JP6440036B2

JP6440036B2 - 抗β２−グリコプロテインＩ抗体及びその治療的用法

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Publication number: JP6440036B2
Application number: JP2016524765A
Authority: JP
Inventors: テデスコ，フランチェスコ; ルイージメローニ，ピア; スブラテッロ，ダニエレ
Original assignee: オンコノックスエーピーエス
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2018-12-19
Anticipated expiration: 2034-07-07
Also published as: ES2729317T3; US20160152696A1; US9777057B2; CA2917661A1; DK3019525T3; JP2016531092A; EP3019525B1; EP3019525A1; WO2015004038A1; CA2917661C

Description

本発明は、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）に罹患した患者の治療のためのヒト遺伝子組換え抗体またはそのフラグメントを提供する。さらに具体的には、本発明は、β２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）のドメインに対応する領域を認識し、補体を結合させることができない、β２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）に特異性がある遺伝子組換えヒト抗体、及び、前記抗体または抗体フラグメントの必要な患者に投与することを含む、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）に罹患した患者の血栓形成、血管閉塞または胎児喪失を治療または阻止する方法を提供する。

抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）は、抗リン脂質結合タンパク質（ａＰＬ）自己抗体が持続的に存在する反復性動脈血栓症及び／または静脈血栓症及び妊娠性病状を特徴とする全身性自己免疫性疾患である。当該症候群は、全身性ループスエリテマトーデスなどの他の自己免疫疾患の一次または二次障害として起こる。ＡＰＳには主に若年者に及ぼし、脳卒中または心筋梗塞の結果として身体障害を誘発する強力な社会的及び経済的影響がある（非特許文献１）。いくらかの患者が短期間に発症し、多臓器不全につながる、さまざまな臓器の小血管の血栓性閉塞を特徴とするＡＰＳの致命的な状態を示す（非特許文献２）。妊娠性病状としては、社会的及び経済的コストが高い、反復性初期及び後期流産、子宮内発育遅滞、早産、及び子癇前症が挙げられる（非特許文献１、３）。

臨床試験及び動物モデルから得たデータにより、ＡＰＳの血栓形成及び流産に抗体が関与することを主張している。いくつかのＰＬ−結合タンパク質がａＰＬの潜在標的と同定されているが、β２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）が最も関係のある標的抗原である強力な証拠がある（非特許文献４−７）。

われわれは、先頃、ヒトβ２ＧＰＩで免疫性を与え、続いて胎児着床部位で選択的に結合する蛍光標識精製タンパク質を注入した妊娠マウスでの胎児喪失の有意な増加を報告した（非特許文献８）。われわれは、親和性クロマトグラフィーによりＡＰＳ患者から精製したａＰＬ−ＩｇＧから抗β２ＧＰＩ抗体を除去するとラットの腸間膜微小循環の血栓作用が有意に減少したことも分かった（非特許文献９）。

抗体は液相中の分子と穏やかな反応性を示すが、抗体が内皮細胞、血小板、単球を含むさまざまな細胞型の膜に存在するβ２ＧＰＩに優先的に結合すること及び栄養膜細胞が主要な病因的役割を演じることは、広く受け入れられている（非特許文献１０）。特に、先頃、病因性ａＰＬがβ２ＧＰＩのドメインＩ（ＤＩ）に形成した立体配座免疫優性エピトープを認識すると示唆された（非特許文献７）。ａＰＬを血液凝固及び胎児喪失に関連付ける機序は、天然抗血液凝固剤及び線維素溶解反応の抑制、内皮細胞、血小板及び単球の活性化の結果、接着分子の発現及び組織因子の放出、合胞細胞−栄養膜細胞分化の抑制及び脱落膜炎症の促進となることを包含する（非特許文献１０）。しかし、これらのａＰＬ−媒介作用は、主にｉｎｖｉｔｒｏデータに基づいて提起されているが、これらの観察のｉｎｖｉｖｏ妥当性を完全に確立することが残っている。

ＡＰＳの補体によって演じられる重要な役割の有力な証拠は、Ｈｏｌｅｒｓ及び同僚による発見から出発している動物モデルで得られており（非特許文献１１）、Ｃ３の欠乏した、またはＣ３転化酵素の抑制剤で治療したマウスは、ａＰＬ−媒介胎児吸収及び成長遅滞から保護される。その後の試験で、選択的補体が欠乏している、または特異的抑制剤で治療した動物を用いて、胎児喪失及び血栓形成の伝達物質としての末端経路Ｃ５ａ及びＭＡＣの活性化生成物の特定に至った（非特許文献１２）。これらの観察のほとんどは、特異性がはっきりしないａＰＬで行われたが、ａＰＬ−媒介血液凝固及び胎児吸収を誘導するときの補体の役割も、抗β２ＧＰＩ特異的抗体を用いて確認された（非特許文献８、９）。

近年、血栓及び流産の発現を阻止するａＰＬの病的作用を制御するために努力の大半が傾けられている。現在、血管の血栓を阻止するためにヘパリンまたはワルファリンなどの抗血液凝固剤が用いられており、低用量アスピリン及び低分子量ヘパリンの組み合わせは、ＡＰＳの産科合併症のための第一次療法の典型になっている。しかし、ＡＰＳによりいくつかの患者でこれらの治療的アプローチが成功しているにもかかわらず、依然としてこれらの治療の利益を得ていない２０〜３０％の間で変動している大部分の患者がいる（非特許文献１３、１４、１５）。

