JP6410791B2 - Mir−145のロックト核酸阻害剤およびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年3月15日に出願された米国仮出願第61/800,755号の利益を請求し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる:配列表のコンピュータ可読形式のコピー(ファイル名:MIRG 41 01WO SeqList ST25.txt、保存日:2014年3月13日、ファイルサイズ5キロバイト)。
したがって、血管リモデリングにおける役割を伴うmiR−145は、新生内膜形成、再狭窄、高血圧症、全身性高血圧症およびPAHなどにおける、異常な平滑筋細胞の増殖と関連する状態に有効な処置を開発するための治療標的を表す。しかし、miR−145をターゲティングするアンチセンスベースの治療剤の送達は、複数の難題を提起しうる。miR−145に対する結合アフィニティーおよび結合特異性、細胞内の取込みの効率、ならびにヌクレアーゼ耐性は全て、オリゴヌクレオチドベースの治療剤の送達および活性における因子である。例えば、オリゴヌクレオチドは、無傷細胞へと導入されると、ヌクレアーゼにより攻撃および分解され、活性の喪失がもたらされることが典型的である。したがって、有用なアンチセンス治療剤は、細胞外および細胞内のヌクレアーゼに対する耐性が大きいほか、細胞膜を透過することも可能であるべきである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
miR−145のシード領域と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記シード領域が、5’−UCCAGUUU−3’(配列番号7)であり、前記配列が、少なくとも3つのロックト核酸(LNA)を含み、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの非ロックトヌクレオチドを含み、同じ配列およびLNA組成ならびに異なるLNAモチーフを含む第2のオリゴヌクレオチドと比較して、in vivoにおける有効性を増大させるオリゴヌクレオチド。
(項目2)
前記第2のオリゴヌクレオチドと比較して、肺における有効性を増大させる、項目1に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目3)
5’末端にLNAを含む、項目1に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目4)
3’末端にLNAを含む、項目1から3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目5)
3つ以下の連続LNAを含む、項目1から4のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目6)
前記配列が、少なくとも4つのロックト核酸(LNA)を含む、項目1から5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目7)
前記配列が、少なくとも5つのロックト核酸(LNA)を含む、項目1から6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目8)
前記配列が、少なくとも6つのロックト核酸(LNA)を含む、項目1から7のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目9)
前記オリゴヌクレオチドが、16マーを含み、前記16マーが、16ヌクレオチドからなり、前記16マーが、miR−145のシード領域と相補的な前記配列を含む、項目1から8のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目10)
前記16マーが、少なくとも9つのLNAを含む、項目9に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目11)
前記16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、5、6、9、10、11、13、15、および16位が、LNAである、項目10に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目12)
前記16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、2、6、8、10、11、13、15、および16位が、LNAである、項目10に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目13)
前記16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、5、6、8、10、11、13、14、および16位が、LNAである、項目10に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目14)
前記16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、3、4、5、6、8、10、13、および16位が、LNAである、項目10に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目15)
前記16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、3、4、7、8、10、12、14、および16位が、LNAである、項目10に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目16)
前記16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、2、6、7、10、11、12、14、および16位が、LNAである、項目10に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目17)
前記16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、3、5、7、9、11、13、15、および16位が、LNAである、項目10に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目18)
前記16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、4、5、7、9、10、12、14、および16位が、LNAである、項目10に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目19)
前記16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、5、6、8、10、11、13、15、および16位が、LNAである、項目10に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目20)
前記非ロックトヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、2’デオキシである、項目1から19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目21)
前記非ロックトヌクレオチドの全てが、2’デオキシである、項目20に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目22)
少なくとも1つの非ロックトヌクレオチドが、2’O−アルキルまたは2’ハロである、項目1から19のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目23)
少なくとも1つのLNAが、2’から4’のメチレン架橋を有する、項目1から22のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目24)
5’キャップ構造、3’キャップ構造、または5’キャップ構造および3’キャップ構造を有する、項目1から23のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目25)
