JP6440170B2 - キメラ一本鎖アンチセンスポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤 - Google Patents

キメラ一本鎖アンチセンスポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤 Download PDF

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Description

本出願は、アンチセンス効果によって標的遺伝子の発現を改変するために有用なキメラ一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤に関する。キメラ一本鎖アンチセンスポリヌクレオチドは、第1の5'ウイング領域および第1の3'ウイング領域の修飾ヌクレオチドに隣接された中央ヌクレオチド領域を含み、これらはそれ自体が、タンパク質に対して低親和性を有し、および/またはDNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損する、第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域のヌクレオチドに隣接されている。上記の二本鎖アンチセンス剤は、上記のキメラ一本鎖ポリヌクレオチドを含む。上記の二本鎖アンチセンス剤は、相補鎖をさらに含む。上記のキメラ一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤を使用して、細胞内のRNA転写レベルまたはタンパク質レベルを改変することができる。
近年、核酸薬と呼ばれる医薬品の現在進行中の開発において、オリゴヌクレオチドが関心を集めており、また特に、標的遺伝子の高い選択性および低毒性の点から考えて、アンチセンス法を利用する核酸薬の開発が積極的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のmRNA(センス鎖)の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO))を細胞に導入することにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を選択的に改変または阻害する方法を含む。同様に、アンチセンス法はまた、miRNAを標的とし、またこのようなmiRNAの活性を改変する働きをする。
図1(上部)に示されるとおり、RNAを含むオリゴヌクレオチドがASOとして細胞に導入されると、ASOは、標的遺伝子の転写産物(mRNA)に結合し、部分的二本鎖が形成される。この二本鎖は、リボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、このため標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が阻害されることが知られている。
他方、DNAを含むオリゴヌクレオチドがASOとして細胞に導入されると、部分的DNA-RNAヘテロ二本鎖が形成される。この構造がRNaseHによって認識され、その結果標的遺伝子のmRNAが分解されるため、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が阻害される(図1、下部)。多くの場合、遺伝子発現抑制効果は、RNA ASOを使用する場合と比較すると、DNAをASOとして使用する場合(RNaseH依存性経路)、より高い。
核酸薬としてオリゴヌクレオチドを利用する場合、標的RNAに対する結合親和性およびin vivoでの安定性を増強するために、例えばロックド核酸(LNA)(登録商標)、他の架橋核酸(BNA)などの様々な核酸アナログが開発されている。
図2に示されるとおり、天然核酸(RNAまたはDNA)の糖部分は4個の炭素原子と1個の酸素原子を有する5員環を有するため、この糖部分はN型とS型の2種類のコンフォメーションを有する。これらのコンフォメーションは一方から他方へと変化し、その結果、核酸のらせん構造も、A型とB型の異なる形態をとることが知られている。上述のASOの標的としての役割を果たすmRNAはA型のらせん構造をとり、その糖部分は主にN型であるため、RNAに対する親和性を高めるという点から考えると、ASOの糖部分がN型をとることが重要である。このコンセプトの下に開発された製品が、LNA(2'-O,4'-C-メチレン-架橋核酸(2',4'-BNA))などの修飾核酸である。例えば、LNAにおいては、2'位の酸素と4'位の炭素がメチレン基で架橋されているため、コンフォメーションはN型に固定され、それ以上コンフォメーション間で変動しない。従って、数個のLNA単位を組み込むことによって合成されるオリゴヌクレオチドは、RNAに対して極めて高い親和性および極めて高い配列特異性を有し、また従来の天然核酸を用いて合成されるオリゴヌクレオチド(特許文献1参照)と比較すると、優れた耐熱性およびヌクレアーゼ抵抗性も示す。他の人工核酸もこのような特徴を有するため、アンチセンス法などの利用に関連して、人工核酸に大きな注目が払われている(特許文献1〜9を参照)。
それにも関わらず、これらの高性能修飾核酸を使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計であっても、依然として治療剤として使用するために適した効率性、効力、および/または安全性に欠けている。
ASOの長さがASOの性能に劇的な影響を与えることが知られているが、2つの対照的な結果がある(非特許文献5〜7)。比較的長いプローブ長さ(例えば、16〜22ヌクレオチド)は、より高い結合強度(より高いTm)およびより高い標的RNA配列に対する特異性を与える。配列特異性が高いほど、一般的に、副作用はより少なくなり、また毒性はほとんどなくなるかまたは全くなくなる。しかし、比較的長いプローブの効力は低い。このような低活性を補償するため、大量投与が必要とされる。
対照的に、比較的短いプローブ長さ(例えば、12〜15ヌクレオチド)は最も強力である - この長さ範囲は、一般的に、遺伝子発現レベルの最高程度の抑制または阻害を提供する。しかしながら、比較的短いプローブはより低い配列特異性を有し、このため一般的には毒性の副反応を引き起こす。
従って、比較的短いASOの効率性および効力を提供し、さらにまた比較的長いASOの安全性も有するポリヌクレオチドに対する必要性がある。
さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドが薬として使用される場合、関連オリゴヌクレオチドが高特異性および高効率性で標的部位に送達され得ることが重要である。オリゴヌクレオチドを送達するための方法としては、コレステロールなどの脂質およびビタミンEを使用すること(非特許文献1および2)、RVG-9Rなどの受容体特異的ペプチドを使用すること(非特許文献3)、または標的部位に特異的な抗体を使用すること(非特許文献4)が挙げられる。
JP 10-304889 A WO 2005/021570 JP 10-195098 A JP 2002-521310 W WO 2007/143315 WO 2008/043753 WO 2008/029619 WO 2003/011887 WO 2007/131238
Kazutaka Nishinaら, Molecular Therapy, 第16巻, 734-740頁 (2008年) Jurgen Soutscheckら, Nature, 第432巻, 173-178頁(2004年) Kazutaka Nishinaら, Molecular Therapy, 第16巻, 734-740頁(2008年) Dan Peerら, Science, 第319巻, 627-630頁(2008年) Ellen Marie Straarupら, Nucleic Acids Research, 第38巻(20), 7100-7111頁(2010年) Tsuyoshi Yamamotoら, J. Nucleic Acids, Article ID 707323, 7頁(2012年) Jan Stenvangら, Silence, 第3:1巻, 17頁(2012年)
増加した長さを有するにも関わらず、比較的短い(〜13塩基)のポリヌクレオチドの有効性および効力を保持する新たなキメラアンチセンスポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤が提供される。新たなキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、付加ヌクレオチドがギャップマー（gapmer）の5'末端、3'末端、または両端に付加されている短いギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。付加ヌクレオチドは、タンパク質結合に対して低親和性を示す。あるいは、上記の付加ヌクレオチドは、天然のDNAまたはRNAヌクレオチドより高いDNase/RNase抵抗性を有し、キメラアンチセンスポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損する。二本鎖アンチセンス剤は、キメラアンチセンスポリヌクレオチドを含む。このため、例えば、本明細書中の開示に従って、タンパク質およびタンパク質様細胞成分に対して低結合親和性を示し、天然のDNAまたはRNAヌクレオチドより高いDNase/RNase抵抗性を有し、および/またはキメラアンチセンスポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損するヌクレオチドを含むウイング領域を一端または両端に付加している20塩基ギャップマーのように、13塩基ギャップマーを再設計することができる。キメラアンチセンス鎖のギャップマー部分、すなわち、中央領域、第1の5'ウイング領域、および第1の3'ウイング領域は、「キメラ二本鎖核酸(Chimeric Double-Stranded Nucleic Acid)」という表題のPCT/JP2012/083180(この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるアンチセンス鎖のいずれかであってよい。
本発明者らは、新たなキメラ一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤は、細胞内に導入されると、転写産物の活性または機能を改変することができると結論づけた。上記の転写産物は、タンパク質コード転写産物であってもよいし、またはmiRNAなどの非タンパク質コード転写産物であってもよい。本出願はさらに、細胞内のタンパク質の発現レベルを変更するための方法、およびアンチセンス効果によってタンパク質構造を変化させるための方法を想定する。
キメラアンチセンスポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤はまた、例えば、タンパク質が過剰発現されるように変更された遺伝子発現レベルによって特徴づけられる症状を有する患者を治療するのにも有用である。患者を、キメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは二本鎖アンチセンス剤を含む医薬組成物で治療することにより、遺伝子発現レベルは、タンパク質レベルが低下し、その結果、症状が寛解する程度まで特異的に抑制または阻害され得る。
特定の実施形態において、以下のものが提供される。
(1) 以下のものを含むキメラアンチセンスポリヌクレオチド：
少なくとも5個のヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域；
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域；
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域；および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで：上記の第2の5'ウイング領域は上記の第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、且つ少なくとも1個の低タンパク質親和性ヌクレオチドを含み；また
上記の第2の3'ウイング領域は上記の第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、且つ少なくとも1個の低タンパク質親和性ヌクレオチドを含む、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域；
であって、ここでヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび低タンパク質親和性ヌクレオチドの総数は100ヌクレオチド以下である、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(2) 以下のものを含むキメラアンチセンスポリヌクレオチド：
少なくとも5個のヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域；
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域；
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域；および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで：上記の第2の5'ウイング領域は上記の第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損し；また
上記の第2の3'ウイング領域は上記の第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損する、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域
