六、第七、第八コントロールグループ）には緑膿菌の細菌懸濁物を注射しなかったが、第一、第二及び第三の実験グループの用量と同じ用量の組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xをそれぞれ注射し、さらに第一及び第二のコントロールグループの用量と同じ用量のペニシリン及びメロペネムをそれぞれ注射した。
7．投与後72時間に、個々の実験グループ及び個々のコントロールグループのオスBALB/Cマウスに第一回目の投与と同じタイプ及び同じ用量の医薬を第二回目として投与した。
8．投与後、オスのBALB/Cマウスを24時間毎に1回観察し、当該マウスの生存状態を記録した。15日目に全動物をサクリファイスした。
生存率＝生存マウス/8ｘ100％
実験結果：本発明に示す組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xは、致死用量の緑膿菌を感染させたマウスの100％を14日間生存させることができる。第二のコントロールグループ（メロペネムグループ）のマウスの生存率は14日後には100％であったが、第一のコントロールグループ（ペニシリングループ）のマウスはいずれも死亡した。致死用量の緑膿菌を感染させたマウスの生存率は図25−27に示されている。第四、第五、第六、第七、及び第八コントロールグループのマウスは全て生存した。
前記実験結果は、本発明に示す組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xはグラム陰性細菌に対して動物で阻害作用を有すること、さらに毒性が低く動物を死亡させないことを示している。
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xの抗菌活性の決定
1．実験動物はオスのBALB/Cマウスであり（体重は約18−22g、Sichuan Universityから入手）、8匹/グループで11グループに割り当て、そのうちの3グループは実験グループであり、残りは種々のコントロールグループである。
2．緑膿菌の細菌懸濁物（Sichuan Universityから入手）をLB固形培地上でストリーキングし、37℃で一晩（約12時間）振盪しながら培養し、続いて4000ｘgで3分間遠心分離した。上清を廃棄し、細菌ペレットを先で使用するために生理学的食塩水に再懸濁した。
3．無菌操作にしたがって、組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xを個々に100μg/mLの濃度のサンプルに生理学的食塩水で処方し、先で使用するために氷上で維持した。
4．ペニシリン及びメロペネムを個々に無菌生理学的食塩水に溶解し、60kgの成人の体表面積を基準にしてオスBALB/Cマウスで臨床的に同等な用量に換算した。ペニシリンの臨床的に同等な用量は9.1mg/動物で、メロペネムのそれは1.5mg/動物である。
5．致死用量の緑膿菌を含む細菌懸濁物を、個々の実験動物グループ及び3つのコントロールグループのオスのBALB/Cマウスの腹腔内に500μL/動物の投与量で注射した。
6．3つの実験グループのオスBALB/Cマウスに細菌を30分感染させた後、第一の実験グループのマウスに組換えタンパク質LhF VII（50μg/動物）を尾から、第二の実験グループのマウスに組換えタンパク質LhF IX（100μg/動物）を尾から、第三の実験グループのマウスに組換えタンパク質LhF X（100μg/動物）を尾から投与した。3つのコントロールグループのオスBALB/Cマウスに細菌を30分感染させた後、第一及び第二のコントロールグループのマウスにペニシリン（9.1mg/動物）及びメロペネム（1.5mg/動物）をそれぞれ尾から投与し、第三のコントロールグループのマウスには投与しなかった。残りのコントロールグループ（すなわち第四、第五、第六、第七、第八コントロールグループ）には緑膿菌の細菌懸濁物を注射しなかったが、第一、第二及び第三の実験グループの用量と同じ用量の組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xをそれぞれ注射し、さらに第一及び第二のコントロールグループの用量と同じ用量のペニシリン及びメロペネムをそれぞれ注射した。
7．投与後72時間に、個々の実験グループ及び個々のコントロールグループのオスBALB/Cマウスに第一回目の投与と同じタイプ及び同じ用量の医薬を第二回目として投与した。
8．投与後、オスのBALB/Cマウスを24時間毎に1回観察し、当該マウスの生存状態を記録した。15日目に全動物をサクリファイスした。
生存率＝生存マウス/8ｘ100％
実験結果：本発明に示す組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xは、致死用量の緑膿菌を感染させたマウスの100％を14日間生存させることができる。第二のコントロールグループ（メロペネムグループ）のマウスの生存率は14日後には100％であったが、第一のコントロールグループ（ペニシリングループ）のマウスはいずれも死亡した。致死用量の緑膿菌を感染させたマウスの生存率は図25−27に示されている。第四、第五、第六、第七、及び第八コントロールグループのマウスは全て生存した。
