JP6400981B2 - タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチド及びプライマー対、並びにタラロマイセス属に属する種の検出キット及び検出方法 - Google Patents
タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチド及びプライマー対、並びにタラロマイセス属に属する種の検出キット及び検出方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、耐熱性を有するカビの一種であるタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する種を検出するために用いられるオリゴヌクレオチド及びプライマー対、並びにタラロマイセス属に属する種の検出キット及び検出方法に関する。
カビを含む菌類は、自然界に広く分布しており、食品・清涼飲料水などの製造上問題となるような耐熱性を有する菌株や、発ガン性を有する有害なマイコトキシン等を産生する菌株等を含む。特に、１００℃以下で低温殺菌する果実缶詰やジュース、ジャムなどにおいては、耐熱性菌類の殺滅が困難である。したがって、原料や製造環境などからの耐熱性菌類の混入を防止するとともに、混入の可能性を客観的に評価することにより、これらの菌類の管理や制御を行うことが極めて重要となる。
耐熱性菌類は、一般的には、ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属、タラロマイセス属など、子のう菌類に属するものが挙げられる。このタラロマイセス属に属する種のうち、タラロマイセス マクロスポラス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｃｒｏｓｐｏｒｕｓ）及びタラロマイセス トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）は、実際に果実缶詰やジュース、ジャムなどの酸性食品から検出され得る上、耐熱性が高く、特に問題となる（非特許文献１ Ｔａｂｌｅ１参照）。
そこで、特許文献１、特許文献２及び非特許文献２には、核酸を用いたタラロマイセス属等の耐熱性菌類の検出方法が記載されている。
宇田川 俊一、「食品菌学の課題−耐熱性カビによる危害」、Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ、日本マイコトキシン学会、２０００年、ｖｏｌ．５０ Ｎｏ．１、ｐ．３−ｐ．１１
中山 素一、「ＰＣＲを用いた耐熱性カビの迅速識別同定法」、ソフト・ドリンク技術資料、一般社団法人 全国清涼飲料工業会、２０１２年４月、第１号、ｐ．４３−６０
しかしながら、特許文献１及び特許文献２に記載の検出方法では、タラロマイセス属に属する種であるタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを特異的に検出することが困難であった。このため、特に問題になるとされるこれらの菌に対して有効な対策を採ることが難しかった。
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、タラロマイセス属に属する種を特異的に検出することが可能なオリゴヌクレオチド、プライマー対、検出キット及び検出方法を提供することにある。
本発明者等は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた。その結果、タラロマイセス属に属する種であるタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に、かつ感度よく検出することが可能なオリゴヌクレオチド、プライマー対、検出キット及び検出方法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる下記（Ａ）及び下記（Ｂ）のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる下記（Ｃ）及び下記（Ｄ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（２）タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、
タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域に種特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチド。
（３）（２）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる下記（Ｉ）及び下記（Ｊ）のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる下記（Ｋ）及び下記（Ｌ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド。
（Ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（４）タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、又はタラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｈ）配列番号４に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｍ）配列番号９に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（５）（４）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、又はタラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（ｅ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列
（ｇ）配列番号３に記載の塩基配列
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列
（ｍ）配列番号９に記載の塩基配列
（ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列
（ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列
（ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列
（６）タラロマイセス属に属する種の検出用キットであって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる前記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる前記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる前記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる前記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる前記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる前記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる前記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、及びタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる前記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含む
タラロマイセス属に属する種の検出用キット。
（７）（６）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出用キットであって、
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる前記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び前記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる前記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び前記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる前記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び前記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、並びにタラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる前記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び前記（Ｐ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうちの少なくとも一つのプライマー対を含む
タラロマイセス属に属する種の検出用キット。
（８）（７）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出方法であって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は前記（Ｅ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｆ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は前記（Ｇ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｈ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うことを特徴とする
タラロマイセス属に属する種の検出方法。
（９）タラロマイセス属に属する種の検出方法であって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は前記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、前記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、前記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つを用い、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は前記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、前記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、前記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つを用いることを特徴とする
タラロマイセス属に属する種の検出方法。
（１０）（９）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出方法であって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は前記（Ｅ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｆ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに前記（Ｍ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｎ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含み、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は前記（Ｇ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｈ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに前記（Ｏ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｐ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含むことを特徴とする
タラロマイセス属に属する種の検出方法。
（１１）（１０）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出方法であって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は前記（ｅ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（ｆ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに前記（ｍ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（ｎ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含み、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は前記（ｇ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（ｈ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに前記（ｏ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（ｐ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含むことを特徴とする
タラロマイセス属に属する種の検出方法、
である。
（１）タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる下記（Ａ）及び下記（Ｂ）のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる下記（Ｃ）及び下記（Ｄ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（２）タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、
タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域に種特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチド。
（３）（２）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる下記（Ｉ）及び下記（Ｊ）のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる下記（Ｋ）及び下記（Ｌ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド。
（Ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（４）タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、又はタラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｈ）配列番号４に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｍ）配列番号９に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（５）（４）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、又はタラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（ｅ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列
（ｇ）配列番号３に記載の塩基配列
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列