であって、ここでヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの総数は100ヌクレオチド以下である、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(3) 上記の中央ヌクレオチド領域が、RNAポリヌクレオチドにハイブリダイズすると、中央ヌクレオチド領域/RNAポリヌクレオチド二本鎖がRNaseHによって認識されるヌクレオチドを含む、項目(1または2)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(4) 上記の中央ヌクレオチド領域のヌクレオチドが、DNAおよびホスホロチオエートDNAヌクレオチドから独立して選択される、項目(3)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(5) 上記の中央ヌクレオチド領域が、5〜20個のDNAヌクレオチドを含む、項目(4)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(6)上記の中央ヌクレオチド領域が、5〜12個のDNAヌクレオチドを含む、項目(4)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(7) 上記の中央ヌクレオチド領域が、RNAヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログから独立して選択されるヌクレオチドを含む、項目(1または2)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(8) 上記のヌクレオチドアナログが、LNAヌクレオチド、BNAヌクレオチド、2'-O-Me RNAヌクレオチド、2'-O-メトキシエチルRNAヌクレオチドから独立して選択される、項目(7)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(9) 上記の中央ヌクレオチド領域が、2'-O-Me RNAヌクレオチドおよび2'-O-メトキシエチルRNAヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドを含む、項目(8)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(10) 上記の中央ヌクレオチド領域内のヌクレオチドの少なくとも1個がホスホロチオエート化されている、項目(1〜9)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(11) 上記の中央ヌクレオチド領域内の全ヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、項目(10)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(12) 第1のウイング領域内のヌクレオチドが架橋ヌクレオチドである、項目(1〜11)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(13) 上記の架橋ヌクレオチドが、LNA、cEt BNA、アミドBNA、およびcMOE BNAから独立して選択される、項目(1〜12)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(14) 上記の中央ヌクレオチド領域および第1のウイング領域(1つまたは複数)内のヌクレオチドアナログの少なくとも1個がホスホロチオエート化されている、項目(1〜13)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(15) 上記の低タンパク質親和性ヌクレオチドが、2'-O-メチルRNAヌクレオチド、2'-O-メトキシエチルRNAヌクレオチド、LNA、cMOE BNA、2-フルオロRNAヌクレオチド、ボラノホスフェートヌクレオチド、メチルホスホネートヌクレオチド、ホスホロアミダイトヌクレオチド、5-メチルシトシン、UNAおよび5-プロピニルウリジンから独立して選択される、項目(1〜14)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(16) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、上記の第2の5'ウイング領域を含む、項目(1〜15)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(17) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、上記の第2の3'ウイング領域を含む、項目(1〜15)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(18) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、上記の第2の5'ウイング領域および上記の第2の3'ウイング領域を含む、項目(1〜15)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(19) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、キメラアンチセンスポリヌクレオチドの3'末端および/または5'末端に連結された機能性部分をさらに含む、項目(1〜18)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(20) 上記の機能性部分が、標識機能、精製機能、および標的送達機能から選択される機能を有する、項目(19)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(21) 上記の機能性部分が、切断可能なリンカー部分を介してキメラアンチセンスポリヌクレオチドに連結されている、項目(19)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(22) 上記の機能性部分が、脂質、ペプチド、およびタンパク質から選択される分子である、項目(19)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(23) 上記の脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質、およびグリセリドから選択される、項目(22)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(24) 上記の脂質が、コレステロール、トコフェロール、およびトコトリエノールから選択される、項目(22)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(25) 上記のペプチドが、受容体リガンドフラグメントおよび抗体フラグメントから選択される、項目(22)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(26) 上記のタンパク質が、受容体リガンドおよび抗体から選択される、項目(22)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(27) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、25℃で、100mM塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中で細胞転写産物にハイブリダイズし得る、項目(1または2)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(28) 上記の中央領域が、キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る細胞転写産物に完全に相補的である、項目(27)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(29) 上記の第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域が、上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る細胞転写産物に前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズする場合に少なくとも1個のミスマッチ塩基を含む、項目(27)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(30) 上記の第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域の全ての塩基がミスマッチしている、項目(29)のキメラアンチセンスポリヌクレオチド。
(31) 項目(1〜18)および項目(27-30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドと、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドにアニールされた相補鎖とを含む二本鎖アンチセンス剤。
(32) 上記の相補鎖が、上記の3'末端および/または5'末端に連結された機能性部分をさらに含む、項目(31)のキメラアンチセンスポリヌクレオチドを含む二本鎖アンチセンス剤。
(33) 上記の機能性部分が、標識機能、精製機能、および標的送達機能から独立して選択される機能を有する、項目(32)の二本鎖アンチセンス剤。
(34) 上記の機能性部分が、切断可能なリンカー部分を介して上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドおよび/または相補鎖に独立して連結される、項目(32)の二本鎖アンチセンス剤。
(35) 上記の機能性部分が、脂質、ペプチド、およびタンパク質から独立して選択される分子である、項目(32)の二本鎖アンチセンス剤。
(36) 上記の脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質、およびグリセリドから独立して選択される、項目(35)の二本鎖アンチセンス剤。
(37) 上記の脂質が、コレステロール、トコフェロール、およびトコトリエノールから独立して選択される、項目(35)の二本鎖アンチセンス剤。
(38) 上記のペプチドが、受容体リガンドフラグメントおよび抗体フラグメントから独立して選択される、項目(35)の二本鎖アンチセンス剤。
(39) 上記のタンパク質が、受容体リガンドおよび抗体から独立して選択される、項目(35)の二本鎖アンチセンス剤。
(40) 上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが、25℃で、100mM塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中で細胞転写産物にハイブリダイズし得る、項目(31)のキメラアンチセンスポリヌクレオチドを含む二本鎖アンチセンス剤。
(41) 項目(1〜30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは項目(31-40)のいずれか1つの二本鎖アンチセンス剤、および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
(42) 細胞内の転写産物の機能を改変する方法であって、項目(1〜30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは項目(31-40)のいずれか1つの二本鎖アンチセンス剤を含む組成物を細胞に投与するステップを含む、前記方法。
(43) 細胞内のタンパク質の発現レベルを変化させる方法であって、項目(1〜30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは項目(31-40)のいずれか1つの二本鎖アンチセンス剤を含む組成物を細胞に投与するステップを含む、前記方法。
(44) 細胞内のタンパク質構造を変化させる方法であって、項目(1〜30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは項目(31-40)のいずれか1つの二本鎖アンチセンス剤を含む組成物を細胞に投与するステップを含む、前記方法。
(45) 変化する標的遺伝子の発現レベル、機能またはエディティングによって特徴づけられる症状を有する患者を治療する方法であって、上記の患者に、以下のもの：
(a) 少なくとも1つの項目(1〜30)のいずれか1つのキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは項目(31-40)のいずれか1つの二本鎖アンチセンス剤；および
(b) 製薬上許容可能な担体
を含む治療上有効量の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
特定の実施形態によれば、キメラアンチセンスポリヌクレオチドは、送達部分を複合体と結合させることにより、高特異性および高効率性で標的部位に送達することができる。特定の実施形態によれば、二本鎖アンチセンス剤は、機能性部分(例えば送達部分)を二本鎖複合体に結合させることにより、高特異性および高効率性で標的部位に送達することができる。
