JP6440036B2 - 抗β2−グリコプロテインI抗体及びその治療的用法 - Google Patents
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Description
ヒトβ2GPIに対するヒトファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによりさらにヒンジ領域、ヒトIgGlのCH2及びCH3ドメインを含有するように、scFv−Fcフォーマット(MBB2)に遺伝子組換えされた特異的scFvを選択することが可能になる。さらにELISAによる固定化β2GPIに結合するMBB2の分析により、20ng/mlの濃度でなお標的抗原を検出することができる抗体の強力な反応性(図1A)及び可溶性β2GPIとのおだやかな相互作用が明らかになった(図2)。MBB2は、固相結合型プロトロンビンと反応しなかった。われわれの目標は動物モデルでscFv−Fcを用いることであったため、抗体はマウスβ2GPIを認識する能力も試験され、ヒトカウンターパートとの反応と同様にマウス分子と反応することを証明され、共有エピトープの認識を示唆している(図1A)。カルジオリピン−被覆プレートがいくつかの動物からの血清を含有する遮断緩衝液で処理されている従来の抗カルジオリピン抗体アッセイを用いて、他の動物種からのβ2GPIとMBB2の反応性も評価した。図4に示した結果は、抗体はラット、マウス、ブタ、ヤギ及びウシ胎児を含むいくつかの種からのカルジオリピン−結合β2GPIとさまざまな度数で反応することを示している。その後、β2GPIタンパク質の遺伝子組換え単一ドメインを用いて、MBB2の標的エピトープを同定し、5つのドメインのうち4つを試験して、抗体がドメインに結合することがわかった(図1B)。続いて、Ioannouらが記載したように固相結合型遺伝子組換えDIを用いてMBB2がに結合することを確認した(非特許文献16)。
MBB2がβ2GPIのDIと相互作用することがわかり、われわれはAPS患者のこの特異性がある抗体の臨床的意義の点から、動物モデルで血餅及び胎児喪失を引き起こす抗体の能力を調査することとした。この目的のために、抗体をLPSで感作したラットに注入し、生体内顕微鏡法により腸間膜微小血管でそのプロコアグラント作用を監視した。図3Aに示したように、抗体注入10分後に既に目に見えた血小板−白血球微小凝集塊を特徴とする、初期段階での二相のパターンに続いて、MBB2が血餅形成を誘発した。この凝集物によって引き起こされた一過性血管閉塞に続いて、血栓サイズの進行的増加を特徴とする第2段階が起こり、その結果、血管の永久閉塞となった(図3A及びB)。非感作ラットに注入したMBB2が、小さな白血球−血小板抱合体を生じさせ、60分後に消失し、一方、対照抗体は完全に無効であった(図3A及びB)。
補体のMBB2の病原作用への関与を調査するために、われわれは、最初に、補体のソースとしてNHSの存在下で、補体を活性化する固定化β2GPIに結合したscFv−Fcの能力を分析した。MBB2がClq及びC4の結合によって示唆されたように古典的経路を誘発すること、及びC9の付着によって示された末端複合体の集合を促進することがわかった(図5)。LPSで感作したC6欠乏ラットで、MBB2によって誘発された血栓の発現での補体活性化の作用発現期の役割を評価した。このラットに抗体はごく僅かなプロコアグラント作用があり、腸間膜血管の分析によりC9が存在しないとIgG及びC3の付着物を示した(図6A、E)。抗−β2GPIscFv−Fcの投与前にC5中和抗体を与えた妊娠マウスで、MBB2−誘発胎児喪失への補体の関与を分析した。この治療の結果、胎児喪失の有意な減少及び胎児重量の有意な増加に関係する着床部位でのC9付着を抑制した(図6C〜D)。
