JP6399874B2 - 化合物の抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する方法 - Google Patents

Description

本発明は、化合物の抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する方法に関するものである。本発明は、より詳細には、細胞におけるα４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用の阻害度を指標として細胞接着抑制剤または細胞浸潤抑制剤の抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する方法に関するものである。

炎症反応においては、好中球やリンパ球等に代表される白血球の浸潤像が炎症部位に認められる。白血球の浸潤とは、好中球やリンパ球等の白血球が、サイトカイン、ケモカイン、リピッド及び補体等によって惹起され活性化することにより、ＩＬ−１やＴＮＦαなどのサイトカインにより活性化した血管内皮細胞とローリング（ｒｏ１１ｉｎｇ）又はテターリング（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）と呼ばれる相互作用を行い、血管内皮細胞と接着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）した後、血管外及び周辺組織に遊走することである。

以下に記すように、様々な炎症性疾患及び自己免疫疾患と白血球の接着または浸潤との関連性が報告されている。これらのことからも細胞接着抑制または細胞浸潤抑制作用を有する化合物がそれらの治療または予防剤となりうることが期待できる。
（１）炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病など）の治療または予防剤（非特許文献１，２，３参照）
（２）過敏性腸症候群の治療または予防剤（非特許文献４参照）
（３）リウマチ関節炎の治療または予防剤（非特許文献５参照）
（４）乾癬の治療または予防剤（非特許文献６参照）
（５）多発性硬化症の治療または予防剤（非特許文献７参照）
（６）喘息の治療または予防剤（非特許文献８参照）
（７）アトピー性皮膚炎の治療または予防剤（非特許文献９参照）

細胞接着抑制剤または細胞浸潤抑制剤として、下記の化合物に代表される１，２−ジ（環式基）置換ベンゼン化合物が知られている（特許文献１、特許文献２参照)。

化合物Ａ：１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン 塩酸塩
化合物Ｂ：１−シクロプロピルメチル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル]ピペラジン メタンスルホン酸塩

これらの化合物は、１）αインテグリンの共通保存配列であるＫＸＧＦＦＫＲとカルレティキュリンを用いたｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ系、および２）ＮＭＲ解析により、カルレティキュリンを標的分子とし、インテグリン−カルレティキュリン細胞内相互作用を阻害することにより、リンパ球および好中球双方の細胞接着・浸潤を抑制し、炎症性腸疾患などの動物モデルにおいて薬効を示すことが明らかとなった（非特許文献１０参照）。

ところで、細胞接着抑制剤または細胞浸潤抑制剤の効果を投与前に予測すること、細胞接着抑制剤または細胞浸潤抑制剤の効果のある濃度を決定すること、細胞接着抑制剤または細胞浸潤抑制剤の投与スケジュールを決定すること、細胞接着抑制剤または細胞浸潤抑制剤の効果のある患者を選択することは、細胞接着抑制剤または細胞浸潤抑制剤を用いた治療を効率よく進め、患者のＱＯＬ向上に貢献するために、非常に有用である。また、細胞接着抑制剤または細胞浸潤抑制剤の効果を投与前に予測することは、治療を受ける患者にとって無効な薬剤の投与の回避、副作用の軽減などを可能とするために、非常に有益であり、かつ重要事項である。しかしながら、細胞接着抑制剤または細胞浸潤抑制剤の効果を投与前に予測する方法等については、有効な方法は、未だ見つかっていない。

国際公開第２００５／０６３７０５号 国際公開第２００６／０６８０５８号

ＩｎｆＩａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４７：４１７−４２９（２００２）） Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｅ Ｃｒｏｈｎ‘ｓ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４８：２４−３２（２００３）） 潰瘍性大腸炎の活動期における顆粒球吸着療法（日本アフェレシス学会雑誌１８：１１７−１３１（１９９９）） Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｒｒｉｔａｂ１ｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（Ｇｕｔ．，５１：ｉ４１−ｉ４４（２００２）） Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３６：３７２−３７８（２００４）） Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ（Ｌａｎｃｅｔ，３６１：１１９７−１２０４（２００３）） Ｎｅｗ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｐｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｌｏｌｏｇｙ，２：５６３−５６６（２００３）） Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｓｔｈｍａ（Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ１．，１１１：４５０−４６３（２００３）） Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｓｋｉｎ（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏ１．，１２１：９５１−９６２（２００３）） 大黒理勝 学位論文 カルレティキュリンインテグリン相互作用抑制に基づく新規炎症性腸疾患治療剤Ｅ６００７の創出 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｕｌｉｐｓ．ｔｓｕｋｕｂａ．ａｃ．ｊｐ／ｄｓｐａｃｅ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／２２４１／１０６１９４／１／Ａ５３８３．ｐｄｆ

本発明の課題は、細胞接着抑制剤および細胞浸潤抑制剤である、化合物ＡおよびＢの抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する方法を提供することにある。

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、白血球の接着および浸潤に起因する種々の炎症性疾患及び自己免疫疾患において、α４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用を簡便に検出できる新たな細胞アッセイ系を構築することで、細胞接着抑制剤および細胞浸潤抑制剤である、化合物ＡおよびＢの抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する方法を見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の［１］〜［１６］を提供する。
［１］化合物の抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する方法であって、患者由来の細胞における、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する工程と、測定された阻害度を指標として、化合物に対する患者の感受性を判断する工程と、患者の感受性を指標として、化合物の抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する工程と、を含み、化合物は下記の化合物ＡまたはＢであり、患者は炎症性疾患もしくは自己免疫疾患に罹患している、または罹患していると疑われるものである、方法。

