JP6395880B2 - Fucoidan as a ligand for the diagnosis of degenerative lesions - Google Patents

Description

背景技術
心臓血管変性疾患だけでなく器官特異的変性疾患も含まれるヒト変性疾患の多くは、循環細胞／血管壁相互作用に関係している。セレクチンは、糖質部分に対して高い親和性を示す重要な細胞接着分子である。これらは、白血球／血小板及び白血球／内皮細胞の相互作用を介在することにより、循環細胞成分と血管壁の相互作用の初期段階で顕著で重要な役割を担っている。これまで、３種類のセレクチン：Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン及びＬ−セレクチンが発見されている。Ｌ−セレクチンは、ほとんど全ての循環白血球で構成的に発現される。Ｅ−セレクチンの発現は、サイトカイン及びエンドトキシンなどの様々なメディエーターによる活性化の結果、血管内皮細胞で誘導されうる。Ｐ−セレクチンは細胞質内の顆粒に含まれており、細胞がトロンビン又はヒスタミンに曝露された後、血小板又は内皮細胞表面へ急速に移行する。 BACKGROUND ART Many human degenerative diseases, including not only cardiovascular degenerative diseases but also organ-specific degenerative diseases, are related to circulating cell / blood vessel wall interactions. Selectins are important cell adhesion molecules that show high affinity for carbohydrate moieties. They play a prominent and important role in the early stages of the interaction of circulating cell components and blood vessel walls by mediating leukocyte / platelet and leukocyte / endothelial cell interactions. So far, three types of selectins have been discovered: P-selectin, E-selectin and L-selectin. L-selectin is constitutively expressed on almost all circulating leukocytes. E-selectin expression can be induced in vascular endothelial cells as a result of activation by various mediators such as cytokines and endotoxins. P-selectin is contained in cytoplasmic granules and migrates rapidly to the surface of platelets or endothelial cells after the cells are exposed to thrombin or histamine.

Ｐ−、Ｌ−及びＥ−セレクチンは、構造的に類似の膜貫通タンパク質である。これらは全て、大きな高グリコシル化細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメイン及び小さな細胞質尾部を有する。その細胞外アミノ末端において、これらは、単一のカルシウム依存性（又はＣ−型）レクチンドメイン（Ｌ）、それに続く上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン（Ｅ）及び数種類の補体調節ドメイン（Ｃ）を有する。セレクチン介在性の細胞接着は、アミノ末端レクチンドメインと標的細胞表面上の多種多様な糖質提示分子とのカルシウム依存性相互作用から生じる。それぞれのセレクチンの親和性はリガンドに依存して変化するが、これらは、全て、シアリルルイスＸ（ＳＬｅ^ｘ）として知られる、シアル酸及びフコース残基を含有する特定の四糖類の糖質構造に結合する。 P-, L-, and E-selectin are structurally similar transmembrane proteins. These all have a large hyperglycosylated extracellular domain, a single transmembrane domain and a small cytoplasmic tail. At its extracellular amino terminus these are a single calcium-dependent (or C-type) lectin domain (L) followed by an epidermal growth factor (EGF) -like domain (E) and several complement regulatory domains (C ). Selectin-mediated cell adhesion results from calcium-dependent interactions between the amino-terminal lectin domain and a wide variety of carbohydrate presenting molecules on the target cell surface. The affinity of each selectin varies depending on the ligand, but these all bind to the carbohydrate structure of a particular tetrasaccharide containing sialic acid and fucose residues, known as sialyl Lewis X (SLe ^x ). To do.

セレクチン介在性の結合事象は、正常な生理学的プロセスにおいて重要な役割を担っているが、セレクチンは、また、多くの病変に関与していることが知られている。このような病変には、アテローム血栓性疾患などの血小板活性化及びフィブリン形成を伴う臨床症状（E. Galkina et al., Curr. Drug Targets, 2007, 8: 1239-1248）；敗血症、脳虚血症又は虚血再かん流などの急性の内皮細胞活性化を伴う臨床症状（C.R. Calvey et al., J. Invest. Surg., 2007, 20: 71-85）；高血圧、脂質異常症、肥満（S. Nishimura et al., J. Clin. Invest., 2008, 118: 710-721）又は心臓血管系、肺若しくは脳の変性障害（M. Fisher, Rev. Neurol. Dis., 2008, 5 Suppl. 1: S4-S11; S.I. van Kasteren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106: 18-23）などの慢性的な内皮細胞活性化を伴う臨床症状；及び三次リンパ組織新生若しくは自己免疫疾患などの慢性的な白血球の局在集積を伴う臨床症状が挙げられる。また、セレクチン相互作用は、特定の上皮癌転移に関与する接着機構を媒介することができる（I.P Witz, Immunol. Lett., 2006, 104: 89-93; 1; S. Gout et al., Clin. Exp. Metastasis, 2008, 25: 335-344; L. Borsig, Expert Rev. Anticancer Ther., 2008, 8: 1247-1255）。   While selectin-mediated binding events play an important role in normal physiological processes, selectins are also known to be involved in many lesions. Such lesions include clinical symptoms associated with platelet activation and fibrin formation such as atherothrombotic disease (E. Galkina et al., Curr. Drug Targets, 2007, 8: 1239-1248); sepsis, cerebral ischemia Or clinical symptoms with acute endothelial cell activation such as ischemia or ischemia-reperfusion (CR Calvey et al., J. Invest. Surg., 2007, 20: 71-85); hypertension, dyslipidemia, obesity ( S. Nishimura et al., J. Clin. Invest., 2008, 118: 710-721) or cardiovascular, lung or brain degenerative disorders (M. Fisher, Rev. Neurol. Dis., 2008, 5 Suppl. 1: S4-S11; SI van Kasteren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106: 18-23) and other clinical manifestations with chronic endothelial cell activation; Alternatively, clinical symptoms associated with localized accumulation of leukocytes such as autoimmune diseases can be mentioned. Selectin interactions can also mediate adhesion mechanisms involved in certain epithelial cancer metastases (IP Witz, Immunol. Lett., 2006, 104: 89-93; 1; S. Gout et al., Clin Exp. Metastasis, 2008, 25: 335-344; L. Borsig, Expert Rev. Anticancer Ther., 2008, 8: 1247-1255).

セレクチンは、これらの病変のいくつかの診断における潜在的に有用なマーカーと考えられている。現在、主に磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）（S. Bouty et al., Contrast Media Mol. Imaging, 2006, 1: 15-22）、シンチグラフィー（G. Hairi et al., Ann. Biomed. Eng., 2008, 36: 821-830）により、そして最近では超音波を用いて（F.S. Villanueva et al., Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med., 2008, 5: S26-S32）、セレクチンをイメージングするために多くの労力が注がれている。これまでに開発されたセレクチンイメージング剤のほとんどは、抗セレクチン抗体（B.A. Kaufman et al., Eur. Heart J., 2007, 28: 2011-2017; G. Hairi et al., Ann. Biomed. Eng., 2008, 36: 821-830; K. Licha et al., J. Biomed. Opt., 2005, 10: 41205; and P. Hauff et al., Radiology, 2004, 231: 667-673）及びシアリルルイスＸアナログ又は誘導体である（S. Bouty et al., Contrast Media Mol. Imaging, 2006, 1: 15-22; F.S. Villanueva et al., Circulation, 2007, 115: 345-352）。これらのイメージング剤は、炎症、神経変性障害、癌及び血栓症において、セレクチンのin vivo非侵襲的検出を可能にすることが示された。しかし、これらは、その工業的開発及び商業化を明らかに妨げるいくつかの欠点を有している。実際に、シアリルルイスＸベースのイメージング剤及び抗体ベースのイメージング剤の調製及び精製は、複雑で高コストである。   Selectin is considered a potentially useful marker in the diagnosis of some of these lesions. Currently, mainly magnetic resonance imaging (MRI) (S. Bouty et al., Contrast Media Mol. Imaging, 2006, 1: 15-22), scintigraphy (G. Hairi et al., Ann. Biomed. Eng., 2008, 36: 821-830) and recently using ultrasound (FS Villanueva et al., Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med., 2008, 5: S26-S32) to image selectins. Much effort has been devoted to this. Most of the selectin imaging agents developed so far are anti-selectin antibodies (BA Kaufman et al., Eur. Heart J., 2007, 28: 2011-2017; G. Hairi et al., Ann. Biomed. Eng. , 2008, 36: 821-830; K. Licha et al., J. Biomed. Opt., 2005, 10: 41205; and P. Hauff et al., Radiology, 2004, 231: 667-673) and Sialyl Lewis X It is an analogue or derivative (S. Bouty et al., Contrast Media Mol. Imaging, 2006, 1: 15-22; FS Villanueva et al., Circulation, 2007, 115: 345-352). These imaging agents have been shown to allow in vivo non-invasive detection of selectins in inflammation, neurodegenerative disorders, cancer and thrombosis. However, they have several drawbacks that clearly hinder their industrial development and commercialization. In fact, the preparation and purification of sialyl Lewis X-based imaging agents and antibody-based imaging agents are complex and expensive.

従って、当技術分野において、心臓／神経血管病変、神経変性障害及び癌転移などの疾患の非侵襲的診断及び／又は予防スクリーニングを可能にする、循環細胞／血管壁相互作用をイメージング及び検出するための新規なアプローチ法が求められている。特に、製造することが容易であり、比較的安価なセレクチンイメージング剤が望ましい。   Accordingly, in the art to image and detect circulating cell / vessel wall interactions that allow non-invasive diagnosis and / or prophylactic screening of diseases such as heart / neurovascular lesions, neurodegenerative disorders and cancer metastasis. There is a need for a new approach. In particular, a selectin imaging agent that is easy to manufacture and relatively inexpensive is desirable.

発明の概要
本発明は、セレクチンの検出及びセレクチンにより介在される望ましくない又は異常な相互作用を特徴とする疾患及び障害の診断のための改善されたシステム並びに戦略に関する。特に、本発明は、フコイダンが、セレクチンに対して高い親和性、特異性及び／又は選択性を示すことを出願人が認識することを包含する。さらに具体的には、本出願人は、Ｐ−セレクチンと数種の低分子量（ＬＭＷ）多糖：フコイダン、ヘパリン及び硫酸デキストランとの相互作用を比較した。ヒト血小板の結合アッセイ、質量分析、表面プラズモン共鳴及びフローサイトメトリーにより、ＬＭＷフコイダンが、Ｐ−セレクチンの最も有効なリガンドであることが明らかとなった（実施例１参照）。また、フコイダンが水素結合によりフィブリン部分と低い特異的結合をすることを考慮する（K.H. Hsieh, Biochemistry, 1997, 36: 9381-9387）。出願人は、また、テクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）で放射性標識したＬＭＷフコイダンが、動物モデルでの心内膜炎疣贅、動脈瘤血栓及び心房内血栓（血小板−セレクチン曝露及びフィブリン形成を伴う病状）のin vivo検出を可能にしたことを示した（実施例２参照）。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to an improved system and strategy for the detection of selectins and the diagnosis of diseases and disorders characterized by undesirable or abnormal interactions mediated by selectins. In particular, the present invention encompasses Applicants' recognition that fucoidan exhibits high affinity, specificity and / or selectivity for selectins. More specifically, Applicants compared the interaction of P-selectin with several low molecular weight (LMW) polysaccharides: fucoidan, heparin and dextran sulfate. Human platelet binding assay, mass spectrometry, surface plasmon resonance and flow cytometry revealed that LMW fucoidan was the most effective ligand for P-selectin (see Example 1). Also, consider that fucoidan has low specific binding to the fibrin moiety by hydrogen bonding (KH Hsieh, Biochemistry, 1997, 36: 9381-9387). Applicants have also noted that LMW fucoidan radiolabeled with technetium- ^99m ( ^99m Tc) has been shown to cause endocarditis warts, aneurysm thrombus and intra-atrial thrombus (platelet-selectin exposure and fibrin formation in animal models). It was shown that in vivo detection was possible (see Example 2).

従って、本発明は、セレクチンの検出及びイメージングのための、並びに、セレクチンの望ましくない又は異常な発現を特徴とする疾患及び障害の診断のためのフコイダンの使用を提供する。   Thus, the present invention provides the use of fucoidan for the detection and imaging of selectins and for the diagnosis of diseases and disorders characterized by unwanted or abnormal expression of selectins.

さらに具体的には、一態様においては、本発明は、少なくとも一つの検出可能な部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含むイメージング剤を提供する。好ましくは、イメージング剤はセレクチン標的である。さらに好ましくは、イメージング剤の少なくとも一つのフコイダン部分が、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン及びＥ−セレクチンからなる群から選択される少なくとも一つのヒトセレクチンと、約０．１nM〜約５００nM、好ましくは、約０．５nM〜約１０nM、さらに好ましくは、約１nM〜約５nMの解離定数で結合する。   More specifically, in one aspect, the invention provides an imaging agent comprising at least one fucoidan moiety associated with at least one detectable moiety. Preferably, the imaging agent is a selectin target. More preferably, the at least one fucoidan moiety of the imaging agent and at least one human selectin selected from the group consisting of P-selectin, L-selectin and E-selectin, and about 0.1 nM to about 500 nM, preferably It binds with a dissociation constant of about 0.5 nM to about 10 nM, more preferably about 1 nM to about 5 nM.

特定の実施態様においては、検出可能な部分は、検出可能な部分と錯体形成する金属キレート部分を含む。   In certain embodiments, the detectable moiety comprises a metal chelating moiety that complexes with the detectable moiety.

特定の実施態様においては、検出可能な部分は、プラナーシンチグラフィ（ＰＳ）又はシングルフォトンエミッションコンピュータトモグラフィ（ＳＰＥＣＴ）により検出可能である。例えば、検出可能な部分は、テクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、ガリウム−６７（^６７Ｇａ）、イットリウム−９１（^９１Ｙ）、インジウム−１１１（^１１１Ｉｎ）、レニウム−１８６（^１８６Ｒｅ）及びタリウム−２０１（^２０１Ｔｌ）からなる群から選択される放射性核種である。特定の好ましい実施態様においては、検出可能な部分は、テクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）である。 In certain embodiments, the detectable moiety is detectable by planar scintigraphy (PS) or single photon emission computed tomography (SPECT). For example, the detectable moiety may be a ^{technetium-99m (99m} Tc), gallium ^-67 (67 Ga), yttrium ^{-91 (91} Y), ^{indium--111 (111} In), rhenium ^{-186 (186} Re) and thallium - It is a radionuclide selected from the group consisting of 201 ( ²⁰¹ Tl). In certain preferred embodiments, the detectable moiety is technetium- ^99m ( ^99m Tc).

他の実施態様においては、検出可能な部分は、ポジトロンエミッショントモグラフィ（ＰＥＴ）により検出可能である。例えば、検出可能な部分は、炭素−１１（^１１Ｃ）、窒素−１３（^１３Ｎ）、酸素−１５（^１５Ｏ）及びフッ素−１８（^１８Ｆ）からなる群から選択することができる。 In other embodiments, the detectable moiety is detectable by positron emission tomography (PET). For example, the detectable moiety may be selected from the group consisting of carbon ^{-11 (11} C), nitrogen ^{-13 (13} N), oxygen -15 ⁽¹⁵ O) and fluorine -18 ⁽¹⁸ F).

他の実施態様においては、検出可能な部分は、造影超音波検査法（ＣＥＵＳ）により検出可能である。例えば、検出可能な部分は、音響的に活性なマイクロバブル及び音響的に活性なリポソームからなる群から選択することができる。   In other embodiments, the detectable moiety can be detected by contrast-enhanced ultrasonography (CEUS). For example, the detectable moiety can be selected from the group consisting of acoustically active microbubbles and acoustically active liposomes.

さらに他の実施態様においては、検出可能な部分は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）により検出可能である。例えば、検出可能な部分は、ガドリニウムＩＩＩ（Ｇｄ^３＋）、クロムＩＩＩ（Ｃｒ^３＋）、ジスプロシウムＩＩＩ（Ｄｙ^３＋）、鉄ＩＩＩ（Ｆｅ^３＋）、ユウロピウム（Ｅｕ^３＋）、マンガンＩＩ（Ｍｎ^２＋）及びイッテルビウムＩＩＩ（Ｙｂ^３＋）からなる群から選択することができる。特定の好ましい実施態様においては、検出可能な部分は、ガドリニウムＩＩＩ（Ｇｄ^３＋）である。あるいは、検出可能な部分は、極小超常磁性酸化鉄粒子（ＵＳＰＩＯ）であることができる。 In yet other embodiments, the detectable moiety is detectable by magnetic resonance imaging (MRI). For example, detectable moieties include gadolinium III (Gd ³⁺ ), chromium III (Cr ³⁺ ), dysprosium III (Dy ³⁺ ), iron III (Fe ³⁺ ), europium (Eu ³⁺ ), manganese II (Mn ²⁺ ) and ytterbium. It can be selected from the group consisting of III (Yb ³⁺ ). In certain preferred embodiments, the detectable moiety is gadolinium III (Gd ³⁺ ). Alternatively, the detectable moiety can be minimal superparamagnetic iron oxide particles (USPIO).

さらに他の実施態様においては、検出可能な部分は、蛍光分光法により検出可能である。例えば、検出可能な部分は、ユウロピウム（Ｅｕ^３＋）、量子ドット、テキサスレッド、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ローダミン、カルボキシシアニン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６８０、Ａｔｔｏ５６５染料、メロシアニン、スチリル染料、オキソノール染料、ＢＯＤＩＰＹ染料及びこれらの分子のアナログ、誘導体又は組み合わせからなる群から選択することができる。特に、特定の実施態様においては、検出可能な部分は、時間分解蛍光測定法により検出可能である。例えば、検出可能な部分は、ユウロピウム（Ｅｕ^３＋）であることができる。 In yet other embodiments, the detectable moiety can be detected by fluorescence spectroscopy. For example, detectable moieties include europium (Eu ³⁺ ), quantum dots, Texas Red, fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), rhodamine, carboxycyanine, Cy-3, Cy-5, Cy5.5, Cy7. DY-630, DY-635, DY-680, Atto565 dye, merocyanine, styryl dye, oxonol dye, BODIPY dye and analogs, derivatives or combinations of these molecules. In particular, in certain embodiments, the detectable moiety can be detected by time-resolved fluorometry. For example, the detectable moiety can be europium (Eu ³⁺ ).