IgGlのCH2ドメインは、Clqの結合部位を含有するため、われわれは、さらに親抗体の病原作用を媒介するときの補体の役割を確認するために、このドメイン(MBB2ΔCH2)を欠く変性型のscFv−FcMBB2を生成した。図7Aに示したELISAの結果は、MBB2ΔCH2がMBB2と同様にβ2GPIと相互反応するが、結合すると、補体を活性化することができないことを示している(図7B)。LPSで前処理した正常ラットに注入した変性分子には、C6欠乏ラットにみられたものに類似している血栓作用のパターンで、ごく僅かなプロコアグラント活性があった。これは血栓事象への補体活性化の重要な関与を強調している(図7C)。さらに、MBB2ΔCH2は、胎児重量及び胎児喪失の点で妊娠結果に影響を及ぼさなかったが、その代わりMBB2によって重度に抑制された(図7E)。
CH2−欠損抗体が固定化β2GPIとの強力な相互作用にもかかわらず補体を活性化するできないという発見により、われわれはMBB2ΔCH2がAPS患者からの抗β2GPI抗体と競合し、そのため、病原作用を阻止する可能性を考えるに至った。この目的のため、LPSで感作したラットでの患者のIgGのプロコアグラント活性をMBB2ΔCH2及び抗−β2GPIの混合物のそれと比較した。図8A〜Bに示したように、CH2−欠損抗体は対照IgGで事前に得たレベルまで血栓形成及び血管閉塞を減少させることができた(非特許文献9)。IgGaPL+だけを受けているラット及びIgGaPL+及びMBB2ΔCH2の両者を受けているラットの間での血栓形成及び血管閉塞の差は、注入から45分後に統計的有意に達した。妊娠マウスに投与した同一分子は、APS患者からの抗−β2GPIIgGによって誘発される胎児死亡を有意に減少させることがわかった(図8C)。本調査で、この臨床的指標は評価した患者からのIgGの注入による影響を受けなかったため、われわれは胎児重量に対する抗体の有益な作用を評価することができなかった。
ヒト及びマウスβ2GPIの精製及び特性化
過塩素酸処理により血液提供者から得た貯留ヒト血清及びマウス血清からβ2GPIを精製し、続いてヘパリンカラム(HiTrap HeparinHP、GE Healthcare、Milan、Italy)上で親和性精製及びイオン交換クロマトグラフィー(Resource−S、GE Healthcare)を行った。放射免疫拡散法を用いてβ2GPIを同定し、さらにSDS−PAGE及びクマシーブルー染色により純度を分析し、及びELISAによりaPL補因子活性を試験した(非特許文献29)。
健康な提供者から得た末梢血リンパ球から、選択のために用いられるファージディスプレイ Ab ライブラリーを誘導した。これは以前に記載されている(非特許文献30)。以前に報告されたように、一晩のインキュベーションによって4℃で、β2GPIで被覆した96ウェルプレートで選択を実施した(実験の詳細について以下を参照)(非特許文献30)。パンニング法を2回反復した。選択96ランダムクローンを選択した後、96ウェルプレートで単一コロニーからのファージを成長させた。ファージELISAによって陽性クローン(B2)を同定し、V遺伝子をシークエンシングし、the−IMGT(登録商標)のIMGT/V−QUESTツール、ImMunoGeneTics information system(登録商標)http://imgt.cines.frを用いたスクリーニングによってVH及びVLファミリー、ならびに用いた遺伝子セグメントを評価した。
ヒトIgGlヒンジ−CH2−CH3ドメインを含有するpMB−SV5(非特許文献31)ベクターにサブクローニングすることによって、陽性scFvB2をヒトscFv−Fcフォーマット(MBB2)に変換した。ほぼ同じ手順に従って、TSA12/22(Adienne、Pharma&Biotech)(非特許文献32)抗C5抗体(MBC5)及び対照MBとして用いた抗−ヒトCD20を含有するマウスscFv−Fcを生成した。(非特許文献33)に従ってCH2−欠損型のscFv−Fc(ACH2)を生成した。この目的のために、プライマー Hu_CH3_センス 5’ACGTGCTAGCCACACATGCCCACCGTGCGGTGGAGGCGGTTCA GGCGGAGGTGGCTCTGGGCAGCCCCGAGAACCACAGG3’及び Hu_CH3 抗 TGCTAAGCTTTTAAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTGGでヒト IgGl CH3−SV5 領域 を増幅した。Nhel及びHindlllでPCRフラグメントを切断し、pMBΔCH2ベクターを生成する同一酵素で切断したPMB−SV5ベクターを含有するB2にクローンした。