Ｒｕｉｚ−Ｉｒａｓｔｏｒｚａ，Ｇ．，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｍ．，Ｂｒａｎｃｈ，Ｗ．＆Ｋｈａｍａｓｈｔａ，Ｍ．Ａ．Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｌａｎｃｅｔ３７６，１４９８−１５０９．Ｅｒｋａｎ，Ｄ．，Ｅｓｐｉｎｏｓａ，Ｇ．＆Ｃｅｒｖｅｒａ，Ｒ．Ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｉｃａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｕｐｄａｔｅｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ．ＡｕｔｏｉｍｍｕｎＲｅｖ１０，７４−７９（２０１０）．Ｍｅｒｏｎｉ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔａｌ．ＯｂｓｔｅｔｒｉｃａｎｄｖａｓｃｕｌａｒＡＰＳ：ｓａｍｅａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｕｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｓｅａｓｅｓ？Ｌｕｐｕｓ２１，７０８−７１０．ＭｃＮｅｉｌ，Ｈ．Ｐ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｈｅｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．Ｎ．＆Ｋｒｉｌｉｓ，Ｓ．Ａ．Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄａｇａｉｎｓｔａｃｏｍｐｌｅｘａｎｔｉｇｅｎｔｈａｔｉｎｃｌｕｄｅｓａｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：ｂｅｔａ２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＩ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＨ）．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８７，４１２０−４１２４（１９９０）．Ｇａｌｌｉ，Ｍ．，ｅｔａｌ．Ａｎｔｉｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＣＡ）ｄｉｒｅｃｔｅｄｎｏｔｔｏｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎｂｕｔｔｏａｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｉｎｃｏｆａｃｔｏｒ．Ｌａｎｃｅｔ３３５，１５４４−１５４７（１９９０）．Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｅ．，Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｋ．＆Ｋｏｉｋｅ，Ｔ．Ａｎｔｉｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎｃｏｆａｃｔｏｒ（ｓ）ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ３３６，１７７−１７８（１９９０）．Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｙ．ＴｈｅＭｉｃｈａｅｌＭａｓｏｎＰｒｉｚｅ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｓｔｒｅｓｓｅｄｏｕｔａｎｔｉｇｅｎｓａｎｄｔｈｅｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔｏｆｄｅｃｏｙｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）５１，３２−３６（２０１２）．Ａｇｏｓｔｉｎｉｓ，Ｃ，ｅｔａｌ．Ｉｎｖｉｖｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｂｅｔａ２ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＩｕｎｄｅｒｖａｒｉｏｕｓｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｂｌｏｏｄ１１８，４２３１−４２３８（２０１１）．Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｆ．，ｅｔａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｕｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｂｅｔａ２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＩｉｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｄｒｅｑｕｉｒｅｓａｐｒｉｍｉｎｇｆａｃｔｏｒ．Ｂｌｏｏｄ１０６，２３４０−２３４６（２００５）．Ｍｅｒｏｎｉ，Ｐ．Ｌ．，Ｂｏｒｇｈｉ，Ｍ．Ｏ．，Ｒａｓｃｈｉ，Ｅ．＆Ｔｅｄｅｓｃｏ，Ｆ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＮａｔＲｅｖＲｈｅｕｍａｔｏｌ７，３３０−３３９．Ｈｏｌｅｒｓ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔａｌ．ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＣ３ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｄｕｃｅｄｆｅｔａｌｌｏｓｓ．ＪＥｘｐＭｅｄ１９５，２１１−２２０（２００２）．Ｇｉｒａｒｄｉ，Ｇ．，ｅｔａｌ．ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＣ５ａｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｍｅｄｉａｔｅｆｅｔａｌｉｎｊｕｒｙｉｎｔｈｅａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ１１２，１６４４−１６５４（２００３）ｄｅＪｅｓｕｓ，Ｇ．Ｒ．，ｅｔａｌ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｏｂｓｔｅｔｒｉｃａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＣｕｒｒＲｈｅｕｍａｔｏｌＲｅｐ１４，７９−８６．Ｅｒｎｅｓｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｍａｒｓｈｂｕｒｎ，Ｐ．Ｂ．＆Ｋｕｔｔｅｈ，Ｗ．Ｈ．Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａｎｕｐｄａｔｅｏｎｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．ＳｅｍｉｎＲｅｐｒｏｄＭｅｄ２９，５２２−５３９．Ｅｍｐｓｏｎ，Ｍ．，Ｌａｓｓｅｒｅ，Ｍ．，Ｃｒａｉｇ，Ｊ．＆Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｒｅｃｕｒｒｅｎｔｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅｆｏｒｗｏｍｅｎｗｉｔｈａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｙｏｒｌｕｐｕｓａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ．ＣｏｃｈｒａｎｅＤａｔａｂａｓｅＳｙｓｔＲｅｖ，ＣＤ００２８５９（２００５）．Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｙ．，ｅｔａｌ．ＢｉｎｄｉｎｇｏｆａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｅｐｉｔｏｐｅｓｏｎｄｏｍａｉｎＩｏｆｈｕｍａｎｂｅｔａ（２）−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＩ：ｍｕｔａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｅｓｉｄｕｅｓＲ３９ｔｏＲ４３．ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ５６，２８０−２９０（２００７）．Ｅｌｌｉｎｇｅｒ，Ｉ．，Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．，Ｓｔｅｆａｎｅｓｃｕ，Ａ．，Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，Ｗ．＆Ｆｕｃｈｓ，Ｒ．ＩｇＧｔｒａｎｓｐｏｒｔａｃｒｏｓｓｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄＢｅＷｏｃｅｌｌｓ：ａｍｏｄｅｌｓｙｓｔｅｍｔｏｓｔｕｄｙＩｇＧｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｔｈｅｐｌａｃｅｎｔａ．ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ２９，７３３−７４４（１９９９）．Ａｇａｒ，Ｃ，ｅｔａｌ．Ｂｅｔａ２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＩｃａｎｅｘｉｓｔｉｎ２ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｏｕｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｔｈｅａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｌｏｏｄ１１６，１３３６−１３４３．Ｓｔｅｉｎｋａｓｓｅｒｅｒ，Ａ．，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅｍａｐｐｉｎｇａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｍｏｄｅｌｌｉｎｇｏｆｔｈｅｆｉｆｔｈｄｏｍａｉｎｏｆｈｕｍａｎｂｅｔａ２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＩ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ３１３，１９３−１９７（１９９２）．ｄｅＧｒｏｏｔ，Ｐ．Ｇ．＆Ｄｅｒｋｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＮｅｔｈＪＭｅｄ６２，２６７−２７２（２００４）．ｄｅＬａａｔ，Ｈ．Ｂ．，Ｄｅｒｋｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｕｒｂａｎｕｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｒｏｅｓｔ，Ｍ．＆ｄｅＧｒｏｏｔ，Ｐ．Ｇ．ｂｅｔａ２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＩ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｕｐｕｓａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｈｉｇｈｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓｉｎｔｈｅａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｌｏｏｄ１０４，３５９８−３６０２（２００４）．Ｒｉｔｉｓ，Ｋ．，ｅｔａｌ．ＡｎｏｖｅｌＣ５ａｒｅｃｅｐｔｏｒ− ｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋｉｎｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｌｉｎｋｓｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙｔｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｓ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７７，４７９４−４８０２（２００６）．Ｒｅｄｅｃｈａ，Ｐ．，ｅｔａｌ．Ｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ：ａｌｉｎｋｂｅｔｗｅｅｎＣ５ａａｎｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｄｕｃｅｄｆｅｔａｌｉｎｊｕｒｙ．Ｂｌｏｏｄ１１０，２４２３−２４３１（２００７）．Ｃａｒｒｅｒａ−Ｍａｒｉｎ，Ａ．，ｅｔａｌ．Ｃ６ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔｍｉｃｅａｒｅｐｒｏｔｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａｍｅｄｉａｔｅｄｂｙａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｌｕｐｕｓ２１，１４９７−１５０５．Ｐｉｅｒａｎｇｅｌｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｖｅｇａ−Ｏｓｔｅｒｔａｇ，Ｍ．＆Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｎ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｉｎｇｔｒｉｇｇｅｒｅｄｂｙａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｐｌａｔｅｌｅｔｓａｎｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ：ａｐａｔｈｗａｙｔｏｔａｒｇｅｔｅｄｔｈｅｒａｐｉｅｓ．ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ１１４，４６７−４７６（２００４）．Ｏｓｔｅｒｔａｇ，Ｍ．Ｖ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｖ．＆Ｐｉｅｒａｎｇｅｌｉ，Ｓ．Ｓ．ＡｐｅｐｔｉｄｅｔｈａｔｍｉｍｉｃｓｔｈｅＶｔｈｒｅｇｉｏｎｏｆｂｅｔａ−２−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＩｒｅｖｅｒｓｅｓａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ− 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本発明は、抗β２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）抗体または抗体フラグメント及び抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）に罹患した患者の血栓形成及び胎児喪失を治療、または阻止する方法でのこの使用を提供する。