図１は、特定のアンチセンス法の一般的な機構を示す図である。図に示される通り、標的遺伝子のmRNAの部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO))(図中の「DNA」)が細胞に導入されると、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現が選択的に阻害される。破線のボックスには、RNaseHがASOにハイブリダイズした場所でmRNAを切断する分解機構が示される。RNaseH切断の結果、mRNAは、通常、機能的遺伝子発現産物を生産するために翻訳されることはない。 図2は、RNA、DNA、およびLNAヌクレオチドの構造を示す模式図である。 図3A〜Cは、キメラポリヌクレオチドの好適な実施形態の例を示す模式図である。コア5'-(第1の5'ウイング)(中央領域)(第1の3'ウイング)-3'は、(第2の5'ウイング)と(第2の3'ウイング)の両方(図3A)、(第2の5'ウイング)のみ(図3B)、または(第2の3'ウイング)のみ(図3C)に連結されていてよい。 図4A〜Dは、キメラポリヌクレオチドの好適な実施形態の例を示す模式図である。キメラポリヌクレオチド5'-(第2の5'ウイング)(第1の5'ウイング)(中央領域)(第1の3'ウイング)(第2の3'ウイング)-3'鎖は、標的RNA鎖(例えば転写産物)にハイブリダイズし得るアンチセンス核酸である。この図において、「X」は機能性部分を表し、脂質(例えばコレステロールもしくはトコフェロール)、糖など、またはタンパク質、ペプチド(例えば抗体)などを独立して表し得る。 図5は、様々な天然および非天然の核酸部分の構造式を示す。 図6A〜6Dは、アンチセンス効果の効力を調整するための手段として5'および3'の第2のウイング領域に配列ミスマッチを組み込むキメラウイングのアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計を示す模式図である。 図7は、Hep1-6細胞に「20mer19PS」、「20mer12PS」、および「13mer12PS」(これらは全てApoB1遺伝子の塩基配列に相補的な配列を有する)を投与し、細胞内のApoB1遺伝子の発現量を定量PCRにより分析したときに得られた結果を示すグラフ、各アンチセンスポリヌクレオチドの配列、および各ポリヌクレオチドの設計を比較する模式図を示す。 図８Aは、2つのギャップマーアンチセンスポリヌクレオチドおよび3つのキメラウイングのアンチセンスポリヌクレオチドの配列、および各ポリヌクレオチドの設計を比較する模式図を示す。 図8Bは、Hep1-6細胞に「20merギャップマー」、「20merキメラ5'/3'ウイング」、「20merキメラ3'ウイング」、「20merキメラ5'ウイング」、および「13merギャップマー」(これらは全てApoB1遺伝子の塩基配列に相補的な配列を有する)を投与し、細胞内のApoB1遺伝子の発現量を定量PCRにより分析したときに得られた結果を示すグラフを示す。 図９は、図の上部に示されるキメラポリヌクレオチドおよび対照ポリヌクレオチドをマウスに投与し、マウスにおけるApoB1遺伝子(その転写産物はアンチセンス鎖によって標的化される)の発現量を分析することによって得られた結果を示すグラフである。 図10は、ノーザンブロット分析の結果を示す。肝臓において欠損するT17およびT20(-)が13merの長さとハイブリダイズしたシグナルが検出された(下右パネル)。マウスU6(内部対照)は、上のパネルに示される。 図11は、様々なキメラ一本鎖ポリヌクレオチドの相対的なアンチセンス効果を示す。 図12は、対照13merと比較した、Gapdh mRNA発現レベルによって正規化されたApoB mRNA発現レベルを示す。 図13は、13merおよびToc-20mer8U PS(-)一本鎖ポリヌクレオチドのアンチセンス効果の比較または時間経過を示す。 図14は、様々なキメラ一本鎖ポリヌクレオチドが脂質レベル(LDL-コレステロール、総コレステロールおよびトリグリセリド)に与える影響を示す。 図15は、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドの実施形態および好適な相補鎖の例示的実施形態の模式図を示す。 図16Aは、ApoB1を標的とするギャップマーアンチセンスポリヌクレオチドおよびキメラアンチセンスポリヌクレオチド、および上記のアンチセンスポリヌクレオチドと共に二本鎖アンチセンス剤を形成するために使用される相補ヌクレオチドの配列を示す。 図16Bは、図16Aに示される二本鎖複合体をマウスに投与し、マウスにおけるApoB1遺伝子(その転写産物はアンチセンス鎖によって標的化される)の発現量を分析することによって得られた結果を示すグラフである。
以下の構造を含むキメラ一本鎖ポリヌクレオチドは、アンチセンス効果による標的遺伝子の発現またはより一般的には転写産物のレベルの改変または抑制において活性である：
少なくとも5個のヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域；
1〜10個のヌクレオチドアナログを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域；
1〜10個のヌクレオチドアナログを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域；および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで：上記の第2の5'ウイング領域は上記の第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、且つ少なくとも1個の低タンパク質親和性ヌクレオチドを含み；また
上記の第2の3'ウイング領域は上記の第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、且つ少なくとも1個の低タンパク質親和性ヌクレオチドを含む、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域；
ここでヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および低タンパク質親和性ヌクレオチドの総数は100ヌクレオチド以下である。
あるいは、以下の構造を含むキメラ一本鎖ポリヌクレオチドは、アンチセンス効果による標的遺伝子の発現またはより一般的には転写産物のレベルの改変または抑制において活性である：
少なくとも5個のヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域；
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域；
少なくとも1個がヌクレオチドアナログである1〜10個のヌクレオチドを含む、上記の中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域；および
第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで：上記の第2の5'ウイング領域は上記の第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損し；また
上記の第2の3'ウイング領域は上記の第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し、且つキメラポリヌクレオチドが送達されると細胞内で欠損する、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域、
ここでヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの総数は100ヌクレオチド以下である。
特定の実施形態は、上記のキメラ一本鎖アンチセンスポリヌクレオチドを含む、精製されたまたは単離された二本鎖アンチセンス剤を含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖の中央ヌクレオチド領域は、アンチセンス鎖が転写産物にハイブリダイズするとRNaseHによって認識される少なくとも4個の連続ヌクレオチド、または一部の実施形態においては、少なくとも5個の連続ヌクレオチドを含む。
相補鎖は、ヌクレオチドおよび場合によりヌクレオチドアナログ、また場合により低タンパク質親和性ヌクレオチドを含み、さらに相補鎖は、アンチセンス鎖にアニールし得る。
一部の実施形態において、相補鎖は、以下のものを含む：
(i) RNAヌクレオチドおよび場合によりヌクレオチドアナログ、また場合により低タンパク質親和性ヌクレオチド、さらに場合によりDNAヌクレオチド；あるいは
(ii) DNAヌクレオチドおよび/もしくはヌクレオチドアナログならびに/または低タンパク質親和性ヌクレオチド；あるいは
(iii) PNAヌクレオチド。
「アンチセンス効果」とは、標的転写産物(RNAセンス鎖)の、例えばDNA鎖、またはより一般的には、アンチセンス効果を引き起こすように設計され、転写産物などの部分配列に相補的な鎖とのハイブリダイゼーションの結果として生じる、標的遺伝子の発現または標的転写産物のレベルの抑制を意味する。特定の例において、翻訳の阻害またはエクソンスキッピングなどのスプライシング機能改変効果(図1における、点線で囲まれている領域の外側の上部の説明を参照)は、ハイブリダイゼーション産物により転写産物をカバーすることによって引き起こすことが可能であり、および/または転写産物の分解は、ハイブリダイズされた部分の認識の結果として生じ得る(図1における、点線で囲まれている領域内の説明を参照)。
アンチセンス効果によってその発現が抑制される「標的遺伝子」または「標的転写産物」は特に限定されず、その例としては、様々な疾患においてその発現が増加する遺伝子が挙げられる。また、「標的遺伝子の転写産物」は、標的遺伝子をコードするゲノムDNAから転写されるmRNAであり、さらにまた、塩基修飾に供されていないmRNA、スプライスされていないmRNA前駆体などを含む。さらに一般的には、「転写産物」は、DNA依存性RNAポリメラーゼによって合成される任意のRNAであってよい。
本明細書中で使用される用語「核酸」は、モノマーのヌクレオチドもしくはヌクレオシドを指していてもよく、または複数のモノマーからなるオリゴヌクレオチドを意味していてもよい。用語「ポリヌクレオチド」および「核酸鎖」もまた、本明細書中でオリゴヌクレオチドを指すために使用される。核酸鎖は、化学的合成法により(例えば自動合成装置を使用して)、または酵素的工程(例えば、限定するものではないが、ポリメラーゼ、リガーゼ、または制限反応)により、全体的にまたは部分的に調製することができる。
本明細書中で使用される用語「キメラポリヌクレオチド」は、少なくとも1個の天然ヌクレオチド(例えば、DNAまたはRNAヌクレオチド)および少なくとも1個の非天然ヌクレオチド(例えば、LNA、2'-O-メチルRNA)を含むか、または完全に非天然ヌクレオチドからなり、その結果として天然には生じないポリヌクレオチドである、ポリヌクレオチドを意味する。特定の実施形態によるキメラポリヌクレオチドは、例えば標的遺伝子の転写産物などの転写産物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
用語「キメラアンチセンスポリヌクレオチド」または「キメラASO」は、標的転写産物に相補的な配列を含むキメラポリヌクレオチドを意味する。
用語「二本鎖アンチセンス剤」は、アンチセンス効果を引き起こすことができる二本鎖ポリヌクレオチド複合体を意味する。二本鎖アンチセンス剤は、2本以上のポリヌクレオチド鎖を含み得る。一部の実施形態において、上記の鎖はアニールする。一部の実施形態において、上記のアンチセンス剤は、アンチセンス鎖と相補鎖の2本の鎖を含み、これらの2本はアニールして二本鎖複合体を形成することができる。アンチセンス鎖はキメラポリヌクレオチド(以下に記載)である。相補鎖は、一部の実施形態において、キメラポリヌクレオチドであり、また他の実施形態においては天然ヌクレオチドからなり、さらに他の実施形態においてはペプチド核酸単位を含む。
本明細書中で使用される用語「相補的」は、水素結合を介して、いわゆるワトソン-クリック塩基対(天然型塩基対)または非ワトソン-クリック塩基対(フーグスティーン型塩基対など)が形成され得る関係を意味する。標的転写産物(例えば標的遺伝子の転写産物)の塩基配列、およびキメラアンチセンスポリヌクレオチドの塩基配列が完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列が少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、またはより好ましくは90％以上(例えば、95％、96％、97％、98％、または99％以上)の相補性を有していれば許容可能である。配列の相補性は、BLASTプログラムなどを使用することによって決定することができる。第1の鎖は、配列が相補的である場合に、第2の鎖に「アニールする」かまたは「ハイブリダイズする」ことができる。当業者であれば、鎖間の相補性の程度を考慮して、2本の鎖がアニールし得る条件(温度、塩濃度等)を容易に決定することができる。またさらに、当技術分野において通常の技能を有する者は、例えば、標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。
キメラアンチセンスポリヌクレオチドの鎖長は特に限定されないが、鎖長は、通常、少なくとも8塩基、少なくとも10塩基、少なくとも12塩基、または少なくとも13塩基である。鎖長は、20塩基以下、25塩基以下、または35塩基以下であってよい。鎖長は、約100塩基もの長さであってもよい。鎖長の範囲は、10〜35塩基、12〜25塩基、または13〜20塩基であってよい。特定の例において、長さの選択は、一般的に、費用、合成収率などの他の因子中でも特に、アンチセンス効果の強度と標的に対する核酸鎖の特異性とのバランスによって決まる。
一部の実施形態において、キメラASOの長さおよびキメラASOと標的鎖との間の相補性の程度の選択もまた、RNaseHによって切断された後のキメラASOと標的鎖との間の結合親和性によって決まり得る。ASOの効力は、切断前のASOの標的との結合親和性、ならびに切断された物質がASOから解離し、その結果ASOが別の標的鎖に自由に結合し得るオフレートの両方によって決まる。
キメラアンチセンスポリヌクレオチドは、「中央領域」、「第1の5'ウイング領域」、および「第1の3'ウイング領域」を含む。キメラポリヌクレオチドは、「第2の5'ウイング領域」もしくは「第2の3'ウイング領域」、またはその両方をさらに含む。これらの領域は、以下にさらに説明される。1つのこのような領域または別の領域への、特定のヌクレオチドの割り当ては排他的ではない。所与のポリヌクレオチドのヌクレオチドを異なる領域に割り当てるための幾つかの方法があり得る。これらの領域名は便宜上のものであるが、上記のヌクレオチドがこのような領域を与える配列を調製することにより、ポリヌクレオチドが本明細書中に記載される機能的性能を達成することが明らかでなければならない。
「中央領域」は、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチドの両方を含む。中央領域用に選択されるヌクレオチドの種類は、主に、可能なアンチセンス作用機序(1つまたは複数)の種類を決定する。例えば、DNAおよび/またはDNA様ヌクレオチドを中央領域に含めると、RNaseHによって認識され得るDNA/RNAヘテロ二本鎖構造の形成が生じる。従って、この場合、RNaseH依存性作用機序が可能である。他方、DNAおよび/またはDNA様ヌクレオチドが中央領域から除外される場合、RNaseH-非依存性作用機序が起こることが予想される。当然のことながら、たとえDNA/RNAヘテロ二本鎖構造が形成されたとしても、RNaseH-非依存性機構は生じ得る。