（ｍ）配列番号９に記載の塩基配列
（ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列
（ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列
（ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列
（６）タラロマイセス属に属する種の検出用キットであって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる前記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる前記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる前記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる前記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる前記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる前記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる前記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、及びタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる前記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含む
タラロマイセス属に属する種の検出用キット。
（７）（６）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出用キットであって、
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる前記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び前記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる前記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び前記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる前記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び前記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、並びにタラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる前記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び前記（Ｐ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうちの少なくとも一つのプライマー対を含む
タラロマイセス属に属する種の検出用キット。
（８）（７）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出方法であって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は前記（Ｅ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｆ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は前記（Ｇ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｈ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うことを特徴とする
タラロマイセス属に属する種の検出方法。
（９）タラロマイセス属に属する種の検出方法であって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は前記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、前記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、前記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つを用い、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は前記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、前記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、前記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つを用いることを特徴とする
タラロマイセス属に属する種の検出方法。
（１０）（９）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出方法であって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は前記（Ｅ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｆ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに前記（Ｍ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｎ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含み、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は前記（Ｇ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｈ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに前記（Ｏ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（Ｐ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含むことを特徴とする
タラロマイセス属に属する種の検出方法。
（１１）（１０）に記載のタラロマイセス属に属する種の検出方法であって、
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は前記（ｅ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（ｆ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに前記（ｍ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（ｎ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含み、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は前記（ｇ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（ｈ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに前記（ｏ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び前記（ｐ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含むことを特徴とする
タラロマイセス属に属する種の検出方法、
である。
本発明により、タラロマイセス属に属する種を特異的に検出することが可能なオリゴヌクレオチド、プライマー対、検出キット及び検出方法を提供することが可能となる。
以下、本発明を詳細に説明する。
＜本発明の特徴＞
本発明は、タラロマイセス属に属する種を特異的に検出するために用いられるオリゴヌクレオチド及びプライマー対、並びにタラロマイセス属に属する種を特異的に検出することが可能な検出キット及び検出方法を提供するものである。従来は、タラロマイセス属に属する種を特異的に検出することが困難であった（特許文献１及び特許文献２参照）。そこで、本発明の発明者らは、カビ・キノコに特異的なハイドロフォビン遺伝子、微生物の一部と植物が保持するイソクエン酸リアーゼ遺伝子（後述する）に着目することで、タラロマイセス属に属する種を特異的に検出する技術を見出した。
本発明は、タラロマイセス属に属する種を特異的に検出するために用いられるオリゴヌクレオチド及びプライマー対、並びにタラロマイセス属に属する種を特異的に検出することが可能な検出キット及び検出方法を提供するものである。従来は、タラロマイセス属に属する種を特異的に検出することが困難であった（特許文献１及び特許文献２参照）。そこで、本発明の発明者らは、カビ・キノコに特異的なハイドロフォビン遺伝子、微生物の一部と植物が保持するイソクエン酸リアーゼ遺伝子（後述する）に着目することで、タラロマイセス属に属する種を特異的に検出する技術を見出した。
＜タラロマイセス属＞
タラロマイセス属は、耐熱性を有するカビの一種であって、子のう菌類に属する。子のう菌類は、子のう胞子という、硬い種子がさらに硬い殻に包まれたような強固な状態で土壌中に広く存在する菌類である。タラロマイセス属のカビの中には、９０℃以上でも耐熱性を有するものがいるため、１００℃以下の低温で殺菌することが一般的な果実缶詰やジャム等の果実加工食品、あるいはジュースや緑茶飲料等の清涼飲料水の製造上、問題となる。
タラロマイセス属は、耐熱性を有するカビの一種であって、子のう菌類に属する。子のう菌類は、子のう胞子という、硬い種子がさらに硬い殻に包まれたような強固な状態で土壌中に広く存在する菌類である。タラロマイセス属のカビの中には、９０℃以上でも耐熱性を有するものがいるため、１００℃以下の低温で殺菌することが一般的な果実缶詰やジャム等の果実加工食品、あるいはジュースや緑茶飲料等の清涼飲料水の製造上、問題となる。
＜タラロマイセス属に属する種＞
タラロマイセス属に属する種は、タラロマイセス属に属するカビであって、具体的には、タラロマイセス マクロスポラス、タラロマイセス トラキスペルムス、タラロマイセス フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ）、タラロマイセス ルテウス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｕｔｅｕｓ）、タラロマイセス ウォルトマンニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）、タラロマイセス バシリスポラス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓ）等が挙げられる。
タラロマイセス属に属する種は、タラロマイセス属に属するカビであって、具体的には、タラロマイセス マクロスポラス、タラロマイセス トラキスペルムス、タラロマイセス フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ）、タラロマイセス ルテウス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｕｔｅｕｓ）、タラロマイセス ウォルトマンニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）、タラロマイセス バシリスポラス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓ）等が挙げられる。
＜タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムス＞
本発明では、タラロマイセス属に属する種のうち、タラロマイセス マクロスポラス、タラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出する技術を提供する。タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスは、他のタラロマイセス属に属する菌と比較しても、果実缶詰やジャム等の果実加工食品、あるいはジュースや緑茶飲料等の清涼飲料水から検出される可能性が高い。これに加えて、他のタラロマイセス属に属する菌と比較しても耐熱性及びＤ値が高く、１００℃以下の低温加熱による滅殺は困難である（非特許文献１ Ｔａｂｌｅ１参照）。このため、上記２つの菌を種特異的に検出することは、食品の安全性を確保する上でもきわめて重要である。
本発明では、タラロマイセス属に属する種のうち、タラロマイセス マクロスポラス、タラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出する技術を提供する。タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスは、他のタラロマイセス属に属する菌と比較しても、果実缶詰やジャム等の果実加工食品、あるいはジュースや緑茶飲料等の清涼飲料水から検出される可能性が高い。これに加えて、他のタラロマイセス属に属する菌と比較しても耐熱性及びＤ値が高く、１００℃以下の低温加熱による滅殺は困難である（非特許文献１ Ｔａｂｌｅ１参照）。このため、上記２つの菌を種特異的に検出することは、食品の安全性を確保する上でもきわめて重要である。
＜ハイドロフォビン遺伝子＞
ハイドロフォビン遺伝子は、本発明に係るオリゴヌクレオチドやプライマー対を用いた検出の標的となる遺伝子のうちの一つである。ハイドロフォビン遺伝子は、カビ・キノコに特異的であると考えられている遺伝子であって、ハイドロフォビンという低分子量タンパク質をコードする。ハイドロフォビンは、空気中に菌糸、子実体等の構造体を形成するカビ・キノコなどの細胞表層に普遍的に存在し、その表層に撥水性を与える機能等を有する。
ハイドロフォビン遺伝子は、本発明に係るオリゴヌクレオチドやプライマー対を用いた検出の標的となる遺伝子のうちの一つである。ハイドロフォビン遺伝子は、カビ・キノコに特異的であると考えられている遺伝子であって、ハイドロフォビンという低分子量タンパク質をコードする。ハイドロフォビンは、空気中に菌糸、子実体等の構造体を形成するカビ・キノコなどの細胞表層に普遍的に存在し、その表層に撥水性を与える機能等を有する。
＜イソクエン酸リアーゼ＞
イソクエン酸リアーゼは、グリオキシル酸回路の反応を触媒する酵素の一つであり、グリオキシル酸回路に特有の酵素である。グリオキシル酸回路は、微生物の一部や植物に見られる代謝回路であり、イソクエン酸からリンゴ酸とコハク酸を生成し、さらにオキサロ酢酸を生成することができる。（"Life and death in a macrophage: role of the glyoxylate cycle in virulence" Eukaryotic Cell, 2002, vol.1 (5) , pp.657-662 参照）
イソクエン酸リアーゼは、グリオキシル酸回路の反応を触媒する酵素の一つであり、グリオキシル酸回路に特有の酵素である。グリオキシル酸回路は、微生物の一部や植物に見られる代謝回路であり、イソクエン酸からリンゴ酸とコハク酸を生成し、さらにオキサロ酢酸を生成することができる。（"Life and death in a macrophage: role of the glyoxylate cycle in virulence" Eukaryotic Cell, 2002, vol.1 (5) , pp.657-662 参照）
図１は、グリオキシル酸回路の反応を示す図である。同図に示すように、イソクエン酸リアーゼ（Isocitrate Lyase）は、イソクエン酸（Isocitrate）からグリオキシル酸（Glyoxylate）を生成する反応を触媒する。
＜イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域＞
イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域は、本発明に係るオリゴヌクレオチド及びプライマー対がハイブリダイズすることが可能な遺伝子領域の一つである。なお以下の説明において、「イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子」を単に「イソクエン酸リアーゼ遺伝子」ともいうものとする。
イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域は、本発明に係るオリゴヌクレオチド及びプライマー対がハイブリダイズすることが可能な遺伝子領域の一つである。なお以下の説明において、「イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子」を単に「イソクエン酸リアーゼ遺伝子」ともいうものとする。
また、「ハイブリダイズする」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが目的遺伝子領域内の特定の配列と相補的に結合することをいうものとする。
＜オリゴヌクレオチド＞
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡが１０塩基〜３０塩基、１５塩基〜２５塩基、さらに１８〜２０塩基結合したものをいう。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、より具体的には、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスの種特異的な検出に用いるものである。
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡが１０塩基〜３０塩基、１５塩基〜２５塩基、さらに１８〜２０塩基結合したものをいう。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるオリゴヌクレオチドであって、より具体的には、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスの種特異的な検出に用いるものである。
本発明のオリゴヌクレオチドは、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのハイドロフォビン遺伝子を標的として種特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドである。あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子領域に種特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドである。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法のプライマー、ハイブリダイゼーション法の核酸プローブ、固相担体に結合された補足プローブ等、分子生物学的な種々の検出方法に用いることができる。なお、本発明のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ法に用いる場合には、少なくとも一方のプライマーに本発明に係るオリゴヌクレオチドを用いればよく、他方のプライマーを他のオリゴヌクレオチドとすることも可能である。
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、標識化されずに用いられてもよいし、放射性物質や蛍光・発光物質、酵素や酵素基質等の標識物によって標識化して核酸プローブやプライマーとして用いることもできる。
＜オリゴヌクレオチド：タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられるオリゴヌクレオチド＞
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられるオリゴヌクレオチドは、下記（Ａ）及び（Ｂ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は下記（Ｉ）及び下記（Ｊ）のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドにより、タラロマイセス マクロスポラスを種特異的に検出することが可能となる。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられるオリゴヌクレオチドは、下記（Ａ）及び（Ｂ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は下記（Ｉ）及び下記（Ｊ）のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドにより、タラロマイセス マクロスポラスを種特異的に検出することが可能となる。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｉ）配列番号９に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｊ）配列番号１０に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
＜オリゴヌクレオチド：タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられるオリゴヌクレオチド＞
タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられるオリゴヌクレオチドは、下記（Ｃ）及び（Ｄ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は下記（Ｋ）及び下記（Ｌ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドにより、タラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出することが可能となる。
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられるオリゴヌクレオチドは、下記（Ｃ）及び（Ｄ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は下記（Ｋ）及び下記（Ｌ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドにより、タラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出することが可能となる。
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｄ）配列番号４に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｋ）配列番号１１に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｌ）配列番号１２に記載の塩基配列若しくはその相補配列、又は当該塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
＜配列番号１〜４に記載の塩基配列＞
配列番号１及び２に記載の塩基配列は、タラロマイセス マクロスポラスのハイドロフォビン遺伝子内の所定の塩基配列と相補的な塩基配列である。同様に、配列番号３及び４に記載の塩基配列は、タラロマイセス トラキスペルムスのハイドロフォビン遺伝子内の所定の塩基配列と相補的な塩基配列である。
配列番号１及び２に記載の塩基配列は、タラロマイセス マクロスポラスのハイドロフォビン遺伝子内の所定の塩基配列と相補的な塩基配列である。同様に、配列番号３及び４に記載の塩基配列は、タラロマイセス トラキスペルムスのハイドロフォビン遺伝子内の所定の塩基配列と相補的な塩基配列である。
配列番号１〜４に記載の塩基配列は、以下のように探索された。まず、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスのハイドロフォビン遺伝子領域と予測されるＤＮＡ領域をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、シーケンス解析等によりその増幅産物の塩基配列を解析した。続いて、解析された塩基配列がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属等のハイドロフォビン遺伝子と比較的高い相同性を示すことを確認し、増幅産物がそれぞれタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスのハイドロフォビン遺伝子であると推認した。続いて、解析された塩基配列に基づいて配列番号１〜４の塩基配列のプライマーを含む複数のプライマー対を設計し、これらのプライマー対がＰＣＲ法によりタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出可能か否か検討した。その結果、後述するように、配列番号１及び２の塩基配列を有するプライマー対によりタラロマイセス マクロスポラスが、配列番号３及び４の塩基配列を有するプライマー対によりタラロマイセス トラキスペルムスが、それぞれ特異的に検出されることが確認され、配列番号１〜４に記載の塩基配列を見出した。
＜配列番号９〜１２に記載の塩基配列＞
配列番号９及び１０に記載の塩基配列は、タラロマイセス マクロスポラスのイソクエン酸リアーゼ遺伝子内の所定の塩基配列と相補的な塩基配列である。同様に、配列番号１１及び１２に記載の塩基配列は、タラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼ遺伝子内の所定の塩基配列と相補的な塩基配列である。
配列番号９及び１０に記載の塩基配列は、タラロマイセス マクロスポラスのイソクエン酸リアーゼ遺伝子内の所定の塩基配列と相補的な塩基配列である。同様に、配列番号１１及び１２に記載の塩基配列は、タラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼ遺伝子内の所定の塩基配列と相補的な塩基配列である。
配列番号９〜１２に記載の塩基配列は、以下のように探索された。まず、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼ遺伝子領域と予測されるＤＮＡ領域をＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、シーケンス解析等によりその増幅産物の塩基配列を解析した。続いて、解析された塩基配列がアスペルギルス属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属等のイソクエン酸リアーゼ遺伝子と比較的高い相同性を示すことを確認し、増幅産物がそれぞれタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼ遺伝子であると推認した。続いて、解析された塩基配列に基づいて配列番号９〜１２の塩基配列のプライマーを含む複数のプライマー対を設計し、これらのプライマー対がＰＣＲ法によりタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出可能か否か検討した。その結果、後述するように、配列番号９及び１０の塩基配列を有するプライマー対によりタラロマイセス マクロスポラスが、配列番号１１及び１２の塩基配列を有するプライマー対によりタラロマイセス トラキスペルムスが、それぞれ特異的に検出されることが確認され、配列番号９〜１２に記載の塩基配列を見出した。
＜相補配列＞
本発明に係る相補配列とは、ある塩基配列の相補鎖となり得る塩基配列をいう。配列番号１〜４に記載の塩基配列の相補配列は、配列番号１〜４に記載の塩基配列と同様に、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのハイドロフォビン遺伝子領域に種特異的にハイブリダイズすることが可能である。
同様に、配列番号９〜１２に記載の塩基配列の相補配列は、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼ遺伝子領域に種特異的にハイブリダイズすることが可能である。
したがって、本発明に係る相補配列は、本発明に係るオリゴヌクレオチド及びプライマー対として用いられ得る。
本発明に係る相補配列とは、ある塩基配列の相補鎖となり得る塩基配列をいう。配列番号１〜４に記載の塩基配列の相補配列は、配列番号１〜４に記載の塩基配列と同様に、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのハイドロフォビン遺伝子領域に種特異的にハイブリダイズすることが可能である。
同様に、配列番号９〜１２に記載の塩基配列の相補配列は、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼ遺伝子領域に種特異的にハイブリダイズすることが可能である。
したがって、本発明に係る相補配列は、本発明に係るオリゴヌクレオチド及びプライマー対として用いられ得る。
＜塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列＞
本発明において「塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列」とは、当該塩基配列若しくはその相補配列と実質的に相同な塩基配列をいう。より具体的には、１〜３個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列であって、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出することが可能な塩基配列をいうものとする。
本発明において「塩基配列若しくはその相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列」とは、当該塩基配列若しくはその相補配列と実質的に相同な塩基配列をいう。より具体的には、１〜３個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列であって、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出することが可能な塩基配列をいうものとする。
＜プライマー対＞
本発明に係るプライマー対は、２本のオリゴヌクレオチドの組み合わせであり、ＰＣＲ法におけるプライマー対として用いられるものである。本発明に係るプライマー対は、タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、より具体的には、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスの種特異的な検出に用いるものである。
本発明に係るプライマー対は、２本のオリゴヌクレオチドの組み合わせであり、ＰＣＲ法におけるプライマー対として用いられるものである。本発明に係るプライマー対は、タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、より具体的には、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスの種特異的な検出に用いるものである。
本発明に係るプライマー対は、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのハイドロフォビン遺伝子領域内の所定領域をＰＣＲ法により増幅することが可能なものである。あるいは、本発明に係るプライマー対は、タラロマイセス マクロスポラス又はタラロマイセス トラキスペルムスのイソクエン酸リアーゼ遺伝子領域内の所定領域をＰＣＲ法により増幅することが可能なものである。すなわち、本発明に係るプライマー対の各プライマーは、ハイドロフォビン遺伝子領域内又はイソクエン酸リアーゼ遺伝子領域内の増幅予定領域の、２本鎖ＤＮＡの両鎖の３´側にハイブリダイズすることが可能に構成される。
本発明に係るプライマー対は、典型的には、そのままプライマー対として使用されるが、標識物で標識化して用いることもできる。また、本発明のプライマー対は、例えば、５〜２０μＭ、さらに８〜１２μＭの濃度に調製し、ＰＣＲに用いることができる。なお、ＰＣＲ法については後述する。
＜プライマー対：タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられるオリゴヌクレオチド＞
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられるプライマー対は、下記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、又は下記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とすることができる。当該プライマー対により、タラロマイセス マクロスポラスを迅速かつ種特異的に検出することが可能となる。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｍ）配列番号９に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられるプライマー対は、下記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、又は下記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とすることができる。当該プライマー対により、タラロマイセス マクロスポラスを迅速かつ種特異的に検出することが可能となる。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｍ）配列番号９に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
さらに、上記プライマー対のうち、下記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。あるいは、上記プライマー対のうち、下記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。これらのプライマー対により、タラロマイセス マクロスポラスを迅速かつより精度よく検出することが可能となり、例えばテンプレートＤＮＡ（ｔｅｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ）の濃度が１０〜１００ｐｇ／μｌであっても検出することが可能となる。
（ｅ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列
（ｍ）配列番号９に記載の塩基配列
（ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列
（ｅ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列
（ｍ）配列番号９に記載の塩基配列
（ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列
＜プライマー対：タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられるオリゴヌクレオチド＞
タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられるプライマー対は、下記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、又は下記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｐ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とすることができる。当該プライマー対により、タラロマイセス トラキスペルムスを迅速かつ種特異的に検出することが可能となる。
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｈ）配列番号４に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられるプライマー対は、下記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、又は下記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｐ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対とすることができる。当該プライマー対により、タラロマイセス トラキスペルムスを迅速かつ種特異的に検出することが可能となる。
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｈ）配列番号４に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
さらに、上記プライマー対のうち、下記（ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｈ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。あるいは、上記プライマー対のうち、下記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。これらのプライマー対により、タラロマイセス トラキスペルムスを迅速かつより精度よく検出することが可能となり、例えばテンプレートＤＮＡの濃度が１０〜１００ｐｇ／μｌであっても検出することが可能となる。
（ｇ）配列番号３に記載の塩基配列
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列
（ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列
（ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列
（ｇ）配列番号３に記載の塩基配列
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列
（ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列
（ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列
＜プライマー対：フォワードプライマー／リバースプライマー＞
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合には、例えば、上記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。また、例えば、上記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。
同様に、上記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。また、例えば、上記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合には、例えば、上記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。また、例えば、上記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。
同様に、上記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。また、例えば、上記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。
タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合には、例えば、上記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（Ｈ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。また、例えば、上記（ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｈ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（ｈ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。
同様に、上記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（Ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。また、例えば、上記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。
同様に、上記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（Ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。また、例えば、上記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうち、上記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、上記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとすることができる。
＜検出用キット＞
本発明に係るタラロマイセス属に属する種の検出用キットは、上記（Ａ）〜（Ｄ）、上記（Ｉ）〜（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、及び上記（Ｅ）〜（Ｈ）、上記（Ｍ）〜（Ｐ）、上記（ｅ）〜（ｈ）、上記（ｍ）〜（ｐ）の塩基配列で表されるプライマー対のうちの少なくとも一つを含み、タラロマイセス マクロスポラス及び／又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出するものである。本発明の検出用キットは、これらをプライマーや核酸プローブとして含み、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法に用いるキットや、ハイブリダイゼーション法に用いるキット等、分子生物学的な種々の検出方法に用いるキットとして構成され得る。
本発明に係るタラロマイセス属に属する種の検出用キットは、上記（Ａ）〜（Ｄ）、上記（Ｉ）〜（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、及び上記（Ｅ）〜（Ｈ）、上記（Ｍ）〜（Ｐ）、上記（ｅ）〜（ｈ）、上記（ｍ）〜（ｐ）の塩基配列で表されるプライマー対のうちの少なくとも一つを含み、タラロマイセス マクロスポラス及び／又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出するものである。本発明の検出用キットは、これらをプライマーや核酸プローブとして含み、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法に用いるキットや、ハイブリダイゼーション法に用いるキット等、分子生物学的な種々の検出方法に用いるキットとして構成され得る。
具体的に、本発明に係る検出用キットは、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる上記（Ａ）及び上記（Ｂ）のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、並びにタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる上記（Ｃ）及び上記（Ｄ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含むものである。
あるいは、本発明に係る検出用キットは、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる上記（Ｉ）及び上記（Ｊ）のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、並びにタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる上記（Ｋ）及び上記（Ｌ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含むものであってもよい。
あるいは、本発明に係る検出用キットは、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる上記（Ｉ）及び上記（Ｊ）のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、並びにタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる上記（Ｋ）及び上記（Ｌ）の塩基配列のいずれか一方の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含むものであってもよい。
また、本発明に係る検出用キットは、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる前記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる上記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる上記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合に用いられる上記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる上記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる上記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる上記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、及びタラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合に用いられる上記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含むものとすることもできる。
また、本発明の検出用キットは、タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる上記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる上記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる上記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、並びにタラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる上記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（Ｐ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうちの少なくとも一方のプライマー対を含むものとすることもできる。
さらに、上記プライマー対は、上記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよく、上記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。あるいは、上記プライマー対は、上記（ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｈ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよく、上記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び上記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。
本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチド及び上記プライマー対の他に、被験菌のＤＮＡ抽出試薬や、ＰＣＲ用試薬、標識検出物質等、菌の検出に通常用いられる物質を含んでいてもよい。このようなキットにより、タラロマイセス マクロスポラス及び／又はタラロマイセス トラキスペルムスをより簡便かつ種特異的に検出することが可能となる。
＜タラロマイセス属に属する種の検出方法＞
本発明に係るタラロマイセス属に属する種の検出方法は、上記（Ａ）〜（Ｄ）、上記（Ｉ）〜（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｅ）〜（Ｈ）、上記（Ｍ）〜（Ｐ）、上記（ｅ）〜（ｈ）、上記（ｍ）〜（ｐ）の塩基配列で表されるプライマー対のうちの少なくとも一つを用いて、タラロマイセス マクロスポラス及び／又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出する方法である。本発明に係る検出方法は、検体から抽出した核酸と上記オリゴヌクレオチド等とを接触させることで、分子生物学的にタラロマイセス マクロスポラス及び／又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出する方法とすることができる。このような検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法、捕捉プローブを用いた標的核酸の捕捉等が挙げられる。