本発明に従ったヒト遺伝子組換え抗体またはフラグメントは、β２ＧＰＩのＤＩドメインに対応する領域を認識し（ＤＩドメインの定義のための参考文献４０及び４１を参照）、β２ＧＰＩ結合に続く補体を活性化することができない。

１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、ｉｎｖｉｔｒｏ競合結合アッセイでβ２ＧＰＩに結合した患者の自己抗体を移動することができる。

もう１つの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、ＶＨ及びＶＬ鎖を含有し、それぞれが配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２、、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１またはＳＥＱＩＤＮＯ：２と少なくとも９５％同一である配列を有する。

もう１つの実施形態では、前記ＶＨ及びＶＬ鎖はそれぞれＳＥＱＩＤＮＯ：４及び５によって同定されたポリヌクレオチド配列によってコードされる。

好ましい実施形態では、前記抗体は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧである。

もう１つの実施形態では、抗体フラグメントは単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、ＶＬ及びＶＨは、機能的にリンカーによって結合されている。

なおさらに１つの実施形態では、抗体フラグメントは、さらに免疫グロブリン重鎖不変領域のアミノ酸配列または免疫グロブリン重鎖不変領域のサブドメインを含むｓｃＦｖ−Ｆｃであり、前記免疫グロブリン重鎖不変領域は好ましくはヒトＩｇＧ重鎖から選択される。

好ましい実施形態では、本発明に従った抗体またはそのフラグメント、特にｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧＣＨ２ドメインの欠失によって補体を固定させることができない。

もう１つの好ましい実施形態では、ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントは、それぞれポリヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：７及びＳＥＱＩＤＮＯ：３によってコードされる。ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントの対応するアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：６によって同定される。

本発明に従った抗体またはそのフラグメントは、さらにＣ−末端に位置したペプチドタグを含むことができ、前記タグは結合特異性を前記抗体のβ２ＧＰＩに変えない。

本発明のもう１つの目的は、本明細書に定義されたように、有効成分として、遺伝子組換え抗体またはそのフラグメント及び薬学的に許容されるキャリアを含有する医薬組成物である。