一部の実施形態において、中央領域は、「RNAポリヌクレオチドにハイブリダイズすると、中央ヌクレオチド領域/RNAポリヌクレオチド二本鎖がRNaseHによって認識される」少なくとも5個のヌクレオチドを含む。「RNAにハイブリダイズすると」「RNaseHによって認識される」上記の「少なくとも5個のヌクレオチド」は、通常、5〜20個の連続塩基を含む領域、5〜16個の連続塩基を含む領域、5〜12個の連続塩基を含む領域、または5〜8個の連続塩基を含む領域である。さらに、この領域において使用し得るヌクレオチドは、天然DNAのように、RNAヌクレオチドにハイブリダイズするとRNaseHによって認識され、ここでRNaseHが当該RNA鎖を切断するヌクレオチドである。好適なヌクレオチド(例えば、修飾DNAヌクレオチドおよび他の塩基)は、当技術分野において公知である。RNAヌクレオチドのような、2'-ヒドロキシ基を含むヌクレオチドは適していないことが知られている。当業者であれば、RNaseH依存性効果が望まれる場合、この領域の「少なくとも5個のヌクレオチド」における使用に対する、あるヌクレオチドの適合性を容易に決定することができる。一実施形態において、中央ヌクレオチド領域のヌクレオチドは、DNAおよびホスホロチオエートDNAヌクレオチドから独立して選択される。
一部の実施形態において、中央領域は、RNAポリヌクレオチドにハイブリダイズすると、中央ヌクレオチド領域/RNAポリヌクレオチド二本鎖がRNaseHによって認識されるわずかに4個のヌクレオチドを含み得る。
他の実施形態において、中央領域はDNAを含まない。すなわち、特定の実施形態において、アンチセンス核酸は、RNaseH非依存性効果を有するか、あるいは、非RNaseH依存性アンチセンス効果を有する。「非RNaseH依存性アンチセンス効果」は、標的遺伝子の転写産物(RNAセンス鎖)と当該転写産物の部分配列に相補的な核酸鎖がハイブリダイズする場合の、翻訳の阻害の結果として生じる標的遺伝子の発現を抑制する活性、またはスプライシング機能改変効果(例えばエクソンスキッピング)を意味する(図1における、点線で囲まれている領域の外側の上部の説明を参照)。
「DNAを含まない核酸」は、天然DNAおよび修飾DNAを含まないアンチセンス核酸を意味し、その例は、RNA、修飾RNA、ヌクレオチドアナログ、PNA、またはモルホリノ核酸を含む核酸であり得る。さらに、「DNAを含まない核酸」に関して、核酸の一部または全体は、ヌクレアーゼに対する抵抗性が高いという点から考えると、修飾ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチドアナログで構成されていてよい。このような修飾の例としては、例えば、以下に記載される修飾が挙げられ、また同じヌクレオチドが組み合わされた複数種類の修飾に供されてもよい。さらに、修飾核酸の数および修飾の位置に関する好ましい実施形態は、以下に記載されるとおりに、修飾後にキメラポリヌクレオチドが有するアンチセンス効果を測定することによって特徴づけることができる。
中央領域内のヌクレオチドの塩基配列と標的遺伝子の転写産物の塩基配列とが互いに完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列は、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、またより好ましくは90％以上(例えば、95％、96％、97％、98％、99％以上)の相補性を有し得る。
「DNAを含まない核酸」の長さに特定の限定はないが、この長さは上記のとおりであり、また通常、5〜35塩基、5〜25塩基、12〜25塩基、または13〜20塩基である。
「DNAを含まない核酸」の長さに特定の限定はないが、この長さは上記のとおりであり、また通常、5〜35塩基、5〜25塩基、12〜25塩基、または13〜20塩基である。
本明細書中で使用される「DNAヌクレオチド」は、天然DNAヌクレオチド、あるいは修飾された塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットを有するDNAヌクレオチドを意味する。同様に、「RNAヌクレオチド」は、天然RNAヌクレオチド、あるいは修飾された塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットを有するRNAヌクレオチドを意味する。修飾された塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットは、サブユニット内で単一の置換基が付加または置換されており、且つこのサブユニットが全体としては異なる化学基で置換されていない塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットである。ヌクレオチドを含む領域の一部または全体がデオキシリボヌクレアーゼなどに対して高い抵抗性を有するという点から考えると、DNAは修飾ヌクレオチドであってよい。このような修飾の例としては、シトシンの5-メチル化、5-フッ素化、5-臭素化、5-ヨウ素化およびN4-メチル化；チミジンの5-脱メチル化、5-フッ素化、5-臭素化および5-ヨウ素化；アデニンのN6-メチル化および8-臭素化；グアニンのN2-メチル化および8-臭素化；ホスホロチオエート化、メチルホスホン化、メチルチオホスホン化、キラルメチルホスホン化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、2'-O-メチル化、2'-メトキシエチル(MOE)化、2'-アミノプロピル(AP)化、および2'-フッ素化が挙げられる。しかしながら、優れた薬物動態を有するという点から考えて、ホスホロチオエート化が好ましい。このような修飾は、同じDNAが組み合わされた複数種類の修飾に供され得るように実施することができる。また、以下に考察されるとおり、同様の効果を達成するため、RNAヌクレオチドが修飾されていてもよい。
特定の例において、修飾DNAの数および修飾の位置は、本明細書中に開示されるキメラアンチセンスポリヌクレオチドによって提供されるアンチセンス効果などに影響を与える可能性がある。これらの実施形態は、標的遺伝子の配列などによって変動し得るため、場合にもよるが、当技術分野において通常の技能を有する者であれば、アンチセンス法に関連する文献の説明を参照することによって好適な実施形態を決定することができる。さらに、修飾後のキメラアンチセンスポリヌクレオチドが有するアンチセンス効果が測定される場合、このようにして得られた測定値が修飾前のキメラアンチセンスポリヌクレオチドの測定値と比較して著しく低くなければ(例えば、修飾後に得られた測定値が修飾前のキメラアンチセンスポリヌクレオチドの測定値と比較して30％以上低い場合、関連の修飾を評価することができる。アンチセンス効果の測定は、被験核酸化合物を細胞などに導入し、さらにノーザンブロッティング、定量PCR、およびウェスタンブロッティングなどの公知技術を適切に使用することによって、発現が被験核酸化合物によって提供されるアンチセンス効果によって抑制されている細胞内の標的遺伝子の発現量(mRNA量、cDNA量、タンパク質量など)を測定することにより、以下の実施例に示されるとおりに実施することができる。候補薬剤は、キメラアンチセンスポリヌクレオチド自体、または二本鎖アンチセンス剤の一部としてのキメラアンチセンスポリヌクレオチドであり得る。
本明細書中で使用される「RNAヌクレオチド」は、天然RNAヌクレオチド、あるいは修飾された塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットを有するRNAヌクレオチドを意味する。修飾された塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットは、サブユニット中で単一の置換基が付加または置換されており、且つこのサブユニットが全体としては異なる化学基で置換されていない塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットである。
核酸の一部または全体は、リボヌクレアーゼ(RNase)などのヌクレアーゼに対して高い抵抗性を有するという点から考えて、修飾ヌクレオチドであってよい。このような修飾の例としては、シトシンの5-メチル化、5-フッ素化、5-臭素化、5-ヨウ素化およびN4-メチル化；チミジンの5-脱メチル化、5-フッ素化、5-臭素化および5-ヨウ素化；アデニンのN6-メチル化および8-臭素化；グアニンのN2-メチル化および8-臭素化；ホスホロチオエート化、メチルホスホン化、メチルチオホスホン化、キラルメチルホスホン化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、2'-O-メチル化、2'-メトキシエチル(MOE)化、2'-アミノプロピル(AP)化、デオキシリボースの2'-炭素と3'-炭素間の切断(「UNA」を生じる)および2'-フッ素化が挙げられる。さらにまた、チミジン塩基がウラシル塩基に置換されているRNAヌクレオチドも想定される。しかし、優れた薬物動態を有するという点から考えて、ホスホロチオエート化が用いられる。さらに、このような修飾は、同じ核酸が組み合わされた複数種類の修飾に供され得るように実施することができる。例えば、以下に記載される実施例において用いられるとおり、酵素的切断に対する抵抗性を与えるため、同じRNAが、ホスホロチオエート化と2'-O-メチル化に供され得る。
本明細書中で使用される「ヌクレオチドアナログ」は、塩基、糖、またはリン酸結合サブユニットが、サブユニット内で付加もしくは置換されている2つ以上の置換基を有するか、または前記サブユニットが全体として異なる化学基で置換されている非天然ヌクレオチドを意味する。2つ以上の置換を有するアナログの例は、糖環上の2つの置換(典型的には2'位および4'位の炭素原子に結合している)によって架橋単位が付加されている架橋核酸である。特定の実施形態による第1のウイングに関して、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性および/またはヌクレアーゼに対する標的遺伝子の抵抗性を高めるという点から考えて、第1のウイングはさらにヌクレオチドアナログを含む。「ヌクレオチドアナログ」は、修飾(架橋基、置換基等)によって、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性および/またはヌクレアーゼに対する核酸の抵抗性が増強された任意の核酸であってよく、その例としては、JP 10-304889 A、WO 2005/021570、JP 10-195098 A、JP 2002-521310 W、WO 2007/143315、WO 2008/043753、WO 2008/029619、およびWO 2008/049085(本明細書中以降、これらの文献は「アンチセンス法に関連した文献」と呼ばれる)において、アンチセンス法における使用に適していると開示されている核酸が挙げられる。すなわち、その例としては、上記の文献中に開示される核酸：ヘキシトール核酸(HNA)、シクロヘキサン核酸(CeNA)、ペプチド核酸(PNA)、グリコール核酸(GNA)、トレオース核酸(TNA)、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA(tcDNA)、2'-O-メチル化核酸、2'-MOE(2'-O-メトキシエチル)化核酸、2'-AP(2'-O-アミノプロピル)化核酸、2'-フッ素化核酸、2'-F-アラビノ核酸(2'-F-ANA)、およびBNA(架橋核酸)が挙げられる。
特定の実施形態によるBNAは、2'位の炭素原子および4'位の炭素原子が2つ以上の原子によって架橋されている任意のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであってよい。架橋核酸の例は当業者に公知である。このようなBNAの1つのサブグループは4'-(CH2)p-O-2',4'-(CH2)p-S-2',4'-(CH2)p-OCO-2',4'-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2'(式中、p、mおよびnは、それぞれ1〜4の整数、0〜2の整数、および1〜3の整数を表し；またR3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、およびユニット置換基(蛍光標識分子または化学発光標識分子、核酸切断活性を有する機能性基、細胞内または核内局在化シグナルペプチドなど)を表す)によって架橋された2'位の炭素原子と4'位の炭素原子を有するように表すことができる。さらに、特定の実施形態によるBNAに関し、3'位の炭素原子上のOR2置換基および5'位の炭素原子上のOR1置換基において、R1およびR2は、典型的には水素原子であるが、互いに同一であっても異なっていてもよく、さらにまた核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、または-P(R4)R5(ここで、R4およびR5は、互いに同一であっても異なっていてもよく、それぞれヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1〜5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1〜5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1〜6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、または1〜5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す)であってもよい。このようなBNAの非限定的な例としては、アルファ-L-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNAまたはベータ-D-メチレンオキシ(4'-CH2-O-2')BNA(LNA(ロックド核酸(登録商標)、2',4'-BNA)としても知られている)、エチレンオキシ(4'-CH2)2-O-2')BNA(ENAとしても知られている)、ベータ-D-チオ(4'-CH2-S-2')BNA、アミノオキシ(4'-CH2-O-N(R3)-2')BNA、オキシアミノ(4'-CH2-N(R3)-O-2')BNA(2',4'-BNANCとしても知られている)、2',4'-BNAcoc、3'-アミノ-2',4'-BNA、5'-メチルBNA、(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(cEt BNAとしても知られている)、(4'-CH(CH2OCH3)-O-2')BNA(cMOE BNAとしても知られている)、アミドBNA(4'-C(O)-N(R)-2')BNA(R=H、Me)(AmNAとしても知られている)、および当業者に公知の他のBNAが挙げられる。