本発明に係るタラロマイセス属に属する種の検出方法は、上記（Ａ）〜（Ｄ）、上記（Ｉ）〜（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｅ）〜（Ｈ）、上記（Ｍ）〜（Ｐ）、上記（ｅ）〜（ｈ）、上記（ｍ）〜（ｐ）の塩基配列で表されるプライマー対のうちの少なくとも一つを用いて、タラロマイセス マクロスポラス及び／又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出する方法である。本発明に係る検出方法は、検体から抽出した核酸と上記オリゴヌクレオチド等とを接触させることで、分子生物学的にタラロマイセス マクロスポラス及び／又はタラロマイセス トラキスペルムスを検出する方法とすることができる。このような検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法、捕捉プローブを用いた標的核酸の捕捉等が挙げられる。
具体的に、本発明に係る検出方法は、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は上記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つを用い、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は上記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つを用いることを特徴とする。
また、本発明に係る検出方法は、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は上記（Ｅ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｆ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は上記（Ｇ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｈ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うことを特徴とする。
同様に、本発明に係る検出方法は、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は上記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行い、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は上記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行ってもよい。
また、本発明に係る検出方法は、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は上記（Ｅ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｆ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに上記（Ｍ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｎ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一つのステップを含み、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は上記（Ｇ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｈ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに上記（Ｏ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｐ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一つのステップを含んでもよい。
さらに、上記プライマー対は、上記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよく、上記（ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｈ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。
あるいは、上記プライマー対は、上記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよく、上記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。
あるいは、上記プライマー対は、上記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよく、上記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対であってもよい。
＜タラロマイセス属に属する種の検出方法：ＰＣＲ法＞
本発明に係るＰＣＲ法は、例えば、テンプレートとしてＤＮＡを用いたＰＣＲ法（以下、通常のＰＣＲ法とする）、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法等を用いることができるが、通常のＰＣＲ法が好ましい。
本発明に係るＰＣＲ法は、例えば、テンプレートとしてＤＮＡを用いたＰＣＲ法（以下、通常のＰＣＲ法とする）、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ法等を用いることができるが、通常のＰＣＲ法が好ましい。
ＰＣＲ法は、まず、テンプレートの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、プライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用反応バッファー、及び滅菌蒸留水等を混合したＰＣＲ反応液を調製する。次に、サーマルサイクラー等を用いて熱変性反応、アニーリング反応、及び伸長反応を連続して行い、これを所定サイクル繰り返すことにより、ＰＣＲ反応を行う。そして、ＰＣＲ反応後の反応液中の増幅産物を確認し、所望のＤＮＡ断片が増幅されているか否か確認する。テンプレートの核酸としては、後述する検体から直接核酸を抽出した溶液や、培養した菌から核酸を抽出した溶液を用いることができる。
本発明に係るＰＣＲ法におけるプライマー対は、少なくとも一方のプライマーに本発明に係るオリゴヌクレオチドを用いればよく、他方のプライマーを他のオリゴヌクレオチドとすることも可能である。より好ましくは、プライマー対として、本発明に係るプライマー対を用いることができる。ＰＣＲ反応液に含まれる他の要素も、濃度と量とを適宜決定することができる。ＰＣＲ反応条件等も、使用するポリメラーゼの種類等を考慮して、適宜決定することができる。
増幅産物の確認方法も特に限定されず、例えば、アガロースゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、シーケンス解析による塩基配列を決定する方法等を適用することができる。このうち、アガロースゲル電気泳動法及びキャピラリー電気泳動法が簡便に増幅産物を確認でき、より好ましい。
＜タラロマイセス属に属する種の検出方法：検体から抽出された核酸を用いて検出する方法＞
本発明に係る検出方法は、検体から抽出された核酸を用いて、タラロマイセス属に属する種を検出することができる。すなわち、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は、検体から抽出された核酸に上記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、及び上記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つをハイブリダイズさせる。また、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は、上記抽出された核酸に上記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つをハイブリダイズさせることで、タラロマイセス属に属する種を検出することができる。核酸は、例えばＤＮＡを用いることができる。
本発明に係る検出方法は、検体から抽出された核酸を用いて、タラロマイセス属に属する種を検出することができる。すなわち、タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は、検体から抽出された核酸に上記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、及び上記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つをハイブリダイズさせる。また、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は、上記抽出された核酸に上記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つをハイブリダイズさせることで、タラロマイセス属に属する種を検出することができる。核酸は、例えばＤＮＡを用いることができる。
また、検体からの核酸の抽出方法は特に限定されず、例えば、製造原料等の検体から菌を培養し、培養した菌からＤＮＡ等の核酸を抽出してもよい。あるいは、製造原料等の検体から直接核酸を抽出してもよい。
また、ＰＣＲを行う場合には、上記抽出された核酸をテンプレートとして用いてＰＣＲを行うことができる。当該核酸がＤＮＡの場合、テンプレートＤＮＡの濃度は、１０ｐｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌであってもよく、好ましくは１００ｐｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌであってもよい。
＜タラロマイセス属に属する種の検出方法：検体＞
本発明に係る検体としては、タラロマイセス属に属する菌の可能性がある菌株や、タラロマイセス属に属する菌を含んでいる可能性がある製造原料等が挙げられる。製造原料等は、食品の製造原料等が挙げられる。当該食品は、例えば、タラロマイセス属による汚染が問題となる、果実缶詰やジャム等の果実加工食品、ジュースや緑茶飲料等の清涼飲料水等であってもよい。
本発明に係る検体としては、タラロマイセス属に属する菌の可能性がある菌株や、タラロマイセス属に属する菌を含んでいる可能性がある製造原料等が挙げられる。製造原料等は、食品の製造原料等が挙げられる。当該食品は、例えば、タラロマイセス属による汚染が問題となる、果実缶詰やジャム等の果実加工食品、ジュースや緑茶飲料等の清涼飲料水等であってもよい。
＜タラロマイセス属に属する種を同定する方法＞
本発明は、さらに、検体に含まれるタラロマイセス属に属する種を同定する方法を提供することができる。本発明に係る同定方法は、検体から抽出した核酸に、以下のステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）の少なくとも一方のステップを含む。ステップ（ｉ）は、上記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、及び上記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つをハイブリダイズさせることでタラロマイセス マクロスポラスを検出する。ステップ（ｉｉ）は、上記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つをハイブリダイズさせることでタラロマイセス トラキスペルムスを検出する。
本発明は、さらに、検体に含まれるタラロマイセス属に属する種を同定する方法を提供することができる。本発明に係る同定方法は、検体から抽出した核酸に、以下のステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）の少なくとも一方のステップを含む。ステップ（ｉ）は、上記（Ａ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｂ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｉ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、及び上記（Ｊ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つをハイブリダイズさせることでタラロマイセス マクロスポラスを検出する。ステップ（ｉｉ）は、上記（Ｃ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｄ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、上記（Ｋ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び上記（Ｌ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一つをハイブリダイズさせることでタラロマイセス トラキスペルムスを検出する。
上記ステップ（ｉ）を行い、タラロマイセス マクロスポラスが検出された場合は、検体に含まれていた上記種がタラロマイセス マクロスポラスであると同定することができる。一方、上記ステップ（ｉｉ）を行い、タラロマイセス トラキスペルムスが検出された場合は、検体に含まれていた菌がタラロマイセス トラキスペルムスであると同定することができる。
上記ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）は、いずれか一方のみを行ってもよい。あるいは、上記ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）の双方を行ってもよい。双方を行う場合、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）の時間的な前後は特に限定されない。
＜本発明の作用効果＞
本発明に係るオリゴヌクレオチド及びプライマー対は、いずれも、上記塩基配列を有することにより、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムス各々を種特異的に検出することができる。タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスは、上述のように、他のタラロマイセス属に属する菌と比較して、果実加工食品や清涼飲料水から検出される可能性が高いことに加え、耐熱性及びＤ値も高く、低温加熱による滅殺が難しい。したがって、これらの菌が検出された場合は、加熱殺菌等ではなく、製造原料の除去や製造環境の見直し等の処置を迅速に行う必要が生じる。本発明によれば、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出することができるため、上記処置の実行を迅速かつ適切に判断することが可能となる。したがって、汚染の拡大を防止することができる。
本発明に係るオリゴヌクレオチド及びプライマー対は、いずれも、上記塩基配列を有することにより、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムス各々を種特異的に検出することができる。タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスは、上述のように、他のタラロマイセス属に属する菌と比較して、果実加工食品や清涼飲料水から検出される可能性が高いことに加え、耐熱性及びＤ値も高く、低温加熱による滅殺が難しい。したがって、これらの菌が検出された場合は、加熱殺菌等ではなく、製造原料の除去や製造環境の見直し等の処置を迅速に行う必要が生じる。本発明によれば、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出することができるため、上記処置の実行を迅速かつ適切に判断することが可能となる。したがって、汚染の拡大を防止することができる。