本発明の特定の実施態様においては、イメージング剤は、二つ以上の画像技術により検出可能であり、従って、マルチモーダルイメージングで使用することができる。例えば、イメージング剤は、超音波検査、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ポジトロンエミッショントモグラフィ（ＰＥＴ）、シングルフォトンエミッションコンピュータトモグラフィ（ＳＰＥＣＴ）、蛍光分光法、コンピュータトモグラフィ及びＸ線ラジオグラフィーからなる群から選択される、任意の適切な画像技術の組み合わせにより検出可能でありうる。特定の実施態様においては、このようなイメージング剤は、二つ以上の画像技術により検出可能な少なくとも一つの検出可能な部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含む。他の実施態様においては、このようなイメージング剤は、第一の検出可能な部分及び第二の検出可能な部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含み、ここで、第一の検出可能な部分は、第一の検出可能な部分により検出可能であり、第二の検出可能な部分は、第二の検出可能な部分により検出可能である。   In certain embodiments of the invention, the imaging agent can be detected by more than one imaging technique and can therefore be used in multimodal imaging. For example, the imaging agent is a group consisting of ultrasound examination, magnetic resonance imaging (MRI), positron emission tomography (PET), single photon emission computed tomography (SPECT), fluorescence spectroscopy, computer tomography and X-ray radiography. May be detectable by any suitable combination of imaging techniques selected from: In certain embodiments, such imaging agents include at least one fucoidan moiety associated with at least one detectable moiety detectable by two or more imaging techniques. In other embodiments, such an imaging agent comprises a first detectable moiety and at least one fucoidan moiety associated with a second detectable moiety, wherein the first detectable moiety. Can be detected by the first detectable portion, and the second detectable portion can be detected by the second detectable portion.

特定の実施態様においては、フコイダン部分は、約２０００〜約８０００Daの平均分子量を有する。他の実施態様においては、フコイダン部分は、約２０，０００〜約７０，０００Daの平均分子量を有する。さらに他の実施態様においては、フコイダン部分は、約１００，０００〜約５００，０００Daの平均分子量を有する。   In certain embodiments, the fucoidan moiety has an average molecular weight of about 2000 to about 8000 Da. In other embodiments, the fucoidan moiety has an average molecular weight of about 20,000 to about 70,000 Da. In yet other embodiments, the fucoidan moiety has an average molecular weight of about 100,000 to about 500,000 Da.

別の態様においては、本発明は、有効量の本発明の少なくとも１つのイメージング剤又は生理学的に許容しうるその塩及び少なくとも一つの薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物を提供する。   In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an effective amount of at least one imaging agent of the present invention or a physiologically acceptable salt thereof and at least one pharmaceutically acceptable carrier.

関連する態様においては、本発明は、セレクチンの検出及び／又はイメージングのための組成物の製造のための、本発明に記載のイメージング剤の使用を提供する。本発明は、また、セレクチンが関与する臨床症状の診断のための組成物の製造のための、本発明のイメージング剤の使用を提供する。   In a related aspect, the present invention provides the use of an imaging agent according to the present invention for the manufacture of a composition for detection and / or imaging of selectins. The present invention also provides the use of the imaging agent of the present invention for the manufacture of a composition for the diagnosis of clinical conditions involving selectins.

さらに別の態様においては、本発明は、患者におけるセレクチンが関与する臨床症状を診断するための方法を提供し、前記方法は、有効量のイメージング剤又はその医薬組成物を患者に投与する工程；及び、画像技術を用いて、イメージング剤に結合する任意のセレクチンを検出する工程を含む。   In yet another aspect, the present invention provides a method for diagnosing a clinical condition involving selectin in a patient, said method comprising administering to the patient an effective amount of an imaging agent or pharmaceutical composition thereof; And detecting any selectin binding to the imaging agent using imaging techniques.

関連する態様においては、本発明は、セレクチンが関与する臨床症状のin vivo診断方法で使用するための本明細書に開示のイメージング剤を提供する。   In a related aspect, the present invention provides an imaging agent disclosed herein for use in an in vivo diagnostic method of a clinical condition involving selectins.

本発明のイメージング剤及び／又は方法を使用して診断することができる臨床症状の例は、血栓症、心筋虚血／再かん流傷害、脳卒中及び虚血脳外傷、神経変性障害、腫瘍転移及び腫瘍増殖並びに関節リウマチからなる群のメンバーである。   Examples of clinical conditions that can be diagnosed using the imaging agents and / or methods of the present invention include thrombosis, myocardial ischemia / reperfusion injury, stroke and ischemic brain trauma, neurodegenerative disorders, tumor metastasis and Member of the group consisting of tumor growth as well as rheumatoid arthritis.

さらに別の態様においては、本発明は、生体系における異常セレクチンの存在を検出するための方法を提供し、前記方法は、生体系を、有効量のイメージング剤又はその医薬組成物と接触させる工程；及び、画像技術を用いて、イメージング剤に結合する任意のセレクチンを検出する工程を含む。生物試料は、細胞、体液又は生物組織であることができる。   In yet another aspect, the present invention provides a method for detecting the presence of an abnormal selectin in a biological system, the method comprising contacting the biological system with an effective amount of an imaging agent or pharmaceutical composition thereof. And using an imaging technique to detect any selectin that binds to the imaging agent. The biological sample can be a cell, body fluid or biological tissue.

関連する態様においては、本発明は、セレクチンが関与する臨床症状のin vivo診断方法で使用するための本明細書に開示のイメージング剤を提供する。   In a related aspect, the present invention provides an imaging agent disclosed herein for use in an in vivo diagnostic method of a clinical condition involving selectins.

特定の実施態様においては、生物試料は、セレクチンが関与する臨床症状を有する疑いがある患者由来のものであり、前記方法は、前記臨床症状を診断するために用いられる。   In certain embodiments, the biological sample is from a patient suspected of having a clinical symptom involving selectin, and the method is used to diagnose the clinical symptom.

他の実施態様においては、生物試料は、セレクチンが関与する臨床症状のための処置を受けた患者由来のものであり、前記方法は、前記処置に対する患者の反応をモニタリングするために用いられる。   In other embodiments, the biological sample is from a patient undergoing treatment for a clinical condition involving selectin, and the method is used to monitor the patient's response to the treatment.

なおさらに別の態様においては、本発明は、患者におけるセレクチンが関与する臨床症状の診断のための、又は生物組織における異常セレクチンの検出のためのキットを提供し、前記キットは、フコイダン部分、検出可能な部分及び本明細書に記載のセレクチン標的イメージング剤を調製するための説明書を含む。   In still yet another aspect, the present invention provides a kit for diagnosis of clinical symptoms involving selectin in a patient or for detection of abnormal selectin in biological tissue, said kit comprising a fucoidan moiety, detection Includes possible portions and instructions for preparing the selectin-targeted imaging agents described herein.

特定の実施態様においては、検出可能な部分は、テクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、ガリウム−６７（^６７Ｇａ）、イットリウム−９１（^９１Ｙ）、インジウム−１１１（^１１１Ｉｎ）、レニウム−１８６（^１８６Ｒｅ）及びタリウム−２０１（^２０１Ｔｌ）からなる群から選択される寿命の短い放射性核種である。 In certain embodiments, the detectable moiety may be a ^{technetium-99m (99m} Tc), gallium ^-67 (67 Ga), yttrium ^{-91 (91} Y), ^{indium--111 (111} an In), rhenium -186 ⁽¹⁸⁶ Re) and a short-lived radionuclide selected from the group consisting of thallium-201 ( ²⁰¹ Tl).

キットは、セレクチン標的イメージング剤を用いて、臨床症状を診断するための説明書をさらに含むことができる。   The kit can further include instructions for diagnosing clinical symptoms using the selectin-targeted imaging agent.

本発明のこれらの及び他の目的、利点及び特徴は、以下の好ましい実施態様の詳細な記載を読むことにより当業者には明らかとなるであろう。   These and other objects, advantages and features of the present invention will become apparent to those of ordinary skill in the art upon reading the following detailed description of the preferred embodiments.

図１は、硫酸化多糖によるＳＬｅ^ｘ／Ｐ−セレクチン結合の阻害を示すグラフである。マイクロタイタープレートに固定化されたＰ−セレクチンとのＳＬｅ^ｘポリアクリルアミド−ビオチンの結合は、実施例１に記載のようにして、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体形成により定量され、ペルオキシダーゼ反応は、濃度を増加させた硫酸デキストラン（▲）、ヘパリン（■）及びフコイダン（●）の存在下、４０５nmにおいて記録した。代表的な実験結果を示す［平均±標準偏差（ｎ≧３）］。FIG. 1 is a graph showing inhibition of SLe ^x / P-selectin binding by sulfated polysaccharides. The binding of SLe ^x polyacrylamide-biotin to P-selectin immobilized on a microtiter plate was quantified by streptavidin-peroxidase complex formation as described in Example 1, and the peroxidase reaction was performed at a concentration of Recordings were made at 405 nm in the presence of increased dextran sulfate (▲), heparin (■) and fucoidan (●). Representative experimental results are shown [mean ± standard deviation (n ≧ 3)]. 図２は、固定化ＩｇＧ又はＰ−セレクチンにおける硫酸化多糖の会合及び解離プロファイルを示す代表的なセンサーグラムのセットである。フコイダン（Ａ）、ヘパリン（Ｂ）及び硫酸デキストラン（Ｃ）を、ヤギ抗ヒトＦｃＩｇＧ（灰色で記載、非特異的コントロール）＋Ｐ−セレクチン／Ｆｃキメラ（黒色で記載）を固定化したＳＰＲ ＣＭ５センサーチップ上に注入した。動態試験を、流速３０μL／分で実施した。レゾナンスユニット（ＲＵ）での代表的なセンサーグラムを、全てのＬＭＷ硫酸化多糖に対して、同じ１μＭの濃度でオーバーレイする。フコイダン（上部曲線）、ヘパリン（下部曲線）又は硫酸デキストラン（中間曲線）とのＰ−セレクチンの特異的結合について、解離定数を、１：１ラングミュア結合モデルプロット（Ｄ）を使用して計算した。ＩｇＧ上の非特異的結合が、それぞれの多糖で観測された。FIG. 2 is a representative set of sensorgrams showing the association and dissociation profiles of sulfated polysaccharides on immobilized IgG or P-selectin. SPR CM5 sensor chip on which fucoidan (A), heparin (B) and dextran sulfate (C) are immobilized goat anti-human FcIgG (shown in gray, non-specific control) + P-selectin / Fc chimera (shown in black) Infused above. Kinetic tests were performed at a flow rate of 30 μL / min. A representative sensorgram in resonance unit (RU) is overlaid at the same 1 μM concentration for all LMW sulfated polysaccharides. For specific binding of P-selectin to fucoidan (upper curve), heparin (lower curve) or dextran sulfate (middle curve), dissociation constants were calculated using a 1: 1 Langmuir binding model plot (D). Nonspecific binding on IgG was observed with each polysaccharide. 図３は、全血における、ヒト血小板とのＦＩＴＣ結合ＬＭＷフコイダンの結合を示すグラフである。１４０μM（１mg/mL）のＦＩＴＣ結合ＬＭＷフコイダンを、ＰＢＳで１０倍希釈したヒトクエン酸血と一緒に、室温で、２０分間インキュベーションした。血小板の活性化を、２．５μM ＡＤＰ（中活性化因子；点線）又は２００μM ＴＲＡＰ（強活性化因子；実線）で誘導した。フローサイトメトリーを用いて、血小板を、その側方及び前方散乱並びに蛍光標識した特異的血小板抗体に対する陽性から同定した。血小板とのＦＩＴＣ結合ＬＭＷフコイダンの結合をＦＬ１チャネルで検出した。同様の結果が他の２つのドナーを用いて得られた。FIG. 3 is a graph showing the binding of FITC-bound LMW fucoidan to human platelets in whole blood. 140 μM (1 mg / mL) FITC-conjugated LMW fucoidan was incubated with human citrate blood diluted 10-fold in PBS for 20 minutes at room temperature. Platelet activation was induced with 2.5 μM ADP (medium activator; dotted line) or 200 μM TRAP (strong activator; solid line). Flow cytometry was used to identify platelets from their side and forward scatter as well as positive for fluorescently labeled specific platelet antibodies. FITC-bound LMW fucoidan binding to platelets was detected in the FL1 channel. Similar results were obtained with the other two donors. 図４は、ＬＭＷフコイダンの存在下での、血小板との標識ＣＤ６２Ｐ抗体の結合阻害を示すグラフである。実施例１に記載のようにして、ＣＤ６２Ｐ抗体を、非標識ＬＭＷフコイダンの存在下又は非存在下でインキュベーションした。血小板の活性化を、２００μM ＴＲＡＰで誘導した。フローサイトメトリーを用いて、血小板を、その側方及び前方散乱並びに蛍光標識した特異的血小板抗体に対する陽性から同定した。関連のないＰＣ５標識ＩｇＧ抗体の活性化血小板との結合を、比較のために報告する。ＦＬ４チャネルで観測された、血小板とのＰＣ５標識ＣＤ６２Ｐ抗体の結合は、ＬＭＷフコイダンの存在下で有意に減少した。蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を、関連のないＩｇＧ単独でのインキュベーションから得られた値に正規化した。^Uｐ＜０．０５ Student's t-検定を用いたＣＤ６２Ｐ単独の場合のデータとの差FIG. 4 is a graph showing inhibition of labeled CD62P antibody binding to platelets in the presence of LMW fucoidan. CD62P antibody was incubated in the presence or absence of unlabeled LMW fucoidan as described in Example 1. Platelet activation was induced with 200 μM TRAP. Flow cytometry was used to identify platelets from their side and forward scatter as well as positive for fluorescently labeled specific platelet antibodies. Unrelated PC5 labeled IgG antibody binding to activated platelets is reported for comparison. The binding of PC5-labeled CD62P antibody to platelets observed in the FL4 channel was significantly reduced in the presence of LMW fucoidan. Mean fluorescence intensity (MFI) was normalized to the value obtained from incubation with irrelevant IgG alone. ^U p <0.05 Difference from data for CD62P alone using Student's t-test 図５は、大動脈弁疣贅を有する左心内膜炎ラットモデルでの心臓の組織像（左）及びオートラジオグラフィー（右）断面図を示す。（Ａ）組織切片の疣贅は、弁に限定され（３）、一方、大動脈（１）及び弁下心筋（２）は正常であった。オートラジオグラフィーでは、in vivo注入された^９９ｍＴｃ標識フコイダンからのシグナルが、正確に弁疣贅と共局在化している。（Ｂ）オートラジオグラフィーにおいて、疣贅のない心筋のネガティブコントロールは、バックグラウンドを与える。（Ｃ）オートラジオグラフィーでは、^９９ｍＴｃ標識フコイダンからのシグナルが、カテーテルの周りのフィブリノイドカフ（fibrinoid cuff）と正確に共局在化している。FIG. 5 shows a heart histology (left) and autoradiography (right) cross section in a rat model of left endocarditis with aortic valve warts. (A) Warts on tissue sections were limited to valves (3), while aorta (1) and subvalvular myocardium (2) were normal. In autoradiography, the signal from ^99m Tc-labeled fucoidan injected in vivo is exactly co-localized with the valve warts. (B) In autoradiography, the negative control of the myocardium without warts gives the background. (C) In autoradiography, the signal from ^99m Tc-labeled fucoidan is accurately co-localized with the fibrinoid cuff around the catheter. 図６は、心房内血栓ラットモデルでのトモグラフィーＳＰＥＣＴのin vivoイメージング（左）、組織像（中間）及びオートラジオグラフィー（右）断面図を示す。トモグラフィーＳＰＥＣＴは、ラットの左心房における^９９ｍＴｃ標識フコイダンの保持を示す。組織像の結果から、両側が筋肉の心房内腔にフィブリン血栓があることが示される。オートラジオグラフィーでは、^９９ｍＴｃ標識フコイダンからのシグナルが、血栓に対向する心筋に局在化している。FIG. 6 shows in vivo imaging (left), histology (middle) and autoradiography (right) cross sections of tomography SPECT in an intraatrial thrombus rat model. Tomography SPECT shows retention of ^99m Tc labeled fucoidan in the left atrium of rats. The histological results show that there is a fibrin thrombus in the atrial lumen that is muscular on both sides. In autoradiography, the signal from ^99m Tc-labeled fucoidan is localized in the myocardium facing the thrombus. 図７は、動脈瘤血栓症ラットモデルでの腹部大動脈瘤の組織像（左）及びオートラジオグラフィー（右）断面図を示す。オートラジオグラフィーでは、^９９ｍＴｃ標識フコイダンからのシグナルが、薄い血栓（青色）が組織像上で局在化している内腔／血管壁接触面で局在化している。FIG. 7 shows a cross-sectional view of an abdominal aortic aneurysm tissue image (left) and autoradiography (right) in an aneurysm thrombosis rat model. In autoradiography, the signal from ^99m Tc-labeled fucoidan is localized at the lumen / blood vessel wall interface where a thin thrombus (blue) is localized on the histology.

定義
明細書全体を通して、以下の段落で定義するいくつかの用語を用いる。 Definitions Throughout the specification, several terms are used that are defined in the following paragraphs.

本明細書で使用される用語「セレクチン」は、当技術分野において理解されている意味を有し、これは、白血球、内皮細胞又は血小板表面に構成的又は誘導的に存在する、糖質結合のカルシウム依存性細胞接着分子ファミリーの任意のメンバーを指す。本明細書で使用される用語「Ｅ−セレクチン」は、当技術分野において理解されている意味を有し、これは、ＳＥＬＥ；ＣＤ６２Ｅ；ＥＬＡＭ；ＥＬＡＭ１；ＥＳＥＬ；又はＬＥＣＡＭ２（ヒトＥ−セレクチンのＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０００４５０（ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿０００４４１（タンパク質））としても知られている細胞接着分子を指す。本明細書で使用される用語「Ｌ−セレクチン」は、当技術分野において理解されている意味を有し、これは、ＳＥＬＬ；ＣＤ６２Ｌ；ＬＡＭ−１；ＬＡＭ１；ＬＥＣＡＭ１；ＬＮＨＲ；ＬＳＥＬ；ＬＹＡＭ１；Ｌｅｕ−８；Ｌｙａｍ−１；ＰＬＮＨＲ；ＴＱ１；又はｈＬＨＲｃ（ヒトＬ−セレクチンのＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０００６５５（ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿０００６４６（タンパク質））としても知られている細胞接着分子を指す。本明細書で使用される用語「Ｐ−セレクチン」は、当技術分野において理解されている意味を有し、これは、ＳＥＬＰ；ＣＤ６２；ＣＤ６２Ｐ；ＦＬＪ４５１５５；ＧＭＰ１４０；ＧＲＭＰ；ＰＡＤＧＥＭ；又はＰＳＥＬ（ヒトＰ−セレクチンのＧｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００３００５（ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿００２９９６（タンパク質））としても知られている細胞接着分子を指す。   As used herein, the term “selectin” has an art-recognized meaning, which is a carbohydrate-binding, constitutive or inducible surface on leukocytes, endothelial cells or platelet surfaces. Refers to any member of the calcium-dependent cell adhesion molecule family. As used herein, the term “E-selectin” has the meaning understood in the art and includes SELE; CD62E; ELAM; ELAM1; ESEL; or LECAM2 (Genbank of human E-selectin). Registration number: NM_000450 (mRNA) and NP_000441 (protein)). As used herein, the term “L-selectin” has an art-recognized meaning, which includes SELL; CD62L; LAM-1; LAM1; LECAM1; NLHR; LSEL; LYAM1; -8; Lyam-1; PLNHR; TQ1; or hLHRc (Genbank accession numbers of human L-selectin: NM_000655 (mRNA) and NP_000646 (protein)). The term “P-selectin” as used herein has an art-recognized meaning, which is SELP; CD62; CD62P; FLJ45155; GMP140; GRMP; PADGEM; or PSEL (human P -Refers to cell adhesion molecules also known as Genbank accession numbers of selectins: NM_003005 (mRNA) and NP_002996 (protein)).