化合物Ａ：１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン 塩酸塩
化合物Ｂ：１−シクロプロピルメチル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル]ピペラジン メタンスルホン酸塩
［２］相互作用の阻害度の測定方法が、Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法（以下、ＰＬＡ法と略す）である、［１］記載の方法。
［３］Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法において、一次抗体として異種動物から得られた、抗ヒトインテグリン抗体と抗ヒトカルレティキュリン抗体を使用する、［２］記載の方法。
［４］ＰＬＡ法において、一次抗体として抗ヒトインテグリンウサギ抗体と抗ヒトカルレティキュリンマウス抗体を使用する、［３］記載の方法。
［５］化合物が化合物Ａである、［１］〜［４］のいずれか記載の方法。
［６］化合物が化合物Ｂである、［１］〜［４］のいずれか記載の方法。
［７］細胞が白血球である、［１］〜［６］のいずれか記載の方法。
［８］細胞が、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、リウマチ関節炎、乾癬、多発性硬化症、喘息またはアトピー性皮膚炎の患者由来の白血球である、［１］〜［６］のいずれか記載の方法。
［９］細胞が、炎症性腸疾患の患者由来の白血球である、［１］〜［６］のいずれか記載の方法。
［１０］細胞が、潰瘍性大腸炎、クローン病の患者由来の白血球である、［１］〜［６］のいずれか記載の方法。
［１１］α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する工程の前に、赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を得る工程であって、患者から採取された全血を溶血処理し、白血球を固定化し、遠心操作により白血球画分を単離する工程を含む、［７］〜［１０］のいずれか記載の方法。
［１２］α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する工程の前に剥離防止処理されたスライドガラス上に赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を塗布した塗沫標本を作製する工程を含む、［１１］記載の方法。
［１３］炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、リウマチ関節炎、乾癬、多発性硬化症、喘息またはアトピー性皮膚炎に罹患している患者の化合物に対する感受性の検査の指標とするために、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する方法であって、患者由来の白血球におけるα４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度をＰｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法で測定する工程を含み、化合物は下記の化合物ＡまたはＢである、方法。

化合物Ａ：１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン 塩酸塩
化合物Ｂ：１−シクロプロピルメチル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル]ピペラジン メタンスルホン酸塩
［１４］患者が炎症性腸疾患に罹患している患者である［１３］記載の方法。
［１５］α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度をＰｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法で測定する工程の前に、赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を得る工程であって、患者から採取された全血を溶血処理し、白血球を固定化し、遠心操作により白血球画分を単離する工程を含む、［１３］または［１４］記載の方法。
［１６］α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度をＰｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法で測定する工程の前に、剥離防止処理されたスライドガラス上に赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を塗布した塗沫標本を作製する工程を含む、［１５］記載の方法。

本発明は、さらに、以下の［Ｐ１］〜［Ｐ１１］及び［Ｐ１２’］〜［Ｐ１３’］を提供する。
［Ｐ１］化合物が抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い患者を選択する方法であって、患者由来の細胞における、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する工程と、測定された阻害度を指標として化合物に対する患者の感受性を判断する工程と、患者の感受性を指標として、化合物が抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い患者として選択する工程を含み、化合物は下記の化合物ＡまたはＢであり、患者は炎症性疾患もしくは自己免疫疾患に罹患している、または罹患していると疑われるものである、方法。

化合物Ａ：１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン 塩酸塩
化合物Ｂ：１−シクロプロピルメチル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル]ピペラジン メタンスルホン酸塩
［Ｐ２］患者に対して抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い化合物の投与量を決定する方法であって、患者由来の細胞における、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物阻害度を測定する工程と、測定された阻害度を指標として、化合物に対する患者の感受性を判断する工程と、患者の感受性を指標として、患者に対して抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い化合物の投与量を決定する工程と、を含み、化合物は下記の化合物ＡまたはＢであり、患者は炎症性疾患もしくは自己免疫疾患に罹患している、または罹患していると疑われるものである、方法。

化合物Ａ：１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン 塩酸塩
化合物Ｂ：１−シクロプロピルメチル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル]ピペラジン メタンスルホン酸塩。
［Ｐ３］患者に対して抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い化合物の投与スケジュールを決定する方法であって、患者由来の細胞における、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する工程と、測定された阻害度を指標として、化合物に対する患者の感受性を判断する工程と、患者の感受性を指標として、患者に対して抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い化合物の投与スケジュールを決定する工程と、を含み、化合物は下記の化合物ＡまたはＢであり、患者は炎症性疾患もしくは自己免疫疾患に罹患している、または罹患していると疑われるものである、方法。

化合物Ａ：１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン 塩酸塩
化合物Ｂ：１−シクロプロピルメチル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル]ピペラジン メタンスルホン酸塩。
［Ｐ４］相互作用の阻害度の測定方法が、Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法（以下、ＰＬＡ法と略す）である、［Ｐ１］〜［Ｐ３］のいずれか記載の方法。
［Ｐ５］ＰＬＡ法において、一次抗体として異種動物から得られた、抗ヒトインテグリン抗体と抗ヒトカルレティキュリン抗体を、好ましくは、一次抗体として抗ヒトインテグリンウサギ抗体と抗ヒトカルレティキュリンマウス抗体を使用する、［Ｐ４］記載の方法。
［Ｐ６］化合物が化合物Ａである、［Ｐ１］〜［Ｐ５］のいずれか記載の方法。
［Ｐ７］化合物が化合物Ｂである、［Ｐ１］〜［Ｐ５］のいずれか記載の方法。
［Ｐ８］細胞が白血球である、［Ｐ１］〜［Ｐ７］のいずれか記載の方法。
［Ｐ９］細胞が、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、リウマチ関節炎、乾癬、多発性硬化症、喘息またはアトピー性皮膚炎の患者由来の白血球である、［Ｐ１］〜［Ｐ７］のいずれか記載の方法。
［Ｐ１０］細胞が、炎症性腸疾患の患者由来の白血球である、［Ｐ１］〜［Ｐ７］のいずれか記載の方法。
［Ｐ１１］細胞が、潰瘍性大腸炎、クローン病の患者由来の白血球である、［Ｐ１］〜［Ｐ７］のいずれか記載の方法。
［Ｐ１２’］α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する工程の前に、赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を得る工程であって、患者から採取された全血を溶血処理し、白血球を固定化し、遠心操作により白血球画分を単離する工程を含む、［Ｐ８］〜［Ｐ１１］のいずれか記載の方法。
［Ｐ１３’］α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する工程の前に剥離防止処理されたスライドガラス上に赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を塗布した塗沫標本を作製する工程を含む、［Ｐ１２’］記載の方法。