1または複数のホスホロチオエート結合を含む、項目1から24のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目26)
完全にホスホロチオエート結合された、項目25に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目27)
1〜3カ所のリン酸結合を有する、項目1から25のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目28)
親油性のペンダント基をさらに含む、項目1から27のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目29)
約15〜50ヌクレオチドの長さである、項目1から28のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目30)
miRNA阻害剤である、項目1から29のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目31)
前記16マーが、miR−145のヌクレオチド配列と実質的に相補的である、項目9から30のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目32)
前記16マーが、miR−145と完全に相補的である、項目31に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目33)
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの非ロックトヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、細胞内のmiR−145標的遺伝子の発現を、生理食塩水対照と比べて増大させ、発現の前記増大のp値が、0.05より小さい、項目1から32のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目34)
前記オリゴヌクレオチドで処置された細胞は、miR−145標的遺伝子の発現が、生理食塩水対照と比べて1.0倍超の倍数変化をし、前記倍数変化のp値が、0.05より小さい、項目1から33のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目35)
発現の前記倍数変化が、少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、または1.5倍である、項目33から34のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目36)
前記miR−145標的遺伝子が、Klf4、Klf5、Lrrc71、Nedd4l、Igf1r、Sec1412、Megf6、Fmod、Ankrd12、Golga1、Gpbp1、Hist3h2a、Rapgef2、またはSned1である、項目33から35のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
(項目37)
有効量の、項目1から36のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
(項目38)
前記薬学的に許容される担体が、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、マイクロスフェア、ビーズ、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含む、項目37に記載の医薬組成物。
(項目39)
前記薬学的に許容される担体または希釈剤が、生理食塩水から本質的になる、項目37に記載の医薬組成物。
(項目40)
細胞内のmiR−145の活性を低減または阻害する方法であって、前記細胞を、項目1から36のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
(項目41)
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記細胞が、平滑筋細胞である、項目40または41に記載の方法。
(項目43)
前記細胞が、肺細胞または心臓細胞である、項目40から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記細胞が、in vivoまたはex vivoにおける細胞である、項目40から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
平滑筋細胞の増殖を阻害する方法であって、平滑筋細胞を、項目1から36のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
(項目46)
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記細胞が、肺細胞または心臓細胞である、項目45または46に記載の方法。
(項目48)
前記細胞が、in vivoまたはex vivoにおける細胞である、項目45から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
対象における肺動脈高血圧症(PAH)を防止または処置する方法であって、前記対象へと、項目1から36のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法。
(項目50)
前記肺高血圧症が、特発性肺動脈高血圧症(PAH)、遺伝性PAHもしくは家族性PAH、または続発性肺高血圧症である、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記続発性肺高血圧症が、肺塞栓、気腫、肺線維症、または先天性心疾患に由来する、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記対象が、哺乳動物である、項目49から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記ヒトが、骨形成タンパク質2型受容体をコードする遺伝子内に突然変異を有する、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記医薬組成物を、非経口投与または肺組織への直接注射により投与する、項目49から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記医薬組成物を、前記対象へと、吸入投与経路により投与する、項目49から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記医薬組成物を、乾燥粉末として製剤化する、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記医薬組成物を、液体エアゾールとして製剤化する、項目56に記載の方法。
(項目59)
対象における再狭窄または新生内膜形成を阻害または処置する方法であって、前記対象へと、項目1から36のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法。
(項目60)
前記対象が、哺乳動物である、項目59に記載の方法。
(項目61)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記医薬組成物を、非経口投与または心臓組織への直接注射により投与する、項目59から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与である、項目55または62に記載の方法。
(項目64)
前記医薬組成物を、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐剤投与、カテーテル投与、または舌下投与により投与する、項目49から54または59から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記オリゴヌクレオチドを、25mg/kgまたはそれ未満の用量で送達する、項目49から64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
前記オリゴヌクレオチドを、生理食塩水中で製剤化し、皮下投与する、項目63に記載の方法。