本明細書で使用される用語「イメージング剤」は、画像技術を用いて、特定の生物学的成分（例えば、生体分子）を検出するために使用することができる化合物を指す。本発明のイメージング剤は、少なくとも一つの検出可能な部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含む分子である。本発明のイメージング剤は、in vitro及びex vivo生体系並びに対象において、セレクチンを検出するために使用することができる。   The term “imaging agent” as used herein refers to a compound that can be used to detect a specific biological component (eg, a biomolecule) using imaging techniques. The imaging agent of the present invention is a molecule comprising at least one fucoidan moiety associated with at least one detectable moiety. The imaging agents of the present invention can be used to detect selectins in in vitro and ex vivo biological systems and subjects.

用語「フコイダン部分」は、セレクチンに対して高い親和性、特異性及び／又は選択性を示す任意のフコイダンエンティティ（fucoindan entity）を指す。本発明に関して、フコイダン部分が分子（例えば、イメージング剤）の一部である場合、その分子に対してその特異性／選択性／親和性を付与し、そして、分子が「セレクチン標的」になる（即ち、分子がセレクチンと特異的及び／又は効果的に相互作用及び／又は結合する）。   The term “fucoidan moiety” refers to any fucoindan entity that exhibits high affinity, specificity and / or selectivity for selectins. In the context of the present invention, when a fucoidan moiety is part of a molecule (eg, an imaging agent), it confers its specificity / selectivity / affinity to that molecule, and the molecule becomes a “selectin target” ( That is, the molecule interacts and / or binds specifically and / or effectively with selectin).

用語「結合親和性」及び「親和性」は、本明細書において互換的に使用され、これは、分子エンティティ間の引力のレベルを指す。親和性は、解離定数（Ｋ_ｄ又はＫ_Ｄ）、あるいは、その反対の会合定数（Ｋ_ａ又はＫ_Ａ）として定量的に表すことができる。 The terms “binding affinity” and “affinity” are used interchangeably herein and refer to the level of attraction between molecular entities. Affinity can be expressed quantitatively as the dissociation constant (K _d or K _D ) or the opposite association constant (K _a or K _A ).

本明細書で使用される用語「検出可能な部分」は、分子の一部である場合に、例えば、画像技術を用いて、その分子を可視化することができる任意のエンティティを指す。   The term “detectable moiety” as used herein refers to any entity that, when part of a molecule, can visualize the molecule, for example using imaging techniques.

用語「セレクチンが関与する病態」、「セレクチンが関与する疾患」及び「セレクチンが関与する障害」は、本明細書において互換的に使用される。これらは、望ましくない又は異常なセレクチン介在性相互作用を特徴とする任意の疾患状態を指す。このような状態には、例えば、炎症部位への白血球のホーミング、二次リンパ器官への正常なリンパ球のホーミング、血小板と活性化内皮細胞との相互作用、血管コンパートメントにおける血小板−血小板及び血小板−白血球相互作用などが関与する又はこれらから生じる疾患状態が挙げられる。このような疾患状態の例には、組織移植拒絶反応、血小板介在性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化及び凝固）、機能亢進性冠循環（hyperactive coronary circulation）、急性白血球介在性肺損傷（例えば、成人呼吸窮迫症候群−ＡＲＤＳ）、クローン病、炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、重症筋無力症）、感染症、癌（転移を含む）、血栓症、傷創及び傷創関連敗血症、熱傷、脊髄損傷、消化管粘膜障害（例えば、胃炎、潰瘍）、骨粗しょう症、関節リウマチ、骨関節炎、喘息、アレルギー、乾癬、敗血性ショック、脳卒中、腎炎、アトピー性皮膚炎、凍傷、成人呼吸困難症候群、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病及び虚血発作後の再かん流傷害が挙げられるが、これらに限定されない。   The terms “pathology involving selectin”, “diseases involving selectin” and “disorders involving selectin” are used interchangeably herein. These refer to any disease state characterized by undesirable or abnormal selectin-mediated interactions. Such conditions include, for example, homing of leukocytes to the site of inflammation, normal lymphocyte homing to secondary lymphoid organs, interaction of platelets with activated endothelial cells, platelet-platelet and platelet- in the vascular compartment Examples include disease states involving or arising from leukocyte interactions. Examples of such disease states include tissue transplant rejection, platelet mediated diseases (eg, atherosclerosis and coagulation), hyperactive coronary circulation, acute leukocyte mediated lung injury (eg, Adult respiratory distress syndrome (ARDS), Crohn's disease, inflammatory disease (eg, inflammatory bowel disease), autoimmune disease (eg, multiple sclerosis, myasthenia gravis), infection, cancer (including metastasis), Thrombosis, wounds and wound-related sepsis, burns, spinal cord injury, gastrointestinal mucosal disorders (eg gastritis, ulcers), osteoporosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, asthma, allergy, psoriasis, septic shock, stroke, Include, but are not limited to, nephritis, atopic dermatitis, frostbite, adult respiratory distress syndrome, ulcerative colitis, systemic lupus erythematosus, diabetes and reperfusion injury after ischemic attack .

本明細書で使用される用語「対象」は、ヒト又は別の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又は霊長類）を指す。多くの実施態様においては、対象はヒトである。このような実施態様においては、対象は、その対象がある疾患又は臨床症状に罹患している場合、「個体」又は「患者」と呼ばれることが多い。用語「対象」、「個体」及び「患者」は、特定の年齢を意味するものではなく、そのため、成人、小児及び新生児が包含される。   As used herein, the term “subject” refers to a human or another mammal (eg, mouse, rat, rabbit, hamster, dog, cat, cow, pig, sheep, horse or primate). In many embodiments, the subject is a human. In such embodiments, a subject is often referred to as an “individual” or “patient” if the subject suffers from a disease or clinical condition. The terms “subject”, “individual” and “patient” do not imply a particular age and thus include adults, children and newborns.

用語「生物試料」は、本明細書においてその最も広い意味で使用される。生物試料は、一般的に、対象から得られる。試料は、セレクチンを産生及び／又は含有することができる任意の生物組織又は体液であることができる。試料は、「臨床試料」、即ち、患者由来の試料であることが多い。このような試料には、細胞含有又は非含の体液、例えば、血液、尿、唾液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、滑液、組織又は細針生検試料並びに周知の診断、処置及び／又は転帰履歴を示す保管試料が挙げられるが、これらに限定されない。生物試料は、また、組織学的使用のための凍結切片などの組織切片を含むことができる。用語「生物試料」は、また、生物試料を処理して生成する任意の物質を包含する。生成する物質には、試料から単離された細胞（又はその子孫）、試料から抽出されたタンパク質又は他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。生物試料の処理は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、干渉成分の不活性化、試薬の添加などの一つ以上を含むことができる。   The term “biological sample” is used herein in its broadest sense. A biological sample is generally obtained from a subject. The sample can be any biological tissue or fluid that can produce and / or contain selectins. The sample is often a “clinical sample”, i.e. a patient-derived sample. Such samples include body fluids containing or not containing cells such as blood, urine, saliva, cerebrospinal fluid (CSF), synovial fluid, tissue or fine needle biopsy samples and well-known diagnostic, treatment and / or outcome histories. However, the present invention is not limited to these. Biological samples can also include tissue sections such as frozen sections for histological use. The term “biological sample” also encompasses any material produced by processing a biological sample. Substances produced include, but are not limited to, cells isolated from the sample (or progeny thereof), proteins or other molecules extracted from the sample. The treatment of the biological sample can include one or more of filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interference components, addition of reagents, and the like.

本発明のセレクチン標的イメージング剤又はその医薬組成物に関して、本明細書で使用される場合の用語「有効量」は、その使用目的（例えば、その目的は、生体系又は対象に存在するセレクチンの検出及び／又はイメージング、及び／又はセレクチンが関与する疾患の診断であることができる）を満たすのに十分なイメージング剤又は医薬組成物の任意の量を指す。   With respect to the selectin-targeted imaging agent of the present invention or pharmaceutical composition thereof, the term “effective amount” as used herein refers to the intended use (eg, the purpose is to detect selectins present in a biological system or subject). And / or imaging, and / or diagnosis of diseases involving selectins), which refers to any amount of imaging agent or pharmaceutical composition sufficient to satisfy.

本明細書で使用される「医薬組成物」は、少なくとも１つのセレクチン標的イメージング剤又は生理学的に許容しうるその塩及び少なくとも１つの薬学的に許容されうる担体を含むものとして定義される。   A “pharmaceutical composition” as used herein is defined as comprising at least one selectin-targeted imaging agent or a physiologically acceptable salt thereof and at least one pharmaceutically acceptable carrier.

用語「生理学的に許容しうる塩」は、遊離塩基又は遊離酸の生物活性及び特性を保持し、且つ、生物学的又は他の点においても望ましくないものではない任意の酸付加塩又は塩基付加塩を指す。酸付加塩は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）；及び有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸など）とから形成される。塩基付加塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム塩など）、及び有機塩基（例えば、一級、二級及び三級アミン、天然の置換アミンなどの置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチル−アミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの塩）とから形成することができる。   The term “physiologically acceptable salt” refers to any acid addition salt or base addition that retains the biological activity and properties of the free base or free acid and is not biologically or otherwise undesirable. Refers to salt. Acid addition salts include inorganic acids (eg, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid); and organic acids (eg, acetic acid, propionic acid, pyruvic acid, maleic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid). Acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, salicylic acid, etc.). Base addition salts include inorganic bases (eg, sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, zinc, aluminum salts, etc.) and organic bases (eg, primary, secondary and tertiary amines, natural substituted amines, etc.) Substituted amines, cyclic amines and basic ion exchange resins such as isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, ethanolamine, 2-dimethyl-aminoethanol, 2-diethylaminoethanol, trimethamine, dicyclohexylamine, lysine, arginine Histidine, caffeine, procaine, hydrabamine, choline, betaine, ethylenediamine, glucosamine, methylglucamine, theobromine, purines, piperazine, piperidine, N-ethylpi Lysine, it can be formed from the salt), such as polyamine resin.

本明細書で使用される用語「薬学的に許容されうる担体」は、活性成分の生物活性効果と干渉することなく、投与される濃度でホストに対して過度に毒性を示さない担体媒体を指す。この用語には、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で公知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin, 18^thEd., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA参照）。 The term “pharmaceutically acceptable carrier” as used herein refers to a carrier medium that is not excessively toxic to the host at the concentration administered, without interfering with the bioactive effects of the active ingredients. . The term includes solvents, dispersion media, coating agents, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, adsorption retarders and the like. Pharmaceutically use of such media and agents for active substances is known in the art (e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, EW Martin , 18 th Ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, See PA).

用語「処置」は、本明細書において、（１）疾患又は病状（例えば、セレクチン介在性状態又は病状）の発症を遅延又は予防する；（２）状態又は病状の症状を進行、深刻化又は悪化を遅らせる若しくは止める；（３）状態又は病状の症状の改善をもたらす；及び／又は（４）状態又は病状を治癒することを目的とする、方法又はプロセスを特徴づけるために使用される。処置は、予防（prophylactic）又は予防的（preventive）措置のために、疾患の発症の前に施すことができる。代わりに又は追加的に、処置は、治療的措置のために、疾患又は病状の発生後に施すことができる。   The term “treatment”, as used herein, (1) delays or prevents the onset of a disease or condition (eg, a selectin-mediated condition or condition); (2) advances, aggravates or worsens the symptoms of the condition or condition Used to characterize a method or process aimed at ameliorating the symptoms of a condition or medical condition; and / or (4) curing a condition or medical condition. Treatment can be given before the onset of the disease for prophylactic or preventive measures. Alternatively or additionally, treatment can be given after the occurrence of the disease or condition for therapeutic treatment.

数値に関して本明細書で使用される、用語「およそ（approximately）」及び「約（about）」は、特に明記しない限り又は本文から明らかでない限り、一般的に、数値のいずれかの方向（該数値超又は未満）の１０％の範囲の数値を包含する（このような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）。   As used herein with respect to numerical values, the terms “approximately” and “about” generally refer to any direction of a numerical value (unless it is specifically stated or apparent from the text). Include values in the range of 10% (exceeding or less than) (unless such values exceed 100% of possible values).

特定の好ましい実施態様の詳細な説明
上述したように、本発明は、セレクチンのイメージング及びセレクチンが関与する病態生理学的状態の診断のためのフコイダンの使用に関する。特に、本発明は、画像技術を用いて、in vitro、ex vivo並びにin vivoにおいて、セレクチンの存在を特異的に検出するためのイメージング剤、キット及び戦略を包含する。 Detailed Description of Certain Preferred Embodiments As noted above, the present invention relates to the use of fucoidan for imaging selectins and diagnosing pathophysiological conditions involving selectins. In particular, the present invention encompasses imaging agents, kits and strategies for specifically detecting the presence of selectins in vitro, ex vivo and in vivo using imaging techniques.

Ｉ−セレクチン標的イメージング剤
一態様においては、本発明は、セレクチンに対して高い親和性及び特異性を有する新しい種類のイメージング剤に関する。さらに具体的には、少なくとも一つの検出可能な部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含むセレクチン標的イメージング剤が提供される。 I-Selectin Targeted Imaging Agents In one aspect, the present invention relates to a new class of imaging agents that have high affinity and specificity for selectins. More specifically, there is provided a selectin-targeted imaging agent comprising at least one fucoidan moiety associated with at least one detectable moiety.

フコイダン部分
フコイダン（フコサン又は硫酸化フカンとも呼ばれる）は、抗凝固、抗血栓、抗ウイルス、抗腫瘍、免疫調節、抗炎症及び抗酸化活性などの生物活性を有する広域スペクトラム硫酸化多糖である（B. Li et al., Molecules, 2008, 13: 1671-1695; D. Logeart et al., J. Biomed. Mater Res., 1996, 30: 501-508）。フコイダンは、様々な種類のワカメで主に見つかっている（B. Li et al., Molecules, 2008, 13: 1671-1695; M. Kusaykin et al., Biotechnol. J., 2008, 3: 904-915）。また、フコイダンの異型が、ナマコなどの海洋動物種で発見された。従って、他の硫酸化多糖と比較して、フコイダンは、様々な種類の安価な供給源から広範に入手することができ、当技術分野で公知の抽出方法を用いて容易に得られる（C. Colliec et al., Phytochemistry, 1994, 35(3): 697-700）。これらの抽出方法からは、通常、分子量７０〜８００kDaのフコイダンが得られる。また、高分子量フコイダンから低分子量フコイダン、例えば、約２０kDa未満のフコイダン（EP 0 403 377B, 米国特許第5,321,133号）又は約１０kDa未満のフコイダン（EP 0 846 129 B; 米国特許第6,028,191号; A. Nardella et al., Carbohydr. Res., 1996, 289: 201-208）を調製するプロセスが開発された。 Fucoidan moiety Fucoidan (also called fucosane or sulfated fucan) is a broad spectrum sulfated polysaccharide with biological activities such as anticoagulant, antithrombotic, antiviral, antitumor, immunomodulatory, anti-inflammatory and antioxidant activities (B Li et al., Molecules, 2008, 13: 1671-1695; D. Logeart et al., J. Biomed. Mater Res., 1996, 30: 501-508). Fucoidan is mainly found in various types of seaweed (B. Li et al., Molecules, 2008, 13: 1671-1695; M. Kusaykin et al., Biotechnol. J., 2008, 3: 904- 915). A fucoidan variant was also found in marine species such as sea cucumbers. Thus, compared to other sulfated polysaccharides, fucoidan is widely available from various types of inexpensive sources and is easily obtained using extraction methods known in the art (C. Colliec et al., Phytochemistry, 1994, 35 (3): 697-700). From these extraction methods, fucoidan having a molecular weight of 70 to 800 kDa is usually obtained. Also, high molecular weight fucoidan to low molecular weight fucoidan, for example, fucoidan less than about 20 kDa (EP 0 403 377B, US Pat. No. 5,321,133) or fucoidan less than about 10 kDa (EP 0 846 129 B; US Pat. No. 6,028,191; Nardella et al., Carbohydr. Res., 1996, 289: 201-208) has been developed.

フコイダンは、４位及び２又は３位が硫酸化されており、グリコシド結合でつながっているα−１，２−又はα−１，３−結合Ｌ−フコースポリマーである。しかし、フコース及び硫酸残基の他に、フコイダンは、また、他の単糖（例えば、マンノース、ガラクトース、グルコース、キシロースなど）及びウロン酸基を含有する。異なる褐藻類由来のフコイダンで構造が種によって異なることは、当技術分野で公知である。さらに、フコイダンの構造を化学修飾することもできる。例えば、過硫酸化フコイダン又は過硫酸化フコイダンフラグメントを得るために、フコイダンの硫酸基の割合を増加させる方法が開発された（T.Nishino et al., Carbohydr. Res., 1992, 229: 355-362; S. Soeda et al., Thromb. Res., 1993, 72: 247-256）。   Fucoidan is an α-1,2- or α-1,3-linked L-fucose polymer that is sulfated at the 4 and 2 or 3 positions and is linked by glycosidic bonds. However, in addition to fucose and sulfate residues, fucoidan also contains other monosaccharides (eg, mannose, galactose, glucose, xylose, etc.) and uronic acid groups. It is known in the art that the structure of fucoidan derived from different brown algae varies by species. Furthermore, the structure of fucoidan can be chemically modified. For example, in order to obtain a persulfated fucoidan or a persulfated fucoidan fragment, a method of increasing the proportion of sulfate groups of fucoidan has been developed (T.Nishino et al., Carbohydr. Res., 1992, 229: 355- 362; S. Soeda et al., Thromb. Res., 1993, 72: 247-256).