ＰＬＡ法を用いた、α４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用を簡便に検出できる細胞アッセイ系を新たに構築することにより、化合物の抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する方法、化合物が抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い患者を選択する方法、患者に対して抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い化合物の投与量を決定する方法、患者に対して抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い化合物の投与スケジュールを決定する方法を確立した。

インサイチューＰＬＡ（ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ）を組み合わせた免疫蛍光共焦点顕微鏡観察の結果を表す図である。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を用いて対比染色した（青；上段）。Ｊｕｒｋａｔ細胞内における、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの物理的な相互作用を非常に特異性高く検出することができる（赤色；上段及び中段）。化合物Ａは、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用を阻害する一方、化合物Ｃは、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用を阻害しなかった。スケールバーは、１０μｍ。化合物Ａ：１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン。化合物Ｃ：１−シクロプロピルメチル−４−フェニルピペラジン 塩酸塩。 インサイチューＰＬＡ（ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ）を組み合わせた共焦点レーザースキャン顕微鏡観察の結果を表す図である。核は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて対比染色した（青）。ヒト末梢血白血球における、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの物理的な相互作用を非常に特異性高く検出することができる（赤色）。化合物Ａは、ＰＭＡ刺激により亢進するα４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用を阻害する。 インサイチューＰＬＡ（ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ）を組み合わせた共焦点レーザースキャン顕微鏡観察の画像を画像解析ソフトにより解析した結果を表すグラフである。化合物Ａは、ＰＭＡ刺激により亢進するα４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用を阻害する。

α４−インテグリンおよびカルレティキュリン
本発明で用いるα４−インテグリンは、インテグリンファミリーの一つである。インテグリンは細胞膜貫通受容体タンパク質で細胞接着因子の一つである。本受容体は、α鎖とβ鎖が１：１のヘテロ２量体を形成する。現在、α鎖１８種類、β鎖８種類が同定されている。α４インテグリンは、β１あるいはβ７と対となり、細胞接着因子ＶＣＡＭ−１と結合することが知られている。

本発明で用いるカルレティキュリンは、Ｃａ^２＋イオンを中和したり、新規に合成されたタンパク質や糖タンパク質のフォールディングに関与したりするタンパク質である。

本発明で用いるα４−インテグリンおよびカルレティキュリンは、相互作用することで細胞、特に白血球が刺激され、白血球の浸潤が促進され、ひいては炎症が惹起される。従って、α４−インテグリンおよびカルレティキュリンの相互作用を抑制すれば、白血球が刺激されることがなく、白血球の浸潤が抑制され、ひいては炎症が抑制されると考えられる。

細胞
本発明で用いる細胞は、α４−インテグリンおよびカルレティキュリンの相互作用が測定できる細胞であれば特に限定されないが、好ましくは白血球である。より好ましくは、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎またはクローン病）、過敏性腸症候群、リウマチ関節炎、乾癬、多発性硬化症、喘息またはアトピー性皮膚炎の患者由来の白血球である。

α４−インテグリンおよびカルレティキュリンの相互作用およびその阻害度の測定方法
細胞接着抑制または細胞浸潤抑制作用を有する化合物ＡまたはＢを投与したのち、α４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用抑制に基づく、それらの抗炎症効果または免疫抑制効果を確認する方法としてはいくつかのアッセイ方法が考えられる。例えば、１）特許文献１の試験例１に記載された、固相化されたヒトフィブロネクチンに単離された白血球をホルボールミリスチン酸酢酸（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ 以下ＰＭＡと略す）存在下添加し、細胞内の酵素活性に基づく吸光度変化から接着細胞数を測定する方法、２）特許文献１の試験例２に記載された単離された末梢血好中球を蛍光標識し、固相化されたヒト内皮細胞に、ＰＭＡ存在下添加し、その蛍光強度から接着細胞数を測定する方法、３）電気泳動によってタンパク質を分離し膜に転写後、標的タンパク質に対する抗体で検出するウエスタンブロッティング法、４）標的タンパク質と抗体とが特異的に結合し、不溶化して沈殿する反応を利用し標的タンパク質を検出する免疫沈降法、５）免疫沈降法によって、標的タンパク質と相互作用する別のタンパク質との複合体を回収、測定する共免疫沈降法、６）さらに共免疫沈降法の応用として、タグ付き標的タンパク質を用い、タグと担体との結合を利用して複合体を回収するプルダウン法、７）生きた細胞内でのタンパク質間相互作用を調べるため、標的タンパク質をそれぞれ異なる蛍光タンパク質（主に、シアン色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）に連結した融合タンパク質を細胞に発現させ、近接した蛍光分子間の励起エネルギーの移動を利用する蛍光共鳴エネルギー移動法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｔｈｏｄ：以下ＦＲＥＴ法と略す）、そして８）Ｄｕｏｌｉｎｋ ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ^ＴＭ（Ｏｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 登録商標）法により２種類のタンパク質の相互作用のシグナルを増幅して検出する方法などがある。

上記、１）ないし７）記載の測定方法について、α４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用を簡便に検出できる細胞アッセイ系の構築を試みた。
１）および２）については、全血を使用した場合、全血に占める白血球の割合が少ないため、アッセイ系の構築には至らなかった。３）、４）、５）および６）は、いずれも細胞抽出物を用いたアッセイ法である。うち、３）、４）および５）については、タンパク質間、すなわちα４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用が弱く、またα４−インテグリンに結合しているカルレティキュリンの量が少ないせいか、アッセイ系の構築には至らなかった。６）については、カルレティキュリンの量を増やすことにより、α４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用を検出することはできたが、手技的に全血を用いたアッセイには適さないものと思われる。７）については、採取した血液から白血球を単離するために多段階かつ時間を要し、採血直後の細胞の状況を正確に反映できないおそれがある。即ち、上記１）ないし７）記載の測定方法では、α４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用抑制に基づくアッセイ系の構築には好ましくない方法であることが分かった。