前記実験結果は、本発明に示す組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xはグラム陰性細菌に対して動物で阻害作用を有すること、さらに毒性が低く動物を死亡させないことを示している。
［実施例１２］
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xによる内毒素（LPS）破壊の質量分析による検出
1．実施例6で得た組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X で1mg/mLの大腸菌K12 LPS（Sigma）を処理した。本系は以下のように設定された：
実験グループ： 0.5μg/μL LhF VII、LhF IX、又はLhF X 120μL
1mg/mL LPS 250μL
生理学的食塩水 30μL
コントロールグループ１： 0.5μg/μL LhF VII、LhF IX、又はLhF X 120μL
生理学的食塩水 280μL
コントロールグループ２： TBS 120μL
1mg/mL LPS 250μL
生理学的食塩水 30μL
2．上記に記載の系を150rpmで37℃にて一晩インキュベートした。インキュベーション完了後に、サンプルを17000gの最大回転速度で5分間遠心分離した。遠心分離の完了後に上清を収集した。
3．上清を脱イオン水の透析緩衝液に対して100D透析バッグで16時間透析した。透析完了後に、処理サンプルをMALDI-TOFで分析した。
4．最後に、33％アルコールに溶解した10mg/mLの2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）1μLを1μLのサンプルと一緒によく混合した。
5．DHBと混合したサンプルをステンレススチールのターゲットプレートMTP384（Bruker Daltonics）に滴下し、続いてターゲットプレート上のサンプルを熱風で完全に乾燥させた。
6．乾燥後に、Autoflex TOF/TOF II装置（Bruker）を用い、陽イオンモード下で377nmの窒素レーザービームにより分析を実施した。操作はFlexControl 2.2.ソフトによって制御した。全質量スペクトルを加速電圧90kV及び反射電圧20kVの反射モードで入手した。140nsの陽イオンモード下でパルスを励起した。走査範囲は600から7000の質量対電荷比内である。データ収集時間は平均して500レーザーパルスで、そのうちの最小レーザーエネルギーは十分なシグナル対ノイズ比を達成できなければならない。質量分析で生じるピークをBruker Flex分析ソフト（バージョン3.0）を用いて入手した。
7．ポストソース分解（PSD）質量スペクトルを、Bruker Daltonics LIFT系を用い前駆体イオン加速電圧18.96kV及びフラグメント加速電圧4.37kV（LIFT）で記録した。反射電圧1及び2をそれぞれ23.49kV及び9.69kVに設定した。
実験スペクトルをLhF VIIで実証し、結果は図28に示されている。未処理LPSに由来する明瞭なピークが存在し（中央）、当該m/z 2318.4のピークは、LhF VIIで処理した後のLPSの質量スペクトル（下）には存在せず、軽鎖タンパク質によるLPSの加水分解を示している。したがって、本発明に示すLhF VII、LhF IX、及びLhF XはLPSを加水分解でき、内毒素血症の治療に有用である。
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xによる内毒素（LPS）破壊の質量分析による検出
1．実施例6で得た組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF X で1mg/mLの大腸菌K12 LPS（Sigma）を処理した。本系は以下のように設定された：
実験グループ： 0.5μg/μL LhF VII、LhF IX、又はLhF X 120μL
1mg/mL LPS 250μL
生理学的食塩水 30μL
コントロールグループ１： 0.5μg/μL LhF VII、LhF IX、又はLhF X 120μL
生理学的食塩水 280μL
コントロールグループ２： TBS 120μL
1mg/mL LPS 250μL
生理学的食塩水 30μL
2．上記に記載の系を150rpmで37℃にて一晩インキュベートした。インキュベーション完了後に、サンプルを17000gの最大回転速度で5分間遠心分離した。遠心分離の完了後に上清を収集した。
3．上清を脱イオン水の透析緩衝液に対して100D透析バッグで16時間透析した。透析完了後に、処理サンプルをMALDI-TOFで分析した。
4．最後に、33％アルコールに溶解した10mg/mLの2,5-ジヒドロキシ安息香酸（DHB）1μLを1μLのサンプルと一緒によく混合した。
5．DHBと混合したサンプルをステンレススチールのターゲットプレートMTP384（Bruker Daltonics）に滴下し、続いてターゲットプレート上のサンプルを熱風で完全に乾燥させた。