本発明での使用に適したフコイダン部分は、セレクチンに対してある程度の引力を有し、イメージング剤に含まれる場合に、標的化の役割を担うことができるフコイダン部分である。好ましくは、フコイダン部分は、in vitro及びin vivo条件下で、その親和性／特異性／選択性を保持する安定で非毒性なエンティティである。好ましい実施態様においては、フコイダン部分は、セレクチンに対して高い親和性及び特異性を示す、即ち、これらがセレクチンと特異的に、且つ、効果的的に相互作用、結合又は会合する。適切なフコイダン部分には、１つのセレクチン（即ち、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン又はＰ−セレクチン）についてのみ親和性及び特異性を示すフコイダン、並びに、３種のセレクチン全てと効果的に相互作用、結合又は会合することができる部分を含有する、２つ以上のセレクチンに対して親和性及び特異性を示すフコイダンが含まれる。好ましくは、セレクチンとイメージング剤のフコイダン部分間の相互作用は、画像技術を用いて、少なくともセレクチンを検出するのに必要な時間は十分に強固である。特定の実施態様においては、適切なフコイダン部分は、セレクチンと、約０．１nM〜約５００nM、好ましくは、約０．５nM〜約１０nM、より好ましくは、約１nM〜約５nMの解離定数（Ｋ_ｄ）で相互作用する。 Fucoidan moieties suitable for use in the present invention are fucoidan moieties that have some degree of attraction to selectins and can play a targeting role when included in an imaging agent. Preferably, the fucoidan moiety is a stable, non-toxic entity that retains its affinity / specificity / selectivity under in vitro and in vivo conditions. In a preferred embodiment, the fucoidan moieties exhibit high affinity and specificity for selectins, i.e., they interact, bind or associate specifically and effectively with selectins. Appropriate fucoidan moieties include fucoidan that exhibits affinity and specificity for only one selectin (ie, L-selectin, E-selectin or P-selectin) and effectively interacts with all three selectins, Included are fucoidans that display affinity and specificity for two or more selectins containing moieties that can bind or associate. Preferably, the interaction between the selectin and the fucoidan moiety of the imaging agent is sufficiently strong for at least the time required to detect the selectin using imaging techniques. In certain embodiments, a suitable fucoidan moiety is a selectin and a dissociation constant (K _{d) of} about 0.1 nM to about 500 nM, preferably about 0.5 nM to about 10 nM, more preferably about 1 nM to about 5 nM. ) To interact.

本発明のイメージング剤の設計は、その使用目的及びその使用の特定の状況に望ましい特性により決定される。従って、フコイダン部分は、これらの公知の観測又は予測された特性に基づいて選択されるであろう。例えば、本発明のイメージング剤が、脳における望ましくない又は異常なセレクチン介在性相互作用を特徴とする神経変性障害の診断で使用される実施態様においては、イメージング剤は、好ましくは、血液脳関門を通過することができる。従って、このようなイメージング剤は、好ましくは、低分子量のフコイダン部分（例えば、２〜８kDa又は５kDa未満）を含有する。対照的に、高分子量のフコイダン部分を含有するイメージング剤は、その薬剤が、血管系において、セレクチンをイメージングするために使用される場合により適している。実際に、高分子量であるために、イメージング剤は容易に拡散することができず、そのため、血管系内に留まりやすく、それによって、対象の系の高選択的な標的を可能にする。   The design of the imaging agent of the present invention is determined by its intended use and the properties desired for the particular situation of use. Thus, the fucoidan moiety will be selected based on these known observed or predicted characteristics. For example, in an embodiment where the imaging agent of the present invention is used in the diagnosis of a neurodegenerative disorder characterized by undesirable or abnormal selectin-mediated interactions in the brain, the imaging agent preferably comprises a blood brain barrier. Can pass through. Accordingly, such imaging agents preferably contain a low molecular weight fucoidan moiety (eg, less than 2-8 kDa or less than 5 kDa). In contrast, imaging agents that contain high molecular weight fucoidan moieties are more suitable when the agents are used to image selectins in the vasculature. In fact, because of the high molecular weight, the imaging agent cannot easily diffuse and therefore tends to remain in the vasculature, thereby allowing a highly selective target of the subject system.

高分子量のフコイダン部分は、また、多くの検出可能な部分を有することができ、それによって、イメージング剤の感度を増加させることができる利点を有しうる（即ち、低濃度のセレクチンの検出を可能にする）。これらの分子量に加えて、フコイダン部分はその硫酸塩含有量に基づいて選択することができる。硫酸塩含有量を変更することにより（天然フコイダンの選択又は化学修飾のいずれかにより）、１つのセレクチン（Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン又はＰ−セレクチン）に対して、フコイダン部分（及び対応するイメージング剤）の特異性を改変することが可能である。例えば、Ｐ−及びＥ−セレクチンとの結合がリガンドの硫酸基の存在に伴って増加することが知られている（T.V. Pochechueva et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2003, 13: 1709-1712）。   A high molecular weight fucoidan moiety can also have the advantage of having many detectable moieties, thereby increasing the sensitivity of the imaging agent (ie, allowing detection of low concentrations of selectins). ). In addition to these molecular weights, the fucoidan moiety can be selected based on its sulfate content. By changing the sulfate content (either by selection of natural fucoidan or by chemical modification) for one selectin (L-selectin, E-selectin or P-selectin), the fucoidan moiety (and corresponding imaging) It is possible to modify the specificity of the agent. For example, it is known that the binding to P- and E-selectin increases with the presence of the sulfate group of the ligand (TV Pochechueva et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2003, 13: 1709-1712). .

代わりに又は追加的に、フコイダン部分は、その構造に基づいて、特に、フコイダン部分を検出可能な部分と会合させるために使用することができる少なくとも１個の官能基（又は、使用することができる異なる官能基に容易に化学変換することができる官能基）の存在に基づいて選択することができる。適切な官能基の例には、カルボキシ基、チオール、アミノ基（好ましくは、一級アミノ基）などが挙げられるが、これらに限定されない。   Alternatively or additionally, the fucoidan moiety can be used based on its structure, in particular at least one functional group (or can be used to associate the fucoidan moiety with a detectable moiety. The selection can be based on the presence of functional groups that can be readily chemically converted to different functional groups. Examples of suitable functional groups include, but are not limited to, carboxy groups, thiols, amino groups (preferably primary amino groups), and the like.

検出可能な部分
本発明に関して、検出可能な部分は、超音波検査、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ポジトロンエミッショントモグラフィ（ＰＥＴ）、シングルフォトンエミッションコンピュータトモグラフィ（ＳＰＥＣＴ）、蛍光分光法、コンピュータトモグラフィ、Ｘ線ラジオグラフィー又はこれらの技術の任意の組み合わせなどの画像技術により検出可能なエンティティである。好ましくは、検出可能な部分は、セレクチン標的イメージング剤の一部である場合、in vitro及びin vivo条件下でその特性を保持する安定で非毒性なエンティティである。 Detectable moiety In the context of the present invention, the detectable moiety includes ultrasound examination, magnetic resonance imaging (MRI), positron emission tomography (PET), single photon emission computed tomography (SPECT), fluorescence spectroscopy, computer tomography. , An entity detectable by imaging techniques such as X-ray radiography or any combination of these techniques. Preferably, the detectable moiety is a stable, non-toxic entity that retains its properties under in vitro and in vivo conditions when it is part of a selectin targeted imaging agent.

放射性イメージング部分
特定の実施態様においては、セレクチン標的イメージング剤は、プラナーシンチグラフィ（ＰＳ）、ポジトロンエミッショントモグラフィ（ＰＥＴ）及びシングルフォトンエミッションコンピュータトモグラフィ（ＳＰＥＣＴ）などの核医学画像技術により検出可能なように設計される。このような実施態様においては、本発明のイメージング剤は、少なくとも一つの放射性核種（即ち、放射性同位体）と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含む。 Radioimaging moiety In certain embodiments, the selectin-targeted imaging agent is detectable by nuclear medicine imaging techniques such as planar scintigraphy (PS), positron emission tomography (PET) and single photon emission computed tomography (SPECT). Designed as such. In such embodiments, the imaging agents of the present invention comprise at least one fucoidan moiety that is associated with at least one radionuclide (ie, a radioisotope).

ＳＰＥＣＴ及びＰＥＴは、腫瘍、動脈瘤、様々な組織への不規則な血流又は血流不足、血球細胞障害、並びに甲状腺機能及び肺機能の欠損などの器官の機能不全を検出するために使用されている。両方の技術から、生物試料又は患者の体内に導入された放射性核種の濃度についての情報が得られる。ＰＥＴは、陽電子放出放射性核種により間接的に放出される一対のγ線を検出することにより画像を生成する。ＰＥＴ分析では、目的の領域（例えば、脳、胸部、肝臓）全体にわたって、身体の一連の薄片画像（thin slice image）が得られる。これらの薄片画像から、検査領域を三次元表示にすることができる。しかし、この技術で使用する寿命の短い放射性同位元素を生成するのに必要な粒子加速装置の近傍に位置する必要があるため、ＰＥＴセンターはわずかしかない。ＳＰＥＣＴは、ＰＥＴと似ているが、ＳＰＥＣＴで使用する放射性物質は、ＰＥＴで使用する放射性物質より崩壊時間が長く、二重γ線の代わりに単一γ線を放出する。ＳＰＥＣＴ画像は、ＰＥＴ画像より感度がより低く、そしてＰＥＴ画像ほど詳細ではないが、ＳＰＥＣＴ技術はＰＥＴほど高価ではなく粒子加速器の近傍である必要がないという利点がある。プラナーシンチグラフィ（ＰＳ）は、同じ放射性核種を使用するという点でＳＰＥＣＴと似ている。しかし、ＰＳからは２Ｄ情報しか得られない。   SPECT and PET are used to detect organ dysfunctions such as tumors, aneurysms, irregular blood flow or insufficiency to various tissues, blood cell damage, and thyroid and lung function defects. ing. Both techniques provide information about the concentration of radionuclides introduced into the biological sample or patient. PET generates an image by detecting a pair of gamma rays emitted indirectly by a positron emitting radionuclide. In PET analysis, a series of thin slice images of the body are obtained over the entire region of interest (eg, brain, chest, liver). From these flake images, the inspection area can be displayed in three dimensions. However, there are only a few PET centers because it needs to be located in the vicinity of the particle accelerator required to produce the short-lived radioisotopes used in this technology. SPECT is similar to PET, but the radioactive material used in SPECT has a longer decay time than the radioactive material used in PET and emits a single gamma ray instead of a double gamma ray. Although SPECT images are less sensitive than PET images and are not as detailed as PET images, SPECT technology has the advantage that it is not as expensive as PET and does not need to be near the particle accelerator. Planar scintigraphy (PS) is similar to SPECT in that it uses the same radionuclide. However, only 2D information can be obtained from PS.

従って、特定の実施態様においては、本発明のイメージング剤における検出可能な部分は、ＰＥＴにより検出可能な放射性核種である。このような放射性核種の例には、炭素−１１（^１１Ｃ）、窒素−１３（^１３Ｎ）、酸素−１５（^１５Ｏ）及びフッ素−１８（^１８Ｆ）が挙げられる。 Thus, in certain embodiments, the detectable moiety in the imaging agent of the invention is a radionuclide that is detectable by PET. Examples of such radionuclides, carbon ^{-11 (11} C), nitrogen ^{-13 (13} N), oxygen -15 ⁽¹⁵ O) and fluorine -18 ⁽¹⁸ F) and the like.

他の実施態様においては、検出可能な部分は、プラナーシンチグラフィ又はＳＰＥＣＴにより検出可能な放射性核種である。このような放射性核種の例には、テクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、ガリウム−６７（^６７Ｇａ）、イットリウム−９１（^９１Ｙ）、インジウム−１１１（^１１１Ｉｎ）、レニウム−１８６（^１８６Ｒｅ）及びタリウム−２０１（^２０１Ｔｌ）が挙げられる。好ましくは、放射性核種は、テクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）である。最近実施されている慣用的な核医学方法の８５％超が、^９９ｍＴｃに基づく放射性薬学的手法を用いている。 In other embodiments, the detectable moiety is a radionuclide that is detectable by planar scintigraphy or SPECT. Examples of such radionuclides, ^{technetium-99m (99m} Tc), gallium ^-67 (67 Ga), yttrium ^{-91 (91} Y), ^{indium--111 (111} In), rhenium ^{-186 (186} Re) and And thallium-201 ( ²⁰¹ Tl). Preferably, the radionuclide is technetium- ^99m ( ^99m Tc). More than 85% of conventional nuclear medicine methods currently practiced use radiopharmaceutical techniques based on ^99m Tc.

ＭＲＩイメージング部分
特定の実施態様においては、セレクチン標的イメージング剤は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）により検出可能なように設計される。核磁気共鳴（ＮＭＲ）を応用したＭＲＩは、診断臨床医学及び生物医学研究において、最も強力な非侵襲的技術の一つへと発展した。これは、潜在的に有害な身体的異常を同定するための、血流を観測するための、あるいは心臓血管系の総合的な状態を測定するための、非侵襲的診断ツールとして広く用いられている。ＭＲＩは、潜在的に有害な電離放射線に依存しない利点を有する（他の高技術のイメージング方法に対して）。 MRI Imaging Part In certain embodiments, the selectin targeted imaging agent is designed to be detectable by magnetic resonance imaging (MRI). Nuclear magnetic resonance (NMR) applied MRI has evolved into one of the most powerful non-invasive techniques in diagnostic clinical medicine and biomedical research. It is widely used as a non-invasive diagnostic tool to identify potentially harmful physical abnormalities, to observe blood flow, or to measure the overall state of the cardiovascular system Yes. MRI has the advantage of not relying on potentially harmful ionizing radiation (as opposed to other high-tech imaging methods).

従って、特定の実施態様においては、本発明のイメージング剤は、少なくとも一つの常磁性金属イオンと会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含む。ＭＲＩにより検出可能な常磁性金属イオンの例には、ガドリニウムＩＩＩ（Ｇｄ^３＋）、クロムＩＩＩ（Ｃｒ^３＋）、ジスプロシウムＩＩＩ（Ｄｙ^３＋）、鉄ＩＩＩ（Ｆｅ^３＋）、マンガンＩＩ（Ｍｎ^２＋）及びイッテルビウムＩＩＩ（Ｙｂ^３＋）が挙げられる。特定の好ましい実施態様においては、常磁性金属イオンは、ガドリニウムＩＩＩ（Ｇｄ^３＋）である。ガドリニウムは、ＭＲＩ用のＦＤＡ承認の造影剤である。 Accordingly, in certain embodiments, the imaging agents of the present invention comprise at least one fucoidan moiety that is associated with at least one paramagnetic metal ion. Examples of paramagnetic metal ions detectable by MRI include gadolinium III (Gd ³⁺ ), chromium III (Cr ³⁺ ), dysprosium III (Dy ³⁺ ), iron III (Fe ³⁺ ), manganese II (Mn ²⁺ ) and ytterbium. III (Yb ³⁺ ). In certain preferred embodiments, the paramagnetic metal ion is gadolinium III (Gd ³⁺ ). Gadolinium is an FDA approved contrast agent for MRI.

他の実施態様においては、本発明のイメージング剤は、少なくとも一つの極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）粒子と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含む。ＵＳＰＩＯ粒子は、ヒトの病変をイメージングするための造影剤として現在開発中である（C. Corot et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, 56: 1472-1504）。これらは、周囲の水の磁気共鳴シグナルに大きな撹乱をもたらす数多くの鉄原子を含有する結晶酸化鉄のコアから構成されている。量子ドット（超高感度蛍光プローブとして現在開発中）などの他のタイプのナノ粒子とは対照的に、ＵＳＰＩＯ粒子は、極めて良好な生体適合性を示す。ＵＳＰＩＯ粒子の化学コーティングは、これらの粒子を生体媒質中に拡散させるために必要とされる。また、適切なコーティングが行われると、結果として粒子クリアランスを減少させることができ（「ステルス」効果）、これらの粒子が特定の組織を標的とすることができる分子と結合するための手段を提供することができる（R. Weissleder et al., Magn. Reson. Q, 1992, 8: 55-63）。現在、デキストラン及びそのカルボキシメチル化誘導体などの多糖が、コーティング剤として使用されている。本発明は、ＵＳＰＩＯ粒子をフコイダン部分でコートし、得られたイメージング剤を、ＭＲＩによるセレクチン検出に使用することを提示する。このような本発明のイメージング剤を、セレクチンが関与する心臓血管病変の診断に適用することができる。実際に、半径約１５nmのＵＳＰＩＯ粒子は、アテローム動脈硬化性壁などのより透過性が高い病変血管組織を除いた血管腔の外側で、わずかに拡散する傾向がある。従って、これらは、良好な血液プールイメージング剤となる（J. Bremerich et al., Eur. Radiol., 2007, 17: 3017-3024）。   In another embodiment, the imaging agent of the present invention comprises at least one fucoidan moiety associated with at least one minimal superparamagnetic iron oxide (USPIO) particle. USPIO particles are currently under development as contrast agents for imaging human lesions (C. Corot et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, 56: 1472-1504). These are composed of crystalline iron oxide cores containing numerous iron atoms that cause large disturbances in the magnetic resonance signal of the surrounding water. In contrast to other types of nanoparticles, such as quantum dots (currently being developed as an ultrasensitive fluorescent probe), USPIO particles exhibit very good biocompatibility. A chemical coating of USPIO particles is required to diffuse these particles into the biological medium. Also, when properly coated, the resulting particle clearance can be reduced (the “stealth” effect), providing a means for these particles to bind to molecules that can target specific tissues. (R. Weissleder et al., Magn. Reson. Q, 1992, 8: 55-63). Currently, polysaccharides such as dextran and its carboxymethylated derivatives are used as coating agents. The present invention proposes that USPIO particles are coated with a fucoidan moiety and the resulting imaging agent is used for selectin detection by MRI. Such an imaging agent of the present invention can be applied to diagnosis of cardiovascular lesions involving selectins. In fact, USPIO particles with a radius of about 15 nm tend to diffuse slightly outside the vessel lumen except for more permeable lesioned vascular tissue such as atherosclerotic walls. They are therefore good blood pool imaging agents (J. Bremerich et al., Eur. Radiol., 2007, 17: 3017-3024).