そこで、ＰＬＡ法を用い、種々条件検討することにより、内在性のα４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用を細胞レベルで可視化することに成功した。このことは、全血を用いてその相互作用を検出できる可能性を示唆している。本アッセイ系を用いることにより、炎症性腸疾患などの患者の重症度のレベリングや細胞接着抑制または細胞浸潤抑制作用を有する化合物ＡまたはＢの効きやすい患者の選別、あるいは化合物ＡまたはＢの投与量や投与間隔（投与スケジュール）の予測が期待できる。すなわち、本発明者等は、種々のアッセイ系の中からＰＬＡ法がα４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用抑制に基づく、それらの抗炎症効果または免疫抑制効果を確認する方法として好ましい方法であることを見出した。

ＰＬＡ法は、Ｏｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社が開発した、１分子レベルでの標的タンパク質を特異的に検出する増感技術である（http://www.sigmaaldrich.com/japan/lifescience/proteomics/duolink.html）。ＰＬＡ法を用い、α４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用を検出する新たな細胞アッセイ系の構築を、下記の４つの工程において説明する。

なお、本発明においては、浮遊細胞である白血球をタイプＩコラーゲンでコートしたディッシュに貼り付けることにより、測定を行う。

１）一次抗体と二次抗体の結合
サンプル（白血球の接着したディッシュ）を、ウシ胎児血清を用いてブロッキングした後、標的タンパク質、すなわちα４−インテグリンおよびカルレティキュリンを、それぞれを特異的に認識する免疫動物の異なる一次抗体をサンプルとインキュベーションする。すなわち、相互作用する、α４−インテグリンおよびカルレティキュリンの２種類のタンパク質それぞれに対する一次抗体を作用させる。α４−インテグリンおよびカルレティキュリンはヒトα４−インテグリンおよびヒトカルレティキュリンであることが好ましい。また、α４−インテグリンおよびカルレティキュリンは、それぞれ全長またはそのフラグメントを用いることができる。あるいは、α４−インテグリンおよびカルレティキュリンのアミノ酸配列に基づき合成したものを用いることができる。また、α４−インテグリンおよびカルレティキュリンに対する一次抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも良いが、モノクローナル抗体が好ましい。これらの抗体は、α４−インテグリンおよびカルレティキュリンをそれぞれマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギあるいはウシ等の哺乳動物に免疫して得ることができる。必要に応じて遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノクローナル抗体、ヒト型モノクローナル抗体およびヒト抗体であってもよい。ただし、ヒトα４−インテグリンおよびヒトカルレティキュリンに対する免疫動物は異なっている必要がある。好ましくは、α４−インテグリンにはウサギの一次抗体を、カルレティキュリンにはマウスの一次抗体を、それぞれ作用させる。
次に、一次抗体の種類に応じた二次抗体のセットを作用させる。二次抗体は核酸で修飾されており、２種類の二次抗体が近接した場合に、修飾核酸がライゲーション反応を起こし、環状構造が形成されるよう設計されている。このような二次抗体として、デユオリンク インサイチュー ＰＬＡ プローブを利用することが可能である。より具体的には、一次抗体として、α４−インテグリンにウサギ抗体を、カルレティキュリンにマウス抗体を利用する場合、二次抗体として、デユオリンク インサイチュー ＰＬＡ プローブ ウサギ ＰＬＵＳ（Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ^ＴＭ（Ｏｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 登録商標） ｐｒｏｂｅ Ｒａｂｂｉｔ ＰＬＵＳ）およびデユオリンク インサイチュー ＰＬＡ プローブ マウス ＭＩＮＵＳ（Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕ ＰＬＡ^ＴＭ（Ｏｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 登録商標） ｐｒｏｂｅ Ｍｏｕｓｅ ＭＩＮＵＳ）を利用することができる。

２）ＰＬＡプローブのハイブリダイズとライゲーション反応
サンプルに、リガーゼおよび２種類のオリゴヌクレオチドプローブを添加し、インキュベーションすることで、二次抗体の修飾核酸に環状構造を形成させる。α４−インテグリンおよびカルレティキュリンが相互作用して複合体を形成すると、二次抗体同士が近接（約４０ｎｍ）するため、ライゲーション反応が生じ、環状構造が形成される。一方、α４−インテグリンおよびカルレティキュリンの相互作用が阻害され複合体が形成されない場合は、二次抗体同士が近接しないため、ライゲーション反応が生じない。インキュベーションの条件は、特に限定されないが、好ましくは、３０〜４０℃で１０〜６０分、より好ましくは、３７℃で３０分である。

３）伸長反応と標識プローブのハイブリダイズ
次に、サンプルに、ポリメラーゼおよび蛍光標識したオリゴヌクレオチドプローブを添加し、インキュベーションすることで、環状構造に沿って一本鎖の核酸が伸長される（ローリングサークル型増幅法；ＲＣＡ法）。伸長させる核酸すなわち二次抗体を修飾する核酸には、特定のリピート配列が組み込まれるようになっており、蛍光標識したオリゴヌクレオチドは、リピート配列に対してハイブリダイズするよう設計されている。インキュベーションの条件は、特に限定されないが、好ましくは、３０〜４０℃で６０〜１８０分、より好ましくは、３７℃で１２０分である。

４）封入剤処理と解析
サンプルを封入剤で処理した後、蛍光顕微鏡、好ましくは共焦点顕微鏡でカルレティキュリンとα４−インテグリンとの相互作用を解析する。この際、核染色のため、ＤＡＰＩ染色またはヘキスト染色を行ってもよい。Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩを用いることが可能である。

α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物ＡまたはＢの阻害度
上記ＰＬＡ法を用いた、細胞におけるα４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物ＡまたはＢの阻害度は、蛍光顕微鏡（好ましくは共焦点顕微鏡）を用いて測定することができる。上記ＰＬＡ法では、相互作用の強弱は蛍光強度の強弱として表される。したがって、化合物ＡまたはＢの添加により低下した蛍光強度の割合を、相互作用に対する化合物ＡまたはＢの阻害度として表すことができる。例えば、相互作用の阻害度が、好ましくは１０％以上、更に好ましくは３０％以上、より好ましくは５０以上、特に好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上である場合、患者を高感受性であると判断し得る。