血清
動脈または静脈血栓症または両者の病歴がある患者から血清を得た。これは培地−高力価の抗−β2GPI抗体を含有した。補体のソースとして血液提供者10名からの貯留新鮮血清を用いた。マウス、ラット、ヤギ、ブタ及びウシ胎児を含むさまざまな動物種からも血清試料を採取した。HiTrap Protein Gカラム(Pharmacia、Milan、Italy)で患者の血清からIgGを精製した。
重炭酸緩衝液中で、一晩、精製ヒトまたはマウスβ2GPI(10μg/ml)で被覆したγ−照射ポリスチレンプレート(Maxi−Sorp Nunc−Immunoplates;VWR International)を用いたELISAによって、β2GPIと抗体の相互作用を測定した。1%BSA(Sigma−Aldrich)で遮断後、抗体の段階希釈液をプレートに加え、90分間、室温(RT)でインキュベートした。1:4,000に希釈したアルカリホスファターゼ(AP)−共役抗−ヒトIgG(Sigma−Aldrich)によって結合抗体を明らかし、基質としてp−ニトロフェニルリン酸(PNPP)(Sigma−Aldrich)を用いて反応を発現させ、405nmと読み取った。
細胞標的としてHUVEC及びβ2GPIで被覆した栄養膜細胞細胞系統BeWoを用いて、細胞結合分子と抗体の反応性を試験した。以前に公表されたとおり(非特許文献36)、HUVECを単離し、培養した。10%FCS(Gibco、Invitrogen)を補ったRPMI培地1640(Gibco,Invitrogen)で、37℃及び95%空気/5%CO2で、BeWo細胞(European Collection of Cell Cultures、ECACC、Salisbury、UK)を成長させた。
γ−照射ポリスチレンプレートプレートをヒトβ2GPI(10μg/mL)で被覆して、補体活性化の古典的経路を誘発するための結合scFv−Fcの能力を試験し、続いて90分間、RTでMBB2(10μg/mL)とインキュベートした。その後、30分間、37℃で、100μlの1:100AB+新鮮血清にβ2GPI−結合抗体を暴露した。Quidel(M−Medical、Milan、Italy)から購入した1:8,000のヤギ抗−ヒトClqまたはC4を用いて、Clq及びC4の付着を検出した。Prof.T.E.Mollnes(Oslo、Norway)によって快く提供されたマウス単クローン性抗体aEl1からC9の新生抗原(1:1,000)を用いて、C9の結合を明らかにした。二次抗体として、ともにSigma−AldrichからのAP−共役抗−ヤギIgG(1:4,000)または抗−マウスIgG(1:10,000)を使用した。基質としてPNPPを用いて酵素的反応を発現させ、405nmと読み取った。
in vivo実験には、オスラット(270〜300g)を用いた。University Animal Houseで飼われた局所コロニーからウイスターラットを得た。Harlan Italy(San Pietro al Natisone、Italy)からC6+/+PVGラットを購入し、以前に報告され(非特許文献37)、われわれのAnimal Houseに作られたラットコロニーからC67−/−PVGラットを購入した。Harlan Italy(San Pietro al Natisone、Italy)からBALB/cマウスを購入した。
以前に詳細が記載されたとおり、ラットで抗体−誘発血栓形成を評価した(非特許文献9)。簡潔にすると,Escherichia coli 055:B5からLPSの腹腔内注入を受けた動物(2.5mg/kg体重;Sigma−Aldrich)または、対照としての3時間後に滅菌生理食塩水の腹腔内注入を受けた動物に、チオバルビタールナトリウム(Inactin;80mg/kg)で麻酔をかけた。頸動脈にscFv−Fc(1mg/ml生理食塩水)または精製IgGAPS患者(10mg/ml生理食塩水)から注入する30分前に、0.025mg/kg/分の濃度及び0.25ml/時の速度で、30分、ゆっくりと大腿静脈に白血球及び血小板を染色する蛍光生体色素Rhodamine6G(Sigma−Aldrich)を注入した。CH2−欠損scFv−Fc(2mg/ml生理食塩水/30分)を注入し、続いて、患者IgG(10mg/ml生理食塩水)を30分注入して、aPL−誘発血栓形成を阻止するMBB2ΔCH2の能力を調査した。