ＵＳＰＩＯ粒子は、当技術分野で公知であり、これまでに記載されている（例えば、J. Petersein et al., Magn. Reson. Imaging Clin. Am., 1996, 4: 53-60; B. Bonnemain, J. Drug Target, 1998, 6: 167-174; E.X. Wu et al., NMR Biomed., 2004, 17: 478-483; C. Corot et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, 58: 1471-1504; M. Di Marco et al., Int. J. Nanomedicine, 2007, 2: 609-622参照）。ＵＳＰＩＯ粒子は市販されており、例えば、商標名Sinerem（登録商標）及びCombidex（登録商標）でAMAG Pharmaceuticals, Inc.から販売されている。   USPIO particles are known in the art and have been described previously (eg, J. Petersein et al., Magn. Reson. Imaging Clin. Am., 1996, 4: 53-60; B. Bonnemain). , J. Drug Target, 1998, 6: 167-174; EX Wu et al., NMR Biomed., 2004, 17: 478-483; C. Corot et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 2006, 58 : 1471-1504; see M. Di Marco et al., Int. J. Nanomedicine, 2007, 2: 609-622). USPIO particles are commercially available, for example, sold by AMAG Pharmaceuticals, Inc. under the trade names Sinerem® and Combidex®.

造影超音波検査法イメージング部分
特定の実施態様においては、セレクチン標的イメージング剤は、造影超音波検査法（ＣＥＵＳ）により検出可能なように設計される。超音波は、ヒトの疾患をスクリーニング及び早期発見するために幅広く利用されている技術である。これは、ＭＲＩ又はシンチグラフィーほど高価ではなく、そして、放射線を必要としないため、放射性核種イメージングなどの分子イメージング診断法よりも安全である。 Contrast-enhanced sonography imaging moiety In certain embodiments, the selectin-targeted imaging agent is designed to be detectable by contrast-enhanced ultrasound (CEUS). Ultrasound is a widely used technique for screening and early detection of human diseases. This is safer than molecular imaging diagnostic methods such as radionuclide imaging because it is not as expensive as MRI or scintigraphy and does not require radiation.

従って、特定の実施態様においては、本発明のイメージング剤は、少なくとも一つの音響的に活性な（ガス封入）マイクロバブルと会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含む。様々な音響的に活性なマイクロバブルを、本発明の実施で使用することができる（A.L. Klibanov, Bioconj. Chem., 2005, 16: 9-17; J.R. Lindner, Nat. Rev. Drug Discov., 2004, 3: 527-532; M. McCulloch et al., J. Am. Soc. Echocardiogr., 2000, 13: 959-967; A.M. Takalkar et al., J. Contr. Release, 2004, 96: 473-482; G.E. Weller et al., Biotechnol. Bioeng., 2005, 92: 780-788）。   Accordingly, in certain embodiments, the imaging agents of the present invention comprise at least one fucoidan moiety associated with at least one acoustically active (gas encapsulated) microbubble. A variety of acoustically active microbubbles can be used in the practice of the present invention (AL Klibanov, Bioconj. Chem., 2005, 16: 9-17; JR Lindner, Nat. Rev. Drug Discov., 2004). , 3: 527-532; M. McCulloch et al., J. Am. Soc. Echocardiogr., 2000, 13: 959-967; AM Takalkar et al., J. Contr. Release, 2004, 96: 473-482 GE Weller et al., Biotechnol. Bioeng., 2005, 92: 780-788).

一般的に、このようなマイクロバブルは、ガスコア及びシェルからなる。ガスコアは、これにより検出が可能となるため、マイクロバブルの最も重要な部分である。ガスバブルが超音波周波数の磁場におかれると、これらは圧縮され、振動し、そして特徴的なエコーを反射して、これは、ＣＥＵＳにおいて、明瞭でユニークなソノグラムを生成する。ガスコアは、空気又はペルフルオロカーボン若しくは窒素などの重質ガスからなることができる。重質ガスコアを有するマイクロバブルは、空気を含むコアを有するマイクロバブルと比べて血液循環における持続性がより高い。シェル材料は、マイクロバブルが免疫系によりどの程度取り込まれ易いかを決定する。より親水性の高い材料からなるシェルを有するマイクロバブルでは、免疫系によってより容易に取り込まれる傾向があるが、一方で、より疎水性の高いシェル材料では、マイクロバブルの血液循環中の滞留時間が増加する傾向があり、これにより、コントラストイメージングに使用可能な時間が増加する。マイクロバブルシェルは、アルブミン、ガラクトース、脂質又はポリマーからなることができる（J.R. Lindner, Nat. Rev. Drug Discov., 2004, 3: 527-532）。シェル又はガスコアの組成に関わらず、マイクロバブルのサイズは、ほぼ均一である。これらの直径は、通常、１〜４マイクロメータの範囲である。従って、これらは赤血球よりも小さく、血管の循環さらには微小循環中を容易に流れることができる（F.S. Vallanueva et al., Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med., 2008, 5 Suppl. 2: S26-S32）。   In general, such microbubbles consist of a gas core and a shell. The gas core is the most important part of the microbubble because it allows detection. When gas bubbles are placed in an ultrasonic frequency magnetic field, they are compressed, vibrate, and reflect characteristic echoes, which produce a distinct and unique sonogram in CEUS. The gas core can be composed of air or a heavy gas such as perfluorocarbon or nitrogen. Microbubbles having a heavy gas core are more persistent in blood circulation than microbubbles having a core containing air. The shell material determines how easily microbubbles are taken up by the immune system. Microbubbles with shells made of more hydrophilic materials tend to be more easily taken up by the immune system, while more hydrophobic shell materials have a microbubble residence time in the blood circulation. There is a tendency to increase, which increases the time available for contrast imaging. Microbubble shells can consist of albumin, galactose, lipids or polymers (J.R. Lindner, Nat. Rev. Drug Discov., 2004, 3: 527-532). Regardless of the composition of the shell or gas core, the size of the microbubbles is nearly uniform. These diameters are typically in the range of 1-4 micrometers. Therefore, they are smaller than erythrocytes and can flow easily in the circulation of blood vessels and even in the microcirculation (FS Vallanueva et al., Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med., 2008, 5 Suppl. 2: S26). -S32).

他の実施態様においては、本発明のイメージング剤は、少なくとも一つの音響的に活性な脂質粒子（即ち、ガス封入リポソーム）と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含む。様々な音響的に活性な脂質粒子が当技術分野で公知であり、本発明の実施で使用することができる（H. Alkan-Onyuksel et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85: 486-490; S.M. Demos et al., J. Am. Coll. Cardiol., 1999, 33: 867-875; S.L. Huang et al., J. Pharm. Sci., 2001, 90: 1917-1926; S.L. Huang et al., J. Ultrasound Med., 2002, 28: 339-348; A. Hamilton et al., Circulation, 2002, 105: 2772-2778）。   In other embodiments, the imaging agent of the present invention comprises at least one fucoidan moiety associated with at least one acoustically active lipid particle (ie, gas encapsulated liposome). A variety of acoustically active lipid particles are known in the art and can be used in the practice of the present invention (H. Alkan-Onyuksel et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85: 486). -490; SM Demos et al., J. Am. Coll. Cardiol., 1999, 33: 867-875; SL Huang et al., J. Pharm. Sci., 2001, 90: 1917-1926; SL Huang et al., J. Ultrasound Med., 2002, 28: 339-348; A. Hamilton et al., Circulation, 2002, 105: 2772-2778).

蛍光イメージング部分
特定の実施態様においては、セレクチン標的イメージング剤は、蛍光分光法により検出可能なように設計される。このような実施態様においては、本発明のイメージング剤は、少なくとも一つの蛍光部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含む。 Fluorescent imaging moiety In certain embodiments, the selectin-targeted imaging agent is designed to be detectable by fluorescence spectroscopy. In such embodiments, the imaging agent of the present invention comprises at least one fucoidan moiety that is associated with at least one fluorescent moiety.

本発明の実施で使用される蛍光部分の好ましい光学特性には、高い分子吸収係数、高い蛍光量子収率及び光安定性が含まれる。好ましい蛍光部分は、可視（即ち、４００〜７００nm）又は近赤外線（即ち、７００〜９５０nm）において、吸収及び発光波長を示す。特定の蛍光部分の選択は、診断方法で使用される照射及び検出システムの性質及び特性により決定される。In vivo蛍光イメージングは、哺乳類の生体全身において、蛍光分子（fluorophore）からの蛍光発光を、高感度カメラを使用して検出する。生体組織での光子減衰を防ぐために、近赤外線（ＮＩＲ）領域で発光する蛍光分子が、一般的に好ましい（J. Rao et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2007, 18: 17-25）。近年、蛍光有機、無機及びバイオナノ粒子が追加されて、ＮＩＲプローブのリストが増加し続けている。in vivo蛍光イメージングにおける、近年のイメージング戦略及びレポーター技術の進歩には、プローブの特異性及び親和性を改善し、そして、感度を増強するために標的部位でのシグナルを調節及び増幅する新規なアプローチ法が含まれる。さらなる将来に向けた開発は、高い解像度、集学的手法及び寿命法によるin vivo蛍光イメージングを達成することを目的とする。   Preferred optical properties of the fluorescent moiety used in the practice of the present invention include high molecular absorption coefficient, high fluorescent quantum yield and light stability. Preferred fluorescent moieties exhibit absorption and emission wavelengths in the visible (ie, 400-700 nm) or near infrared (ie, 700-950 nm). The selection of a particular fluorescent moiety is determined by the nature and characteristics of the illumination and detection system used in the diagnostic method. In vivo fluorescence imaging detects fluorescence emission from fluorophore in the whole body of a mammal using a sensitive camera. In order to prevent photon decay in living tissue, fluorescent molecules that emit light in the near infrared (NIR) region are generally preferred (J. Rao et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2007, 18: 17-25). . In recent years, the list of NIR probes continues to increase with the addition of fluorescent organic, inorganic and bio-nanoparticles. Recent advances in imaging strategy and reporter technology in in vivo fluorescence imaging include a novel approach to improve probe specificity and affinity, and to modulate and amplify signals at target sites to enhance sensitivity Law included. Developments for further futures aim to achieve in vivo fluorescence imaging with high resolution, multidisciplinary techniques and lifetime methods.

様々な構造及び特性を有する蛍光部分の多くが、本発明の実施での使用に適している。適切な蛍光標識には、量子ドット（即ち、蛍光無機半導体ナノ結晶）、並びに、テキサスレッド、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ローダミン、フルオレセイン、カルボシアニン、Ｃｙ−３^ＴＭ及びＣｙ−５^ＴＭ（即ち、３−及び５−Ｎ，Ｎ’−ジエチルテトラ−メチルインドジカルボシアニン）、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６８０及びＡｔｔｏ５６５染料、メロシアニン、スチリル染料、オキソノール染料、ＢＯＤＩＰＹ染料（即ち、ボロンジピロメテンジフルオリド蛍光分子）、これらの分子のアナログ、誘導体又は組み合わせなどの蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。 Many of the fluorescent moieties having various structures and properties are suitable for use in the practice of the present invention. Suitable fluorescent labels include quantum dots (ie, fluorescent inorganic semiconductor nanocrystals), as well as Texas Red, fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), rhodamine, fluorescein, carbocyanine, Cy-3 ^™ and Cy- 5 ^TM (ie 3- and 5-N, N′-diethyltetra-methylindodicarbocyanine), Cy5.5, Cy7, DY-630, DY-635, DY-680 and Atto565 dyes, merocyanine, styryl dyes Fluorescent dyes such as, but not limited to, oxonol dyes, BODIPY dyes (ie, boron dipyrromethene difluoride fluorescent molecules), analogs, derivatives or combinations of these molecules.

特定の実施態様においては、検出可能な部分は、時間分解蛍光測定法により検出可能である。例えば、検出可能な部分は、ユウロピウム（Ｅｕ^３＋）である。 In certain embodiments, the detectable moiety can be detected by time-resolved fluorometry. For example, the detectable moiety is europium (Eu ³⁺ ).

当業者に理解されるように、セレクチン標的イメージング剤の設計における、特定のタイプの検出可能な部分の選択は、イメージング剤の使用目的並びに検出に用いられる画像技術により決定されるであろう。   As will be appreciated by those skilled in the art, the selection of a particular type of detectable moiety in the design of a selectin-targeted imaging agent will be determined by the intended use of the imaging agent and the imaging technique used for detection.

特定の実施態様においては、本発明のイメージング剤は、二つ以上の画像技術、例えば、ＭＲＩ−ＰＥＴ、ＭＲＩ−ＳＰＥＣＴ、蛍光−ＭＲＩ、Ｘ線ラジオグラフィー−シンチグラフィーなどの組み合わせにより検出可能なように設計することができる。マルチモーダルイメージングは、生物組織についての様々な種類の情報、例えば、構造及び機能特性の両方を提供する。従って、例えば、イメージング剤は、二つ以上の画像技術により検出可能な少なくとも一つの検出可能な部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含むことができる。このような検出可能な部分の例には、蛍光性の、ＭＲＩにより検出可能なユウロピウム；及び、in vivo蛍光及びＭＲＩ用の造影剤として開発された常磁性Ｇｄ_２Ｏ_３コアを有する発光性のハイブリッドナノ粒子（J.L; Bridot et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129: 5076-5084）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、イメージング剤は、第一の検出可能な部分及び第二の検出可能な部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含むことができ、ここで、第一の検出可能な部分は、第一の画像技術により検出可能であり、第二の検出可能な部分は、第二の画像技術により検出可能である。従って、二重検出能を有する様々なイメージング剤を得ることができる。また、２つの異なるイメージング剤（即ち、第一の画像技術により検出可能な第一のイメージング剤及び第二の画像技術により検出可能な第二のイメージング剤）の同時使用も意図される。 In certain embodiments, the imaging agents of the invention appear to be detectable by a combination of two or more imaging techniques, such as MRI-PET, MRI-SPECT, fluorescence-MRI, X-ray radiography-scintigraphy, etc. Can be designed to Multimodal imaging provides various types of information about biological tissue, such as both structural and functional properties. Thus, for example, an imaging agent can include at least one fucoidan moiety associated with at least one detectable moiety detectable by two or more imaging techniques. Examples of such detectable moieties include: fluorescent, europium detectable by MRI; and luminescent with a paramagnetic Gd ₂ O ₃ core developed as a contrast agent for in vivo fluorescence and MRI. Hybrid nanoparticles (JL; Bridot et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129: 5076-5084) are included, but are not limited to these. Alternatively, the imaging agent can include a first detectable moiety and at least one fucoidan moiety associated with the second detectable moiety, wherein the first detectable moiety is the first detectable moiety. The second detectable technique can be detected by the second image technique. Therefore, various imaging agents having dual detection ability can be obtained. Also contemplated is the simultaneous use of two different imaging agents (ie, a first imaging agent detectable by a first imaging technique and a second imaging agent detectable by a second imaging technique).

セレクチン標的イメージング剤の合成
本発明のイメージング剤を、当技術分野で公知の任意の合成方法により調製することができる。唯一の必要条件は、反応後に、フコイダン部分及び検出可能な部分が、それぞれ親和性及び検出能特性を保持していることである。フコイダンと検出可能な部分は、様々な方法のいずれかで会合することができる。会合は、共有又は非共有結合であってもよい。会合が共有結合である場合、フコイダンと検出可能な部分は、互いに直接的又は間接的（例えば、リンカーを介して）に結合することができる。検出可能な部分が金属エンティティである場合、フコイダン部分は、金属キレート部分を介して、検出可能な金属エンティティに会合することができる。 Synthesis of Selectin Targeted Imaging Agent The imaging agent of the present invention can be prepared by any synthetic method known in the art. The only requirement is that after the reaction, the fucoidan moiety and the detectable moiety retain the affinity and detectability properties, respectively. Fucoidan and the detectable moiety can be associated in any of a variety of ways. The association may be covalent or non-covalent. If the association is a covalent bond, the fucoidan and the detectable moiety can be linked directly or indirectly (eg, via a linker) to each other. If the detectable moiety is a metal entity, the fucoidan moiety can associate with the detectable metal entity via a metal chelate moiety.

さらに具体的には、特定の実施態様においては、フコイダン部分と検出可能な部分は、互いに直接共有結合で連結する。直接の共有結合は、アミド、エステル、炭素−炭素、ジスルフィド、カーバメート、エーテル、チオエーテル、ウレア、アミン又はカーボネート結合を介して形成される。共有結合は、フコイダン部分及び検出可能な部分に存在する官能基を利用して形成されうる。２つの部分を結合させるために使用することができる適切な官能基には、アミン（好ましくは、一級アミノ基）、無水物、ヒドロキシ基、カルボキシ基及びチオールが挙げられるが、これらに限定されない。また、直接の連結は、カルボジイミドなどの活性化試薬を使用して、例えば、一方の部分に存在する一級アミノ基を、他方の部分に存在するカルボキシ基に結合させることにより形成することができる。本発明での使用に適した活性化試薬は、当技術分野で公知である。   More specifically, in certain embodiments, the fucoidan moiety and the detectable moiety are directly covalently linked to each other. Direct covalent bonds are formed through amide, ester, carbon-carbon, disulfide, carbamate, ether, thioether, urea, amine or carbonate linkages. Covalent bonds can be formed utilizing functional groups present on the fucoidan moiety and the detectable moiety. Suitable functional groups that can be used to join the two moieties include, but are not limited to, amines (preferably primary amino groups), anhydrides, hydroxy groups, carboxy groups, and thiols. The direct linkage can also be formed by using an activating reagent such as carbodiimide, for example, by binding a primary amino group present in one part to a carboxy group present in the other part. Activating reagents suitable for use in the present invention are known in the art.

他の実施態様においては、フコイダン部分と検出可能な部分は、リンカーを介して、互いに間接的に共有結合で連結する。これは、当技術分野で公知の、ホモ官能性及びヘテロ官能性リンカーなどの多種多様の安定な二官能性試薬を使用して達成することができる。二官能性リンカーの使用は、活性化試薬を使用する場合とは異なり、二官能性リンカーを使用した場合では、反応後に、連結部分が本発明のイメージング剤に存在することになるが、活性化試薬を使用した場合では、結果として、反応に関与する２つの部分が直接カップリングする。二官能性リンカーの主要な役割は、二つの本来化学的に不活性な部分を反応させることができるようにすることである。しかし、反応生成物の一部となる二官能性リンカーは、また、イメージング剤にある程度の立体配置柔軟性を付与するように選択されうる（例えば、二官能性リンカーは、数種類の原子を含有するアルキル直鎖を含むことができる）。   In other embodiments, the fucoidan moiety and the detectable moiety are indirectly covalently linked to each other via a linker. This can be achieved using a wide variety of stable bifunctional reagents such as homofunctional and heterofunctional linkers known in the art. The use of a bifunctional linker is different from the case of using an activation reagent. In the case of using a bifunctional linker, the linking moiety is present in the imaging agent of the present invention after the reaction. When reagents are used, the result is a direct coupling between the two moieties involved in the reaction. The main role of the bifunctional linker is to be able to react two originally chemically inert moieties. However, the bifunctional linker that becomes part of the reaction product can also be selected to give the imaging agent some degree of configuration flexibility (eg, the bifunctional linker contains several types of atoms). Alkyl straight chain).