さらに、本発明によれば、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーション法等を用いて、タラロマイセス マクロスポラス及び／又はタラロマイセス トラキスペルムスを容易に検出することが可能となる。特にＰＣＲ法を用いる場合は、検体から抽出した核酸と、本発明に係るプライマー対とを用いてＰＣＲを行うことにより、迅速な検出が可能となる。これにより、いわゆるｎｅｓｔｅｄＰＣＲ（非特許文献２参照）のような煩雑な作業が不要となる。
これに加えて、本発明の検出方法は、検出限界に優れている。例えば、ＰＣＲ法では、後述の試験例３及び試験例７に示すように、テンプレートＤＮＡの濃度が１０〜１００ｐｇ／μｌであっても上記各菌を検出することができる。したがって、製造原料からわずかな量の菌しか採取できなかった場合でも検出可能となり、衛生管理の徹底に貢献することが可能となる。
以下、本発明を実施例等に基づき、さらに説明する。
［実施例１：タラロマイセス マクロスポラス検出用のプライマー］
タラロマイセス マクロスポラス検出用として、配列番号１及び２の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。これらのプライマーは、ハイドロフォビン遺伝子をターゲットとして作成したものである。各プライマーは、オペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表１に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
タラロマイセス マクロスポラス検出用として、配列番号１及び２の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。これらのプライマーは、ハイドロフォビン遺伝子をターゲットとして作成したものである。各プライマーは、オペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表１に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
［実施例２：タラロマイセス トラキスペルムス検出用のプライマー］
タラロマイセス トラキスペルムス検出用のプライマーとして、配列番号３及び４の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。これらのプライマーは、ハイドロフォビン遺伝子をターゲットとして作成したものである。各プライマーは、実施例１と同様にオペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表１に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
タラロマイセス トラキスペルムス検出用のプライマーとして、配列番号３及び４の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。これらのプライマーは、ハイドロフォビン遺伝子をターゲットとして作成したものである。各プライマーは、実施例１と同様にオペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表１に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
［試験例１］
試験例１として、実施例１及び実施例２に係るプライマー対を用いて、検体である菌からタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出できるか否か確認した。
試験例１として、実施例１及び実施例２に係るプライマー対を用いて、検体である菌からタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出できるか否か確認した。
（検体の調製）
まず、検体からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ溶液を調製した。検体としては、表２及び表３に示す菌株を用いた。このうち、表２の１，２番及び表３の１，２，５，６番はタラロマイセス マクロスポラスに属する菌株であり、表２の３，４番及び表３の３，４，７，８番は、タラロマイセス トラキスペルムスに属する菌株である。これらの菌株は、独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（JCM）及び独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（NBRC）から入手した。
まず、検体からＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ溶液を調製した。検体としては、表２及び表３に示す菌株を用いた。このうち、表２の１，２番及び表３の１，２，５，６番はタラロマイセス マクロスポラスに属する菌株であり、表２の３，４番及び表３の３，４，７，８番は、タラロマイセス トラキスペルムスに属する菌株である。これらの菌株は、独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（JCM）及び独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（NBRC）から入手した。
各菌株を、ＰＤＡ（Potato Dextrose Agar）培地等にて、約２５〜３０℃、７〜１０日間培養した。回収した菌株から、ZR Fungal/Bacterial DNA Kit（ZYMO RESEARCH製）を用い、付属プロトコールに従ってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、１０〜５０ｎｇ／μｌの濃度のＤＮＡ溶液として調製した。
（ＰＣＲ法による遺伝子増幅）
続いて、調整した４５種類のＤＮＡ溶液と実施例１に係るプライマー対とをそれぞれ用いて、タラロマイセス マクロスポラス検出のためのＰＣＲを行った。同様に、調整した４５種類のＤＮＡ溶液と実施例２に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス トラキスペルムス検出のためのＰＣＲを行った。
続いて、調整した４５種類のＤＮＡ溶液と実施例１に係るプライマー対とをそれぞれ用いて、タラロマイセス マクロスポラス検出のためのＰＣＲを行った。同様に、調整した４５種類のＤＮＡ溶液と実施例２に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス トラキスペルムス検出のためのＰＣＲを行った。
まず、各ＰＣＲ反応液を調製した。各ＰＣＲにおいて、プライマー及びテンプレートＤＮＡ（ｔｅｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ）の塩基配列のみ異なり、ＰＣＲ反応液の組成は同一とした。表４に、ＰＣＲ反応液の組成を示す。テンプレートＤＮＡは、「検体の調製」で調製した各ＤＮＡ溶液とした。Quick Taq（登録商標） HS DyeMix（東洋紡株式会社製）は、ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA Polymerase）、ＰＣＲ用反応バッファー、ｄＮＴＰが予め混合されているＰＣＲ用試薬である。また、実施例１に係るプライマー対において、フォワードプライマーは配列番号１の塩基配列を有するプライマー、リバースプライマーは配列番号２の塩基配列を有するプライマーとした。実施例２に係るプライマー対において、フォワードプライマーは配列番号３の塩基配列を有するプライマー、リバースプライマーは配列番号４の塩基配列を有するプライマーとした。
次に、調製したＰＣＲ反応液について、サーマルサイクラーを用い、遺伝子増幅処理を行った。タラロマイセス マクロスポラスの検出における当該処理の条件は、（１）９４℃２分間の熱変性反応、（２）９４℃で３０秒の熱変性反応、（３）５５℃で３０秒のアニーリング反応、（４）６８℃で２０秒の伸長反応、（５）６８℃で５分の伸長反応とし、（２）〜（４）を３０サイクル行った。タラロマイセス トラキスペルムスの検出における当該処理の条件は、（１）９４℃２分間の熱変性反応、（２）９４℃で３０秒の熱変性反応、（３）５７℃で３０秒のアニーリング反応、（４）６８℃で２０秒の伸長反応、（５）６８℃で５分の伸長反応とし、（２）〜（４）を３０サイクル行った。
（ＰＣＲ増幅産物の確認）
続いて、ＰＣＲ反応液から５〜１０μｌを分取し、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行った。バッファーは、１×ＴＡＥバッファーを用いた。電気泳動後、アガロースゲルを常法に従って染色し、紫外線（ＵＶ）ライトボックス上にてアガロースゲルを撮像した。撮像された画像に基づいてＰＣＲ増幅産物を確認した。
続いて、ＰＣＲ反応液から５〜１０μｌを分取し、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行った。バッファーは、１×ＴＡＥバッファーを用いた。電気泳動後、アガロースゲルを常法に従って染色し、紫外線（ＵＶ）ライトボックス上にてアガロースゲルを撮像した。撮像された画像に基づいてＰＣＲ増幅産物を確認した。
（結果）
図２は、実施例１の電気泳動像であり、図３は実施例２の電気泳動像である。また各図において、Ａは表２に記載の各検体の結果を示し、Ｂは表３に記載の各検体の結果を示す。なお、表２及び表３に付した各菌株の番号と、図２及び図３の電気泳動像に付した各レーンの番号とはそれぞれ対応する。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
図２は、実施例１の電気泳動像であり、図３は実施例２の電気泳動像である。また各図において、Ａは表２に記載の各検体の結果を示し、Ｂは表３に記載の各検体の結果を示す。なお、表２及び表３に付した各菌株の番号と、図２及び図３の電気泳動像に付した各レーンの番号とはそれぞれ対応する。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
まず図２に示すように、Ａの１，２番のレーン、及びＢの１，２，５，６番のレーンにのみ、３００〜４００ｂｐ程度のバンドが確認された。これらのレーンに対応する菌株は、表２を参照し、いずれもタラロマイセス マクロスポラスに属する株である。このことから、実施例１に係るプライマー対が、タラロマイセス マクロスポラスを種特異的に検出可能であることが確認された。
図３に示すように、Ａの３，４番のレーン、及びＢの３，４，７，８番のレーンにのみ、３００〜４００ｂｐ程度のバンドが確認された。これらのレーンに対応する菌株は、表３を参照し、いずれもタラロマイセス トラキスペルムスに属する株である。このことから、実施例２に係るプライマー対が、タラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出可能であることが確認された。
［試験例２］
試験例２では、製造原料より単離した菌株を検体とし、試験例１と同様にタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出できるか否か確認した。
試験例２では、製造原料より単離した菌株を検体とし、試験例１と同様にタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出できるか否か確認した。
（検体の調製）
まず、検体である製造原料から菌株を単離してＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ溶液を調製した。製造原料は、パインアップル、ラズベリー、ブルーベリー、イチゴ等であり、これから８０℃で３０分の加熱を行い、生残した菌株を単離した。単離した菌株は、形態観察及び塩基配列解析法により同定した。同定された菌株を表５に示す。表５に記載された菌株のうち、１，１３番はタラロマイセス マクロスポラスに属する菌株であり、２，３，１０番は、タラロマイセス トラキスペルムスに属する菌株である。
まず、検体である製造原料から菌株を単離してＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ溶液を調製した。製造原料は、パインアップル、ラズベリー、ブルーベリー、イチゴ等であり、これから８０℃で３０分の加熱を行い、生残した菌株を単離した。単離した菌株は、形態観察及び塩基配列解析法により同定した。同定された菌株を表５に示す。表５に記載された菌株のうち、１，１３番はタラロマイセス マクロスポラスに属する菌株であり、２，３，１０番は、タラロマイセス トラキスペルムスに属する菌株である。
各菌株を、ＰＤＡ（Potato Dextrose Agar）培地にて、約２５℃で、７日間培養した。単離した菌株の１白金耳を３０μlの滅菌水に入れ電子レンジで５分加熱し、ボルテックスミキサーでよく撹拌した。1,200rpmで５分間遠心分離し、上澄みをＤＮＡ抽出液とした。
（ＰＣＲ法による遺伝子増幅）
続いて、調整したＤＮＡ溶液と実施例１及び実施例２に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムス検出のためのＰＣＲを行った。本工程は、試験例１と同様であるため、説明を省略する。
続いて、調整したＤＮＡ溶液と実施例１及び実施例２に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムス検出のためのＰＣＲを行った。本工程は、試験例１と同様であるため、説明を省略する。
（ＰＣＲ増幅産物の確認）
続いて、サンプルチューブに入ったＰＣＲ反応液を、マイクロチップ電気泳動装置ＭＣＥ−２０２ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）にセットし、電気泳動を行った。電気泳動後、データ解析ソフトウェア（ＭｕｌｔｉＮＡ Ｖｉｅｗｅｒ）により、ＰＣＲ増幅産物を確認した。
続いて、サンプルチューブに入ったＰＣＲ反応液を、マイクロチップ電気泳動装置ＭＣＥ−２０２ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）にセットし、電気泳動を行った。電気泳動後、データ解析ソフトウェア（ＭｕｌｔｉＮＡ Ｖｉｅｗｅｒ）により、ＰＣＲ増幅産物を確認した。
（結果）
図４は、試験例２の電気泳動像であり、Ａは実施例１、Ｂは実施例２の結果を示す。なお、図４の電気泳動像に付した各レーンの番号と、表５に付した各菌株の番号とはそれぞれ対応している。なお、Ｍ１は、高分子マーカを示し、Ｍ２は低分子マーカを示す。また、Ｐは、ＰＣＲ反応液中のプライマーのピークを示す。
図４は、試験例２の電気泳動像であり、Ａは実施例１、Ｂは実施例２の結果を示す。なお、図４の電気泳動像に付した各レーンの番号と、表５に付した各菌株の番号とはそれぞれ対応している。なお、Ｍ１は、高分子マーカを示し、Ｍ２は低分子マーカを示す。また、Ｐは、ＰＣＲ反応液中のプライマーのピークを示す。
まず図４Ａにおいて、１，１３番のレーンにのみ、試験例１と同程度の大きさのバンドが確認された。これらのレーンに対応する菌株は、表５を参照し、いずれもタラロマイセス マクロスポラスに属する株である。このことから、実施例１に係るプライマー対が、タラロマイセス マクロスポラスを種特異的に検出可能であることが確認された。
次に図４Ｂにおいて、２，３，１０番のレーンにのみ、試験例１と同程度の大きさのバンドが確認された。これらのレーンに対応する菌株は、表５を参照し、いずれもタラロマイセス トラキスペルムスに属する株である。このことから、実施例２に係るプライマー対が、タラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出可能であることが確認された。
［試験例３］
試験例３として、実施例１及び実施例２に係るプライマー対を用いたＰＣＲにおけるタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスの検出限界を確認するため、検体から濃度の異なるＤＮＡ溶液を作成し、試験を行った。
試験例３として、実施例１及び実施例２に係るプライマー対を用いたＰＣＲにおけるタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスの検出限界を確認するため、検体から濃度の異なるＤＮＡ溶液を作成し、試験を行った。
（検体の調製）
まず、検体からＤＮＡを抽出し、濃度の異なるＤＮＡ溶液を調製した。検体としては、タラロマイセス マクロスポラス ＪＣＭ２２８１８株と、タラロマイセス トラキスペルムスＮＢＲＣ３１７５７株とを用いた。これらの菌株の入手元は、試験例１と同様である。
まず、検体からＤＮＡを抽出し、濃度の異なるＤＮＡ溶液を調製した。検体としては、タラロマイセス マクロスポラス ＪＣＭ２２８１８株と、タラロマイセス トラキスペルムスＮＢＲＣ３１７５７株とを用いた。これらの菌株の入手元は、試験例１と同様である。