(項目67)
対象における高血圧症を処置または防止する方法であって、前記対象へと、項目1から36のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む方法。
(項目68)
前記対象が、哺乳動物である、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記哺乳動物が、ヒトである、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記医薬組成物を、非経口投与により投与する、項目67から69のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
前記非経口投与が、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与である、項目70に記載の方法。
(項目72)
前記医薬組成物を、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐剤投与、カテーテル投与、または舌下投与により投与する、項目67から71のいずれか一項に記載の方法。
(項目73)
前記オリゴヌクレオチドを、25mg/kgまたはそれ未満の用量で送達する、項目67から72のいずれか一項に記載の方法。
(項目74)
前記オリゴヌクレオチドを、生理食塩水中で製剤化し、皮下投与する、項目67に記載の方法。
(項目75)
肺動脈高血圧症の処置または防止のためのキットであって、項目1から36のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、投与デバイスとを含むキット。
(項目76)
前記オリゴヌクレオチドが、前記投与デバイス内に含有された粉末として製剤化された、項目75に記載のキット。
(項目77)
前記オリゴヌクレオチドが、前記投与デバイス内に含有された液体エアゾールとして製剤化された、項目75に記載のキット。
(項目78)
前記投与デバイスが、吸入器である、項目75から77のいずれか一項に記載のキット。
により規定される。
antimiR−145化合物のin vivoにおける有効性
肺内のmiR−145をターゲティングする化合物を最適化するために、肺内のmiR−145の直接的mRNA標的の抑制解除を、in vivoにおける機能性についてのリードアウトとして使用して、in vivoスクリーンを実施した。
antimiR−145化合物のmiR−145特異性
49〜52日齢のSprague−Dawleyラットに、25mg/kgの用量で、生理食塩水またはM−11318を皮下注射した。M−11318で処置されたラットの肺に由来する全RNAおよび生理食塩水で処置されたラットの肺に由来する全RNAを、マイクロアレイプロファイリングによる全ゲノムプロファイリングにかけた。M−11318で処置されたラットの肺に由来する全RNAを、生理食塩水で処置されたラットの肺に由来する全RNAと比較すると、miR−145シード含有遺伝子は、上方調節された遺伝子署名が強化される(示差的発現についてのp値<0.01)。強化についてのp値は、超幾何分布関数を使用して計算した(図3)。これらの結果は、M−11318が、miR−145に特異的な、遺伝子標的の抑制解除を誘発することを指し示す。
antimiR−145化合物であるM−11318による、用量依存的な標的抑制解除
49〜52日齢のSprague−Dawleyラットに、25mg/kgの用量の生理食塩水;25mg/kgの用量のM−10591;25mg/kgの用量のM−10934;または5mg/kg、10mg/kg、もしくは25mg/kgの用量のM−11318を皮下注射した。肺組織は、注射の72時間後に回収した。Klf5のmRNAは、リアルタイムPCRにより、肺内全RNA中で測定した。結果は、図4に、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。リアルタイムPCRの結果は、KLF5標的の抑制解除が、M−11318による処置に対して用量反応性であることを指し示す。
antimiR−145化合物であるM−11318およびM−11319による、用量依存的な標的抑制解除
49〜52日齢のSprague−Dawleyラットに、25mg/kgの用量の生理食塩水;25mg/kgの用量のM−10591;25mg/kgの用量のM−10934;5mg/kg、10mg/kg、もしくは25mg/kgの用量のM−11318;または5mg/kg、10mg/kg、もしくは25mg/kgの用量のM−11319を皮下注射した。肺組織は、注射の48時間後に回収した。Nedd4lのmRNAは、リアルタイムPCRにより、肺内全RNA中で測定した。結果は、図5に、生理食塩水で処置された動物と比べた倍数変化の値として示す。リアルタイムPCRの結果は、Nedd4l標的の抑制解除が、M−11318およびM−11319による処置に対して用量反応性であることを指し示す。
antimiR−145は、全身血圧および動脈硬化指数を低減した
16週齢の本態性高血圧ラット(SHR)を、antimiRの、毎週4回、25mg/kgの皮下投与にかけた。18週間後、L−NG−ニトロアルギニンメチルエステル(L−NAME)を、飲用水(50mg/L)により投与し、2週間にわたり不断に施して、パルス波速度(PWV)の測定における治療域を創出した。ラットが20週齢となる研究の終了時に、終点パルス波速度、ベータ指数、および血圧を測定した(図6A)。ACE阻害剤であるペリンドプリルを、高血圧症の1つの標準治療についての基準として、研究に組み入れた。
Claims (9)
- miR−145のシード領域と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記シード領域が、5’−UCCAGUUU−3’(配列番号7)であり、前記オリゴヌクレオチドが、16ヌクレオチドからなり、前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの非ロックトヌクレオチドを含み、ここで、
a.16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、5、6、9、10、11、13、15および16位がLNAであるか、または
b.16マーの5’末端から3’末端へ、前記16マーの1、2、6、8、10、11、13、15および16位がLNAである、
オリゴヌクレオチド。 - 3つ以下の連続LNAを含む、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記非ロックトヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、2’デオキシ、2’O−アルキルまたは2’ハロである、請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 5’キャップ構造、3’キャップ構造、または5’キャップ構造および3’キャップ構造を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 1または複数のホスホロチオエート結合を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 親油性のペンダント基をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記16マーが、miR−145のヌクレオチド配列と実質的にまたは完全に相補的である配列を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 対象における高血圧症を処置または防止する方法における使用のための請求項1から7のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記方法は、前記対象へと、前記オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与するステップを含む、オリゴヌクレオチド。
- 前記高血圧症が肺高血圧症であり、前記肺高血圧症が、特発性肺動脈高血圧症(PAH)、遺伝性PAHもしくは家族性PAH、または続発性肺高血圧症である、請求項8に記載の使用のためのオリゴヌクレオチド。
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