当技術分野で公知の広範で適切なホモ官能性及びヘテロ官能性リンカーを、本発明に関して使用することができる。好ましいリンカーには、アミノ、無水物、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボニル基などの反応性の化学官能性を有する直鎖及び分岐鎖アルキル基、置換アルキル及びアリール基、ヘテロアルキル及びヘテロアリール基などのアルキル及びアリール基が挙げられるが、これらに限定されない。   A wide range of suitable homofunctional and heterofunctional linkers known in the art can be used in connection with the present invention. Preferred linkers include linear and branched alkyl groups having reactive chemical functionality such as amino, anhydride, hydroxyl, carboxyl, carbonyl groups, substituted alkyl and aryl groups, alkyl such as heteroalkyl and heteroaryl groups, and Examples include, but are not limited to, aryl groups.

直接又は間接的共有結合の会合方法を、例えば、蛍光部分を含むセレクチン標的イメージング剤の合成に用いることができる。同様に、このような方法を、フコイダン部分を用いたＵＳＰＩＯ粒子のコーティングに（実施例３参照）、あるいは、音響的に活性なマイクロバブル又はリポソームにフコイダンをグラフトさせるために（実施例４参照）使用することができる。   Direct or indirect covalent association methods can be used, for example, to synthesize selectin-targeted imaging agents that contain a fluorescent moiety. Similarly, such a method can be used to coat USPIO particles with a fucoidan moiety (see Example 3) or to graft fucoidan into acoustically active microbubbles or liposomes (see Example 4). Can be used.

他の実施態様においては、フコイダンと検出可能な部分は、互いに、直接的に、しかし非共有結合的に会合する。非共有結合の会合には、疎水性相互作用、静電相互作用、双極子相互作用、ファン・デル・ワールス相互作用及び水素結合が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、フコイダン部分と検出可能な金属エンティティを、錯体形成により会合させることができる。適切な錯体形成方法には、例えば、フコイダン部分への金属エンティティの直接導入及び金属交換が挙げられる。可能であれば、直接導入が好ましい。このような方法では、一般的に、フコイダン部分の水溶液を金属塩に曝露させるか、あるいは金属塩と混合する。反応混合物のｐＨは、約４〜約１１であることができる。直接導入の方法は当技術分野で公知であり、様々な手順が記載されている（例えば、WO 87/06229参照）。本出願人は、低分子量フコイダンが、容易にテクネチウム−９９ｍと錯体形成することができることを明らかにした（実施例２参照）。金属交換の方法は、金属エンティティが、導入前に異なる酸化状態に還元される必要がある場合に用いられる。金属交換の方法は当技術分野で公知である。特定の放射性核種（例えば、^９９ｍＴｃ）の寿命が短いことを考慮すれば、直接導入をイメージング剤の使用の直前に行う必要があることが理解される。 In other embodiments, the fucoidan and the detectable moiety are associated with each other directly but non-covalently. Non-covalent associations include, but are not limited to, hydrophobic interactions, electrostatic interactions, dipole interactions, van der Waals interactions and hydrogen bonds. For example, a fucoidan moiety and a detectable metal entity can be associated by complexation. Suitable complexing methods include, for example, direct introduction of metal entities into the fucoidan moiety and metal exchange. Direct introduction is preferred if possible. In such methods, the aqueous solution of the fucoidan moiety is generally exposed to or mixed with the metal salt. The pH of the reaction mixture can be about 4 to about 11. Methods of direct introduction are known in the art and various procedures are described (see eg WO 87/06229). The applicant has shown that low molecular weight fucoidan can be easily complexed with technetium-99m (see Example 2). Metal exchange methods are used when a metal entity needs to be reduced to a different oxidation state prior to introduction. Metal exchange methods are known in the art. In view of the short lifetime of certain radionuclides (eg, ^99m Tc), it is understood that direct introduction must be performed immediately prior to use of the imaging agent.

フコイダンと検出可能な金属部分を直接的に非共有結合で会合させることが不可能である場合、セレクチン標的イメージング剤は、少なくとも一つの検出可能な部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含むことができ、ここで検出可能な部分は、検出可能な金属部分と錯体形成する金属キレート部分を含む。フコイダン部分と金属キレート部分の会合は、好ましくは共有結合である。本発明で使用される適切な金属キレート部分は、検出可能な金属部分と結合することが知られている、数多くの金属キレート剤及び金属錯化分子のいずれかであることができる。好ましくは、金属キレート部分は、放射性核種又は常磁性金属イオンと高い親和性で結合する安定で非毒性なエンティティである。   The selectin-targeted imaging agent may include at least one fucoidan moiety that associates with at least one detectable moiety if it is not possible to directly and non-covalently associate the fucoidan with the detectable metal moiety. The detectable moiety can include a metal chelate moiety that complexes with the detectable metal moiety. The association of the fucoidan moiety and the metal chelate moiety is preferably a covalent bond. Suitable metal chelating moieties for use in the present invention can be any of a number of metal chelators and metal complexing molecules known to bind to detectable metal moieties. Preferably, the metal chelate moiety is a stable, non-toxic entity that binds with high affinity to a radionuclide or paramagnetic metal ion.

ガドリニウムＩＩＩ（Ｇｄ^３＋）などの常磁性金属イオンの錯体形成に使用されている金属キレート部分の例には、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）；ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）；及びこれらの誘導体（例えば、米国特許第4,885,363号；5,087,440号；5,155,215号；5,188,816号；5,219,553号；5,262,532号；5,358,704号；及びD. Meyer et al., Invest. Radiol. 1990, 25: S53-55参照）、特に、ＤＴＰＡ−ビス（アミド）誘導体（米国特許第4,687,659号）が挙げられる。常磁性金属イオンと錯体形成する他の金属キレート部分には、アミノポリカルボン酸及びそのリンオキソ酸類縁体（例えば、トリエチレンテトラミンヘキサ酢酸又はＴＴＨＡ）、ジピリドキサール二リン酸（ＤＰＤＰ）などの非環式エンティティ、並びに、大環状エンティティ（例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸又はＤＯ３Ａ）が挙げられる。また、金属キレート部分は、米国特許第5,410,043号；5,277,895号；及び6,150,376号；又はF.H. Arnold, Biotechnol. 1991, 9: 151-156に記載のエンティティのいずれかであってもよい。 Examples of metal chelate moieties used to complex paramagnetic metal ions such as gadolinium III (Gd ³⁺ ) include DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid); DOTA (1,4,7,10-tetraazacyclododecane- N, N ′, N ″, N ′ ″-tetraacetic acid); and derivatives thereof (eg, US Pat. Nos. 4,885,363; 5,087,440; 5,155,215; 5,188,816; 5,219,553; 5,262,532; 5,358,704; and D. Meyer et al., Invest. Radiol. 1990, 25: S53-55), in particular DTPA-bis (amide) derivatives (US Pat. No. 4,687,659). Other metal chelating moieties that complex with paramagnetic metal ions include non-rings such as aminopolycarboxylic acids and their oxophosphoric acid analogs (eg, triethylenetetramine hexaacetic acid or TTHA), dipyridoxal diphosphate (DPDP), etc. Formula entities, as well as macrocyclic entities such as 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ′, N ″ -triacetic acid or DO3A. Alternatively, the metal chelate moiety may be any of the entities described in US Pat. Nos. 5,410,043; 5,277,895; and 6,150,376; or FH Arnold, Biotechnol. 1991, 9: 151-156.

テクネチウム−９９ｍなどの放射性核種と錯体形成する金属キレート部分の例には、例えば、Ｎ_２Ｓ_２及びＮ_３Ｓキレート剤が挙げられる（A.R. Fritzberg et al., J. Nucl. Med. 1982, 23: 592-598；米国特許第4,444,690号；4,670,545号；4,673,562号；4,897,255号；4,965,392号；4,980,147号；4,988,496号；5,021,556号及び5,075,099号）。他の適切な金属キレート部分は、ポリホスフェート（例えば、エチレンジアミンテトラメチレンテトラ−ホスフェート、ＥＤＴＭＰ）；アミノカルボン酸（例えば、ＥＤＴＡ、Ｎ−（２−ヒドロキシ）エチレンジアミン三酢酸、ニトリロ三酢酸、Ｎ，Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）グリシン、エチレンビス（ヒドロキシフェニルグリシン）及びジエチレントリアミン五酢酸）；１，３−ジケトン（例えば、アセチルアセトン、トリフルオロアセチルアセトン及びテノイルトリフルオロアセトン）；ヒドロキシカルボン酸（例えば、酒石酸、クエン酸、グルコン酸及び５−スルホサリチル酸）；ポリアミン（例えば、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン及びトリアミノトリエチルアミン）；アミノアルコール（例えば、トリエタノールアミン及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン）；芳香族複素環塩基（例えば、２，２’−ジイミダゾール、ピコリンアミン、ジピコリンアミン及び１，１０−フェナントロリン）；フェノール（例えば、サリチルアルデヒド、ジスルホピロカテコール及びクロモトロプ酸）；アミノフェノール（例えば、８−ヒドロキシキノリン及びオキシムスルホン酸）；オキシム（例えば、ヘキサメチルプロピレン−アミンオキシム、ＨＭＰＡＯ）；シッフ塩基（例えば、ジサリチルアルデヒド、１，２−プロピレンジイミン）；テトラピロール（例えば、テトラフェニルポルフィン及びフタロシアニン）；硫黄化合物（例えば、トルエンジチオール、メソ−２，３−ジメルカプトコハク酸、ジメルカプトプロパノール、チオグリコール酸、エチルキサンチン酸カリウム、ナトリウムジエチルジチオカルバメート、ジチゾン、ジチオリン酸ジエチル及びチオウレア）；合成大環状化合物（例えば、ジベンゾ［１８］クラウン−６）又は上記試薬の二つ以上の組み合わせから選択することができる。 Examples of metal chelating moieties that complex with radionuclides such as technetium-99m include, for example, N ₂ S ₂ and N ₃ S chelating agents (AR Fritzberg et al., J. Nucl. Med. 1982, 23 U.S. Pat. Nos. 4,444,690; 4,670,545; 4,673,562; 4,897,255; 4,965,392; 4,980,147; 4,988,496; 5,021,556 and 5,075,099). Other suitable metal chelating moieties include polyphosphates (eg, ethylenediaminetetramethylenetetra-phosphate, EDTMP); aminocarboxylic acids (eg, EDTA, N- (2-hydroxy) ethylenediaminetriacetic acid, nitrilotriacetic acid, N, N -Di (2-hydroxyethyl) glycine, ethylenebis (hydroxyphenylglycine) and diethylenetriaminepentaacetic acid); 1,3-diketones (eg acetylacetone, trifluoroacetylacetone and thenoyltrifluoroacetone); hydroxycarboxylic acids (eg tartaric acid) , Citric acid, gluconic acid and 5-sulfosalicylic acid); polyamines (eg, ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetraamine and triaminotriethylamine); amino alcohols (Eg triethanolamine and N- (2-hydroxyethyl) ethylenediamine); aromatic heterocyclic bases (eg 2,2′-diimidazole, picolinamine, dipicolinamine and 1,10-phenanthroline); phenols (eg , Salicylaldehyde, disulfopyrocatechol and chromotropic acid); aminophenols (eg, 8-hydroxyquinoline and oxime sulfonic acid); oximes (eg, hexamethylpropylene-amine oxime, HMPAO); Schiff bases (eg, disalicylaldehyde) 1,2-propylene diimine); tetrapyrrole (eg, tetraphenylporphine and phthalocyanine); sulfur compounds (eg, toluene dithiol, meso-2,3-dimercaptosuccinic acid, dimercaptopropa Thioglycolic acid, potassium ethylxanthate, sodium diethyldithiocarbamate, dithizone, diethyl dithiophosphate and thiourea); synthetic macrocycles (eg dibenzo [18] crown-6) or combinations of two or more of the above reagents You can choose from.

当業者にとって容易に理解されるように、本発明のセレクチン標的イメージング剤は、様々な異なる方法により互いに連結された様々なフコイダン部分及び様々な検出可能な部分を含むことができる。本発明のイメージング剤の範囲内のフコイダン部分は、全て同一であっても異なっていてもよい。同様に、本発明のイメージング剤の範囲内の検出可能な部分は、全て同一であっても異なっていてもよい。セレクチン標的イメージング剤の正確な設計は、その使用目的及びその使用の特定の状況に望ましい特性により影響される。   As will be readily appreciated by those skilled in the art, the selectin-targeted imaging agents of the present invention can include various fucoidan moieties and various detectable moieties linked together by a variety of different methods. The fucoidan moieties within the scope of the imaging agent of the present invention may all be the same or different. Similarly, all detectable moieties within the scope of the imaging agent of the present invention may be the same or different. The exact design of a selectin-targeted imaging agent is influenced by the properties desired for its intended use and the particular circumstances of its use.

ＩＩ−セレクチン標的イメージング剤の使用
本発明は、セレクチンの存在をイメージング及び検出する試薬及び戦略を提供する。さらに具体的には、本発明は、in vitro及びex vivo系並びにヒト患者などの生体対象における、セレクチンの検出、位置測定及び／又は定量化を可能にする画像技術及び方法により検出可能な標的試薬を提供する。提供される方法は、画像技術を用いて、イメージング剤の可視化を可能にする少なくとも一つの検出可能な部分と会合する、セレクチンに対して高い親和性及び特異性を有する少なくとも一つのフコイダン部分を含むセレクチン標的イメージング剤の使用に基づいている。 II-Use of Selectin Targeted Imaging Agents The present invention provides reagents and strategies for imaging and detecting the presence of selectins. More specifically, the present invention relates to target reagents detectable by imaging techniques and methods that enable the detection, localization and / or quantification of selectins in in vitro and ex vivo systems and biological subjects such as human patients. I will provide a. The provided method comprises at least one fucoidan moiety having high affinity and specificity for selectin that is associated with at least one detectable moiety that allows visualization of the imaging agent using imaging techniques. Based on the use of selectin-targeted imaging agents.

さらに具体的には、本発明は、生体系を有効量の本発明のセレクチン標的イメージング剤又はその医薬組成物と接触させる工程を含む、生体系におけるセレクチンの存在を検出する方法を提供する。接触は、好ましくは、相互作用によりイメージング剤とセレクチンとの結合が生じるように、イメージング剤が、前記系に存在するセレクチンと相互作用することができる条件下で行われる。次に、前記系に存在するセレクチンと結合するイメージング剤が、画像技術を用いて検出される。生体系の少なくとも一部の一つ以上の画像を生成することができる。   More specifically, the present invention provides a method for detecting the presence of selectin in a biological system comprising the step of contacting the biological system with an effective amount of a selectin-targeted imaging agent of the present invention or a pharmaceutical composition thereof. Contacting is preferably performed under conditions that allow the imaging agent to interact with the selectin present in the system, such that the interaction results in binding of the imaging agent to the selectin. Next, imaging agents that bind to selectins present in the system are detected using imaging techniques. One or more images of at least a portion of the biological system can be generated.

接触を、当技術分野で公知の任意の適切な方法により行うことができる。例えば、接触は、インキュベーションにより行うことができる。   Contacting can be done by any suitable method known in the art. For example, the contacting can be performed by incubation.

生体系は、セレクチンを産生及び／又は含有することができる、任意の生物学的エンティティであることができる。例えば、生体系は、細胞、体液又は生物組織であってもよい。生体系は、生体対象（例えば、それは、血液から又は生検により得ることができる）又は屍体対象（例えば、それは、剖検で得ることができる）由来であってもよい。対象は、ヒト又は他の哺乳類であってもよい。特定の好ましい実施態様においては、生体系は、セレクチンが関与する臨床症状を有する疑いがある患者に由来する。   A biological system can be any biological entity that can produce and / or contain selectins. For example, the biological system may be a cell, a body fluid, or a biological tissue. The biological system may be derived from a living subject (eg, it can be obtained from blood or by biopsy) or a rod subject (eg, it can be obtained at necropsy). The subject may be a human or other mammal. In certain preferred embodiments, the biological system is derived from a patient suspected of having a clinical condition involving selectins.

本発明は、また、患者におけるセレクチンの存在を検出するための方法を提供する。前記方法は、有効量の本発明のセレクチン標的イメージング剤又はその医薬組成物を患者に投与することを含む。投与は、好ましくは、イメージング剤が、（１）異常セレクチン（即ち、臨床症状に関与するセレクチン）を含有しうる患者の身体の領域に到達することを可能にし、そして（２）相互作用により、イメージング剤とセレクチンとの結合が生じるように、このようなセレクチンと相互作用することができる条件下で実施される。セレクチン標的イメージング剤を投与した後、及び相互作用が起こるのに十分な時間が経過した後、画像技術により、患者に存在する異常セレクチンに結合するイメージング剤が検出される。患者の身体の少なくとも一部の一つ以上の画像を生成することができる。   The present invention also provides a method for detecting the presence of selectin in a patient. The method includes administering to a patient an effective amount of a selectin-targeted imaging agent of the present invention or a pharmaceutical composition thereof. Administration preferably allows the imaging agent to (1) reach a region of the patient's body that may contain abnormal selectins (ie, selectins involved in clinical symptoms) and (2) by interaction, It is performed under conditions that allow interaction with such selectins so that binding of the imaging agent and selectin occurs. After administration of the selectin-targeted imaging agent and after sufficient time for the interaction to occur, imaging techniques detect imaging agents that bind to abnormal selectin present in the patient. One or more images of at least a portion of the patient's body can be generated.

セレクチン標的イメージング剤又はその医薬組成物の投与は、静脈内、動脈内、髄腔内、皮内、腔内投与などの経口及び非経口方法、並びに、経腸方法による投与などの当技術分野で公知の任意の適切な方法により実施することができる。   Administration of the selectin-targeted imaging agent or pharmaceutical composition thereof is carried out in the art such as oral and parenteral methods such as intravenous, intraarterial, intrathecal, intradermal, intracavitary administration, and administration by enteral methods. It can be carried out by any suitable method known in the art.

