JP6440170B2 - キメラ一本鎖アンチセンスポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤 - Google Patents
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Description
(1) 以下のものを含むキメラアンチセンスポリヌクレオチド:
少なくとも5個のヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域;
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域;
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域;および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで:上記の第2の5'ウイング領域は上記の第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、且つ少なくとも1個の低タンパク質親和性ヌクレオチドを含み;また
上記の第2の3'ウイング領域は上記の第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、且つ少なくとも1個の低タンパク質親和性ヌクレオチドを含む、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域;
であって、ここでヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび低タンパク質親和性ヌクレオチドの総数は100ヌクレオチド以下である、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(2) 以下のものを含むキメラアンチセンスポリヌクレオチド:
少なくとも5個のヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域;
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域;
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域;および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで:上記の第2の5'ウイング領域は上記の第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損し;また
上記の第2の3'ウイング領域は上記の第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損する、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域
であって、ここでヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの総数は100ヌクレオチド以下である、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(3) 上記の中央ヌクレオチド領域が、RNAポリヌクレオチドにハイブリダイズすると、中央ヌクレオチド領域/RNAポリヌクレオチド二本鎖がRNaseHによって認識されるヌクレオチドを含む、項目(1または2)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(4) 上記の中央ヌクレオチド領域のヌクレオチドが、DNAおよびホスホロチオエートDNAヌクレオチドから独立して選択される、項目(3)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(5) 上記の中央ヌクレオチド領域が、5〜20個のDNAヌクレオチドを含む、項目(4)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(6)上記の中央ヌクレオチド領域が、5〜12個のDNAヌクレオチドを含む、項目(4)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(7) 上記の中央ヌクレオチド領域が、RNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含む、項目(1または2)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(9) 上記の中央ヌクレオチド領域が、2'-O-Me RNAヌクレオチドおよび2'-O-メトキシエチルRNAヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドを含む、項目(8)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(10) 上記の中央ヌクレオチド領域内のヌクレオチドの少なくとも1個がホスホロチオエート化されている、項目(1〜9)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(11) 上記の中央ヌクレオチド領域内の全ヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、項目(10)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(12) 第1のウイング領域内のヌクレオチドが架橋ヌクレオチドである、項目(1〜11)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(13) 上記の架橋ヌクレオチドが、LNA、cEt BNA、アミドBNA、およびcMOE BNAから独立して選択される、項目(1〜12)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(14) 上記の中央ヌクレオチド領域および第1のウイング領域(1つまたは複数)内のヌクレオチドアナログの少なくとも1個がホスホロチオエート化されている、項目(1〜13)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(15) 上記の低タンパク質親和性ヌクレオチドが、2'-O-メチルRNAヌクレオチド、2'-O-メトキシエチルRNAヌクレオチド、LNA、cMOE BNA、2-フルオロRNAヌクレオチド、ボラノホスフェートヌクレオチド、メチルホスホネートヌクレオチド、ホスホロアミダイトヌクレオチド、5-メチルシトシン、UNAおよび5-プロピニルウリジンから独立して選択される、項目(1〜14)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(16) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、上記の第2の5'ウイング領域を含む、項目(1〜15)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(17) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、上記の第2の3'ウイング領域を含む、項目(1〜15)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(18) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、上記の第2の5'ウイング領域および上記の第2の3'ウイング領域を含む、項目(1〜15)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(19) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、キメラアンチセンスポリヌクレオチドの3'末端および/または5'末端に連結された機能性部分をさらに含む、項目(1〜18)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(21) 上記の機能性部分が、切断可能なリンカー部分を介してキメラアンチセンスポリヌクレオチドに連結されている、項目(19)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(22) 上記の機能性部分が、脂質、ペプチド、およびタンパク質から選択される分子である、項目(19)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(23) 