成体繁殖用オス3:1の割合でメスBALB/cマウス(年齢が6〜8週)を収容し、自然に交配させた。妊娠第0日は、膣栓がみられる日と定義する。第0日に、scFv−Fc(10μg/100μl生理食塩水/マウス)または患者のIgG(50μg/100μl生理食塩水/マウス)のいずれかの尾静脈注入を受けたマウスで堕胎促進作用の抗体を評価し、第15日に殺処分した。1週間に3回、中和MBC5(100μg/400μl生理食塩水/マウス)の腹腔内注入によりマウスで補体を除去した。正常な胚と比べて、そのサイズの小ささ及び壊死または出血の出現によって、吸収した胎児を特定した。胎児喪失のパーセンテージとして結果を示した。それぞれの胎盤とともに子宮及び個々の胎児の重量も記録した。MBB2ΔCH2によるaPL−誘発胎児喪失の対照を評価するための実験では、妊娠の第0日に、静脈に患者のIgG(50μg/100μl生理食塩水/マウス)の注入を受けたメスマウス、及び第0、5、10日に、MBB2ΔCH2(50μg/200μl生理食塩水/マウス)の腹腔内注入を受けたメスマウス吸収した胎児を特定し、数えた。胎児喪失のパーセンテージ及び子宮及び個々の胎児の重量として結果を示している。
以前に記載されたとおり、滅菌生理食塩水の頸動脈内注入後のin vivo実験の終了時に殺処分したラットから腸間膜組織を採取し、血液を除去した(非特許文献9)。切開した組織を小片に切断し、ポリリジン処理ガラススライド(BDH Laboratory Supplies、Poole、United Kingdom)上で延伸した。
Windows用のGraphPad Prism5.0を用いて統計的分析を実施した。マン−ホイトニーの検定で、胎児吸収及び血管閉塞のデータ及びELISA結果を分析した。ステューデントt検定を用いて胎児重量を分析した。データを平均±標準偏差で表し、0.05未満のP値を統計的に有意とみなした。
Claims (10)
- β2GΡIに結合することができるヒト遺伝子組換え抗体であって、補体を活性化することができず、VH及びVL鎖を含有し、それぞれが配列SEQ ID NO:1及びSEQ ID NO:2である配列を有する前記抗体。
- β2GΡΙのDIドメインに結合する請求項1に記載の抗体。
- IgGである請求項1または2に記載の抗体。
- CH2ドメインが除去され、抗体が補体を活性化することができなくなっている、請求項1から3のうちいずれか一項に記載の抗体。
- scFv及びscFv−Fcから選択される、請求項1から4のうちいずれか一項に記載の抗体のフラグメント。
- ポリヌクレオチドSEQ ID NO:7によってコードされている、請求項5に記載のscFvフラグメント。
- CH2ドメインが除去されている、請求項5に記載のscFv−Fcフラグメント。
- in vitro競合結合アッセイで抗リン脂質抗体症候群(APS)に罹患した患者からのβ2GPIに結合した自己抗体を移動することができる、請求項1から4のうちいずれか一項に記載の抗体または請求項5から7のうちいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
- 有効成分として、請求項1から4のうちいずれか一項に記載の抗体または請求項5から7のうちいずれか一項に記載の抗体フラグメント、及び薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
- 抗リン脂質抗体症候群(APS)に罹患した患者の血栓形成、血管閉塞または胎児喪失の治療または予防に用いられる、請求項1から4のうちいずれか一項に記載の抗体または請求項5から7のうちいずれか一項に記載の抗体フラグメントまたは請求項9に記載の医薬組成物。
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