上述したように、セレクチン（生体系又は患者に存在する）に結合するイメージング剤は、造影超音波検査法、プラナーシンチグラフィ、ＳＰＥＣＴ、蛍光分光法又はこれらの組み合わせなどの画像技術を用いて検出される。   As noted above, imaging agents that bind to selectin (present in biological systems or patients) are detected using imaging techniques such as contrast ultrasound, planar scintigraphy, SPECT, fluorescence spectroscopy, or combinations thereof. The

患者又は患者から得られた生体系におけるセレクチンの存在を検出するために提供される本発明の方法は、セレクチンが関与する病態の診断に使用することができる。診断は、患者の身体の一部又は全体を検査及びイメージングすることにより、又は患者から得られる生体系（一つ以上の体液又は生物組織試料など）を検査及びイメージングすることにより達成することができる。どちらかの方法又は両方の組み合わせが、患者が罹患したと疑われる臨床症状に基づいて選択される。患者から得られた結果と臨床的に健康な個体での研究から得られたデータの比較から、診断を決定及び確定することが可能となる。   The methods of the invention provided for detecting the presence of selectin in a patient or a biological system obtained from a patient can be used for diagnosis of a pathological condition involving selectin. Diagnosis can be accomplished by examining and imaging a part or whole of the patient's body, or by examining and imaging a biological system (such as one or more body fluids or biological tissue samples) obtained from the patient. . Either method or a combination of both is selected based on the clinical symptoms suspected of affecting the patient. From a comparison of the results obtained from the patient and data obtained from studies with clinically healthy individuals, it is possible to determine and confirm the diagnosis.

これらの方法は、また、セレクチンが関与する病態の進行を追跡するために用いることができる。例えば、これは、患者における「異常」セレクチンの存在、位置、分布及び定量化についての経時変化を確立するために、一定の期間にわたってこの方法を繰り返すことにより達成することができる。   These methods can also be used to follow the progression of pathologies involving selectins. For example, this can be accomplished by repeating this method over a period of time to establish a time course for the presence, location, distribution and quantification of “abnormal” selectins in the patient.

これらの方法は、また、セレクチンが関与する病態のための処置に対する患者の反応をモニタリングするために使用することができる。例えば、「異常」セレクチンを含有する患者の身体の一部の画像（又は、患者に由来し、且つ、「異常」セレクチンを含有する生体系の一部の画像）は、患者が処置を受ける前後に得られる。「前」及び「後」の画像の比較から、その処置に対する患者の反応をモニタリングすることができる。   These methods can also be used to monitor patient response to treatment for conditions involving selectins. For example, an image of a part of a patient's body containing an “abnormal” selectin (or an image of a part of a biological system derived from the patient and containing an “abnormal” selectin) before and after the patient is treated Is obtained. From a comparison of “before” and “after” images, the patient's response to the treatment can be monitored.

本明細書で提供される本発明の方法により診断することができる、又はその進行を追跡することができる病態は、セレクチンが関与することが知られている任意の疾患及び障害、即ち、セレクチンが介在する望ましくない又は異常な相互作用を特徴とする任意の病状であることができる。本明細書で提供される方法を用いて有利に診断されうるこのような病状の例には、血栓症、心筋虚血／再かん流傷害、脳卒中及び虚血脳外傷、神経変性障害、腫瘍転移及び腫瘍増殖並びに関節リウマチが挙げられるが、これらに限定されない。   The pathologies that can be diagnosed by the methods of the invention provided herein, or whose progression can be followed, are any diseases and disorders known to involve selectin, i.e. selectin It can be any medical condition characterized by intervening undesirable or abnormal interactions. Examples of such pathologies that can be advantageously diagnosed using the methods provided herein include thrombosis, myocardial ischemia / reperfusion injury, stroke and ischemic brain trauma, neurodegenerative disorders, tumor metastasis And tumor growth and rheumatoid arthritis, but are not limited to these.

ＩＩＩ−医薬組成物
本明細書に記載のセレクチンの検出／イメージングの方法並びにセレクチンが関与する病態の診断の方法において、本発明のイメージング剤を、単独で又は医薬組成物として使用することができる。従って、一態様においては、本発明は、セレクチンが関与する臨床症状の診断のための組成物の製造のための、フコイダンの使用を提供する。別の態様においては、本発明は、少なくとも一つのセレクチン標的イメージング剤（又は任意の生理学的に許容しうるその塩）及び少なくとも一つの薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物を提供する。 III-Pharmaceutical Composition The imaging agent of the present invention can be used alone or as a pharmaceutical composition in the method for detecting / imaging selectin described herein and the method for diagnosing a disease state involving selectin. Accordingly, in one aspect, the invention provides the use of fucoidan for the manufacture of a composition for the diagnosis of clinical conditions involving selectins. In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising at least one selectin targeted imaging agent (or any physiologically acceptable salt thereof) and at least one pharmaceutically acceptable carrier.

特定の処方は、選択された投与経路に依存する。患者が罹患したと疑われる特定のタイプの病態及び検査される身体の部位に依存して、イメージング剤を局所的又は全身的に、経口送達（固体、溶液又は懸濁液として）あるいは注射により（例えば、静脈内、動脈内、髄腔内（即ち、髄液を通じて）、皮内又は腔内）投与することができる。   The particular formulation will depend on the route of administration chosen. Depending on the specific type of condition suspected of affecting the patient and the body part being examined, the imaging agent can be delivered locally or systemically, orally (as a solid, solution or suspension) or by injection ( For example, administration can be intravenous, intraarterial, intrathecal (ie, through cerebrospinal fluid), intradermal, or intracavity).

医薬組成物は、注射により投与されることが多い。注射で投与する場合、イメージング剤の医薬組成物は、無菌注射剤の即時調製用に、無菌の水溶液若しくは非水溶液、又は、代わりに無菌の粉末として製剤化することができる。このような医薬組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、そして細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護される必要がある。   The pharmaceutical composition is often administered by injection. When administered by injection, the pharmaceutical composition of the imaging agent can be formulated as a sterile aqueous or non-aqueous solution, or alternatively a sterile powder, for the immediate preparation of sterile injectables. Such pharmaceutical compositions must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi.

注射で投与するための薬学的に許容されうる担体は、水溶液（例えば、ハンク溶液、アルコール性／水性溶液又は食塩水）及び非水性担体（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル）などの溶媒又は分散媒である。注射用医薬組成物は、また、非経口用溶剤（塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど）及び／又は静脈内投与用溶剤（液補充剤、栄養補充剤など）；並びに、塩、緩衝液及び抗菌剤、抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（thirmerosal）など）などの防腐剤を含む、他の従来の薬学的に許容しうる、非毒性の賦形剤及び添加剤を含有してもよい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させることができる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を添加することにより実現できる。様々な成分のｐＨ及び濃度は、当業者が容易に決定することができる。   Pharmaceutically acceptable carriers for administration by injection include aqueous solutions (eg, Hank's solution, alcoholic / aqueous solution or saline) and non-aqueous carriers (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil and ethyl oleate) Or an organic ester for injection) or a dispersion medium. Injectable pharmaceutical compositions also include parenteral solvents (sodium chloride, Ringer's dextrose, etc.) and / or intravenous administration solvents (fluid supplements, nutritional supplements, etc.); and salts, buffers and antibacterial agents, Other conventional pharmaceutically acceptable non-toxic excipients and additives, including preservatives such as antifungal agents (eg, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thirmerosal, etc.) You may contain. Prolonged absorption of the injectable compositions can be brought about by the addition of agents capable of delaying absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin. The pH and concentration of the various components can be readily determined by one skilled in the art.

無菌注射剤は、活性化合物及び他の成分を必要な量の適切な溶媒に加え、次に得られた混合物を、例えば、濾過又は照射により滅菌して調製される。無菌注射剤の調製のための無菌粉末の製造方法には、真空乾燥及び凍結乾燥技術が挙げられる。   Sterile injections are prepared by adding the active compound and other ingredients to the required amount of a suitable solvent and then sterilizing the resulting mixture, for example, by filtration or irradiation. Methods for producing sterile powders for the preparation of sterile injectables include vacuum drying and freeze drying techniques.

一般的に、セレクチン標的イメージング剤（又はその医薬組成物）の用量は、患者の年齢、性別及び体重、並びに、患者が罹患したと疑われる特定の病態、疾患の程度、検査される身体の領域及び検出可能な部分の感度などの検討事項に従って変更される。禁忌、療法及び他の可変要素などの因子も、また、投与されるイメージング剤の用量を調整するために考慮されるべきである。しかし、これは、専門の医師により容易に達成することができる。   In general, the dose of the selectin-targeted imaging agent (or pharmaceutical composition thereof) depends on the patient's age, gender and weight, as well as the particular condition, severity of the disease suspected to be affected, and area of the body being examined. And changes according to considerations such as the sensitivity of the detectable part. Factors such as contraindications, therapy and other variables should also be considered to adjust the dose of imaging agent administered. However, this can be easily accomplished by a specialist physician.

一般的に、セレクチン標的イメージング剤（又はその医薬組成物）の適切な一日用量は、患者に存在する任意の関連した（即ち、一般的に過剰発現した）セレクチンの検出／イメージングを可能にするのに十分なイメージング剤（又は医薬組成物）の最小量に相当する。この用量を最小にするために、静脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下で、そして、好ましくは、検査される部位の近位に投与されることが望ましい。例えば、心臓／神経血管系をイメージングするためには、静脈内投与が適しており；一方、脳及び中枢神経系をイメージングするためには、髄腔内投与がより適している。   In general, an appropriate daily dose of a selectin-targeted imaging agent (or pharmaceutical composition thereof) allows detection / imaging of any relevant (ie, generally overexpressed) selectins present in the patient. This corresponds to the minimum amount of imaging agent (or pharmaceutical composition) sufficient to In order to minimize this dose, it is desirable to administer intravenously, intramuscularly, intraperitoneally or subcutaneously, and preferably proximal to the site being examined. For example, intravenous administration is suitable for imaging the heart / neurovascular system; whereas intrathecal administration is more suitable for imaging the brain and central nervous system.

ＩＶ−キット
別の態様においては、本発明は、本発明の診断方法を実施するために有用な材料を含むキットを提供する。本明細書に記載の診断手順は、臨床検査医、実験研究者又は開業医が行うことができる。 IV-Kits In another aspect, the present invention provides kits comprising materials useful for performing the diagnostic methods of the present invention. The diagnostic procedures described herein can be performed by a clinician, experimental researcher, or practitioner.

特定の実施態様においては、本発明のキットは、本発明に記載のセレクチン標的イメージング剤を作製するために、少なくとも一つのフコイダン及び少なくとも一つの検出可能なエンティティ、そして、場合により、フコイダンと検出可能なエンティティを会合させるための説明書を含む。検出可能なエンティティは、好ましくは、テクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、ガリウム−６７（^６７Ｇａ）、イットリウム−９１（^９１Ｙ）、インジウム−１１１（^１１１Ｉｎ）、レニウム−１８６（^１８６Ｒｅ）及びタリウム−２０１（^２０１Ｔｌ）などの寿命の短い放射性核種である。好ましくは、キットには、フコイダン及び検出可能なエンティティが、患者におけるセレクチンの検出及び特定の臨床症状の診断に適切な量のイメージング剤を調製するために十分な量で含有される。 In certain embodiments, the kits of the invention are detectable with at least one fucoidan and at least one detectable entity, and optionally with fucoidan, to produce a selectin-targeted imaging agent according to the invention. Includes instructions for associating various entities. Detectable entity, preferably ^{technetium-99m (99m} Tc), gallium ^-67 (67 Ga), yttrium ^{-91 (91} Y), ^{indium--111 (111} In), rhenium ^{-186 (186} Re) and thallium It is a short-lived radionuclide such as −201 ( ²⁰¹ Tl). Preferably, the kit contains fucoidan and a detectable entity in an amount sufficient to prepare an appropriate amount of imaging agent for detection of selectin and diagnosis of a particular clinical condition in a patient.

さらに、キットは、一つ以上の標識バッファー及び／又は試薬；精製バッファー、試薬及び／又は手段；注射媒体及び／又は試薬をさらに含むことができる。調製手順及び／又は投与の様々な工程を実施するための、これらのバッファー、試薬及び手段を使用するためのプロトコールをキットに含むことができる。   In addition, the kit can further comprise one or more labeling buffers and / or reagents; purification buffers, reagents and / or means; injection media and / or reagents. Protocols for using these buffers, reagents and means for carrying out the various steps of the preparation procedure and / or administration can be included in the kit.

本発明のキットに含まれる様々な成分を、固体形態（例えば、凍結乾燥）又は液体形態で供給することができる。本発明のキットは、場合により、それぞれ個々の成分用の異なる容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ又はボトル）を含むことができる。各成分は、一般的に、アリコートとしてその個別の容器に入れるのが適切であるか又は濃縮形態で提供される。また、調製方法の特定の工程を実施するのに適切な他の容器も提供される。キットの個々の容器は、好ましくは、販売用に厳重に密閉して維持される。   Various components included in the kits of the invention can be supplied in solid form (eg, lyophilized) or in liquid form. The kits of the present invention can optionally include different containers (eg, vials, ampoules, test tubes, flasks or bottles) for each individual component. Each component is generally suitable to be placed in its individual container as an aliquot or provided in a concentrated form. Other containers suitable for carrying out certain steps of the preparation method are also provided. The individual containers of the kit are preferably maintained in tight seal for sale.

特定の実施態様においては、キットは、本発明の方法に記載のセレクチンが関与する臨床症状の診断のための、その成分を使用するための説明書をさらに含む。本発明の方法に記載のキットを使用するための説明書は、フコイダンと検出可能なエンティティからイメージング剤を調製するための説明書、得られたイメージング剤の投与用量及び様式に関する説明書、セレクチンの検出を行うための説明書及び／又は得られた結果を解明するための説明書を含むことができる。キットは、また、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関により定められた形態に関する通知書を含むことができる。   In certain embodiments, the kit further comprises instructions for using the components for the diagnosis of clinical symptoms involving the selectins described in the methods of the invention. Instructions for using the kits described in the methods of the invention include instructions for preparing an imaging agent from fucoidan and a detectable entity, instructions for the dosage and mode of the resulting imaging agent, selectin Instructions for performing detection and / or instructions for elucidating the results obtained can be included. The kit can also include a notice regarding the form established by the government that regulates the manufacture, use or sale of the pharmaceutical or biological product.

以下の実施例は、本発明を作製及び実施する好ましい形態のいくつかを記載する。しかし、実施例が、単に説明を目的とするものであり、本発明を限定するものではないことを理解すべきである。さらに、実施例での記載が過去形で示されない限り、本文は、本明細書の残りと同様に、実験が実際に行われた、あるいは、データが実際に得られたこと示唆することを意図しているわけではない。   The following examples describe some of the preferred forms of making and practicing the present invention. However, it should be understood that the examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention. Further, unless the description in the examples is presented in the past tense, the text is intended to suggest that the experiment was actually performed or that the data was actually obtained, as in the remainder of this specification. I'm not doing it.

以下に報告される結果のいくつかは、科学論文（L.Bachelet et al., 「Affinity of low molecular weight fucoidan for P-selectin triggers its binding to activated human platelets」, Biochim. Biophys. Acta, 2009, 1790: 141-146）に示されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。以下に報告される他の結果は、International Carbohydrate Symposium, Oslo, Norway, July 24^th-August 1^st, 2008 (L. Bachelet et al., 「fucoidan: A sulfated polysaccharide to target activated platelets in atherosclerosis」）に示された。 Some of the results reported below are published in scientific papers (L. Bachelet et al., “Affinity of low molecular weight fucoidan for P-selectin triggers its binding to activated human platelets”, Biochim. Biophys. Acta, 2009, 1790. : 141-146), which is incorporated herein by reference in its entirety. Other results reported below can be found in International Carbohydrate Symposium, Oslo, Norway, July 24 ^th -August 1 ^st , 2008 (L. Bachelet et al., “Fucoidan: A sulfated polysaccharide to target activated platelets in atherosclerosis”). Indicated.

実施例１：ＬＭＷフコイダンは、Ｐ−セレクチンの高特異的リガンドである
材料及び方法
化学製品．フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、Fluka（Saint-Quentin Fallavier, France）から購入した；ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートは、Dako（Trappes, France）から購入した；ジアミノプロパン、シアノ水素化ホウ素ナトリウム及びペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳは、Sigma-Aldrich（Saint-Quentin Fallavier, France）から購入した；シナピン酸溶液は、Bio-Rad Laboratories（Hercules, CA, USA）から購入した；アミンカップリングキット及びランニングバッファーは、BIAcore（Uppsala, Sweden）から購入した。 Example 1: LMW fucoidan is a highly specific ligand of P-selectin Materials and Methods Chemicals. Fluorescein isothiocyanate (FITC) was purchased from Fluka (Saint-Quentin Fallavier, France); streptavidin-peroxidase conjugate was purchased from Dako (Trappes, France); diaminopropane, sodium cyanoborohydride and peroxidase substrate ABTS was purchased from Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France); sinapinic acid solution was purchased from Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA); amine coupling kit and running buffer were purchased from BIAcore (Uppsala , Sweden).

多糖．低分子量フコイダン（硫酸化繰り返しフコース単位に基づく；Ｍ＝７２００g/M；ＳＯ_４＝３０％（w/w））を、以前に記載されたようにしてワカメから調製した（A. Nardella et al., Carbohydr. Res., 1996,289: 201-208）。低分子量ヘパリン（Ｍ＝５７００g/M；ＳＯ_４＝４５％（w/w））及び低分子量硫酸デキストラン（Ｍ＝８０００g/M；ＳＯ_４＝５２％（w/w））は、Sigma-Aldrichから入手した；２０％molＳＬｅ^ｘ含有のビオチン化ポリアクリルアミド型複合糖質は、Lectinity Holding（Moscow, Russia）から得た。 Polysaccharides. Low molecular weight fucoidan (based on sulfated repeating fucose units; M = 7200 g / M; SO ₄ = 30% (w / w)) was prepared from seaweed as previously described (A. Nardella et al. , Carbohydr. Res., 1996,289: 201-208). Low molecular weight heparin (M = 5700 g / M; SO ₄ = 45% (w / w)) and low molecular weight dextran sulfate (M = 8000 g / M; SO ₄ = 52% (w / w)) are from Sigma-Aldrich Obtained; 20% mol SLe ^x containing biotinylated polyacrylamide type glycoconjugate was obtained from Lectinity Holding (Moscow, Russia).

生体化合物．組み換えヒトＰ−セレクチン（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１２１〜１２４kDa）及び組み換えヒトＰ−セレクチン／Ｆｃキメラ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１４６〜１６０kDa）は、R&D Systems（Lille, France）から得た；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、トロンビン受容体活性化ペプチド（ＴＲＡＰ）及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）は、Sigma-Aldrichから得た；そして精製ペプチド及びタンパク質標準品は、Bio-Rad Laboratoriesから得た。   Biological compounds. Recombinant human P-selectin (121-124 kDa for SDS-PAGE) and recombinant human P-selectin / Fc chimera (146-160 kDa for SDS-PAGE) were obtained from R & D Systems (Lille, France); bovine serum albumin (BSA) ), Thrombin receptor activating peptide (TRAP) and adenosine diphosphate (ADP) were obtained from Sigma-Aldrich; and purified peptides and protein standards were obtained from Bio-Rad Laboratories.