予測または決定する方法
炎症性腸疾患（特に潰瘍性大腸炎もしくはクローン病)、過敏性腸症候群、リウマチ関節炎、乾癬、多発性硬化症、喘息、アトピー性皮膚炎などの白血球の接着および浸潤に起因する種々の炎症性疾患及び自己免疫疾患を有するまたは疑われる患者に、化合物ＡまたはＢを投与したのち、経時的に採血を行う。その後、ＰＬＡ法により、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する阻害を確認しその程度を測定するとともに、各疾患における、化合物ＡまたはＢに対する感受性を予測することが可能である。化合物ＡまたはＢに高感受性であると判断されれば、これらの化合物を投与することは、種々の炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に有効であると予測することができる。化合物ＡまたはＢに低感受性であると判断されれば、これらの化合物を投与することは、種々の炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に好ましくないと予測することができる。

また、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物ＡまたはＢの阻害度を測定し、その阻害度を指標にすることで化合物ＡまたはＢが抗炎症効果または免疫抑制効果を示す可能性が高い患者を選択することができる。化合物ＡまたはＢに高感受性であると判断されれば、これらの化合物を投与することは、種々の炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に有効であると予測することができる。化合物ＡまたはＢに低感受性であると判断されれば、これらの化合物を投与することは、種々の炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に好ましくないと予測することができる。

また、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物ＡまたはＢの阻害度を測定し、その阻害度を指標にすることで化合物ＡまたはＢの投与量を決定することができる。阻害度が十分であると判断されれば、化合物ＡまたはＢの投与量は満たされていると判断することができる。阻害度が十分でないと判断されれば、化合物ＡまたはＢの投与量を増加することが好ましいと判断することができる。

さらに、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物ＡまたはＢの阻害度を測定し、その阻害度を指標にすることで化合物ＡまたはＢの投与間隔（投与スケジュール）を決定することができる。阻害度が十分であると判断されている期間であれば、化合物ＡまたはＢの投与間隔を維持してもよいと判断することができる。阻害度が十分でないと判断された期間であれば、化合物ＡまたはＢの投与間隔を短くすることが好ましいと判断することができる。なお、各判断する工程においては、医師による診断行為を除くことが好ましい。

化合物ＡおよびＢ
化合物Ａ（１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン 塩酸塩）および化合物Ｂ（１−シクロプロピルメチル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル]ピペラジン メタンスルホン酸塩）については、それぞれ国際公開第２００５／０６３７０５号の実施例３１、および国際公開第２００６／０６８０５８号の実施例１記載の合成方法により入手できる。

白血球画分の塗沫標本の作製
患者由来の細胞として白血球を利用する場合、患者から採取された全血を溶血処理し、白血球を固定化し、遠心操作により白血球画分を単離し、単離した白血球画分を用いて塗沫標本を作製することが好ましい。全血の塗沫標本を作製後に固定化処理すると、白血球がスライドグラスから剥落しやすくなるからである。また、全血から白血球を単離する場合、密度勾配遠心法を利用する方法が一般的であるが、密度勾配遠心法は白血球の単離に数時間を要する。インテグリンの活性化は一過性の現象であることが広く知られており、採血から数時間かけて単離した白血球では、患者体内におけるインテグリンの状態を正確に反映されない可能性がある。そこで、より短時間で白血球を単離する方法として、全血を溶血処理し、白血球を固定化し、遠心操作により白血球画分を単離する方法が好ましい。この方法に適した市販の試薬として、例えば、１−ｓｔｅｐ Ｆｉｘ／Ｌｙｓｅ溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｌｙｓｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）、ＩｎｔｒａＰｒｅｐ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社登録商標）、ＷＢＬｙｓｅ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が挙げられ、中でも１−ｓｔｅｐ Ｆｉｘ／Ｌｙｓｅ溶液が好ましい。より具体的には、採取直後の全血１ｍＬに、１ｘ１−ｓｔｅｐ Ｆｉｘ／Ｌｙｓｅ溶液（１％パラホルムアルデヒド（以下、ＰＦＡと略す）含有）を１０ｍＬ添加し、４℃で２４時間保存後に遠心操作（５００×ｇ、５分）することで，赤血球画分を含まない固定化処理された白血球画分を単離することが可能である。

こうして得られた白血球画分は、剥離防止処理されたスライドグラス上に塗布し、塗沫標本を作製することが好ましい。剥離防止処理されていないスライドグラスを用いて塗沫標本を作製すると、白血球がスライドグラスから剥落しやすくなるからである。剥離防止処理されたスライドグラスとしては、例えば、松浪硝子工業（株）製の剥離防止用スライドグラス（ＭＡＳ−ＧＰ ｔｙｐｅＡ コートおよびフロンティアコート）が塗抹標本の支持能に優れており、白血球が剥落しにくい強固な塗抹標本を作製できる。塗沫標本の作製方法は特に限定されず、引きガラス法（ウエッジ法）、クラッシュ法（押し潰し法）、手伸ばし法、フィルター法及び自動遠心塗沫法（サイトスピン法、オートスメア法など）が挙げられ、好ましくは自動遠心塗沫法である。