精製β２ＧＰＩに結合しているＭＢＢ２の分析。（Ａ）さまざまな濃度のＭＢＢ２または対照ＭＢと、γ−照射ポリスチレンプレートプレート上に固定したヒトまたはマウスβ２ＧＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）をインキュベートし、ＥＬＩＳＡによって結合ｓｃＦｖ−Ｆｃを明らかにした。（Ｂ）Ａで報告したとおり、ヒトβ２ＧＰＩドメイン（１０μｇ／ｍＬ）へのＭＢＢ２の結合を分析した。Ｃ及びＤのグラフは、９６−ウェル組織培養プレートで融合まで成長したＨＵＶＥＣまたはＢｅＷｏへのＭＢＢ２または対照ＭＢの結合を示している。ｓｃＦｖ−Ｆｃに暴露する前に、β２ＧＰＩ（５μｇ／ｍＬ）または２０％ＦＣＳと細胞をインキュベートした。ＥＬＩＳＡによって結合抗体を明らかにした。３連で行った実験の平均±ＳＤとして結果を表した。固層結合分子へのＭＢＢ２の結合に関する可溶性β２ＧＰＩの抑制作用の分析。２時間、３７℃で、パーセンテージが増加している血清とＭＢＢ２（１００ｎｇ／１００μＬ）をインキュベートし、ＥＬＩＳＡによって、依然として固定化β２ＧＰＩに結合することができた抗体の残留量を評価した。ＭＢＢ２のプロコアグラント及び堕胎促進作用の分析。生体内顕微鏡によって、さまざまな時間間隔で、ＬＰＳで処理した、または処理していない、及びＭＢＢ２で灌流したまたは対照ＭＢラットで、（Ａ）血栓形成及び（Ｂ）血管閉塞を監視した。ＭＢＢ２または対照ＭＢで処理したマウスの（Ｃ）胎児喪失のパーセンテージ及び（Ｄ）胎児重量。ＭＢＢ２を受けており、ＬＰＳ処理ラットの血栓による血管閉塞、及びＬＰＳなしでＭＢＢ２−処理動物の小細胞凝集物を示している（Ｅ）ラット腸間膜組織の切片。対照ＭＢで処理した動物では血栓及び細胞凝集物ともに検出されなかった。（Ｆ）矢印で示した吸収した胎児を示しているＭＢＢ２−処理妊娠マウスからの子宮の代表的な例、及び生きた子を有している関係のないＭＢ−処理マウスからの子宮の代表的な例。各処理実験記録について３匹のラットで抗体のプロコアグラント作用を評価し、各抗体について少なくとも５匹の妊娠マウスでＭＢＢ２及び対照ＭＢの堕胎促進活性を試験した。平均±ＳＤで結果を表した。対照ＭＢに対して＊Ｐ＜．０５、＊＊Ｐ＜．０１。ＭＢＢ２によるさまざまな種からのβ２ＧＰＩの認識。１０％動物血清で固相結合カルジオリピンをインキュベートし、その後、ＭＢＢ２または対照ＭＢのいずれかに暴露した。ＥＬＩＳＡによって結合抗体を明らかにした。ＭＢＢ２による補体活性化最初に９０分間、ＲＴで、ＡＰＳの患者からのＭＢＢ２（１ｇ／ｍｌ）またはＩｇＧａＰＬ＋とγ−照射ポリスチレンプレートプレート上に固定したヒトβ２ＧＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）をインキュベートし、洗浄後、３０分間、３７℃で１：１００新鮮ヒト血清とインキュベートした。Ｃｌｑ及びＣ４に対するヤギ抗体ならびにＣ９新生抗原に対する単クローン性抗体ａＥｌ１を用いて、ＥＬＩＳＡによって、結合Ｃｌｑ、Ｃ４及びＣ９新生抗原を明らかにした。３連で行った実験の結果の実験を平均±ＳＤとして表した。補体−欠乏または補体−欠損動物のＭＢＢ２によって誘発されたプロコアグラント及び堕胎促進作用の分析。ＬＰＳで感作したＣ６＋／＋及びＣ６−／−ＰＶＧのＭＢＢ２で灌流したラットで、さまざまな時間間隔で、生体内顕微鏡によって、血栓形成（Ａ）及び血管閉塞（Ｂ）を監視した。正常及びＣ５−除去のＭＢＢ２で処理したマウスの胎児喪失のパーセンテージ（Ｃ）及び胎児重量（Ｄ）。ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｃ３及びＣ９の付着について正常及び補体−欠乏のＭＢＢ２で処理した動物でラット腸間膜組織（Ｅ）及び胎児着床部位（Ｆ）の免疫蛍光法分析。ＭＢＢ２のプロコアグラント及び堕胎促進作用を評価し、図３に対する説明で報告したように示した。ＭＢＢ２ΔＣＨ２の結合及びｉｎｖｉｖｏ作用さまざまな濃度のＭＢＢ２または関係のないＭＢとγ−照射ポリスチレンプレートプレート上に固定したヒトまたはマウスβ２ＧＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）をインキュベートし、ＥＬＩＳＡによって結合低分子抗体を明らかにした（Ａ）。図５に対する説明で示したように結合ＭＢＢ２ΔＣＨ２及びＭＢＢ２へのＣｌｑ及びＣ４の付着を評価した（Ｂ）。ＬＰＳで感作した正常のＭＢＢ２ΔＣＨ２またはＭＢＢ２のいずれかで灌流したラットで、さまざまな時間間隔で、生体内顕微鏡によって監視した血栓形成（Ｃ）及び血管閉塞（Ｄ）。ＭＢＢ２ΔＣＨ２またはＭＢＢ２のいずれかで処理した妊娠マウスの（Ｅ）胎児喪失のパーセンテージ及び（Ｆ）胎児重量。ＭＢＢ２のプロコアグラント及び堕胎促進作用を評価し、図３に対する説明で報告したように示した。ＭＢＢ２ΔＣＨ２によるａＰＬの病原作用の対照。ＡＰＳ患者３例から精製したＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）及びＭＢＢ２ΔＣＨ２（２ｍｇ／ｍｌ）または対照ＭＢのいずれかを受けたラットで観察した血栓形成（Ａ）及び血管閉塞（Ｂ）。患者のＩｇＧ及びＭＢＢ２ΔＣＨ２を受けている妊娠マウスの胎児喪失のパーセンテージ（Ｃ）。材料および方法に記載したように評価したＭＢＢ２ΔＣＨ２によるβ２ＧＰＩに結合した患者のＩｇＧの移動（Ｄ）。ＭＢＢ２のプロコアグラント及び堕胎促進作用を評価し、図３に対する説明で報告したように示した。

抗−ヒトβ２ＧＰＩ遺伝子組換え抗体の単離及び特性化
ヒトβ２ＧＰＩに対するヒトファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによりさらにヒンジ領域、ヒトＩｇＧｌのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有するように、ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマット（ＭＢＢ２）に遺伝子組換えされた特異的ｓｃＦｖを選択することが可能になる。さらにＥＬＩＳＡによる固定化β２ＧＰＩに結合するＭＢＢ２の分析により、２０ｎｇ／ｍｌの濃度でなお標的抗原を検出することができる抗体の強力な反応性（図１Ａ）及び可溶性β２ＧＰＩとのおだやかな相互作用が明らかになった（図２）。ＭＢＢ２は、固相結合型プロトロンビンと反応しなかった。われわれの目標は動物モデルでｓｃＦｖ−Ｆｃを用いることであったため、抗体はマウスβ２ＧＰＩを認識する能力も試験され、ヒトカウンターパートとの反応と同様にマウス分子と反応することを証明され、共有エピトープの認識を示唆している（図１Ａ）。カルジオリピン−被覆プレートがいくつかの動物からの血清を含有する遮断緩衝液で処理されている従来の抗カルジオリピン抗体アッセイを用いて、他の動物種からのβ２ＧＰＩとＭＢＢ２の反応性も評価した。図４に示した結果は、抗体はラット、マウス、ブタ、ヤギ及びウシ胎児を含むいくつかの種からのカルジオリピン−結合β２ＧＰＩとさまざまな度数で反応することを示している。その後、β２ＧＰＩタンパク質の遺伝子組換え単一ドメインを用いて、ＭＢＢ２の標的エピトープを同定し、５つのドメインのうち４つを試験して、抗体がドメインに結合することがわかった（図１Ｂ）。続いて、Ｉｏａｎｎｏｕらが記載したように固相結合型遺伝子組換えＤＩを用いてＭＢＢ２がに結合することを確認した（非特許文献１６）。