各菌株から、試験例１と同様にＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、表６に示す濃度のＤＮＡ溶液として調製し、それぞれ試料１〜５とした。
（ＰＣＲ法による遺伝子増幅）
続いて、試料１〜５のＤＮＡ溶液と実施例１に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス マクロスポラス検出のためのＰＣＲを行った。また、試料１〜５のＤＮＡ溶液と実施例２に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス トラキスペルムス検出のためのＰＣＲを行った。本工程は、試験例１と同様であるため、説明を省略する。
続いて、試料１〜５のＤＮＡ溶液と実施例１に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス マクロスポラス検出のためのＰＣＲを行った。また、試料１〜５のＤＮＡ溶液と実施例２に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス トラキスペルムス検出のためのＰＣＲを行った。本工程は、試験例１と同様であるため、説明を省略する。
（ＰＣＲ増幅産物の確認）
続いて、ＰＣＲ増幅産物を確認するため、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行った。本工程も、試験例１と同様であるため、その説明を省略する。
続いて、ＰＣＲ増幅産物を確認するため、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行った。本工程も、試験例１と同様であるため、その説明を省略する。
（結果）
図５は、試験例３の電気泳動像であり、Ａは実施例１、Ｂは実施例２の結果を示す。なお、図５の電気泳動像に付した各レーンの番号と、表６に示す各試料の番号とはそれぞれ対応している。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
図５は、試験例３の電気泳動像であり、Ａは実施例１、Ｂは実施例２の結果を示す。なお、図５の電気泳動像に付した各レーンの番号と、表６に示す各試料の番号とはそれぞれ対応している。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
まず図５Ａにおいて、試料のＤＮＡ濃度が薄くなるに従い、バンドの蛍光強度が低くなる様子が観察された。これにより、実施例１に係るプライマー対が、タラロマイセス マクロスポラスを特異的に検出可能なことが改めて確認された。加えて、ＤＮＡ濃度がそれぞれ１００ｐｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌの試料１〜３のバンドは確認でき、ＤＮＡ濃度がそれぞれ１０ｐｇ／μｌ，１ｐｇ／μｌの試料４，５のバンドは確認することができなかった。このことから、実施例１に係るプライマー対の検出限界は、検体から調製したＤＮＡ濃度にして１０〜１００ｐｇ／μｌであることが示唆された。
図５Ｂにおいても、図５Ａと同様の結果が得られた。すなわち、試料のＤＮＡ濃度が薄くなるに従い、バンドの蛍光強度が低くなる様子が観察された。これにより、実施例２に係るプライマー対が、タラロマイセス トラキスペルムスを特異的に検出可能なことが改めて確認された。また、ＤＮＡ濃度が１００ｐｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌの試料１〜３のバンドは確認でき、ＤＮＡ濃度がそれぞれ１０ｐｇ／μｌ，１ｐｇ／μｌの試料４，５のバンドは確認することができなかった。このことから、実施例２に係るプライマー対の検出限界も、検体から調製したＤＮＡ濃度にして１０〜１００ｐｇ／μｌであることが示唆された。
続いて、上記（Ａ）〜（Ｈ）、（ｅ）〜（ｈ）の配列のいずれにも該当しない配列のプライマーを作成し、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出できるか否か確認した。
［比較例１］
タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスのうちの少なくとも一方を検出するため、配列番号５及び６の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。各プライマーは、オペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表７に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスのうちの少なくとも一方を検出するため、配列番号５及び６の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。各プライマーは、オペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表７に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
［比較例２］
タラロマイセス マクロスポラス検出用のプライマーとして、配列番号７及び８の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。プライマーは、実施例１と同様にオペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表７に、作成したプライマーの塩基配列を示す。
タラロマイセス マクロスポラス検出用のプライマーとして、配列番号７及び８の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。プライマーは、実施例１と同様にオペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表７に、作成したプライマーの塩基配列を示す。
［試験例４］
試験例４として、比較例１に係るプライマー対を用いて、検体である菌からタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスのうちの一方を種特異的に検出できるか否か確認した。なお、本試験例は、試験例１と同様の流れで行ったため、重複している部分についてはその説明を省略する。
試験例４として、比較例１に係るプライマー対を用いて、検体である菌からタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスのうちの一方を種特異的に検出できるか否か確認した。なお、本試験例は、試験例１と同様の流れで行ったため、重複している部分についてはその説明を省略する。
本試験例では、検体として、表８及び表９に示す菌株を用いた。表８の１４番はタラロマイセス トラキスペルムスに属する菌株であり、表９の１２，１３番はタラロマイセス マクロスポラスに属する菌株である。また、表８に示す菌株は、試験例１と同様の独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（NBRC）から入手し、表９に示す菌株は、試験例１と同様の独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（JCM）から入手した。また、ＰＣＲ反応液の組成は、試験例１の表４に記載の組成とした。比較例１に係るプライマー対において、フォワードプライマーは配列番号５の塩基配列を有するプライマー、リバースプライマーは配列番号６の塩基配列を有するプライマーとした。また、ＰＣＲ条件は、（１）９４℃２分間の熱変性反応、（２）９４℃で３０秒の熱変性反応、（３）５３℃で３０秒のアニーリング反応、（４）６８℃で２０秒の伸長反応、（５）６８℃で５分の伸長反応とし、（２）〜（４）を３０サイクル行った。続いて、試験例１と同様に、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を確認した。
（結果）
図６は、試験例４の電気泳動像であり、Ａは表８に記載の菌株、Ｂは表９に記載の菌株の結果を示す。なお、表８及び表９に付した各菌株の番号と、図６Ａ，Ｂの電気泳動像に付した各レーンの番号とはそれぞれ対応する。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
図６は、試験例４の電気泳動像であり、Ａは表８に記載の菌株、Ｂは表９に記載の菌株の結果を示す。なお、表８及び表９に付した各菌株の番号と、図６Ａ，Ｂの電気泳動像に付した各レーンの番号とはそれぞれ対応する。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
図６Ａに示すように、タラロマイセス トラキスペルムスに属する株に係る１４番目のレーンにバンドが確認された。また、図からは確認が難しいが、発明者らは、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓに属する株に係る１５番目のレーンにも、肉眼にてバンドを確認した。これにより、比較例１に係るプライマー対は、タラロマイセス属以外の菌株についても検出することが示唆された。
一方、図６Ｂに示すように、タラロマイセス マクロスポラスに属する株に係る１２番目のレーンにのみ、バンドが確認された。しかしながら、同じくタラロマイセス マクロスポラスに属する株に係る１３番目のレーンからはバンドが確認されなかった。このことから、比較例１に係るプライマー対は、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスのいずれか一方の種特異的な検出は難しいことが確認された。
［試験例５］
試験例５として、比較例２に係るプライマー対を用いて、検体である菌からタラロマイセス マクロスポラスを種特異的に検出できるか否か確認した。なお、本試験例は、試験例１及び試験例４と同様の流れで行ったため、重複している部分についてはその説明を省略する。
試験例５として、比較例２に係るプライマー対を用いて、検体である菌からタラロマイセス マクロスポラスを種特異的に検出できるか否か確認した。なお、本試験例は、試験例１及び試験例４と同様の流れで行ったため、重複している部分についてはその説明を省略する。
本試験例では、検体として、表１０及び表１１に示す菌株を用いた。このうち、表１１の１２，１３番はタラロマイセス マクロスポラスに属する菌株である。また、表１０に示す菌株は、試験例１と同様の独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（NBRC）から入手し、表１１に示す菌株は、試験例１と同様の独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（JCM）から入手した。また、ＰＣＲ反応液の組成は、試験例１の表４に記載の組成とした。比較例２に係るプライマー対において、フォワードプライマーは配列番号７の塩基配列を有するプライマー、リバースプライマーは配列番号８の塩基配列を有するプライマーとした。また、ＰＣＲ条件は、（１）９４℃２分間の熱変性反応、（２）９４℃で３０秒の熱変性反応、（３）５３℃で３０秒のアニーリング反応、（４）６８℃で２０秒の伸長反応、（５）６８℃で５分の伸長反応とし、（２）〜（４）を３０サイクル行った。続いて、試験例１と同様に、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行い、ＰＣＲ増幅産物を確認した。
（結果）
図７は、試験例５の電気泳動像であり、Ａは表１０に記載の菌株、Ｂは表１１に記載の菌株の結果を示す。なお、表１０及び表１１に付した各菌株の番号と、図７Ａ，Ｂの電気泳動像に付した各レーンの番号とはそれぞれ対応する。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
図７は、試験例５の電気泳動像であり、Ａは表１０に記載の菌株、Ｂは表１１に記載の菌株の結果を示す。なお、表１０及び表１１に付した各菌株の番号と、図７Ａ，Ｂの電気泳動像に付した各レーンの番号とはそれぞれ対応する。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
図７Ａに示す電気泳動像からはバンドが確認できなかった。これは、図７Ａに対応する表１０に記載の菌株にはタラロマイセス マクロスポラスに属する菌株が含まれていないため、妥当な結果であると考えられる。
一方、図７Ｂに示すように、タラロマイセス マクロスポラスに属する株に係る１２番目のレーンにのみ、バンドが確認された。しかしながら、タラロマイセス マクロスポラスに属する株に係る１３番目のレーンからはバンドが確認されなかった。このことから、比較例２に係るプライマー対は、タラロマイセス マクロスポラスの種特異的な検出が難しいことが確認された。
試験例４及び試験例５の結果より、上記（Ａ）〜（Ｈ）、（ｅ）〜（ｈ）の配列のいずれにも該当しない比較例１及び比較例２に係るプライマー対では、種特異的な検出ができないことが確認された。したがって、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスの種特異的な検出にはプライマー等の配列が非常に重要であることが確認された。本発明は、無数に考えうる配列のうち、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスの種特異的な検出のための上記配列を見出したものである。
［実施例３：タラロマイセス マクロスポラス検出用のプライマー］
さらに、タラロマイセス マクロスポラス検出用として、配列番号９及び１０の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。これらのプライマーは、イソクエン酸リアーゼ遺伝子をターゲットとして作成したものである。各プライマーは、実施例１，２と同様にオペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表１２に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
さらに、タラロマイセス マクロスポラス検出用として、配列番号９及び１０の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。これらのプライマーは、イソクエン酸リアーゼ遺伝子をターゲットとして作成したものである。各プライマーは、実施例１，２と同様にオペロンバイオテクノロジー株式会社に合成依頼した。表１２に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
［実施例４：タラロマイセス トラキスペルムス検出用のプライマー］
タラロマイセス トラキスペルムス検出用として、配列番号１１及び１２の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。これらのプライマーは、イソクエン酸リアーゼ遺伝子をターゲットとして作成したものである。表１２に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
タラロマイセス トラキスペルムス検出用として、配列番号１１及び１２の塩基配列を有するＰＣＲ用のプライマー対を作成した。これらのプライマーは、イソクエン酸リアーゼ遺伝子をターゲットとして作成したものである。表１２に、作成したプライマー対の塩基配列を示す。
［試験例６］
試験例６として、実施例３及び実施例４に係るプライマー対を用いて、検体である菌からタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出できるか否か確認した。なお、試験例１と重複する部分については説明を省略する。
試験例６として、実施例３及び実施例４に係るプライマー対を用いて、検体である菌からタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出できるか否か確認した。なお、試験例１と重複する部分については説明を省略する。
（検体の調整）
まず、検体からＤＮＡを抽出し、試験例１と同様にＤＮＡ溶液を調整した。検体としては、表２及び表３に示す菌株を用いた。さらに、各菌株を、ＰＤＡ（Potato Dextrose Agar）培地等にて、約２５〜３０℃、７〜１０日間培養した。回収した菌株から、試験例１と同様に、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、１０〜５０ｎｇ／μｌの濃度のＤＮＡ溶液として調製した。
まず、検体からＤＮＡを抽出し、試験例１と同様にＤＮＡ溶液を調整した。検体としては、表２及び表３に示す菌株を用いた。さらに、各菌株を、ＰＤＡ（Potato Dextrose Agar）培地等にて、約２５〜３０℃、７〜１０日間培養した。回収した菌株から、試験例１と同様に、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは、１０〜５０ｎｇ／μｌの濃度のＤＮＡ溶液として調製した。