6．乾燥後に、Autoflex TOF/TOF II装置（Bruker）を用い、陽イオンモード下で377nmの窒素レーザービームにより分析を実施した。操作はFlexControl 2.2.ソフトによって制御した。全質量スペクトルを加速電圧90kV及び反射電圧20kVの反射モードで入手した。140nsの陽イオンモード下でパルスを励起した。走査範囲は600から7000の質量対電荷比内である。データ収集時間は平均して500レーザーパルスで、そのうちの最小レーザーエネルギーは十分なシグナル対ノイズ比を達成できなければならない。質量分析で生じるピークをBruker Flex分析ソフト（バージョン3.0）を用いて入手した。
7．ポストソース分解（PSD）質量スペクトルを、Bruker Daltonics LIFT系を用い前駆体イオン加速電圧18.96kV及びフラグメント加速電圧4.37kV（LIFT）で記録した。反射電圧1及び2をそれぞれ23.49kV及び9.69kVに設定した。
実験スペクトルをLhF VIIで実証し、結果は図28に示されている。未処理LPSに由来する明瞭なピークが存在し（中央）、当該m/z 2318.4のピークは、LhF VIIで処理した後のLPSの質量スペクトル（下）には存在せず、軽鎖タンパク質によるLPSの加水分解を示している。したがって、本発明に示すLhF VII、LhF IX、及びLhF XはLPSを加水分解でき、内毒素血症の治療に有用である。
［実施例１３］
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xによって加水分解された大腸菌K12 LPSの銀染色による検出
1．実施例6で入手した組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xと一緒にLPSサンプルをそれぞれインキュベートした。コントロールグループはTBS緩衝液と一緒にインキュベートしたLPSサンプルであった。インキュベーションは一晩続けた。その後遠心分離を実施してペレットを収集した。
2．LPSのための1ｘのローディング緩衝液（10g/L SDS、100g/Lシュクロース、0.5％β-メルカプトエタノール、10mg/Lブロモフェノールブルーを含む0.05Mトリス-HCl（pH6.8））を処理ペレットのサンプルと混合し、金属浴にて5分間100℃でインキュベートした。
3．分離ゲル（15％）をよく混合して調製した。分離ゲルの上部に水を重層した。分離ゲルは4mol/Lの尿素（Bio-Rad）を含み厚さは1.0mmを有する。詳細な組成は以下の通りである：1.15mLの脱イオン水、2.5mLの30％アクリルアミド、1.3mLの1.5mol/Lトリス-HCl （pH8.8、10％のSDSを含む）、50μLの10％過硫酸アンモニウム、4μLのTEMED。
4．以下のように5％のスタッキングゲルを調製した：下記（1.42 mLの脱イオン水、0.33mLの30％アクリルアミド、0.25mLの1mol/Lトリス-HCl（pH6.8、10％のSDSを含む）、20μLの10％過硫酸アンモニウム、4μLのTEMED）をよく混合して注ぎ入れた。10ウェルの櫛を迅速に挿入した。
5．ゲルを調製した後でサンプルをロードした。続いて、ゲルを120Vの電圧で泳動してサンプルを分離させた。泳動後、ゲルを採取して銀染色を開始した。ゲルをトレーに移し脱イオン水で徹底的に洗浄し、続いてゲルを3回脱イオン水で洗浄した。
6．洗浄完了後、ゲルを酸化のために50mLの固定溶液（30％アルコール、10％氷酢酸、7g/L過ヨウ素酸）で室温にて25分間固定した。固定完了後に、ゲルを毎回脱イオン水で3回5分間洗浄した。
7．洗浄完了後、ゲルを100mLのAgNO3（1g/L）中で室温にて40分間染色した。染色完了後、ゲルを1回ddH2Oで洗浄した。
8．ゲルを予め氷上で冷却した50mLのNa2CO3（30g/L）に移した（前記には可視化直前に0.02％のホルムアルデヒドが添加される）。バンドが出現したとき、又はバンドが暗色になり始めたとき、6mLの氷酢酸を添加して反応を停止させた。前記停止溶液を停止反応完了時に除去し、ゲルを脱イオン水中で維持した。
銀染色図は、図29に示すようにLhF VIIで実証した。LhF VIIで処理した後、LPSバンドは明瞭に減少し弱くなり、軽鎖タンパク質はLPSの大半を排除することを示した。したがって、本発明に示すLhF VII、LhF IX、及びLhF XはLPSを加水分解でき、内毒素血症の治療に有用であり得る。
組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xによって加水分解された大腸菌K12 LPSの銀染色による検出
1．実施例6で入手した組換えタンパク質LhF VII、LhF IX、及びLhF Xと一緒にLPSサンプルをそれぞれインキュベートした。コントロールグループはTBS緩衝液と一緒にインキュベートしたLPSサンプルであった。インキュベーションは一晩続けた。その後遠心分離を実施してペレットを収集した。