ＭＢＢ２が細胞結合β２ＧＰＩと相互作用するかどうかを明らかにするために、最初にＨＵＶＥＣ及びＢｅＷｏを精製β２ＧＰＩに暴露し、表面をタンパク質と結合させ、その後、ｓｃＦｖ−Ｆｃとインキュベートした。図１Ｃ及びＤに示したように、ＭＢＢ２は、非関連抗体と異なり、β２ＧＰＩを加えた２つの細胞型に結合することができた。高濃度の対照抗体でＢｅＷｏに観察されたかすかなシグナルは、これらの細胞上のＩｇＧレセプターの発現と矛盾しない（非特許文献１７）。

血栓形成及び胎児喪失に対するＭＢＢ２のｉｎｖｉｖｏ作用
ＭＢＢ２がβ２ＧＰＩのＤＩと相互作用することがわかり、われわれはＡＰＳ患者のこの特異性がある抗体の臨床的意義の点から、動物モデルで血餅及び胎児喪失を引き起こす抗体の能力を調査することとした。この目的のために、抗体をＬＰＳで感作したラットに注入し、生体内顕微鏡法により腸間膜微小血管でそのプロコアグラント作用を監視した。図３Ａに示したように、抗体注入１０分後に既に目に見えた血小板−白血球微小凝集塊を特徴とする、初期段階での二相のパターンに続いて、ＭＢＢ２が血餅形成を誘発した。この凝集物によって引き起こされた一過性血管閉塞に続いて、血栓サイズの進行的増加を特徴とする第２段階が起こり、その結果、血管の永久閉塞となった（図３Ａ及びＢ）。非感作ラットに注入したＭＢＢ２が、小さな白血球−血小板抱合体を生じさせ、６０分後に消失し、一方、対照抗体は完全に無効であった（図３Ａ及びＢ）。

第２セットの実験では、われわれはマウスの妊娠結果に対するＭＢＢ２の作用を調査した。抗体１０μｇの単一注入で、平均値６０％の有意な割合の胎児吸収を誘発するのに十分であり、ほぼ同じ量の対照ｓｃＦｖ−Ｆｃで処理した動物にみられた値１０％より有意に高かった。さらに、抗−β２ＧＰＩ抗体は、胎児成長に影響を及ぼし、胎児重量を実質的に減少させた（図３Ｃ〜Ｄ）。

補体がＭＢＢ２のｉｎｖｉｖｏ作用に必要である。
補体のＭＢＢ２の病原作用への関与を調査するために、われわれは、最初に、補体のソースとしてＮＨＳの存在下で、補体を活性化する固定化β２ＧＰＩに結合したｓｃＦｖ−Ｆｃの能力を分析した。ＭＢＢ２がＣｌｑ及びＣ４の結合によって示唆されたように古典的経路を誘発すること、及びＣ９の付着によって示された末端複合体の集合を促進することがわかった（図５）。ＬＰＳで感作したＣ６欠乏ラットで、ＭＢＢ２によって誘発された血栓の発現での補体活性化の作用発現期の役割を評価した。このラットに抗体はごく僅かなプロコアグラント作用があり、腸間膜血管の分析によりＣ９が存在しないとＩｇＧ及びＣ３の付着物を示した（図６Ａ、Ｅ）。抗−β２ＧＰＩｓｃＦｖ−Ｆｃの投与前にＣ５中和抗体を与えた妊娠マウスで、ＭＢＢ２−誘発胎児喪失への補体の関与を分析した。この治療の結果、胎児喪失の有意な減少及び胎児重量の有意な増加に関係する着床部位でのＣ９付着を抑制した（図６Ｃ〜Ｄ）。

ｉｎｖｉｖｏ作用を誘発するための非補体固定抗β２ＧＰＩ抗体の失敗
ＩｇＧｌのＣＨ２ドメインは、Ｃｌｑの結合部位を含有するため、われわれは、さらに親抗体の病原作用を媒介するときの補体の役割を確認するために、このドメイン（ＭＢＢ２ΔＣＨ２）を欠く変性型のｓｃＦｖ−ＦｃＭＢＢ２を生成した。図７Ａに示したＥＬＩＳＡの結果は、ＭＢＢ２ΔＣＨ２がＭＢＢ２と同様にβ２ＧＰＩと相互反応するが、結合すると、補体を活性化することができないことを示している（図７Ｂ）。ＬＰＳで前処理した正常ラットに注入した変性分子には、Ｃ６欠乏ラットにみられたものに類似している血栓作用のパターンで、ごく僅かなプロコアグラント活性があった。これは血栓事象への補体活性化の重要な関与を強調している（図７Ｃ）。さらに、ＭＢＢ２ΔＣＨ２は、胎児重量及び胎児喪失の点で妊娠結果に影響を及ぼさなかったが、その代わりＭＢＢ２によって重度に抑制された（図７Ｅ）。

ＭＢＢ２ΔＣＨ２が患者のＩｇによって誘発されたｉｎｖｉｖｏ作用を阻止する。
ＣＨ２−欠損抗体が固定化β２ＧＰＩとの強力な相互作用にもかかわらず補体を活性化するできないという発見により、われわれはＭＢＢ２ΔＣＨ２がＡＰＳ患者からの抗β２ＧＰＩ抗体と競合し、そのため、病原作用を阻止する可能性を考えるに至った。この目的のため、ＬＰＳで感作したラットでの患者のＩｇＧのプロコアグラント活性をＭＢＢ２ΔＣＨ２及び抗−β２ＧＰＩの混合物のそれと比較した。図８Ａ〜Ｂに示したように、ＣＨ２−欠損抗体は対照ＩｇＧで事前に得たレベルまで血栓形成及び血管閉塞を減少させることができた（非特許文献９）。ＩｇＧａＰＬ＋だけを受けているラット及びＩｇＧａＰＬ＋及びＭＢＢ２ΔＣＨ２の両者を受けているラットの間での血栓形成及び血管閉塞の差は、注入から４５分後に統計的有意に達した。妊娠マウスに投与した同一分子は、ＡＰＳ患者からの抗−β２ＧＰＩＩｇＧによって誘発される胎児死亡を有意に減少させることがわかった（図８Ｃ）。本調査で、この臨床的指標は評価した患者からのＩｇＧの注入による影響を受けなかったため、われわれは胎児重量に対する抗体の有益な作用を評価することができなかった。