特定の実施形態によるアンロックド核酸(UNA)は、2'位の炭素原子と3'位の炭素原子との間の共有結合が切断されて柔軟性の向上をもたらす任意のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドであってよい。アンロックド核酸の例は当業者に公知である。
さらに、ヌクレオチドアナログにおいて、特定の実施形態によれば、塩基部分は修飾されていてもよい。塩基部分の修飾の例としては、シトシンの5-メチル化、5-フッ素化、5-臭素化、5-ヨウ素化およびN4-メチル化；チミジンの5-脱メチル化、5-フッ素化、5-臭素化および5-ヨウ素化；アデニンのN6-メチル化および8-臭素化；ならびにグアニンのN2-メチル化および8-臭素化が挙げられる。さらに、特定の実施形態による修飾核酸においては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾の例としては、ホスホロチオエート化、メチルホスホン化、メチルチオホスホン化、キラルメチルホスホン化、ホスホロジチオエート化、およびホスホロアミデート化が挙げられる。しかし、優れた薬物動態を有するという点から考えると、例えば、中央領域および第1のウイング領域においてホスホロチオエート化を用いてもよい。さらにまた、このような塩基部分の修飾またはリン酸ジエステル結合部位の修飾は、同じ核酸が組み合わされた複数種類の修飾に供され得るように実施することができる。
一般的に、修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログは、本明細書中に例示される修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログに限定されない。例えば、米国特許第8,299,039号からTachasら、特に17〜22欄に開示されている修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログなどの、多数の修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドアナログが当技術分野において公知であり、またこの出願の実施形態において使用し得る。天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログの例は、図5に示されている。
当技術分野において通常の技能を有する者であれば、このような修飾核酸の中から、アンチセンス効果、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性、ヌクレアーゼに対する抵抗性などを考慮して、ヌクレオチドアナログを適切に選択し且つ使用することができる。しかし、一部の実施形態において、ヌクレオチドアナログは、以下の式(1)：
Figure 0006440170
 によって表されるLNAである。
式(1)において、「塩基」は、置換されていてもよい芳香族複素環式基または芳香族炭化水素環基、例えば天然ヌクレオシドの塩基部分(プリン塩基もしくはピリミジン塩基)または非天然(修飾)ヌクレオシドの塩基部分(塩基部分の修飾の例としては、上記の修飾が挙げられる)を表し；また
R1およびR2(互いに同一であっても異なっていてもよい)は、それぞれ、水素原子、核酸合成のためのヒドロキシル基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成のための保護基によって保護されているリン酸基、または-P(R4)R5(ここで、R4およびR5(互いに同一であっても異なっていてもよい)は、それぞれ、ヒドロキシル基、核酸合成のための保護基によって保護されているヒドロキシル基、メルカプト基、核酸合成のための保護基によって保護されているメルカプト基、アミノ基、1〜5個の炭素原子を有するアルコキシ基、1〜5個の炭素原子を有するアルキルチオ基、1〜6個の炭素原子を有するシアノアルコキシ基、または1〜5個の炭素原子を有するアルキル基で置換されているアミノ基を表す)を表す。
上記の化学式によって示される化合物は、ヌクレオシドとして表されるが、「LNA」およびより一般的には特定の実施形態によるBNAとしては、リン酸誘導基が関連するヌクレオシド(ヌクレオチド)に結合しているヌクレオチド形態が挙げられる。言い換えれば、LNAなどのBNAは、二本鎖核酸複合体を含む核酸鎖に、ヌクレオチドとして組み込まれる。
さらに、一部の実施形態におけるヌクレオチドアナログは、以下の式(2)および(3)によって表されるアンロックド核酸(UNA)である：
Figure 0006440170
Figure 0006440170
 アンロックド核酸(UNA)オリゴヌクレオチドは、他のヌクレオチドに対するそれらの親和性および特異性を調節し得る柔軟なRNA模倣物である。このアンロックド核酸UNAは、非環式RNAアナログであり、C2'-C3'結合が切断されている2',3'-セコ-RNAとしても知られている。結合切断はアンロックド核酸(UNA)を柔軟にし、またこれらに様々な核酸の熱力学的安定性の調節をもたらす。
「第1の5'ウイング領域」および「第1の3'ウイング領域」は、特定の実施形態によれば、それぞれ5'側および3'側に位置し、中央領域の各端の末端ヌクレオチドに連続的に結合している。
中央領域の5'側に直に配置されるヌクレオチドアナログを含む領域(本明細書中以降「第1の5'ウイング領域」とも呼ばれる)および中央領域の3'側に直に配置されるヌクレオチドアナログを含む領域(本明細書中以降「第1の3'ウイング領域」とも呼ばれる)は、それぞれ、アンチセンス法に関連する文献において考察される少なくとも1種のヌクレオチドアナログを独立して含み、またさらに、このようなヌクレオチドアナログに加えて天然核酸(DNAまたはRNA)も含み得る。さらに、第1の5'ウイング領域および第1の3'ウイング領域の鎖長は、独立して、通常、1〜10塩基、1〜7塩基、または2〜5塩基である。
さらに、第1の5'ウイング領域および第1の3'ウイング領域内のヌクレオチドアナログおよび天然ヌクレオチドの種類の数および位置の好適な実施形態があるが、これは、特定の実施形態においては、これらの核酸の数および位置は、二本鎖核酸複合体によって提供されるアンチセンス効果などに影響を与える可能性があるためである。これらの好適な実施形態は、配列などによって変動し得るため、場合にもよるが、当技術分野において通常の技能を有する者は、アンチセンス法に関連する文献の説明を参照することによって好適な実施形態を決定することができる。さらに、修飾後のアンチセンス鎖単独が有するアンチセンス効果または修飾後の二本鎖アンチセンス剤が有するアンチセンス効果が、「少なくとも5個のヌクレオチド」を含む領域の場合と同様に測定されると、このようにして得られた測定値が修飾前の上記の鎖または薬剤の測定値と比較して著しく低くなければ、関連の修飾は、好ましい実施形態であると評価することができる。
上記のとおり、キメラアンチセンスポリヌクレオチドは、少なくとも1つの「第2のウイング」領域を含む。一部の実施形態は、ポリヌクレオチドの5'末端または3'末端のいずれかに1つだけ第2のウイング領域を含んでいてもよいし、またはキメラアンチセンスポリヌクレオチドは、第2の5'ウイング領域と第2の3'ウイング領域の両方を含んでいてもよい。これらの構造設計は、図3A〜3Cに示される。
「第2の5'ウイング領域」および「第2の3'ウイング領域」は、存在する場合、少なくとも1つの低タンパク質親和性ヌクレオチドを含む。
「低タンパク質親和性ヌクレオチド」は、(i) DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAヌクレオチドよりも抵抗性であり、また(ii) タンパク質またはタンパク質様細胞成分に対する結合に対して低親和性を有するヌクレオチドである。特に、ヌクレオチドは、タンパク質に対して、ホスホロチオエート化ヌクレオチドよりも低い結合親和性を有する。従って、低タンパク質親和性ヌクレオチドは、上記の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであるが、このヌクレオチドはホスホロチオエート化はされていない。
低タンパク質親和性ヌクレオチドの例としては、2'-O-メチルRNAヌクレオチド、2'-O-メトキシエチルRNAヌクレオチド、LNA、cMOE BNA、2-フルオロRNAヌクレオチド、ボラノホスフェートヌクレオチド、メチルホスホネートヌクレオチド、ホスホロアミダイトヌクレオチド、5-メチルシトシン、アンロックド核酸(UNA)および5-プロピニルウリジンが挙げられる。
本明細書中で開示される第2のウイングは、主題のキメラポリヌクレオチドの長さを、ASOについて通常望まれる長さを超えて伸長する。しかしながら、ここで、また以下の実施例中で記載されるとおり、低タンパク質親和性ヌクレオチドを第2のウイング領域(1つまたは複数)に含めることによって、比較的長い長さのASOにおいて通常観察される性能減少は、低下するかまたは除去されることもある。言い換えれば、本明細書中に記載されるキメラアンチセンスポリヌクレオチドによって達成される遺伝子発現阻害の程度は、第2のウイング領域(1つまたは複数)を有さず、このため必然的に長さが比較的短い従来のギャップマーASOの性能にほぼ等しい。さらに、本明細書中に記載される二本鎖アンチセンス剤によって達成することができる遺伝子発現阻害の程度は、第2のウイング領域(1つまたは複数)を有さず、このため必然的に長さが比較的短い従来の一本鎖ギャップマーASOの性能に、ほぼ等しく、等しく、また一部の実施形態においては超えている。
それぞれの第2のウイング領域の長さは独立している。それぞれの第2のウイングの長さには、キメラアンチセンスポリヌクレオチドの全長が100ヌクレオチド以下であるという全体的制限以外には、特定の限定はない。
第2のウイング領域(1つまたは複数)内の塩基の結合親和性を調節することが望ましい。1つの極端な例は、第2のウイング領域(1つまたは複数)内のヌクレオチドを、転写産物内の標的配列に対して完全に相補的であるように選択し得ることである。または、第2のウイング領域(1つまたは複数)配列は、対応する標的に対して完全にミスマッチしていてよい。さらに、第2のウイング領域(1つまたは複数)内のマッチ塩基対およびミスマッチ塩基対の任意の組み合わせもまた想定される。これらの選択肢は、図6A〜6Dに模式的に示される。アンチセンス阻害の性能において結合親和性が重要な検討事項であるということは、当技術分野において公知である。非特許文献6において考察されているように、ASOの最大効力を達成するため、ASOと標的との間に結合親和性の最適範囲がある。従って、第2の5'ウイング領域および第2の3'ウイング領域に組み込まれているマッチ塩基およびミスマッチ塩基の長さ、塩基含有量およびパターンは、本明細書中に開示される実施形態による使用のために最適化することができる。
一部の実施形態による相補鎖は、上記のキメラアンチセンスポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドである。相補鎖の塩基配列とキメラアンチセンス鎖の塩基配列とが互いに完全に相補的であることは必ずしも必要ではなく、塩基配列は、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、またより好ましくは90％以上(例えば、95％、96％、97％、98％、99％以上)の相補性を有し得る。
相補鎖は、RNA、DNA、PNA(ペプチド核酸)およびBNA(例えばLNA)から選択される少なくとも1種類の核酸を含むポリヌクレオチドである。さらに具体的には、相補鎖は、(i) RNAヌクレオチドおよび場合によりヌクレオチドアナログ、また場合により低タンパク質親和性ヌクレオチド、さらに場合によりDNAヌクレオチド；あるいは(ii) DNAヌクレオチドおよび/もしくはヌクレオチドアナログならびに/または低タンパク質親和性ヌクレオチド；あるいは(iii) PNAヌクレオチドを含む。
「RNAヌクレオチドおよび場合によりヌクレオチドアナログ、また場合により低タンパク質親和性ヌクレオチド、さらに場合によりDNAヌクレオチド」という用語は、相補鎖がRNAヌクレオチドを含み、場合により鎖内にヌクレオチドアナログをさらに含んでいてよく、また場合により鎖内に低タンパク質親和性ヌクレオチドをさらに含んでいてよく、さらに場合により鎖内にDNAヌクレオチドををさらに含んでいてよいことを意味する。「DNAヌクレオチドおよび/もしくはヌクレオチドアナログならびに/または低タンパク質親和性ヌクレオチド」という用語は、第2の鎖が、DNAヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログ、または低タンパク質親和性ヌクレオチドのいずれかを含んでいてもよいし、あるいはDNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、または低タンパク質親和性ヌクレオチドの幾つかの組み合わせを含んでいてもよいことを意味する。「PNAヌクレオチド」という用語は、第2の鎖が、他のヌクレオチドを含んでいてもよいが、実質的にPNAヌクレオチドを含み得ることを意味する。
細胞内で特定の実施形態の二本鎖アンチセンス剤がRNaseHによって認識され、このために相補核酸鎖が分解されてキメラアンチセンス鎖を放出する場合、第2の核酸鎖は、一般的に、RNAヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ペプチドなどの機能性分子が二本鎖複合体に容易に結合することができるという点から考えると、第2の核酸鎖はPNAを含む。
相補鎖の長さは特に限定されない。相補鎖は、キメラアンチセンスポリヌクレオチドより短くてもよく、同じ大きさでもよく、またはより長くてもよい。一部の実施形態において、2つ以上のキメラアンチセンスポリヌクレオチドにアニールし得る相補鎖が使用される。2つ以上のキメラアンチセンス鎖は、同じ配列を標的としてもよいし、または異なる配列を標的としてもよい。
一部の実施形態において、二本鎖アンチセンス剤は、3つ以上のポリヌクレオチドを含む。例えば、2つのアンチセンス鎖は、1つの相補鎖と二本鎖複合体を形成することができる。様々な多成分二本鎖複合体がPCT/JP2012/083180に開示されており、これらもまた、本出願において開示される二本鎖アンチセンス剤に適用することができる。