細胞膜透過処理
次に、塗抹標本中の白血球を、界面活性剤などの細胞膜透過処理剤で処理を行い、抗体等のＰＬＡ法に必要な試薬が白血球の細胞内に入りやすくする。細胞膜透過処理剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ^ＴＭ ２０、サポニン、ジギトニン、ロイコパーム（Ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ^ＴＭ ＡｂＤ社 登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ^ＴＭ Ｘ−１００、ＮＰ−４０が挙げられ、好ましくはＴｒｉｔｏｎ^ＴＭ Ｘ−１００である。より具体的には、１００％エタノール（室温 １０分）、１００％メタノール（室温 １０分）及び０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ^ＴＭ Ｘ−１００（室温 ２０分）の各溶液で順次、白血球の細胞膜透過処理を行う。
引き続き、抗カルレティキュリン抗体及び抗α４インテグリン抗体を添加し、ＰＬＡ法を実施する。ＰＬＡ法に使用できる市販の試薬として、Ｄｕｏｌｉｎｋ ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ^ＴＭ（Ｏｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 登録商標）及びＤｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ ｓｉｔｕ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ^ＴＭ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）が挙げられる。ＰＬＡ法によるα４−インテグリン−カルレティキュリン相互作用を検出するアッセイ系は上述の通りである。

以下に実施例を掲げて詳細に説明するが、本発明は、これに限定されない。

化合物Ａ（１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン）は、国際公開第２００５／０６３７０５号の実施例３１の記載の方法に従って合成した。化合物Ｃ（１−シクロプロピルメチル−４−フェニルピペラジン 塩酸塩）は、下記の方法で合成した。化合物Ａは国際公開第２００５／０６３７０５号に記載されている通り、細胞接着抑制または細胞浸潤抑制作用を有するが、化合物Ｃはそのような作用を有しない。

１−（シクロプロピルメチル）−４−フェニルピペラジン 塩酸塩

１−フェニルピペラジン（３００ｍｇ，１．８５ｍｍｏＬ）、シクロプロパンカルボキサアルデヒド（１９５ｍｇ，２．７８ｍｍｏＬ）、および酢酸（０．１ｍＬ）をテトラヒドロフラン（７ｍＬ）に溶解した。この混合溶液に、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（１．１８ｇ，５．５５ｍｍｏＬ）を攪拌下に加えた。室温で２時間攪拌した後に、炭酸カリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。この有機層を濃縮し、得られた残渣をＮＨ−シリカゲルで精製（ヘプタン−酢酸エチル）することにより、１−（シクロプロピルメチル）−４−フェニルピペラジン３９４ｍｇを得た（収率９８％）。
なお、ＮＨ−シリカゲルは、プロピルアミンコーティングが施された富士シリシア化学社製のＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ−ＮＨシリカゲルをいう。
^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：０．１２−０．１６（ｍ，２Ｈ），０．５２−０．５７（ｍ，２Ｈ），０．８７−０．９５（ｍ，１Ｈ），２．３２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．６９−２．７１（ｍ，４Ｈ），３．２２−３．２５（ｍ，４Ｈ），６．８３−６．８７（ｍ，１Ｈ），６．９２−６．９６（ｍ，２Ｈ），７．２４−７．２９（ｍ，２Ｈ）．
１−（シクロプロピルメチル）−４−フェニルピペラジン（３９４ｍｇ）を酢酸エチルに溶解し、４Ｎ−塩化水素 酢酸エチル溶液（０．４６３ｍＬ，１．８５ｍｍｏＬ）を加えた。これにヘプタンを加え、生成した固体をろ別し、真空乾燥することで、１−（シクロプロピルメチル）−４−フェニルピペラジン 塩酸塩４３７ｍｇを得た（収率９３％）。
ＭＳ ｍ／ｅ（ＥＳＩ）２１７（ＭＨ^＋）．

（実施例１）
Ｄｕｏｌｉｎｋ ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＬＡ ^ＴＭ （Ｏｌｉｎｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社 登録商標）を用いたα４−インテグリンとカルレティキュリンの細胞内相互作用の検出および化合物ＡまたはＣによるその阻害の検出

実施例（１ａ）一次抗体の結合
０．３ｍｇ／ｍＬコラーゲン(ＴｙｐｅＩ−Ｃ、新田ゼラチン社製)でコーティングした３５ｍｍφガラスボトムディッシュ（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に、１０％非働化牛胎児血清（テルモ社製）、２％（ｗ／ｖ）Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン−１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＷＡＫＯ社製)に懸濁したＪｕｒｋａｔ細胞を１ｘ１０^６個/ｗｅｌｌになるよう２ｍＬ／ｗｅｌｌ添加した。これに直ちに、１００％エタノール（ＷＡＫＯ社製）で２ｍＭに希釈した化合物ＡまたはＣを５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、続いてジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ社製）で調製した２０μｇ／ｍＬ ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を１μＬ／ｗｅｌｌ添加後、ディッシュを３７℃で１２時間、５％ＣＯ_２インキュベーター内で保温した。保温後、ディッシュから上清を除去し、２ｍＬのＨａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以下ＨＢＳＳと略す。ＧＩＢＣＯ社製）で３回洗浄し、そこへ３．７％ホルムアルデヒド水溶液（ＷＡＫＯ社製）を含むＨＢＳＳを２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３０分間固定した。固定後、２ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ^ＴＭ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＨＢＳＳを２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で５分間透過処理した。２ｍＬのＨＢＳＳで３回洗浄し、そこへ氷冷した１００％のメタノール（ＷＡＫＯ社製）を１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加して、−２０℃で１０分間固定した。固定後、ディッシュから上清を除去し、２ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄し、これに３％牛胎児血清（ＢＳＡ、ＷＡＫＯ社製）を含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ ｔｗｅｅｎ２０（以下ＴＢＳＴと略す。Ｓｉｇｍａ社製）を２ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間保温した。ディッシュから上清を除去後、２ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄し、０．３％ＢＳＡ／ＴＢＳＴで２μｇ／ｍＬと４μｇ／ｍＬにそれぞれ希釈した抗ヒトα４−インテグリンウサギ抗体（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）と抗ヒトカルレティキュリンマウス抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ社製）を７０μＬ／ｗｅｌｌ添加して、４℃で１晩静置させた。

実施例（１ｂ）ＰＬＡプローブへの二次抗体の結合
翌日、ディッシュから上清を除去し、２ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄した。そこへ、マウスＭＩＮＵＳ（１／５量）、ウサギＰＬＵＳ（１／５量）、１／１０ ｂｌｏｃｋ Ｂ（３／５量）の割合で混合したＰＬＡ液を７０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で２時間乾燥しないようインキュベーターで保温した。