β２ＧＰＩが栄養膜細胞及び脱落膜内皮細胞の表面で検出される場合、ａＰＬ−媒介胎児喪失を阻止するために治療薬としてＭＢＢ２ΔＣＨ２を使用するにはａＰＬが胚着床時に血液中で循環するという臨床的観察を考慮に入れなければならない（非特許文献８）。このことは、ＭＢＢ２ΔＣＨ２は、ＡＰＳの患者に有益な作用を及ぼすために、β２ＧＰＩに既に結合した抗体を移動しなければならないことが示唆される。この問題に対処するため、最初に３０分間患者のＩｇＧと固定化β２ＧＰＩをインキュベートし、続いてＭＢＢ２ΔＣＨ２に暴露した。ＣＨ２欠損抗体を明らかにすることができなかったが、患者の抗体を認識したＩｇＧのＣＨ２ドメインに向けた二次抗体を用いてβ２ＧＰＩに結合したままの残留ａＰＬを測定した。図８Ｃに示した結果は、変異抗体は約４０〜５０％の患者のＩｇＧを除去することができたことを示している。結合抗体を完全に移動することができなかったことは、ＡＰＳ患者で循環している多クローン抗体はβ２ＧＰＩの他のエピトープに向かっている可能性が高いという事実によって説明することができる。

材料および方法
ヒト及びマウスβ２ＧＰＩの精製及び特性化
過塩素酸処理により血液提供者から得た貯留ヒト血清及びマウス血清からβ２ＧＰＩを精製し、続いてヘパリンカラム（ＨｉＴｒａｐＨｅｐａｒｉｎＨＰ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）上で親和性精製及びイオン交換クロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−Ｓ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行った。放射免疫拡散法を用いてβ２ＧＰＩを同定し、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色により純度を分析し、及びＥＬＩＳＡによりａＰＬ補因子活性を試験した（非特許文献２９）。

ｂ２−ＧＰＩの個々のドメインＩ、ＩＩ、ＩＶ及びＶの構築のためにｐＢａｃＰＡＫ９（非特許文献３９）にクローンしたヒトｂ２ＧＰＩ（非特許文献３８）の完全長ｃＤＮＡクローンを用いた（非特許文献４０）。Ｊｕｎｉｐｅｒと呼ばれるコンピュータープログラムを使用して得た合成ＤＩ遺伝子を用いて、遺伝子組換えドメインＩ（ＤＩ）も生成した。遺伝子を発現プラスミドｐＥＴ（２６ｂ）にクローンし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現させた（非特許文献４１）。

遺伝子組換え抗体。
健康な提供者から得た末梢血リンパ球から、選択のために用いられるファージディスプレイＡｂライブラリーを誘導した。これは以前に記載されている（非特許文献３０）。以前に報告されたように、一晩のインキュベーションによって４℃で、β２ＧＰＩで被覆した９６ウェルプレートで選択を実施した（実験の詳細について以下を参照）（非特許文献３０）。パンニング法を２回反復した。選択９６ランダムクローンを選択した後、９６ウェルプレートで単一コロニーからのファージを成長させた。ファージＥＬＩＳＡによって陽性クローン（Ｂ２）を同定し、Ｖ遺伝子をシークエンシングし、ｔｈｅ−ＩＭＧＴ（登録商標）のＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴツール、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒを用いたスクリーニングによってＶＨ及びＶＬファミリー、ならびに用いた遺伝子セグメントを評価した。

遺伝子組換え抗体のクローニング及び精製
ヒトＩｇＧｌヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含有するｐＭＢ−ＳＶ５（非特許文献３１）ベクターにサブクローニングすることによって、陽性ｓｃＦｖＢ２をヒトｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマット（ＭＢＢ２）に変換した。ほぼ同じ手順に従って、ＴＳＡ１２／２２（Ａｄｉｅｎｎｅ、Ｐｈａｒｍａ＆Ｂｉｏｔｅｃｈ）（非特許文献３２）抗Ｃ５抗体（ＭＢＣ５）及び対照ＭＢとして用いた抗−ヒトＣＤ２０を含有するマウスｓｃＦｖ−Ｆｃを生成した。（非特許文献３３）に従ってＣＨ２−欠損型のｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＡＣＨ２）を生成した。この目的のために、プライマーＨｕ＿ＣＨ３＿センス５’ＡＣＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧ３’及びＨｕ＿ＣＨ３抗ＴＧＣＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＴＴＴＧＧでヒトＩｇＧｌＣＨ３−ＳＶ５領域を増幅した。Ｎｈｅｌ及びＨｉｎｄｌｌｌでＰＣＲフラグメントを切断し、ｐＭＢΔＣＨ２ベクターを生成する同一酵素で切断したＰＭＢ−ＳＶ５ベクターを含有するＢ２にクローンした。

最後に、発現のため全遺伝子組換え抗体（ＭＢＢ２、ＭＢＢ２ΔＣＨ２、ＭＢＣ５及び対照ＭＢ）をｐＵＣＯＥベクター（非特許文献３４）にサブクローンした。ＨｙｇｒｏｍｉｃＢ（５００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による選択によって安定したトランスフェクトＣＨＯ−細胞系統を得た。製造業者の指示書に従って、使い捨てのＣＥＬＬｉｎｅＳｙｓｔｅｍバイオリアクター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中でＬ−グルタミン、抗生物質及びＨｙｇｒｏｍｉｃｉｎＢを補った、血清なしのＣＨＯ−ＳＦＭ−ＩＩ培地で安定的に選択された細胞クローンを培養することによって、両ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合の大規模生成を実施した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ低圧クロマトグラフィー系（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ）上で、ＨｉＴｒａｐタンパク質Ｇカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）親和性カラムクロマトグラフィーを用いることによって、少なくとも４０ｍｌの細胞培養上澄み液からｓｃＦｖ−Ｆｃを精製した。溶離後、ＢｕｐＨＴＭリン酸緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で精製ｓｃＦｖ−Ｆｃの調製物を透析により分離し、一部を採取し、−８０°Ｃで保管した。
血清
動脈または静脈血栓症または両者の病歴がある患者から血清を得た。これは培地−高力価の抗−β２ＧＰＩ抗体を含有した。補体のソースとして血液提供者１０名からの貯留新鮮血清を用いた。マウス、ラット、ヤギ、ブタ及びウシ胎児を含むさまざまな動物種からも血清試料を採取した。ＨｉＴｒａｐＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）で患者の血清からＩｇＧを精製した。