一部の実施形態において、相補ポリヌクレオチドは、全体的にまたは部分的に、天然ヌクレオチドと比較して、リボヌクレアーゼ(RNase)などのヌクレアーゼに対して抵抗性の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含む。このような修飾の例としては、シトシンの5-メチル化、5-フッ素化、5-臭素化、5-ヨウ素化およびN4-メチル化；チミジンの5-脱メチル化、5-フッ素化、5-臭素化および5-ヨウ素化；アデニンのN6-メチル化および8-臭素化；グアニンのN2-メチル化および8-臭素化；ホスホロチオエート化、メチルホスホン化、メチルチオホスホン化、キラルメチルホスホン化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、2'-O-メチル化、2'-メトキシエチル(MOE)化、2'-アミノプロピル(AP)化、および2'-フッ素化が挙げられる。さらにまた、チミジン塩基がウラシル塩基で置換されているRNAヌクレオチドも想定される。低タンパク質親和性ヌクレオチドはまた、相補鎖に組み込まれていてもよい。しかし、一部の実施形態においては、ホスホロチオエート化が用いられる。さらに、このような修飾は、同じ核酸が組み合わされた複数種類の修飾に供され得るように実施し得る。例えば、以下に記載される実施例において用いられるとおり、酵素的切断に対する抵抗性を与えるため、同じRNAをホスホロチオエート化と2'-O-メチル化に供してもよい。しかし、RNAヌクレオチドがRNaseHによって切断されることが予想されるかまたは望まれる場合には、ホスホロチオエート化または2'-O-メチル化のいずれかのみが一般的に適用される。
相補鎖内のヌクレオチドアナログの数および修飾の位置の好適な実施形態があるが、これは、上記の数および修飾の位置が、特定の実施形態における二本鎖アンチセンス剤によって提供されるアンチセンス効果などに影響を与える可能性があるるためである。これらの好適な実施形態は、修飾される核酸の種類、配列などによって変動し得るため、状況にもよるが、種類、配列などは、修飾後の二本鎖アンチセンス剤が有するアンチセンス効果を上記と同じ方法で測定することによって特徴付けることができる。
一部の実施形態において、RNaseAなどのリボヌクレアーゼによる分解は相補鎖が特定の細胞の核内に送達されるまで抑制されるが、相補鎖は、特定の細胞内でRNaseHに分解されることによってアンチセンス効果を容易に示し得るという点から考えると、相補鎖は、一般的にRNAを含み、またヌクレアーゼの安定性および/またはTmを増加させるヌクレオチドを組み込むことができる。例えば、上記の相補鎖の、キメラアンチセンス鎖のウイング領域(すなわち第1のもしくは第2の5'ウイング領域および/または第1のもしくは第2の3'ウイング領域)の1つに相補的な領域において、場合により、酵素(例えばリボヌクレアーゼ)による複合体の分解を抑制する役割を果たす、1つ以上の修飾核酸、1つ以上のヌクレオチドアナログ、および/または1つ以上の低タンパク質親和性ヌクレオチドを組み込むことができる。
特定の実施形態によれば、修飾は、RNAの2'-O-メチル化および/またはホスホロチオエート化である。さらに、一部の実施形態において、アンチセンス鎖のウイング領域の1つに相補的な相補鎖の全領域が修飾されていてもよいし、またはアンチセンス鎖のウイング領域に相補的な領域の部分が修飾されていてもよい。さらに、修飾されている領域は、修飾されている領域がその部分を含む限り、第1の核酸鎖の修飾核酸を含む領域より長くてもよいし、またはより短くてもよい。アンチセンス鎖の構造に関連した相補鎖の構造の一部の実施形態の例は、図15に示されている。最初に、上の構造は、二重ウイングアンチセンスポリヌクレオチド(DW-ASO)である。その下は、4つの相補鎖の例である。例えば、二本鎖剤がRNaseHによる切断に感受性であることが望ましい場合、中央領域に相補的な相補鎖の部分は、好ましくはRNAを含む(RNA(o) = 二リン酸結合を有するRNA)。DW-ASOの様々なウイング領域に相補的な相補鎖の部分は、修飾ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチドアナログも含み得る。例えば、二重ウイング構造は、相補鎖(cRNA(DW))にも含まれ得る。または、各端の第1のウイング領域および第2のウイング領域に相補的な相補鎖の部分は、必ずしも低タンパク質親和性ヌクレオチドではない(cRNA(G)またはcLNA(G)；Gは「ギャップマー」構造を指す)が、修飾ヌクレオチドおよび/またはヌクレオチドアナログを含み得る。または、相補鎖はペプチド核酸を含み得る。図6は、構造の簡略図を示し、様々な相補領域は、必ずしも登録されていなければならないというわけではない。当業者であれば、二本鎖アンチセンス剤の所望の機能性(構成ポリヌクレオチドの機能性を含む)を逸脱することなく構造を改変し得るということは容易に理解することができる。最終的に、図15に示される相補鎖は、5'末端に機能性基「X」を含む。このような基は、任意選択で含まれ、また以下に記載される。
二本鎖アンチセンス剤において、1つ以上の構成ポリヌクレオチドは、機能性部分をさらに含み得る。
一部の実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドに相補的な鎖は、ポリヌクレオチドに結合する機能性部分を含み得る。図15に戻って参照すると、機能性部分「X」は、様々な例の相補鎖の5'末端に連結されていることが示されている。さらに以下に記載される機能性部分は、代替的に、3'末端に連結されていてもよく、またはポリヌクレオチドの内側の位置に連結されていてもよい。他の実施形態において、相補鎖は、ポリヌクレオチドの複数の位置に連結されていてもよく、および/または1つの位置に一群として連結されていてもよい、2つ以上の機能性部分を含む。
一部の実施形態において、キメラアンチセンスポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに結合された機能性部分を含み得る。例えば、機能性部分は、図4B、4C、および4Dに示されるとおり、キメラアンチセンスポリヌクレオチドの5'-末端ヌクレオチド、または3'-末端ヌクレオチド、あるいは5'末端ヌクレオチドおよび3'末端ヌクレオチドの両方に連結されていてよい。当然のことながら、機能性部分は内側の位置に連結されていてもよく、また上記のとおり、2つ以上部が連結されていてよい。
特定の実施形態のキメラアンチセンスポリヌクレオチドにおいて、機能性部分はポリヌクレオチドに結合されていてもよい。ポリヌクレオチド(例えば、アンチセンスポリヌクレオチドまたは相補ポリヌクレオチド)と機能性部分との間の結合は、直接結合であってもよいし、または別の物質によって介在される間接結合であってもよい。しかし、特定の実施形態においては、機能性部分が、共有結合、イオン性結合、水素結合などを介して第2のウイングなどのポリヌクレオチドに直接結合されていることが好ましく、またより安定な結合を得ることができるという点から考えると、共有結合がより好ましい。機能性部分はまた、切断可能な連結基を介してポリヌクレオチドに結合されていてもよい。例えば、機能性部分は、ジスルフィド結合を介して連結されていてもよい。
機能性部分がキメラポリヌクレオチドに所望の機能を与える限り、特定の実施形態による「機能性部分」の構造について特定の限定はない。所望の機能としては、標識機能、精製機能、および送達機能が挙げられる。標識機能を与える部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどの化合物が挙げられる。精製機能を与える部分の例としては、ビオチン、アビジン、Hisタグペプチド、GSTタグペプチド、FLAGタグペプチドなどの化合物が挙げられる。
さらに、キメラポリヌクレオチドを高特異性および高効率性で標的部位に送達し、これにより関連の核酸による標的遺伝子の発現を極めて効果的に抑制するという点から考えて、一部の実施形態のキメラアンチセンスポリヌクレオチドを体内の「標的部位」に送達する活性を有する分子が、キメラアンチセンスポリヌクレオチドおよび/または別の二本鎖アンチセンス剤のポリヌクレオチド成分に、機能性部分として結合されていることが好ましい。一部の実施形態においては、機能性部分が、相補鎖(すなわち、アンチセンスポリヌクレオチドに相補的で、アニールしているポリヌクレオチド)に連結されていることが好ましい。
「標的送達機能」を有する部分は、例えば、特定の実施形態のキメラポリヌクレオチドを肝臓などに高特異性および高効率性で送達し得るという点から考えて、脂質であってよい。このような脂質の例としては、コレステロールおよび脂肪酸などの脂質(例えば、ビタミンE(トコフェロール、トコトリエノール)、ビタミンA、およびビタミンD)；ビタミンKなどの脂溶性ビタミン(例えば、アシルカルニチン)；アシル-CoAなどの中間代謝産物；糖脂質、グリセリド、およびそれらの誘導体が挙げられる。しかし、これらの中でも、より高い安全性を有するという点から考えて、特定の実施形態において、コレステロールおよびビタミンE(トコフェロールおよびトコトリエノール)が使用される。さらに、特定の実施形態のキメラアンチセンスポリヌクレオチドを高特異性および高効率性で脳に送達し得るという点から考えて、特定の実施形態による「機能性部分」の例としては、糖(例えば、グルコースおよびスクロース)が挙げられる。さらにまた、様々な臓器の細胞表面上に存在する様々なタンパク質に結合することによって、特定の実施形態のキメラアンチセンスポリヌクレオチドを様々な臓器に高特異性および高効率性で送達し得るという点から考えて、特定の実施形態による「機能性部分」の例としては、ペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体リガンドならびに抗体および/またはそのフラグメント)が挙げられる。
特定の実施形態のキメラアンチセンスポリヌクレオチドに関して、図4B、4Cおよび4Dに示されるとおり、機能性部分は、5'-末端ヌクレオチド、もしくは3'-末端ヌクレオチド、または5'末端ヌクレオチドと3'末端ヌクレオチドの両方に連結することができる。標識を核酸鎖にカップリングするための技術は、標識部分の性質および核酸中の結合点によって異なり、これらは当技術分野において周知である。図示されていないが、機能性部分は、ポリヌクレオチドの鎖末端部位ではなく内側部位に連結することができる。同様に、このような技術は当技術分野において周知である。
このように、一部の実施形態のキメラポリヌクレオチドの幾つかの好適な例示的実施形態を説明したが、キメラポリヌクレオチドは、上記の例示的実施形態に限定されることが意図されるものではない。さらに、当技術分野において通常の技能を有する者であれば、公知の方法を適切に選択することによって、様々な実施形態によるキメラポリヌクレオチドを製造することができる。例えば、一部の実施形態による核酸は、標的転写産物の塩基配列(または、一部の例では、標的遺伝子の塩基配列)の情報に基づいて核酸の各塩基配列を設計し、市販の自動核酸合成装置(Applied Biosystems, Inc.の製品；Beckman Coulter, Inc.の製品；など)を使用して核酸を合成し、その後、結果として得られたオリゴヌクレオチドを逆相カラムなどを使用して精製することによって製造することができる。この方法で製造された核酸は、適切な緩衝溶液中で混合され、約90℃〜98℃で数分(例えば5分間)変性され、その後核酸は約30℃〜70℃で約1〜8時間アニールされ、このようにして一部の実施形態の二本鎖核酸複合体を製造することができる。さらに、機能性部分を有するポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成中または合成後に、機能性部分をオリゴヌクレオチド鎖に連結することによって製造することができる。機能性部分を核酸に連結するための多数の方法が、当技術分野において周知である。
このように、キメラ一本鎖アンチセンスポリヌクレオチドと相補ポリヌクレオチドの好適な例示的実施形態が記載される。さらなる実施形態もまた、以下の実施例に開示される。しかし、本発明者らによって想定されるキメラポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤は、上記の例示的実施形態または以下の実施例に限定されない。
アンチセンス効果によって標的遺伝子の発現または標的転写産物のレベルを改変するための組成物もまた想定される。
一部の実施形態のキメラ一本鎖ポリヌクレオチドおよび二本鎖アンチセンス剤は、高特異性および高効率性で標的部位に送達することが可能であり、以下に記載される実施例に開示されるとおり、標的遺伝子の発現または転写産物のレベルを極めて効果的に抑制することができる。従って、一部の実施形態は、活性成分として一部の実施形態のキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは二本鎖アンチセンス剤を含み、アンチセンス効果によって、例えば標的遺伝子の発現を改変または抑制することが意図される組成物を提供する。特に、一部の実施形態のキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは二本鎖アンチセンス剤は、低濃度で投与される場合でも高い有効性を与えることが可能であり、またキメラ設計は、低減された毒性も示す。さらに、アンチセンスポリヌクレオチドまたは二本鎖アンチセンス剤を特定の臓器に向けることにより、有害な副作用を低下させることができる。従って、一部の実施形態はまた、例えば、標的遺伝子の発現の増加に関連する疾患(代謝疾患、腫瘍、および感染症など)を治療および予防することが意図される医薬組成物を提供することもできる。
一部の実施形態のキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは二本鎖アンチセンス剤を含む組成物は、公知の製薬法によって製剤化することができる。例えば、本組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、微粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、解膠剤(peptizer)、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、コーティング剤、軟膏、硬膏剤(plaster)、パップ剤(cataplasm)、経皮剤、ローション剤、吸入剤、エアロゾル剤、注射剤および坐剤の形態で経腸的に(経口的など)、または非経腸的に使用することができる。
これらの製剤の製剤化に関して、薬理学的に許容可能な担体または食品および飲料品として許容可能な担体、特に滅菌水、生理食塩水、植物性油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁化剤、界面活性剤、pH調整剤、安定化剤、香味料、香料、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、鎮静剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、増粘剤、矯味剤、溶解助剤、および他の添加剤を適切に組み込むことができる。