実施例（１ｃ）ＰＬＡプローブのハイブリタイズ反応
保温後、ディッシュから上清を除去し、２ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄後、ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを７０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１５分間インキュベーターで静置させた。

実施例（１ｄ）ＰＬＡプローブのライゲーション反応
保温後、ディッシュから上清を除去し、２ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄した。そこへ、１／４０量のリガーゼを含むライゲーション緩衝液（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を７０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃にて１５分間インキュベーターで静置させた。

実施例（１ｅ）伸長反応と標識プローブのハイブリタイズ
保温後、そこへ１／８０量のポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を含むアンプリフィケーション緩衝液（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を７０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で９０分間インキュベーターで静置させた。これより、すべての操作は遮光下で実施した。

実施例（１ｆ）検出
保温後、ディッシュから上清を除去し、２ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄後、ディテクション緩衝液（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を７０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で６０分間インキュベーターに静置させた。

実施例（１ｇ）最終洗浄と解析
保温後、ディッシュに２×生理食塩水−クエン酸ナトリウム（以下ＳＳＣと略す。）を１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で２分間静置させた。ディッシュから上清を除去し、１×ＳＳＣを１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で２分間静置させた。ディッシュから上清を除去し、０．２×ＳＳＣを１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で２分間静置させた。ディッシュから上清を除去し、０．０２×ＳＳＣを１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で２分間静置させた。静置後、ディッシュから上清を除去し、７０％エタノール溶液（ＷＡＫＯ社製）を１ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１分間静置させた。そこへ、１ｍＬのＨＢＳＳを添加し室温で１分間静置させた。そこへ、１ｍｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ｓｔａｉｎを１μｇ／ｍＬになるように１μＬ添加し、室温で５分間静置させた。静置後、２ｍＬのＨＢＳＳで２回洗浄し、ＨＢＳＳを２ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、共焦点顕微鏡（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ ｆｉｌｔｅｒ，Ｈｏｅｃｈｓｔ ｆｉｌｔｅｒ，ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉ，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ Ｅｘ（ｎｍ）／Ｅｍ（ｎｍ）５９５／６１２，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ Ｅｘ（ｎｍ）／Ｅｍ（ｎｍ）３５２／４５５）で観察した。結果を図１に示す。化合物Ａは、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用を阻害する一方、化合物Ｃは、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用を阻害しなかった。

（実施例２）
Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｎ ｓｉｔｕ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ^ＴＭ （ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）によるプライマリー細胞（ヒト末梢血白血球）のα４−インテグリンとカルレティキュリンの細胞内相互作用の検出および化合物Ａによるその阻害の検出

実施例（２ａ）健常成人からの全血の採取
１００Ｕのヘパリンナトリウム（エイワイファーマ社製）を含むプラスチックチューブに、健常成人の肘静脈より採取した２５ｍＬの全血を添加し、緩やかに混和したのち、実験使用時まで室温で静置した。

実施例（２ｂ）白血球の固定及び単離
１５ｍＬのポリプロピレンコニカルチューブ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ社製）に全血１ｍＬ添加した。これに直ちに、ジメチルスルホキシド（ＳＩＧＭＡ社製）で５ｍＭに希釈した化合物Ａを１μＬ／チューブ添加し、続いてジメチルスルホキシド（ＳＩＧＭＡ社製）で調製した１０μＭ ＰＭＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を１μＬ／チューブまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ社製）で調製した１０μｇ／ｍＬ ＳＤＦ−１α（ＷＡＫＯ社製）を１０μＬ／チューブ添加後、チューブを３７℃で３０−６０分、恒温水槽で保温した。保温後、超純水で１０倍希釈した１−Ｓｔｅｐ Ｆｉｘ／Ｌｙｓｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を１０ｍＬ／チューブ添加して転倒混和後、４℃で一晩静置させた。翌日、チューブを５００×ｇ ４℃で５分遠心し、上清を除去し得られた沈殿物に０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社製）を含むＰＢＳを２ｍＬ／チューブ添加し懸濁して、チューブを５００×ｇ ４℃で５分遠心した。チューブから上清を除去し得られた沈殿物に０．５％ ＢＳＡを含むＰＢＳを４００μＬ／チューブ添加し懸濁した。得られた固定化処理された白血球は、使用時まで４℃保温した。

実施例（２ｃ）白血球の塗抹標本作製及び細胞膜透過処理と一次抗体処理
剥離防止コートスライドグラス（ＦＲＯＮＴＩＥＲ、ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に、集細胞遠心装置（サイトスピン３、ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて、懸濁した白血球を５０μＬ／スライドグラス添加して、１５００ｒｐｍ 室温で５分遠心し、塗抹標本（スメア）を作製した。これに直ちに、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ^ＴＭ Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＨＢＳＳ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を１００μＬ／塗抹標本添加し、室温で２０分細胞直ちに希釈緩衝液（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）で２μｇ／ｍＬと４μｇ／ｍＬに膜透過処理した。２００μＬのＨＢＳＳで２回（それぞれ室温で５分）洗浄し、そこへブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１−２滴／塗抹標本添加し、３７℃で６０分乾燥しないようインキュベーターで保温した。塗抹標本から上清を除去後、それぞれ希釈した抗ヒトα４−インテグリンウサギ抗体（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）と抗ヒトカルレティキュリンマウス抗体（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加して、４℃で一晩静置した。

実施例（２ｄ）一次抗体へのＰＬＡプローブの結合
翌日、塗抹標本から上清を除去し、２００μＬの洗浄緩衝液Ａ（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ Ａ）で２回（それぞれ室温で５分）洗浄した。そこへ、ＰＬＡプローブ マウスＭＩＮＵＳ（１／５量）、ＰＬＡプローブ ウサギＰＬＵＳ（１／５量）、抗体希釈液（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ、３／５量）の割合で混合したＰＬＡ液を５０μＬ／塗抹標本添加し、３７℃で６０分乾燥しないようインキュベーターで保温した。