抗体結合アッセイ
重炭酸緩衝液中で、一晩、精製ヒトまたはマウスβ２ＧＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）で被覆したγ−照射ポリスチレンプレート（Ｍａｘｉ−ＳｏｒｐＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ；ＶＷＲＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いたＥＬＩＳＡによって、β２ＧＰＩと抗体の相互作用を測定した。１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で遮断後、抗体の段階希釈液をプレートに加え、９０分間、室温（ＲＴ）でインキュベートした。１：４，０００に希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）−共役抗−ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって結合抗体を明らかし、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて反応を発現させ、４０５ｎｍと読み取った。

ほぼ同じアプローチに従い、Ｄｒ．Ｐ．Ｇ．ＤｅＧｒｏｏｔ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ）によって快く提供された遺伝子組換えドメインを用いて、抗−β２ＧＰＩｓｃＦｖ−Ｆｃのドメイン特異性を調査した。

固相結合カルジオリピンをさまざまな動物からの１０％血清に暴露し、続いてＭＢＢ２または対照ＭＢ（１ｇ／ｍｌ）とともにインキュベートしたという変更だけをして、Ｔｉｎｃａｎｉら（非特許文献３５）によって記載されたとおり抗カルジオリピン抗体を検出した。前記記載のとおり、結合抗体を検出した。

半定量的ＱＵＡＮＴＡＬｉｔｅ（登録商標）ａＰＳ／ＰＴＩｇＧ及び抗ホスファチジルセリン／プロトロンビン複合体抗体を検出するＩｇＭ（ＩＮＯＶＡＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて抗−プロトロンビン抗体を明らかにした。

ＭＢＢ２ΔＣＨ２によるβ２ＧＰＩに結合した患者の抗体の移動

最初に、３０分間、ＲＴで、γ−照射ポリスチレンプレートプレート上に固定したヒトβ２ＧＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）を患者の血清（１：２００）に暴露し、続いて３０分間、ＲＴで、ＭＢＢ２ΔＣＨ２（２μｇ／１００μｌ）とともにインキュベートした。患者の抗体に存在するが、ＭＢＢ２ΔＣＨ２に存在しないＣＨ２ドメインを認識するマウス単クローン性ＩｇＧ（クローンＭＫ１Ａ６ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃＲａｌｅｉｇｈＵＳＡ；１：１，０００）を用いたＥＬＩＳＡによってβ２ＧＰＩに結合した残留患者抗体の量を測定し、６０分間、ＲＴで１：１０，０００のＡＰ−共役ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートすることによって検出した。

細胞−表面β２ＧＰＩにＭＢＢ２の結合
細胞標的としてＨＵＶＥＣ及びβ２ＧＰＩで被覆した栄養膜細胞細胞系統ＢｅＷｏを用いて、細胞結合分子と抗体の反応性を試験した。以前に公表されたとおり（非特許文献３６）、ＨＵＶＥＣを単離し、培養した。１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補ったＲＰＭＩ培地１６４０（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７℃及び９５％空気／５％ＣＯ２で、ＢｅＷｏ細胞（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ、ＥＣＡＣＣ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＵＫ）を成長させた。

９６−ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）で融合まで成長させた細胞について、ＭＢＢ２の結合を評価し、９０分間、３７℃及び９５％空気／５％ＣＯ２で、精製ヒトβ２ＧＰＩ（５μｇ／ｍｌ）または２０％ＦＣＳに暴露した。その後、１時間、ＲＴで濃度が増加している１００μｌの抗体と細胞をインキュベートし、続いてＨＵＶＥＣ及びＢｅＷｏそれぞれ用の（１：４，０００）ＡＰ−または（１：４，０００）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートした。基質としてＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＰＮＰＰまたは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）または両者を用いて、酵素的反応を発現させ、ＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉｓｋａｎＥＬＩＳＡリーダー（ＦｌｏｗＬａｂｓ、Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）で４０５または４５０ｎｍと読み取った。

補体活性化の評価
γ−照射ポリスチレンプレートプレートをヒトβ２ＧＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）で被覆して、補体活性化の古典的経路を誘発するための結合ｓｃＦｖ−Ｆｃの能力を試験し、続いて９０分間、ＲＴでＭＢＢ２（１０μｇ／ｍＬ）とインキュベートした。その後、３０分間、３７℃で、１００μｌの１：１００ＡＢ＋新鮮血清にβ２ＧＰＩ−結合抗体を暴露した。Ｑｕｉｄｅｌ（Ｍ−Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）から購入した１：８，０００のヤギ抗−ヒトＣｌｑまたはＣ４を用いて、Ｃｌｑ及びＣ４の付着を検出した。Ｐｒｏｆ．Ｔ．Ｅ．Ｍｏｌｌｎｅｓ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）によって快く提供されたマウス単クローン性抗体ａＥｌ１からＣ９の新生抗原（１：１，０００）を用いて、Ｃ９の結合を明らかにした。二次抗体として、ともにＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈからのＡＰ−共役抗−ヤギＩｇＧ（１：４，０００）または抗−マウスＩｇＧ（１：１０，０００）を使用した。基質としてＰＮＰＰを用いて酵素的反応を発現させ、４０５ｎｍと読み取った。

動物
ｉｎｖｉｖｏ実験には、オスラット（２７０〜３００ｇ）を用いた。ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｎｉｍａｌＨｏｕｓｅで飼われた局所コロニーからウイスターラットを得た。ＨａｒｌａｎＩｔａｌｙ（ＳａｎＰｉｅｔｒｏａｌＮａｔｉｓｏｎｅ、Ｉｔａｌｙ）からＣ６＋／＋ＰＶＧラットを購入し、以前に報告され（非特許文献３７）、われわれのＡｎｉｍａｌＨｏｕｓｅに作られたラットコロニーからＣ６７−／−ＰＶＧラットを購入した。ＨａｒｌａｎＩｔａｌｙ（ＳａｎＰｉｅｔｒｏａｌＮａｔｉｓｏｎｅ、Ｉｔａｌｙ）からＢＡＬＢ／ｃマウスを購入した。