製剤化の際、非特許文献1に開示されるとおり、機能性部分として脂質が結合している一部の実施形態のキメラアンチセンスポリヌクレオチドまたは二本鎖アンチセンス剤は、リポタンパク質(例えばカイロミクロンまたはカイロミクロンレムナント)と共に複合体を形成することができる。さらに、経腸投与の効率性を高めるという点から考えて、リポタンパク質に加えて、結腸粘膜上皮透過性増強作用を有する物質(例えば、中鎖脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸またはそれらの誘導体(塩、エステル形態またはエーテル形態))および界面活性剤(非イオン性界面活性剤およびアニオン性界面活性剤)との複合体(混合ミセルおよび混合エマルション)を使用することもできる。
一部の実施形態の組成物の投与の好ましい形態には特定の限定はなく、その例としては、経腸(経口など)または非経腸投与、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気管気管支投与、直腸投与、および筋肉内投与、ならびに輸血による投与が挙げられる。
一部の実施形態の組成物は、被検体としてヒトを含む動物に使用することができる。しかし、ヒトを除く動物には特定の限定はなく、様々な家畜、家禽、ペット、実験動物などが一部の実施形態の被検体となり得る。
一部の実施形態の組成物が投与または摂取される場合、投与量または摂取量は、被検体の年齢、体重、症状および健康状態、組成物の種類(医薬品、食品および飲料品など)に応じて適切に選択され得る。しかし、特定の実施形態による組成物の摂取有効量は、キメラポリヌクレオチド0.001mg/kg/日〜50mg/kg/日である。
一部の実施形態のキメラポリヌクレオチドまたは二本鎖アンチセンス剤は、以下の実施例に開示されるとおり、高特異性および高効率性で標的部位に送達することが可能であり、さらに標的遺伝子の発現または転写産物のレベルを極めて効果的に改変または抑制することができる。従って、一部の実施形態は、一部の実施形態のキメラポリヌクレオチドまたは二本鎖アンチセンス剤を被検体に投与し、アンチセンス効果によって標的遺伝子の発現または転写産物レベルを抑制する方法を提供することができる。さらに、一部の実施形態の組成物を被検体に投与することにより、例えば、標的遺伝子の発現の増加に関連する様々な疾患を治療または予防する方法もまた提供される。
本明細書中以降、一部の実施形態は、実施例によってさらに具体的に説明されるが、実施形態が以下の実施例に限定されることが意図されるものではない。
実施例1
本発明の一実施形態によるキメラポリヌクレオチドの阻害効力を、2つの従来のギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較する実験を行った。ポリヌクレオチド構造および実験の結果は図7に示される。対照ギャップマーは、長さ13塩基(ApoB1 ASO 13mer；配列番号6)、および長さ20塩基(ApoB1 ASO 20mer-4；配列番号2)である。13mer対照は、8個のホスホロチオエート化DNAヌクレオチドの中央領域、2個のLNA塩基の第1の5'ウイング領域、および3個のLNA塩基の第1の3'ウイング領域を有するが、いずれの側にも第2のウイングは有していない。20mer対照は13merと同じ構造を有し、5'末端に4個のホスホロチオエート化2'-O-Me RNA塩基を、また3'末端に3個のホスホロチオエート化2'-O-Me RNA塩基を付加している。開示によれば、これらの塩基は低タンパク質親和性ヌクレオチドではなく(これらはホスホロチオエート化されているため)、このためこれらの塩基は第2の5'または3'ウイング領域を構成しない。これらは実際に、第1のウイング領域の一部として分類される(また従って、20mer対照は、6塩基の5'ウイング領域と6塩基のの3'ウイング領域とを有するギャップマーである)。
キメラポリヌクレオチドApoB1 ASO 20mer-5；配列番号7)は、8塩基の中央領域、2個のLNA塩基の第1の5'ウイング領域および3個のLNA塩基の第1の3'ウイング領域を含み、これに4個の2'-O-Me RNA塩基の第2の5'ウイング領域と3個の2'-O-Me RNA塩基の第2の3'ウイング領域を付加している。2'-O-Me RNA塩基は低タンパク質親和性ヌクレオチドであり、このようにして第2のウイング領域を構成する。
3つのASOを、Hep1-6肝臓細胞を使用して、以下の手順に従ってin vivoで試験した。
上記のASOをそれぞれ、リポフェクタミン2000(Invitrogen, Inc.製)を使用して、試薬と共に提供される使用プロトコルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション時点の、それぞれのASOの培地中濃度は、2nM、10nM、および20nMであった。さらに、ASOが細胞に添加されていない対照も調製した。続いて、トランスフェクションの24時間後、Isogenを用いて細胞を回収し、また製造者の使用プロトコルに従ってmRNAを回収し、mRNAの量を決定した。
製造者のプロトコルに従ってSuperScript IIIを使用して、一定量のmRNAからcDNAを合成した。続いて、得られたcDNAをテンプレートとして使用し、TaqManシステムを使用して定量RT-PCRを実施した。定量RT-PCRにおいて使用されたプライマーは、様々な遺伝子数に基づいて、Life Technologies Corpによって設計および製造されたプライマーであった。温度および時間に関するPCR条件は以下のとおりであった：95℃で15秒、60℃で30秒、および72℃で1秒を1サイクルとして設計し、その40サイクルを実施した。このようにして得られた定量RT-PCRの結果に基づいて、rApoBの発現量/rGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量をそれぞれ計算し、対照群についての計算結果と核酸投与群についての計算結果を比較し、t-試験によって評価した。このようにして得られた結果は図7に示される。
図7中の結果によって示されるとおり、3つのASOは全てアンチセンス効果を示し、より高濃度のASOにおいてより高い阻害が得られた。しかし、20merキメラポリヌクレオチドの阻害効力を20mer対照と比較すると、キメラポリヌクレオチドはより高度の阻害を提供する。13mer対照の効力は依然としてより高いが、第2のウイングの存在は、従来の20mer対照ASOと比較して改善された性能を提供し、13mer対照と比較して低減された毒性を有することが予想される。結果は、第2のウイング領域の包含が、改善されたアンチセンス能を提供することを明らかにする。
実施例2
第2の5'ウイング領域、第2の3'ウイング領域、または両方ウイング領域のいずれかを有する本発明の実施形態によるキメラポリヌクレオチドの阻害効力を比較する実験を行った。これらのポリヌクレオチド構造および実験結果は、図8Aに示される。2つの従来のギャップマー対照を、3つの異なるキメラポリヌクレオチドの阻害効力と比較した。
これらのASOを、実施例1に記載される手順に従って、Hep1-6肝臓細胞を使用してin vivoで試験し、その結果は図8Bに示される。ASOは、20nMの濃度でトランスフェクトされた。
図8B中の結果によって示されるとおり、5つのASOは全て、陰性対照(ASOなし)と相対してアンチセンス効果を示す。しかし、20merキメラポリヌクレオチドの阻害効力を20mer対照と比較すると、キメラポリヌクレオチドは、3つの全ての場合において、より高度の阻害を提供する。有意に、第2の5'ウイングを有するキメラポリヌクレオチドは、13mer対照によって達成された阻害と統計的に同じ効力を示した。このように、第2のウイングの存在は、13merギャップマーにより得られる性能と同様の、20merASOにより得られる性能をもたらす。さらに、20merキメラポリヌクレオチドは、13mer対照と比較して、低減された毒性を有すると予想される。
実施例3
次に、マウスにおいて、キメラポリヌクレオチドをin vivoで試験した。ASOプローブと対照の配列および設計は図9に示される。ASOは、それぞれ尾静脈を介して3.0mg/kgの量でマウスに静脈注射した。マウスは、体重20〜25gの4週齢の雌のICRマウスであった。マウスを使用した実験は全て、n = 3で実施した。さらにまた、陰性対照群として、一本鎖ASOまたは二本鎖核酸複合体の代わりにPBSのみを注射したマウスも作製した。注射の72時間後、マウスにPBSを灌流させ、その後マウスを解剖して肝臓を摘出した。続いて、実施例1に記載される方法と同じ方法によって、mRNAの抽出、cDNAの合成、および定量RT-PCRを実施し、mApoBの発現量/mGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量を計算し、PBSを投与した群(PBSのみ)と核酸を投与した群の間の比較を行った。このようにして得られた結果は図9に示される。
図9に示されるとおり、2つのASOはアンチセンス効果を示す(13mer対照および20mer-5キメラポリヌクレオチド)が、2つの20mer対照(20mer-1および20-4)はアンチセンス効果を示さない。13mer対照の効力は依然としてキメラポリヌクレオチドより高いが、第2のウイングの存在は、従来の20mer対照ASOと比較して改善された性能を与え、13mer対照と比較して低減された毒性を有すると予想される。結果は、第2のウイング領域の包含が、in vivoにおいて改善されたアンチセンス能を提供することを明らかにする。
実施例4
Toc(トコフェロール)-HDOの設計および合成。様々な長さ(13-〜23-mer)の一連のDNA-LNAギャップマー(gapmer)またはキメラマー（chimeramer)が、マウスApoB mRNA(NM_009693)を標的とするように設計され、Gene Design(大阪、日本)およびHokkaido System Science(札幌、日本)によって合成された。
ApoB mRNAを標的とするキメラマーの配列は以下のとおりであった：
1) ApoB1 13mer、
5'-G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号1)；
2) ApoB1 Toc13merPS(-)、
5'-Toc_G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号1)；
3) ApoB1 Toc17merPS(-)、
5'-Toc-U(X)-C(X)-C(X)-A(X)-G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号2)；
4) ApoB1 Toc20merPS(-)、
5'-Toc-A(X)-A(X)-G(X)-U(X)-C(X)-C(X)-A(X)-G(L)^C(L)
^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号3)；
5) ApoB1 Toc20merPS(+)
5'-Toc^A(X)^A(X)^G(X)^U(X)^C(X)^C(X)^A(X)^G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号4)；および
6) ApoB1 TocPEG13mer
5'-Toc^スペーサー18^G(L)^C(L)^a^t^t^g^g^t^a^t^T(L)^C(L)^A(L)-3' (配列番号1)；
ここで、小文字はDNAを表し、括弧内に示される大文字のLはLNAを表し(大文字のCはLNAメチルシトシンを示す)、括弧内に示される大文字のXは、UNAまたは2'-O-メチル糖修飾を表し、山形マークはホスホロチオエート結合を表す。
マウス研究
病原体除去動物施設において、4〜5週齢の野生型Crlj:CD1(ICR)マウス(Oriental Yeast、東京、日本)を12時間の明/暗周期に維持し、食餌と水を自由に摂取させた。ASOギャップマーまたはキメラマーを、体重に基づく尾静脈注射によってマウスに投与した。オリゴヌクレオチドは全てPBS中で製剤化し、PBSは対照としても使用した。オリゴヌクレオチドを0.75〜6mg/kgの1回注射によって野生型マウスに投与した。死後分析のため、60mg/kgのペントバルビタールを腹腔内に投与することによってマウスを最初に深く麻酔し、次いで、瞬目反射がないことを確認した後、PBSを用いる経心臓的灌流によって屠殺した。動物実験は全て、東京医科歯科大学の動物実験のための倫理的および安全性ガイドライン(#0140144A)に従って実施した。
定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応アッセイ。全RNAを、Isogen(ニッポンジーン(Nippon Gene)、東京、日本)を使用してマウス肝臓から抽出した。mRNAを検出するため、DNase処理したRNA(2マイクログラム)を、SuperScript IIIおよびRandom Hexamers(Life Technologies、カールスバッド、カリフォルニア州)を用いて逆転写した。RNAを検出するため、Light Cycler 480 Real-Time PCR Instrument(Roche Diagnostics、マンハイム、ドイツ)を使用することにより、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)分析を実施した。Applied Biosystemsにより、マウスのApoB、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapdh；NM_008084)遺伝子用のプライマーおよびプローブが設計された。このようにして得られた結果は図に示される。
ノーザンブロット分析
Isogen II(ニッポンジーン(Nippon Gene))を用いてマウス肝臓から全RNAを抽出した。全RNA(45マイクログラム)を、18％ポリアクリルアミド-尿素ゲル中の電気泳動によって分離し、Hybound-N+膜(Amersham Biosciences、ピスカタウェイ、ニュージャージー州)に転写した。このブロットを、DIGオリゴヌクレオチド3'末端標識キット、第2世代(Roche Diagnostics)を使用してジゴキシゲニン-ddUTPで標識した、cRNA配列に対応するプローブ、またはマウス U6ミクロRNA配列(内部対照)とハイブリダイズさせた。ギャップマーまたはキメラマーを検出するためのDNAプローブの配列は、5'-TGAATACCAATGCTG-3'であった。シグナルは、Gene Images CDP-star Detection Kit(Amersham Biosciences)によって可視化した。このようにして得られた結果は、図10に示される。