上記の脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質、およびグリセリドから選択される、項目(22)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(24) 上記の脂質が、コレステロール、トコフェロール、およびトコトリエノールから選択される、項目(22)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(25) 上記のペプチドが、受容体リガンドフラグメントおよび抗体フラグメントから選択される、項目(22)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(26) 上記のタンパク質が、受容体リガンドおよび抗体から選択される、項目(22)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(27) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、25℃で、100mM塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中で細胞転写産物にハイブリダイズし得る、項目(1または2)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(28) 上記の中央領域が、キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る細胞転写産物に完全に相補的である、項目(27)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(29) 上記の第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域が、上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る細胞転写産物に前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズする場合に少なくとも1個のミスマッチ塩基を含む、項目(27)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(30) 上記の第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域の全ての塩基がミスマッチしている、項目(29)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(32) 上記の相補鎖が、上記の3'末端および/または5'末端に連結された機能性部分をさらに含む、項目(31)のキメラアンチセンスポリヌクレオチドを含む二本鎖アンチセンス剤。
(33) 上記の機能性部分が、標識機能、精製機能、および標的送達機能から独立して選択される機能を有する、項目(32)の二本鎖アンチセンス剤。
(34) 上記の機能性部分が、切断可能なリンカー部分を介して上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドおよび/または相補鎖に独立して連結される、項目(32)の二本鎖アンチセンス剤。
(35) 上記の機能性部分が、脂質、ペプチド、およびタンパク質から独立して選択される分子である、項目(32)の二本鎖アンチセンス剤。
(36) 上記の脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質、およびグリセリドから独立して選択される、項目(35)の二本鎖アンチセンス剤。
(37) 上記の脂質が、コレステロール、トコフェロール、およびトコトリエノールから独立して選択される、項目(35)の二本鎖アンチセンス剤。
(38) 上記のペプチドが、受容体リガンドフラグメントおよび抗体フラグメントから独立して選択される、項目(35)の二本鎖アンチセンス剤。
(39) 上記のタンパク質が、受容体リガンドおよび抗体から独立して選択される、項目(35)の二本鎖アンチセンス剤。
(40) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、25℃で、100mM塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中で細胞転写産物にハイブリダイズし得る、項目(31)のキメラアンチセンスポリヌクレオチドを含む二本鎖アンチセンス剤。
(42) 細胞内の転写産物の機能を改変する方法であって、項目(1〜30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは項目(31-40)のいずれか1つの二本鎖アンチセンス剤を含む組成物を細胞に投与するステップを含む、前記方法。
(43) 細胞内のタンパク質の発現レベルを変化させる方法であって、項目(1〜30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは項目(31-40)のいずれか1つの二本鎖アンチセンス剤を含む組成物を細胞に投与するステップを含む、前記方法。
(44) 細胞内のタンパク質構造を変化させる方法であって、項目(1〜30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは項目(31-40)のいずれか1つの二本鎖アンチセンス剤を含む組成物を細胞に投与するステップを含む、前記方法。
(45) 変化する標的遺伝子の発現レベル、機能またはエディティングによって特徴づけられる症状を有する患者を治療する方法であって、上記の患者に、以下のもの:
(a) 少なくとも1つの項目(1〜30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは項目(31-40)のいずれか1つの二本鎖アンチセンス剤;および
(b) 製薬上許容可能な担体
を含む治療上有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
少なくとも5個のヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域;
1〜10個のヌクレオチドアナログを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域;
1〜10個のヌクレオチドアナログを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域;および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで:上記の第2の5'ウイング領域は上記の第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、且つ少なくとも1個の低タンパク質親和性ヌクレオチドを含み;また
上記の第2の3'ウイング領域は上記の第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、且つ少なくとも1個の低タンパク質親和性ヌクレオチドを含む、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域;
ここでヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および低タンパク質親和性ヌクレオチドの総数は100ヌクレオチド以下である。
少なくとも5個のヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域;
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域;
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域;および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで:上記の第2の5'ウイング領域は上記の第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損し;また
上記の第2の3'ウイング領域は上記の第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損する、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域、
ここでヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの総数は100ヌクレオチド以下である。
(i) RNAヌクレオチドおよび場合によりヌクレオチドアナログ、また場合により低タンパク質親和性ヌクレオチド、さらに場合によりDNAヌクレオチド;あるいは
(ii) DNAヌクレオチドおよび/もしくはヌクレオチドアナログならびに/または低タンパク質親和性ヌクレオチド;あるいは
(iii) PNAヌクレオチド。
R1およびR2(互いに同一であっても異なっていてもよい)は、それぞれ、水素原子、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、または-P(R4)R5(ここで、R4およびR5(互いに同一であっても異なっていてもよい)は、それぞれ、ヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1〜5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1〜5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1〜6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、または1〜5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す)を表す。
本発明の一実施形態によるキメラポリヌクレオチドの阻害効力を、2つの従来のギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較する実験を行った。ポリヌクレオチド構造および実験の結果は図7に示される。対照ギャップマーは、長さ13塩基(ApoB1 ASO 13mer;配列番号6)、および長さ20塩基(ApoB1 ASO 20mer-4;配列番号2)である。13mer対照は、8個のホスホロチオエート化DNAヌクレオチドの中央領域、2個のLNA塩基の第1の5'ウイング領域、および3個のLNA塩基の第1の3'ウイング領域を有するが、いずれの側にも第2のウイングは有していない。20mer対照は13merと同じ構造を有し、5'末端に4個のホスホロチオエート化2'-O-Me RNA塩基を、また3'末端に3個のホスホロチオエート化2'-O-Me RNA塩基を付加している。開示によれば、これらの塩基は低タンパク質親和性ヌクレオチドではなく(これらはホスホロチオエート化されているため)、このためこれらの塩基は第2の5'または3'ウイング領域を構成しない。これらは実際に、第1のウイング領域の一部として分類される(また従って、20mer対照は、6塩基の5'ウイング領域と6塩基のの3'ウイング領域とを有するギャップマーである)。
第2の5'ウイング領域、第2の3'ウイング領域、または両方ウイング領域のいずれかを有する本発明の実施形態によるキメラポリヌクレオチドの阻害効力を比較する実験を行った。これらのポリヌクレオチド構造および実験結果は、図8Aに示される。2つの従来のギャップマー対照を、3つの異なるキメラポリヌクレオチドの阻害効力と比較した。
次に、マウスにおいて、キメラポリヌクレオチドをin vivoで試験した。ASOプローブと対照の配列および設計は図9に示される。ASOは、それぞれ尾静脈を介して3.0mg/kgの量でマウスに静脈注射した。マウスは、体重20〜25gの4週齢の雌のICRマウスであった。マウスを使用した実験は全て、n = 3で実施した。さらにまた、陰性対照群として、一本鎖ASOまたは二本鎖核酸複合体の代わりにPBSのみを注射したマウスも作製した。注射の72時間後、マウスにPBSを灌流させ、その後マウスを解剖して肝臓を摘出した。続いて、実施例1に記載される方法と同じ方法によって、mRNAの抽出、cDNAの合成、および定量RT-PCRを実施し、mApoBの発現量/mGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量を計算し、PBSを投与した群(PBSのみ)と核酸を投与した群の間の比較を行った。このようにして得られた結果は図9に示される。
Toc(トコフェロール)-HDOの設計および合成。様々な長さ(13-〜23-mer)の一連のDNA-LNAギャップマー(gapmer)またはキメラマー(chimeramer)が、マウスApoB mRNA(NM_009693)を標的とするように設計され、Gene Design(大阪、日本)およびHokkaido System Science(札幌、日本)によって合成された。
1) ApoB1 13mer、
5'-G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号1);
2) ApoB1 Toc13merPS(-)、
5'-Toc_G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号1);
3) ApoB1 Toc17merPS(-)、
5'-Toc-U(X)-C(X)-C(X)-A(X)-G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号2);
4) ApoB1 Toc20merPS(-)、
5'-Toc-A(X)-A(X)-G(X)-U(X)-C(X)-C(X)-A(X)-G(L)^C(L)
^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号3);
5) ApoB1 Toc20merPS(+)
5'-Toc^A(X)^A(X)^G(X)^U(X)^C(X)^C(X)^A(X)^G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号4);および
6) ApoB1 TocPEG13mer
5'-Toc^スペーサー18^G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号1);
ここで、小文字はDNAを表し、括弧内に示される大文字のLはLNAを表し(大文字のCはLNAメチルシトシンを示す)、括弧内に示される大文字のXは、UNAまたは2'-O-メチル糖修飾を表し、山形マークはホスホロチオエート結合を表す。
病原体除去動物施設において、4〜5週齢の野生型Crlj:CD1(ICR)マウス(Oriental Yeast、東京、日本)を12時間の明/暗周期に維持し、食餌と水を自由に摂取させた。ASOギャップマーまたはキメラマーを、体重に基づく尾静脈注射によってマウスに投与した。オリゴヌクレオチドは全てPBS中で製剤化し、PBSは対照としても使用した。オリゴヌクレオチドを0.75〜6mg/kgの1回注射によって野生型マウスに投与した。死後分析のため、60mg/kgのペントバルビタールを腹腔内に投与することによってマウスを最初に深く麻酔し、次いで、瞬目反射がないことを確認した後、PBSを用いる経心臓的灌流によって屠殺した。動物実験は全て、東京医科歯科大学の動物実験のための倫理的および安全性ガイドライン(#0140144A)に従って実施した。
Isogen II(ニッポンジーン(Nippon Gene))を用いてマウス肝臓から全RNAを抽出した。全RNA(45マイクログラム)を、18%ポリアクリルアミド-尿素ゲル中の電気泳動によって分離し、Hybound-N+膜(Amersham Biosciences、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)に転写した。このブロットを、DIGオリゴヌクレオチド3'末端標識キット、第2世代(Roche Diagnostics)を使用してジゴキシゲニン-ddUTPで標識した、cRNA配列に対応するプローブ、またはマウス U6ミクロRNA配列(内部対照)とハイブリダイズさせた。ギャップマーまたはキメラマーを検出するためのDNAプローブの配列は、5'-TGAATACCAATGCTG-3'であった。シグナルは、Gene Images CDP-star Detection Kit(Amersham Biosciences)によって可視化した。このようにして得られた結果は、図10に示される。
次に、マウスにおいて、二本鎖アンチセンス剤をin vivoで試験した。様々なアンチセンスプローブおよび相補鎖の配列および設計は、図16Aに示される。相補鎖において、トコフェロール(Toc)は5'末端に結合している。このようにして、二本鎖剤、また恐らくはキメラアンチセンスポリヌクレオチドの送達を肝臓に向けることができる機能性部分が相補鎖に組み込まれた。
アンチセンス鎖
1. 20mer-1 ApoB1 ASO:
5'-TsCsCsAsGsCsaststsgsgstsastsTsCsAsGsTsG-3'(配列番号5)
2. 20mer-4 ApoB1 ASO:
5'-u s c s c s a s GsCsaststsgsgstsastsTsCsAs g s u s g-3'(配列番号6)
3. 20mer-5 ApoB1 ASO:
5'-uccaGsCsaststsgsgstsastsTsCsAgug-3'(配列番号7)
4. 13mer ApoB1 ASO:
5'-GsCsaststsgsgstsastsTsCsA-3'(配列番号8)
(大文字:LNA;小文字:DNA;下線:2'-O-Me RNA;s:塩基間のホスホロチオエート)
相補鎖
1. 20-mer Toc-ApoB1 cRNA:
5'-Toc-c s a s c s u s g s AAUACCAAUGs c s u s g s g s a-3'(配列番号9)
2. 13-mer Toc-ApoB1 cRNA:
5'-Toc-u s g s a s AUACCAAU s g s c-3'(配列番号10)
(大文字:RNA、下線:2'-OMe-RNA、s:塩基間のホスホロチオエート)
Claims (15)
- 以下のものを含むキメラアンチセンスポリヌクレオチドとキメラアンチセンスポリヌクレオチドにアニールされた相補鎖とを含む二本鎖アンチセンス剤:
5〜20個のDNAおよびホスホロチオエートDNAヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域;
少なくとも1個が架橋ヌクレオチドアナログである2〜5個のヌクレオチドを含む、該中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域;
少なくとも1個が架橋ヌクレオチドアナログである2〜5個のヌクレオチドを含む、該中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域;および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで:
該第2の5'ウイング領域は該第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、ホスホロチオエート化されていない3〜7個の2'-O-メチルRNAヌクレオチドまたはUNAからなり;また
該第2の3'ウイング領域は該第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、ホスホロチオエート化されていない3〜7個の2'-O-メチルRNAヌクレオチドまたはUNAからなる、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域;
であって、ここでヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および低タンパク質親和性ヌクレオチドの総数は100ヌクレオチド以下である、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチド。 - 以下のものを含むキメラアンチセンスポリヌクレオチドとキメラアンチセンスポリヌクレオチドにアニールされた相補鎖とを含む二本鎖アンチセンス剤:
5〜20個のDNAおよびホスホロチオエートDNAヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域;
少なくとも1個が架橋ヌクレオチドアナログである2〜5個のヌクレオチドを含む、該中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域;
少なくとも1個が架橋ヌクレオチドアナログである2〜5個のヌクレオチドを含む、該中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域;および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで:
該第2の5'ウイング領域は該第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、ホスホロチオエート化されていない3〜7個の2'-O-メチルRNAヌクレオチドまたはUNAからなり、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し;また
該第2の3'ウイング領域は該第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、ホスホロチオエート化されていない3〜7個の2'-O-メチルRNAヌクレオチドまたはUNAからなり、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有する、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域
であって、ここでヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの総数は100ヌクレオチド以下である、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチド。 - 前記中央ヌクレオチド領域が、RNAポリヌクレオチドにハイブリダイズすると、該中央ヌクレオチド領域/RNAポリヌクレオチド二本鎖がRNaseHによって認識されるヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記中央ヌクレオチド領域内のヌクレオチドの少なくとも1個がホスホロチオエート化されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記中央ヌクレオチド領域内の全ヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、請求項4に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記第1のウイング領域内の架橋ヌクレオチドが、LNA、cEt BNA、アミドBNA、およびcMOE BNAから独立して選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記中央ヌクレオチド領域および前記第1のウイング領域(1つまたは複数)内のヌクレオチドアナログの少なくとも1個がホスホロチオエート化されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドが、前記第2の5'ウイング領域のみを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドが、前記第2の3'ウイング領域のみを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドが、前記第2の5'ウイング領域および前記第2の3'ウイング領域を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドが、25℃で、100mM塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中で細胞転写産物にハイブリダイズし得る、請求項1または2に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記中央領域が、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る細胞転写産物に完全に相補的である、請求項11に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域が、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る細胞転写産物に該キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズする場合に少なくとも1個のミスマッチ塩基を含む、請求項11に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域の全ての塩基がミスマッチしている、請求項13に記載の二本鎖アンチセンス剤。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤、および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
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