ヨーロッパ（８６／６０９／ＥＥＣ）及びイタリア（Ｄ．Ｌ．Ｉ１６／９２）の法律のガイドラインに従って全実験手順を実施し、ＩｔａｌｉａｎＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈならびにＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｎｉｍａｌＨｏｕｓｅによって承認された。

血栓症のラットモデル
以前に詳細が記載されたとおり、ラットで抗体−誘発血栓形成を評価した（非特許文献９）。簡潔にすると，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ０５５：Ｂ５からＬＰＳの腹腔内注入を受けた動物（２．５ｍｇ／ｋｇ体重；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または、対照としての３時間後に滅菌生理食塩水の腹腔内注入を受けた動物に、チオバルビタールナトリウム（Ｉｎａｃｔｉｎ；８０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた。頸動脈にｓｃＦｖ−Ｆｃ（１ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）または精製ＩｇＧＡＰＳ患者（１０ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）から注入する３０分前に、０．０２５ｍｇ／ｋｇ／分の濃度及び０．２５ｍｌ／時の速度で、３０分、ゆっくりと大腿静脈に白血球及び血小板を染色する蛍光生体色素Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ６Ｇ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注入した。ＣＨ２−欠損ｓｃＦｖ−Ｆｃ（２ｍｇ／ｍｌ生理食塩水／３０分）を注入し、続いて、患者ＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を３０分注入して、ａＰＬ−誘発血栓形成を阻止するＭＢＢ２ΔＣＨ２の能力を調査した。

部分的または完全に血管を閉塞する白血球及び血小板の蛍光凝集物の形成について、小動脈、毛細管及び毛細血管後静脈を含有する少なくとも３つの微小血管領域を分析した。検査した血栓の数及び微小血管の総数の割合で結果を表し、閉塞した微小血管のパーセンテージでも結果を表した。

妊娠結果の分析
成体繁殖用オス３：１の割合でメスＢＡＬＢ／ｃマウス（年齢が６〜８週）を収容し、自然に交配させた。妊娠第０日は、膣栓がみられる日と定義する。第０日に、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（１０μｇ／１００μｌ生理食塩水／マウス）または患者のＩｇＧ（５０μｇ／１００μｌ生理食塩水／マウス）のいずれかの尾静脈注入を受けたマウスで堕胎促進作用の抗体を評価し、第１５日に殺処分した。１週間に３回、中和ＭＢＣ５（１００μｇ／４００μｌ生理食塩水／マウス）の腹腔内注入によりマウスで補体を除去した。正常な胚と比べて、そのサイズの小ささ及び壊死または出血の出現によって、吸収した胎児を特定した。胎児喪失のパーセンテージとして結果を示した。それぞれの胎盤とともに子宮及び個々の胎児の重量も記録した。ＭＢＢ２ΔＣＨ２によるａＰＬ−誘発胎児喪失の対照を評価するための実験では、妊娠の第０日に、静脈に患者のＩｇＧ（５０μｇ／１００μｌ生理食塩水／マウス）の注入を受けたメスマウス、及び第０、５、１０日に、ＭＢＢ２ΔＣＨ２（５０μｇ／２００μｌ生理食塩水／マウス）の腹腔内注入を受けたメスマウス吸収した胎児を特定し、数えた。胎児喪失のパーセンテージ及び子宮及び個々の胎児の重量として結果を示している。

免疫蛍光法分析
以前に記載されたとおり、滅菌生理食塩水の頸動脈内注入後のｉｎｖｉｖｏ実験の終了時に殺処分したラットから腸間膜組織を採取し、血液を除去した（非特許文献９）。切開した組織を小片に切断し、ポリリジン処理ガラススライド（ＢＤＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｕｐｐｌｉｅｓ、Ｐｏｏｌｅ、ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ）上で延伸した。

ＯＣＴ培地（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＤｉｖｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．）に埋め込んだマウス胎盤の急速凍結した試料の切片（７μｍ）を用いた。１：４００ヤギ抗−マウスＣ３（ＭＰＣａｐｐｅｌ、Ｓｏｌｏｎ、ＵＳＡ）、及び１：２００ウサギ抗−マウスＣ９（Ｌｅｉｄｅｎ、ＮＬ、Ｐｒｏｆ．Ｍ．ＤＤａｈａからの快く提供）続いてＦＩＴＣ−共役二次抗体（Ｄａｋｏ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を用いて、間接免疫蛍光法によってマウスＣ３及びＣ９の組織付着を分析した。蛍光ＬｅｉｃａＤＭ２０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）のもとでスライドを検査した。

統計的分析
Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５．０を用いて統計的分析を実施した。マン−ホイトニーの検定で、胎児吸収及び血管閉塞のデータ及びＥＬＩＳＡ結果を分析した。ステューデントｔ検定を用いて胎児重量を分析した。データを平均±標準偏差で表し、０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。

Claims

β２ＧΡＩに結合することができるヒト遺伝子組換え抗体であって、補体を活性化することができず、ＶＨ及びＶＬ鎖を含有し、それぞれが配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２である配列を有する前記抗体。
β２ＧΡΙのＤＩドメインに結合する請求項１に記載の抗体。
ＩｇＧである請求項１または２に記載の抗体。
ＣＨ２ドメインが除去され、抗体が補体を活性化することができなくなっている、請求項１から３のうちいずれか一項に記載の抗体。
ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ−Ｆｃから選択される、請求項１から４のうちいずれか一項に記載の抗体のフラグメント。
ポリヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：７によってコードされている、請求項５に記載のｓｃＦｖフラグメント。
ＣＨ２ドメインが除去されている、請求項５に記載のｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント。
ｉｎｖｉｔｒｏ競合結合アッセイで抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）に罹患した患者からのβ２ＧＰＩに結合した自己抗体を移動することができる、請求項１から４のうちいずれか一項に記載の抗体または請求項５から７のうちいずれか一項に記載の抗体フラグメント。
有効成分として、請求項１から４のうちいずれか一項に記載の抗体または請求項５から７のうちいずれか一項に記載の抗体フラグメント、及び薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）に罹患した患者の血栓形成、血管閉塞または胎児喪失の治療または予防に用いられる、請求項１から４のうちいずれか一項に記載の抗体または請求項５から７のうちいずれか一項に記載の抗体フラグメントまたは請求項９に記載の医薬組成物。