実施例（２ｅ）ＰＬＡプローブのライゲーション反応
保温後、塗抹標本から上清を除去し、２００μＬの洗浄緩衝液Ａ（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ Ａ）で２回（それぞれ室温で５分）洗浄した。そこへ、１／４０量のリガーゼを含むライゲーション緩衝液（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬ／塗抹標本添加し、３７℃にて３０分乾燥しないようインキュベーターで保温した。

実施例（２ｆ）伸長反応と標識プローブのハイブリタイズ
保温後、塗抹標本から上清を除去し、２００μＬの洗浄緩衝液Ａ（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ Ａ）で２回（それぞれ室温で５分）洗浄した。そこへ、１／８０量のポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を含むアンプリフィケーション緩衝液（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬ／塗抹標本添加し、３７℃で６０分乾燥しないようインキュベーターで保温した。すべての操作は遮光下で実施した。

実施例（２ｇ）Ｈｏｅｃｈｓｔ染色
保温後、塗抹標本から上清を除去し、２００μＬの洗浄緩衝液Ｂ（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ Ｂ）で２回（それぞれ室温で１０分）、その後超純水で１００倍希釈した２００μＬの洗浄緩衝液Ｂ（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ Ｂ）で１回（室温 １分）洗浄した。そこへ、２μｇ／ｍＬ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を含むＰＢＳを５０μＬ／塗抹標本添加し、３７℃で１０分乾燥しないようインキュベーターで保温した。すべての操作は遮光下で実施した。

実施例（２ｈ）最終洗浄とカバーグラス封入
保温後、塗抹標本から上清を除去し、ＰＢＳを２００μＬ／塗抹標本添加した。直ちに、塗抹標本から上清を除去し、封入剤（Ｇｏｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を１滴／塗抹標本添加し、カバーグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）をかぶせ、室温で一晩乾燥させた。すべての操作は遮光下で実施した。

実施例（２ｉ）観察および解析
翌日、共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０ ｖｅｒ．４．０，ＣＡＲＬ ＺＥＩＳＳ社製、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ Ｅｘ（ｎｍ）／Ｅｍ（ｎｍ）５４３／５６０−６２５，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ Ｅｘ（ｎｍ）／Ｅｍ（ｎｍ）４０５／４２０−４８０）で観察した。次に、得られた画像を画像解析ソフト（ＺＥＮ ２０１２ ｌｉｔｅ、ＣＡＲＬ ＺＥＩＳＳ社製）を用いて解析した。α４−インテグリンとカルレティキュリンの相互作用由来のＴｅｘａｓ Ｒｅｄの赤色シグナル（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｓｕｍ：単位Ｇｒａｙ）を、核由来のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２由来の青色シグナル（Ａｒｅａ：単位Ｐｉｘｅｌ^２）で除算し数値化した。なお、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄの赤色シグナルが強力かつ細胞表面積の大きい細胞（単球）は除外して画像解析し数値を算出した。結果を図２及び図３に示す。化合物Ａは、ＰＭＡ刺激によって亢進するα４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用を阻害した。

Claims (15)

1. 化合物の抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する方法であって、
   患者由来の細胞における、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度をＰｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法により測定する工程と、
   測定された阻害度を指標として、化合物に対する患者の感受性を判断する工程と、
   患者の感受性を指標として、化合物の抗炎症効果または免疫抑制効果を予測する工程と、を含み、
   化合物は下記の化合物ＡまたはＢであり、
   患者は炎症性疾患もしくは自己免疫疾患に罹患している、または罹患していると疑われるものである、
   方法。
   
   化合物Ａ：１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン 塩酸塩
   化合物Ｂ：１−シクロプロピルメチル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル]ピペラジン メタンスルホン酸塩
2. Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法において、一次抗体として異種動物から得られた、抗ヒトインテグリン抗体と抗ヒトカルレティキュリン抗体を使用する、請求項１記載の方法。
3. Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法において、一次抗体として抗ヒトインテグリンウサギ抗体と抗ヒトカルレティキュリンマウス抗体を使用する、請求項２記載の方法。
4. 化合物が化合物Ａである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
5. 化合物が化合物Ｂである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
6. 細胞が白血球である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
7. 細胞が、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、リウマチ関節炎、乾癬、多発性硬化症、喘息またはアトピー性皮膚炎の患者由来の白血球である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
8. 細胞が、炎症性腸疾患の患者由来の白血球である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
9. 細胞が、潰瘍性大腸炎またはクローン病の患者由来の白血球である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
10. α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する工程の前に、赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を得る工程であって、患者から採取された全血を溶血処理し、白血球を固定化し、遠心操作により白血球画分を単離する工程を含む、請求項６〜９のいずれか一項記載の方法。
11. α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する工程の前に剥離防止処理されたスライドガラス上に赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を塗布した塗沫標本を作製する工程を含む、請求項１０記載の方法。
12. 炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、リウマチ関節炎、乾癬、多発性硬化症、喘息またはアトピー性皮膚炎に罹患している患者の化合物に対する感受性の検査の指標とするために、α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度を測定する方法であって、
    患者由来の白血球におけるα４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度をＰｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法で測定する工程を含み、
    化合物は下記の化合物ＡまたはＢである、
    方法。
    
    化合物Ａ：１−プロピル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル］ピペラジン 塩酸塩
    化合物Ｂ：１−シクロプロピルメチル−４−［２−（３，３，５，５−テトラメチルシクロヘキシル）フェニル]ピペラジン メタンスルホン酸塩
13. 患者が炎症性腸疾患に罹患している患者である請求項１２記載の方法。
14. α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度をＰｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法で測定する工程の前に、赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を得る工程であって、患者から採取された全血を溶血処理し、白血球を固定化し、遠心操作により白血球画分を単離する工程を含む、請求項１２または１３記載の方法。
15. α４−インテグリンとカルレティキュリンとの相互作用に対する化合物の阻害度をＰｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法で測定する工程の前に、剥離防止処理されたスライドガラス上に赤血球画分を含まない固定化された白血球画分を塗布した塗沫標本を作製する工程を含む、請求項１４記載の方法。