2．LPSのための1ｘのローディング緩衝液（10g/L SDS、100g/Lシュクロース、0.5％β-メルカプトエタノール、10mg/Lブロモフェノールブルーを含む0.05Mトリス-HCl（pH6.8））を処理ペレットのサンプルと混合し、金属浴にて5分間100℃でインキュベートした。
3．分離ゲル（15％）をよく混合して調製した。分離ゲルの上部に水を重層した。分離ゲルは4mol/Lの尿素（Bio-Rad）を含み厚さは1.0mmを有する。詳細な組成は以下の通りである：1.15mLの脱イオン水、2.5mLの30％アクリルアミド、1.3mLの1.5mol/Lトリス-HCl （pH8.8、10％のSDSを含む）、50μLの10％過硫酸アンモニウム、4μLのTEMED。
4．以下のように5％のスタッキングゲルを調製した：下記（1.42 mLの脱イオン水、0.33mLの30％アクリルアミド、0.25mLの1mol/Lトリス-HCl（pH6.8、10％のSDSを含む）、20μLの10％過硫酸アンモニウム、4μLのTEMED）をよく混合して注ぎ入れた。10ウェルの櫛を迅速に挿入した。
5．ゲルを調製した後でサンプルをロードした。続いて、ゲルを120Vの電圧で泳動してサンプルを分離させた。泳動後、ゲルを採取して銀染色を開始した。ゲルをトレーに移し脱イオン水で徹底的に洗浄し、続いてゲルを3回脱イオン水で洗浄した。
6．洗浄完了後、ゲルを酸化のために50mLの固定溶液（30％アルコール、10％氷酢酸、7g/L過ヨウ素酸）で室温にて25分間固定した。固定完了後に、ゲルを毎回脱イオン水で3回5分間洗浄した。
7．洗浄完了後、ゲルを100mLのAgNO3（1g/L）中で室温にて40分間染色した。染色完了後、ゲルを1回ddH2Oで洗浄した。
8．ゲルを予め氷上で冷却した50mLのNa2CO3（30g/L）に移した（前記には可視化直前に0.02％のホルムアルデヒドが添加される）。バンドが出現したとき、又はバンドが暗色になり始めたとき、6mLの氷酢酸を添加して反応を停止させた。前記停止溶液を停止反応完了時に除去し、ゲルを脱イオン水中で維持した。
銀染色図は、図29に示すようにLhF VIIで実証した。LhF VIIで処理した後、LPSバンドは明瞭に減少し弱くなり、軽鎖タンパク質はLPSの大半を排除することを示した。したがって、本発明に示すLhF VII、LhF IX、及びLhF XはLPSを加水分解でき、内毒素血症の治療に有用であり得る。
Claims (8)
- グラム陰性細菌によって生じる疾患を治療する医薬の調製における、ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質又は該ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質を含む医薬組成物の使用であって、該タンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3に記載される、前記使用。
- 前記タンパク質が、原核細胞組換えプラスミドから発現されるか、真核細胞組換えプラスミドから発現されるか、又は化学的合成によって調製されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
- グラム陰性細菌によって生じる疾患が内毒素血症であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
- 前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、 シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス及びセラチア・マルセッセンスから選択される１以上であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の使用。
- リポ多糖類を加水分解する製品の調製における、ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質又は該ヒト凝固因子軽鎖遺伝子によってコードされるタンパク質を含む組成物の使用であって、該タンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号:1、配列番号:2又は配列番号:3に記載される、前記使用。
- 前記タンパク質が、原核細胞組換えプラスミドから発現されるか、真核細胞組換えプラスミドから発現されるか、又は化学的合成によって調製されることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
- 前記リポ多糖類が、グラム陰性細菌のリポ多糖類であることを特徴とする、請求項５又は６に記載の使用。
- 前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、 シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス及びセラチア・マルセッセンスから選択される１以上であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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