（ＰＣＲ法による遺伝子増幅）
続いて、調整した４５種類のＤＮＡ溶液と実施例３に係るプライマー対とをそれぞれ用いて、タラロマイセス マクロスポラス検出のためのＰＣＲを行った。同様に、調整した４５種類のＤＮＡ溶液と実施例４に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス トラキスペルムス検出のためのＰＣＲを行った。
続いて、調整した４５種類のＤＮＡ溶液と実施例３に係るプライマー対とをそれぞれ用いて、タラロマイセス マクロスポラス検出のためのＰＣＲを行った。同様に、調整した４５種類のＤＮＡ溶液と実施例４に係るプライマー対とを用いて、タラロマイセス トラキスペルムス検出のためのＰＣＲを行った。
まず、各ＰＣＲ反応液を調製した。各ＰＣＲにおいて、プライマー及びテンプレートＤＮＡ（ｔｅｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ）の塩基配列のみ異なり、ＰＣＲ反応液の組成は同一とした。表１３に、ＰＣＲ反応液の組成を示す。テンプレートＤＮＡは、「検体の調製」で調製した各ＤＮＡ溶液とした。また、実施例３に係るプライマー対において、フォワードプライマーは配列番号９の塩基配列を有するプライマー、リバースプライマーは配列番号１０の塩基配列を有するプライマーとした。実施例４に係るプライマー対において、フォワードプライマーは配列番号１１の塩基配列を有するプライマー、リバースプライマーは配列番号１２の塩基配列を有するプライマーとした。
次に、調製したＰＣＲ反応液について、サーマルサイクラーを用い、遺伝子増幅処理を行った。タラロマイセス マクロスポラスの検出における当該処理の条件は、（１）９４℃２分間の熱変性反応、（２）９４℃で３０秒の熱変性反応、（３）５３℃で３０秒のアニーリング反応、（４）６８℃で２０秒の伸長反応、（５）６８℃で５分の伸長反応とし、（２）〜（４）を３０サイクル行った。タラロマイセス トラキスペルムスの検出における当該処理の条件は、（１）９４℃２分間の熱変性反応、（２）９４℃で３０秒の熱変性反応、（３）５０℃で３０秒のアニーリング反応、（４）６８℃で３０秒の伸長反応、（５）６８℃で５分の伸長反応とし、（２）〜（４）を３０サイクル行った。
（ＰＣＲ増幅産物の確認）
続いて、ＰＣＲ反応液から５〜１０μｌを分取し、試験例１と同様に、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動後、試験例１と同様にアガロースゲルを撮像した。撮像された画像に基づいてＰＣＲ増幅産物を確認した。
続いて、ＰＣＲ反応液から５〜１０μｌを分取し、試験例１と同様に、１．３％（１〜１．５％）濃度のアガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動後、試験例１と同様にアガロースゲルを撮像した。撮像された画像に基づいてＰＣＲ増幅産物を確認した。
（結果）
図８は、実施例３の電気泳動像であり、図９は実施例４の電気泳動像である。また各図において、Ａは表２に記載の各検体の結果を示し、Ｂは表３に記載の各検体の結果を示す。なお、表２及び表３に付した各菌株の番号と、図８及び図９の電気泳動像に付した各レーンの番号とはそれぞれ対応する。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
図８は、実施例３の電気泳動像であり、図９は実施例４の電気泳動像である。また各図において、Ａは表２に記載の各検体の結果を示し、Ｂは表３に記載の各検体の結果を示す。なお、表２及び表３に付した各菌株の番号と、図８及び図９の電気泳動像に付した各レーンの番号とはそれぞれ対応する。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
まず図８に示すように、Ａの１，２番のレーン、及びＢの１，２，５，６番のレーンにのみ、３００〜４００ｂｐ程度のバンドが確認された。これらのレーンに対応する菌株は、表２を参照し、いずれもタラロマイセス マクロスポラスに属する株である。このことから、実施例３に係るプライマー対が、タラロマイセス マクロスポラスを種特異的に検出可能であることが確認された。
図９に示すように、Ａの３，４番のレーン、及びＢの３，４，７，８番のレーンにのみ、３００〜４００ｂｐ程度のバンドが確認された。これらのレーンに対応する菌株は、表３を参照し、いずれもタラロマイセス トラキスペルムスに属する株である。このことから、実施例４に係るプライマー対が、タラロマイセス トラキスペルムスを種特異的に検出可能であることが確認された。
［試験例７］
試験例７として、試験例３と同様に、実施例３及び実施例４に係るプライマー対を用いたＰＣＲにおけるタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスの検出限界を確認するため、検体から濃度の異なるＤＮＡ溶液を作成し、試験を行った。なお、検体及び検体の調整方法は試験例３と同様であり、遺伝子増幅及び確認の方法は試験例６と同様であるため、説明を省略する。
試験例７として、試験例３と同様に、実施例３及び実施例４に係るプライマー対を用いたＰＣＲにおけるタラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスの検出限界を確認するため、検体から濃度の異なるＤＮＡ溶液を作成し、試験を行った。なお、検体及び検体の調整方法は試験例３と同様であり、遺伝子増幅及び確認の方法は試験例６と同様であるため、説明を省略する。
（結果）
図１０は、試験例７の電気泳動像であり、Ａは実施例３、Ｂは実施例４の結果を示す。なお、図１０の電気泳動像に付した各レーンの番号と、表６に示す各試料の番号とはそれぞれ対応している。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
図１０は、試験例７の電気泳動像であり、Ａは実施例３、Ｂは実施例４の結果を示す。なお、図１０の電気泳動像に付した各レーンの番号と、表６に示す各試料の番号とはそれぞれ対応している。Ｍのレーンは、サイズマーカーを示す。
まず図１０Ａにおいて、試料のＤＮＡ濃度が薄くなるに従い、バンドの蛍光強度が低くなる様子が観察された。これにより、実施例３に係るプライマー対が、タラロマイセス マクロスポラスを特異的に検出可能なことが改めて確認された。加えて、ＤＮＡ濃度がそれぞれ１００ｐｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌの試料１〜３のバンドは確認でき、ＤＮＡ濃度がそれぞれ１０ｐｇ／μｌ，１ｐｇ／μｌの試料４，５のバンドは確認することができなかった。このことから、実施例３に係るプライマー対の検出限界は、検体から調製したＤＮＡ濃度にして１０〜１００ｐｇ／μｌであることが示唆された。
図１０Ｂにおいても、図１０Ａと同様の結果が得られた。すなわち、試料のＤＮＡ濃度が薄くなるに従い、バンドの蛍光強度が低くなる様子が観察された。これにより、実施例４に係るプライマー対が、タラロマイセス トラキスペルムスを特異的に検出可能なことが改めて確認された。また、ＤＮＡ濃度が１００ｐｇ／μｌ〜１０ｎｇ／μｌの試料１〜３のバンドは確認でき、ＤＮＡ濃度がそれぞれ１０ｐｇ／μｌ，１ｐｇ／μｌの試料４，５のバンドは確認することができなかった。このことから、実施例４に係るプライマー対の検出限界も、検体から調製したＤＮＡ濃度にして１０〜１００ｐｇ／μｌであることが示唆された。
試験例６及び試験例７の結果より、イソクエン酸リアーゼ遺伝子領域にハイブリダイズする実施例３及び実施例４のプライマー対によっても、タラロマイセス マクロスポラス及びタラロマイセス トラキスペルムスの種特異的な検出が可能であることが確認された。これは、本発明者らが数ある遺伝子領域のうちから上記遺伝子領域を探索し、さらに種特異的にハイブリダイズする上記プライマー対を見出したことによるものである。
Claims (11)
- タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列 - タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、
タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｈ）配列番号４に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列 - タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、
タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（Ｍ）配列番号９に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列 - タラロマイセス属に属する種の検出に用いられるプライマー対であって、
タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｐ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（Ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列 - タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、又はタラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対若しくは下記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｐ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対。
（ｅ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列
（ｇ）配列番号３に記載の塩基配列
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列
（ｍ）配列番号９に記載の塩基配列
（ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列
（ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列
（ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列 - タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を含む
タラロマイセス属に属する種の検出用キット。
（Ｅ）配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｆ）配列番号２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列 - タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を含む
タラロマイセス属に属する種の検出用キット。
（Ｇ）配列番号３に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｈ）配列番号４に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列 - タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を含む
タラロマイセス属に属する種の検出用キット。
（Ｍ）配列番号９に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列
（Ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス マクロスポラスの検出が可能な塩基配列 - タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（Ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（Ｐ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を含む
タラロマイセス属に属する種の検出用キット。
（Ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列
（Ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列、又は当該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されておりかつタラロマイセス トラキスペルムスの検出が可能な塩基配列 - タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｅ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び前記（ｆ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、タラロマイセス マクロスポラスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｍ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｎ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、タラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｇ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｈ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対、並びにタラロマイセス トラキスペルムスをＰＣＲ法により検出する場合に用いられる下記（ｏ）の塩基配列で表されたオリゴヌクレオチド及び下記（ｐ）の塩基配列でそれぞれ表されたオリゴヌクレオチドからなるプライマー対のうちの少なくとも一つのプライマー対を含む
タラロマイセス属に属する種の検出用キット。
（ｅ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列
（ｇ）配列番号３に記載の塩基配列
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列
（ｍ）配列番号９に記載の塩基配列
（ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列
（ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列
（ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列 - タラロマイセス マクロスポラスを検出する場合は下記（ｅ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び下記（ｆ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに下記（ｍ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び下記（ｎ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含み、タラロマイセス トラキスペルムスを検出する場合は下記（ｇ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び下記（ｈ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップ、並びに下記（ｏ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド及び下記（ｐ）の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドをプライマー対としてＰＣＲを行うステップのうち少なくとも一方のステップを含むことを特徴とする
タラロマイセス属に属する種の検出方法。
（ｅ）配列番号１に記載の塩基配列
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列
（ｇ）配列番号３に記載の塩基配列
（ｈ）配列番号４に記載の塩基配列
（ｍ）配列番号９に記載の塩基配列
（ｎ）配列番号１０に記載の塩基配列
（ｏ）配列番号１１に記載の塩基配列
（ｐ）配列番号１２に記載の塩基配列
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