図11および図12に示されるとおり、3つのASO(13mer対照、Toc-17-mer-8U PS-キメラポリヌクレオチドおよびToc-20-mer-8U PS-キメラポリヌクレオチド)は、アンチセンス効果を示す。他方、2つの20mer対照(20mer-9および20-mer-8U PS+)は、アンチセンス効果を示さない。Toc-20-mer-8U PS-の効力は、依然として他の2つのキメラポリヌクレオチド(13mer対照およびToc-20-mer-8U PS-キメラポリヌクレオチド)の効力より高い。さらに、Toc-20-mer-8U PS-の有効性は、注射の14日後まで延長された(図13)。さらに、Toc-20-mer-8U PS-の効力は、用量依存様式であった(図14)。
これらの結果は、PSを有さない第2のウイングの存在が、PSを有する従来の20merの対照ASOと比較して改善された性能を提供し、また上記の20-mer-8U PS-ASOが、対照と比較して低減された毒性を有すると予想されることを示唆している。
「高エクソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド」は、(i)DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAヌクレオチドよりも抵抗性であり、(ii)エクソヌクレアーゼに対して天然のDNAまたはRNAヌクレオチドよりも抵抗性であり、また(III)エンドヌクレアーゼに対して天然のDNAまたはRNAヌクレオチドと抵抗性が相対的に同じか、または抵抗性がより低いヌクレオチドである。
高エクソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドの例としては、2'-O-メチルRNAヌクレオチド、2'-O-メトキシエチルRNAヌクレオチド、LNA、cMOE BNA、2-フルオロRNAヌクレオチド、ボラノホスフェートヌクレオチド、メチルホスホネートヌクレオチド、ホスホロアミダイトヌクレオチド、5-メチルシトシン、5-プロピニルウリジン、およびアンロックド核酸(UNA)が挙げられる。
実施例5
次に、マウスにおいて、二本鎖アンチセンス剤をin vivoで試験した。様々なアンチセンスプローブおよび相補鎖の配列および設計は、図16Aに示される。相補鎖において、トコフェロール(Toc)は5'末端に結合している。このようにして、二本鎖剤、また恐らくはキメラアンチセンスポリヌクレオチドの送達を肝臓に向けることができる機能性部分が相補鎖に組み込まれた。
cRNAへのトコフェロール部分の結合は、公知技術に従って、トコフェロールのクロマン環の6位のヒドロキシル基がホスホロアミダイトに連結されているトコフェロールアミダイトを調製し、次いで、標準的なカップリング方法によってトコフェロールアミダイトをRNAの5'末端にカップリングすることによって行われた。
アンチセンスポリヌクレオチドおよび相補鎖(cRNA)の配列、組成および鎖長は以下のとおりであった：
アンチセンス鎖
1. 20mer-1 ApoB1 ASO：
5'-TsCsCsAsGsCsaststsgsgstsastsTsCsAsGsTsG-3'(配列番号5)
2. 20mer-4 ApoB1 ASO：
5'-u s c s c s a s GsCsaststsgsgstsastsTsCsAs g s u s g-3'(配列番号6)
3. 20mer-5 ApoB1 ASO：
5'-uccaGsCsaststsgsgstsastsTsCsAgug-3'(配列番号7)
4. 13mer ApoB1 ASO：
5'-GsCsaststsgsgstsastsTsCsA-3'(配列番号8)
(大文字：LNA；小文字：DNA；下線：2'-O-Me RNA；s：塩基間のホスホロチオエート)
相補鎖
1. 20-mer Toc-ApoB1 cRNA：
5'-Toc-c s a s c s u s g s AAUACCAAUGs c s u s g s g s a-3'(配列番号9)
2. 13-mer Toc-ApoB1 cRNA：
5'-Toc-u s g s a s AUACCAAU s g s c-3'(配列番号10)
(大文字：RNA、下線：2'-OMe-RNA、s：塩基間のホスホロチオエート)
アンチセンスポリヌクレオチドと、同じ長さを有する各cRNAとを等モル量で混合し、この混合物を95℃で5分間加熱し、次いで37℃で1時間保温し、これによりこれらの核酸鎖をアニールし、二本鎖核酸複合体を形成する。アニールした核酸を、4℃または氷上で保存した。
二本鎖複合体を、それぞれ、尾静脈を介して0.75mg/kgの量でマウスに静脈注射した。マウスは、体重20〜25gの4週齢の雌のICRマウスであった。マウスを使用する実験は全て、n = 3で行った。さらにまた、陰性対照群として、二本鎖複合体の代わりにPBSのみを注射したマウスも作製した。注射の72時間後、マウスにPBSを灌流させ、次いでマウスを解剖して肝臓を摘出した。続いて、実施例1に記載される方法と同じ方法によってmRNAの抽出、cDNAの合成、および定量RT-PCRを実施し、mApoBの発現量/mGAPDH(内部標準遺伝子)の発現量を計算し、PBSを投与した群(PBSのみ)と核酸を投与した群の間の比較を行った。このようにして得られた結果は図16Bに示される。
図16Bに示されるとおり、20mer-4 ASO、20mer-5 ASO、および13mer ASOを含有する3つの二本鎖複合体は、PBS対照と比較して統計的に有意なレベルの抑制を示した。さらに、20mer-5 ASOを含む二本鎖剤は、二本鎖13merギャップマー対照のアンチセンス効果と同様のアンチセンス効果を示す。このように、20mer-5 ASOにおける二重ウイング構造は、従来の20mer対照ASOと比較して改善された性能を提供し、また13mer対照と比較して低減された毒性を有することが予想される。上記の結果は、キメラアンチセンスポリヌクレオチド(すなわち、この場合には二重ウイング構造を有するアンチセンスポリヌクレオチド、ならびにこのポリヌクレオチドの3'末端および5'末端の両方の第2のウイング)を含む二本鎖アンチセンス剤が、in vivoで改善されたアンチセンス能を提供することを示す。

Claims (15)

  1. 以下のものを含むキメラアンチセンスポリヌクレオチドとキメラアンチセンスポリヌクレオチドにアニールされた相補鎖とを含む二本鎖アンチセンス剤：
    5〜20個のDNAおよびホスホロチオエートDNAヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域；
    少なくとも1個が架橋ヌクレオチドアナログである2〜5個のヌクレオチドを含む、該中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域；
    少なくとも1個が架橋ヌクレオチドアナログである2〜5個のヌクレオチドを含む、該中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域；および
    第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで：
    該第2の5'ウイング領域は該第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、ホスホロチオエート化されていない3〜7個の2'-O-メチルRNAヌクレオチドまたはUNAからなり；また
    該第2の3'ウイング領域は該第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、ホスホロチオエート化されていない3〜7個の2'-O-メチルRNAヌクレオチドまたはUNAからなる、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域；
    であって、ここでヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、および低タンパク質親和性ヌクレオチドの総数は100ヌクレオチド以下である、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチド。
  2. 以下のものを含むキメラアンチセンスポリヌクレオチドとキメラアンチセンスポリヌクレオチドにアニールされた相補鎖とを含む二本鎖アンチセンス剤：
    5〜20個のDNAおよびホスホロチオエートDNAヌクレオチドから独立して選択されるヌクレオチドを含む中央ヌクレオチド領域；
    少なくとも1個が架橋ヌクレオチドアナログである2〜5個のヌクレオチドを含む、該中央ヌクレオチド領域の5'末端に連結された第1の5'ウイング領域；
    少なくとも1個が架橋ヌクレオチドアナログである2〜5個のヌクレオチドを含む、該中央ヌクレオチド領域の3'末端に連結された第1の3'ウイング領域；および
    第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域であって、ここで：
    該第2の5'ウイング領域は該第1の5'ウイング領域の5'末端に連結されており、ホスホロチオエート化されていない3〜7個の2'-O-メチルRNAヌクレオチドまたはUNAからなり、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有し；また
    該第2の3'ウイング領域は該第1の3'ウイング領域の3'末端に連結されており、ホスホロチオエート化されていない3〜7個の2'-O-メチルRNAヌクレオチドまたはUNAからなり、DNaseまたはRNaseに対して天然のDNAまたはRNAより高い抵抗性を有する、前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域
    であって、ここでヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの総数は100ヌクレオチド以下である、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチド。
  3. 前記中央ヌクレオチド領域が、RNAポリヌクレオチドにハイブリダイズすると、該中央ヌクレオチド領域/RNAポリヌクレオチド二本鎖がRNaseHによって認識されるヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  4. 前記中央ヌクレオチド領域内のヌクレオチドの少なくとも1個がホスホロチオエート化されている、請求項１〜３のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  5. 前記中央ヌクレオチド領域内の全ヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、請求項４に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  6. 前記第1のウイング領域内の架橋ヌクレオチドが、LNA、cEt BNA、アミドBNA、およびcMOE BNAから独立して選択される、請求項１〜５のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  7. 前記中央ヌクレオチド領域および前記第1のウイング領域(1つまたは複数)内のヌクレオチドアナログの少なくとも1個がホスホロチオエート化されている、請求項１〜６のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  8. 前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドが、前記第2の5'ウイング領域のみを含む、請求項１〜７のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  9. 前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドが、前記第2の3'ウイング領域のみを含む、請求項１〜７のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  10. 前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドが、前記第2の5'ウイング領域および前記第2の3'ウイング領域を含む、請求項１〜７のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  11. 前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドが、25℃で、100mM塩化ナトリウム、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中で細胞転写産物にハイブリダイズし得る、請求項１または２に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  12. 前記中央領域が、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る細胞転写産物に完全に相補的である、請求項１１に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  13. 前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域が、前記キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズし得る細胞転写産物に該キメラアンチセンスポリヌクレオチドがハイブリダイズする場合に少なくとも1個のミスマッチ塩基を含む、請求項１１に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  14. 前記第2の5'ウイング領域および/または第2の3'ウイング領域の全ての塩基がミスマッチしている、請求項１３に記載の二本鎖アンチセンス剤。
  15. 請求項１〜１４のいずれか1項に記載の二本鎖アンチセンス剤、および製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
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