抗体．ＰＣ５標識ＩｇＧ（ＭＯＰＣ−２１クローン）、ＰＣ５標識抗ヒトＰ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ、ＡＫ−４クローン）、ＦＩＴＣ標識ＩｇＭ及びＦＩＴＣ標識ＰＡＣ−１（インテグリン複合体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性立体配置に対する）は、BD Biosciences（Le Pont de Claix, France）から入手した；ＦＩＴＣ標識ＩｇＧ（ＭＯＰＣ−２１クローン）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４１（インテグリンＧＰＩＩｂ）及びヤギ抗ヒトＦｃＩｇＧペルオキシダーゼは、Beckman-Coulter（Roissy, France）から入手した；ヤギ抗ヒトＦｃＩｇＧは、Sigma-Aldrichから入手した；抗ヒトＰ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ、Ｇ１クローン）は、COGER（Paris, France）入手した。   antibody. PC5-labeled IgG (MOPC-21 clone), PC5-labeled anti-human P-selectin (CD62P, AK-4 clone), FITC-labeled IgM and FITC-labeled PAC-1 (to the active configuration of integrin complex GPIIb / IIIa) are: FITC-labeled IgG (MOPC-21 clone), FITC-labeled anti-human CD41 (integrin GPIIb) and goat anti-human FcIgG peroxidase were obtained from Beckman-Coulter (Roissy, France), from BD Biosciences (Le Pont de Claix, France). Goat anti-human FcIgG was obtained from Sigma-Aldrich; anti-human P-selectin (CD62P, G1 clone) was obtained from COGER (Paris, France).

他の材料．Immulon 1Bマイクロタイタープレートは、VWR（Fontenay sous Bois, France）から寄付された。アニオン性タンパク質チップＣＭ１０は、Bio-Rad Laboratoriesから得た；ＣＭ５センサーチップはBIAcoreから得た。   Other materials. Immulon 1B microtiter plate was donated by VWR (Fontenay sous Bois, France). Anionic protein chip CM10 was obtained from Bio-Rad Laboratories; CM5 sensor chip was obtained from BIAcore.

多糖のＦＩＴＣ標識．５００mgの多糖及び２５０mgのＮａＢＨ_３ＣＮを、４mLの２．５Ｍジアミノプロパン塩酸塩溶液に添加した。６０℃で２４時間後、２５０mgのＮａＢＨ_３ＣＮを混合物に添加して、反応を４８時間実施した。試料を、凍結乾燥する前に、透析した（１０００Daをカットオフ）。１５０mgのアミノ化多糖を、６mLの０．５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解させた。６mgのＦＩＴＣを溶液に添加し、これを４℃、暗闇で２時間撹拌した。中性にした後、溶液を透析して（１０００Daをカットオフ）、凍結乾燥した。次に、着色した化合物を、１５０mg/mLで１ＭＮａＣｌに溶解させ、エタノールで沈殿し、４５００rpmで２０分間遠心して、遊離フルオレセインを除去した。このプロトコールを用いて、０．１９±０．０６蛍光色素分子／多糖鎖でグラフティングさせて、フコイダンの蛍光標識に成功した。 Polysaccharide FITC labeling. 500 mg polysaccharide and 250 mg NaBH ₃ CN were added to 4 mL of 2.5 M diaminopropane hydrochloride solution. After 24 hours at 60 ° C., 250 mg NaBH ₃ CN was added to the mixture and the reaction was carried out for 48 hours. Samples were dialyzed (1000 Da cut off) prior to lyophilization. 150 mg of aminated polysaccharide was dissolved in 6 mL of 0.5 M carbonate buffer (pH 9.6). 6 mg of FITC was added to the solution, which was stirred at 4 ° C. in the dark for 2 hours. After neutralization, the solution was dialyzed (1000 Da cut off) and lyophilized. The colored compound was then dissolved in 1M NaCl at 150 mg / mL, precipitated with ethanol and centrifuged at 4500 rpm for 20 minutes to remove free fluorescein. Using this protocol, fucoidan was successfully fluorescently labeled with 0.19 ± 0.06 fluorophore / polysaccharide chain.

シアリルルイスＸを用いたＰ−セレクチン結合アッセイ．このプロトコールは、以前に記載された方法（Weitz-Schmidt et al., Anal. Biochem., 1999, 273: 81-88）を適用したものであった。Ｐ−セレクチン／Ｆｃキメラ（５μg/mL；リン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ、１３７mMＮａＣｌ、８．１mMＮａ_２ＨＰＯ_４、１．４mMＫＨ_２ＰＯ_４及び２．７mMＫＣｌ、ｐＨ＝７．２）を、４℃で一晩かけて、マイクロタイタープレートにコートした。プレートを、アッセイバッファー（２０mMＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０mMＮａＣｌ及び１mMＣａＣｌ_２含有）で洗浄し、同バッファー中、３％ＢＳＡを用いて、４℃で４時間ブロッキングして、再度洗浄した。多糖又は抗ヒトＰ−セレクチン（Ｇ１クローン）及びビオチン化ＳＬｅ^ｘポリマーをアッセイバッファーで希釈して、Ｐ−セレクチンコートウェル又はＢＳＡコートウェル（非特異的コントロール）に添加し、４℃で一晩インキュベーションした。次に、プレートを洗浄し、アッセイバッファーで１：１０００に希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼをウェルに添加した。４℃で４時間後、プレートをアッセイバッファーで洗浄した。ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質溶液を添加して、１０分後、呈色反応を２％シュウ酸で停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、４０５nmの光学密度を測定して結合ＳＬｅ^ｘポリマーを決定した。 P-selectin binding assay using sialyl Lewis X. This protocol was adapted from a previously described method (Weitz-Schmidt et al., Anal. Biochem., 1999, 273: 81-88). P-selectin / Fc chimera (5 μg / mL; phosphate buffered saline PBS, 137 mM NaCl, 8.1 mM Na ₂ HPO ₄ , 1.4 mM KH ₂ PO ₄ and 2.7 mM KCl, pH = 7.2) at 4 ° C. The microtiter plate was coated overnight. The plate was washed with assay buffer (20 mM Hepes, pH 7.4, containing 150 mM NaCl and 1 mM CaCl ₂ ), blocked with 3% BSA in the same buffer for 4 hours at 4 ° C., and washed again. Polysaccharide or anti-human P-selectin (G1 clone) and biotinylated SLe ^x polymer are diluted in assay buffer and added to P-selectin or BSA-coated wells (non-specific control) and incubated overnight at 4 ° C. did. The plates were then washed and streptavidin-peroxidase diluted 1: 1000 in assay buffer was added to the wells. After 4 hours at 4 ° C., the plates were washed with assay buffer. The ABTS peroxidase substrate solution was added and 10 minutes later, the color reaction was stopped with 2% oxalic acid. Using a microplate reader, the optical density at 405 nm was measured to determine the bound SLe ^x polymer.

ＰＳＧＬ−１を用いたＰ−セレクチン結合アッセイ．Ｐ−セレクチン（５μg/mLのＰＢＳ溶液、１３７mMＮａＣｌ、８．１mMＮａ_２ＨＰＯ_４、１．４mMＫＨ_２ＰＯ_４及び２．７mMＫＣｌ、ｐＨ＝７．２）を、４℃で一晩かけて、マイクロタイタープレートにコートした。プレートを、アッセイバッファー（２０mMＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０mMＮａＣｌ及び１mMＣａＣｌ_２含有）で洗浄し、同バッファー中、３％ＢＳＡを用いて、４℃で４時間ブロッキングして、再度洗浄した。フコイダン及びＰＳＧＬ−１／Ｆｃキメラをアッセイバッファーで希釈して、Ｐ−セレクチンコートウェル又はＢＳＡコートウェル（非特異的コントロール）に添加し、４℃で一晩インキュベーションした。次に、プレートを洗浄し、アッセイバッファーで１：１０００に希釈したＩｇＧ抗Ｆｃ−ペルオキシダーゼをウェルに添加した。４℃で４時間後、プレートをアッセイバッファーで洗浄した。ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質を添加して、５分後、呈色反応を２％シュウ酸で停止した。マイクロプレートリーダーを用いて、４０５nmの光学密度を測定して結合ＰＳＧＬ−１を決定した。 P-selectin binding assay using PSGL-1. P-selectin (5 μg / mL in PBS, 137 mM NaCl, 8.1 mM Na ₂ HPO ₄ , 1.4 mM KH ₂ PO ₄ and 2.7 mM KCl, pH = 7.2) was placed in a microtiter plate overnight at 4 ° C. Coated. The plate was washed with assay buffer (20 mM Hepes, pH 7.4, containing 150 mM NaCl and 1 mM CaCl ₂ ), blocked with 3% BSA in the same buffer for 4 hours at 4 ° C., and washed again. Fucoidan and PSGL-1 / Fc chimera were diluted in assay buffer and added to P-selectin or BSA coated wells (non-specific control) and incubated overnight at 4 ° C. The plates were then washed and IgG anti-Fc-peroxidase diluted 1: 1000 in assay buffer was added to the wells. After 4 hours at 4 ° C., the plates were washed with assay buffer. Five minutes after adding the ABTS peroxidase substrate, the color reaction was stopped with 2% oxalic acid. The bound PSGL-1 was determined by measuring the optical density at 405 nm using a microplate reader.

ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析．アニオン性タンパク質チップアレイＣＭ１０を使用した。５μLのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）を用いて、スポットを２回、５分間予備湿潤させた。５００ngの組み換えヒトＰ−セレクチンを、１ＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）で、総容量５μLに希釈した様々な濃度の多糖（Ｐ−セレクチンと多糖のモル比、１／１〜１／１００）の非存在下又は存在下で混合して試料を調製し、４℃で１時間インキュベーションした。試料をスポットに適用し、湿潤チャンバー中、室温で、４５分間インキュベーションした。スポットを、５μLの１ＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）で３回、５μLの蒸留水で２回洗浄し、その後、１０分間風乾させた。１μLの飽和シナピン酸溶液（５０％アセトニトリル、０．５％トリフルオロ酢酸）を各スポットに２回適用した。タンパク質チップアレイを、タンパク質チップリーダー（PBS II, Bio-Rad）を用いて解析した。タンパク質の質量を、精製ペプチド及びタンパク質標準品を使用して外部校正した。スペクトルを、タンパク質チップソフトウェア３．１．１（Bio-Rad）で解析した。   SELDI-TOF analysis. An anionic protein chip array CM10 was used. Spots were pre-wetted twice for 5 minutes with 5 μL of Hepes (pH 7.0). In the absence of various concentrations of polysaccharide (Molar ratio of P-selectin to polysaccharide, 1/1 to 1/100) in which 500 ng of recombinant human P-selectin was diluted with 1M Hepes (pH 7.0) to a total volume of 5 μL. Alternatively, samples were prepared by mixing in the presence and incubated at 4 ° C. for 1 hour. Samples were applied to the spots and incubated for 45 minutes at room temperature in a humid chamber. The spots were washed 3 times with 5 μL of 1M Hepes (pH 7.0) and twice with 5 μL of distilled water and then air dried for 10 minutes. 1 μL of saturated sinapinic acid solution (50% acetonitrile, 0.5% trifluoroacetic acid) was applied twice to each spot. The protein chip array was analyzed using a protein chip reader (PBS II, Bio-Rad). Protein mass was externally calibrated using purified peptides and protein standards. The spectra were analyzed with protein chip software 3.1.1 (Bio-Rad).

表面プラズモン共鳴．BIAcore 2000光バイオセンサーを使用した。カルボキシメチル化デキストラン表面ＣＭ５センサーチップを、標準的なアミンカップリング化学を用いて、ヤギ抗ヒトＦｃＩｇＧと結合させた（平均６５００RU）。次に、組み換えヒトＰ−セレクチン／Ｆｃキメラをチップに捕捉した（平均１７５０RU）。ヤギ抗ヒトＦｃＩｇＧを非特異的コントロールとして使用した。試料を、ランニングバッファー（１０mMＨｅｐｅｓ、１５０mMＮａＣｌ、１mMＣａＣｌ_２及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で希釈した。フローセル、温度、流速、試料容量及び混合は、BIAcoreコントロールソフトウェアを使用して選択した。センサーグラムは、BIAevaluationソフトウェアを使用して解析した。 Surface plasmon resonance. A BIAcore 2000 optical biosensor was used. Carboxymethylated dextran surface CM5 sensor chip was coupled with goat anti-human FcIgG (average 6500 RU) using standard amine coupling chemistry. The recombinant human P-selectin / Fc chimera was then captured on the chip (average 1750 RU). Goat anti-human FcIgG was used as a non-specific control. Samples were diluted with running buffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl ₂ and 0.005% Tween-20, pH 7.4). The flow cell, temperature, flow rate, sample volume and mixing were selected using BIAcore control software. Sensorgrams were analyzed using BIAevaluation software.

フローサイトメトリー．成人健常者ドナーの血液を、３．８％（w/v）クエン酸ナトリウムに採取した。クエン酸処理したヒト全血（５μL）を、ＰＢＳ（１３７mMＮａＣｌ、８．１mMＮａ_２ＨＰＯ_４、１．４mMＫＨ_２ＰＯ_４及び２．７mMＫＣｌ、ｐＨ＝７．２）で４０μLに希釈した。ＡＤＰを最終濃度２．５μMで、又はＴＲＡＰを最終濃度２００μMで添加して、血小板を活性化させた。５μLのＬＭＷ多糖（ＦＩＴＣ標識又は非標識、ＰＢＳで希釈）及び５μLの蛍光標識抗体（ＰＣ５標識抗ＣＤ６２Ｐ ＡＫ−４クローン又はＦＩＴＣ標識ＰＡＣ−１若しくはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４１；ＰＢＳで８：１００；５：１００及び３：１００に希釈）を、室温で２０分間添加した。溶液を、ＰＢＳで１mLに希釈した後、フローサイトメトリーで解析した。データを、Coulter EPICS XL-MCLフローサイトメーター（Beckman Coulter）に収集した。試料解析を側方及び前方散乱で実施し、対数モードを用いて、蛍光を、ＦＬ１（フルオレセイン）又はＦＬ４（ＰＣ５）で得た。各試料から、７５００事象を収集した。抗Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ、ＡＫ−４クローン）抗体の陽性（非活性化、ＡＤＰ活性化及びＴＲＡＰ活性化血小板に対してそれぞれ、０．４％、７３．４％及び９７．８％）から、血小板活性化レベルを評価した。GENS（登録商標）System IIソフトウェア（Beckman Coulter）でデータ処理し、ヒストグラムを様々な条件に対して重ね合わせて示す。 Flow cytometry. Blood from adult healthy donors was collected in 3.8% (w / v) sodium citrate. Citrated human whole blood (5 μL) was diluted to 40 μL with PBS (137 mM NaCl, 8.1 mM Na ₂ HPO ₄ , 1.4 mM KH ₂ PO ₄ and 2.7 mM KCl, pH = 7.2). Platelets were activated by adding ADP at a final concentration of 2.5 μM or TRAP at a final concentration of 200 μM. 5 μL LMW polysaccharide (FITC labeled or unlabeled, diluted in PBS) and 5 μL fluorescent labeled antibody (PC5 labeled anti-CD62P AK-4 clone or FITC labeled PAC-1 or FITC labeled anti-CD41; PBS 8: 100; 5: 100 and 3: 100) were added at room temperature for 20 minutes. The solution was diluted to 1 mL with PBS and then analyzed by flow cytometry. Data was collected on a Coulter EPICS XL-MCL flow cytometer (Beckman Coulter). Sample analysis was performed with side and forward scatter, and fluorescence was obtained with FL1 (fluorescein) or FL4 (PC5) using logarithmic mode. From each sample, 7500 events were collected. From anti-P-selectin (CD62P, AK-4 clone) antibody positive (0.4%, 73.4% and 97.8% for deactivated, ADP activated and TRAP activated platelets respectively), Platelet activation level was assessed. Data is processed with GENS® System II software (Beckman Coulter) and histograms are shown overlaid for various conditions.

統計解析．示されたデータは、各回、ｎ≧３の試料／条件で実施した少なくとも３つの同一及び独立した実験の代表結果である。統計比較をStudent's t−検定で実施した。   Statistical analysis. The data shown is representative of at least 3 identical and independent experiments performed each time with n ≧ 3 samples / conditions. Statistical comparison was performed by Student's t-test.

結果
ＬＭＷフコイダンは、Ｐ−セレクチンとのＳＬｅ^Ｘ及びＰＳＧＬ−１の結合を阻害．固定化Ｐ−セレクチンとのＳＬｅ^ｘ−ポリアクリルアミド−ビオチンの結合を、ＬＭＷフコイダン、ヘパリン及び硫酸デキストランの存在下で測定した。このアッセイにおいて、抗ヒトＰ−セレクチン抗体（クローンＧ１、ポジティブコントロール）は、Ｐ−セレクチンとのＳＬｅ^ｘの結合を完全にブロックした。Ｐ−セレクチンに結合するＳＬｅ^ｘの量は、多糖の濃度の増加に伴って減少した。しかし、大きな差異が、硫酸化多糖間で観測された（図１）。フコイダンによる阻害は、ヘパリン及び硫酸デキストランを用いた場合より一層顕著であった（それぞれ、ＩＣ_５０が２０nM、４００nM及び＞２５，０００nM）。また、固定化Ｐ−セレクチンとのＰＳＧＬ−１／Ｆｃキメラの結合を、ＬＭＷフコイダンの存在下で評価した。Ｐ−セレクチンに結合するＰＳＧＬ−１の量は、フコイダンの濃度の増加に伴って減少した（ＩＣ_５０が５nM）。 Results LMW fucoidan inhibits SLe ^X and PSGL-1 binding to P-selectin. SLe ^x -polyacrylamide-biotin binding to immobilized P-selectin was measured in the presence of LMW fucoidan, heparin and dextran sulfate. In this assay, anti-human P-selectin antibody (clone G1, positive control) completely blocked SLe ^x binding to P-selectin. The amount of SLe ^x binding to P-selectin decreased with increasing polysaccharide concentration. However, large differences were observed between sulfated polysaccharides (Figure 1). Inhibition by fucoidan was even more pronounced than with heparin and dextran sulfate (IC ₅₀ of 20 nM, 400 nM and> 25,000 nM, respectively). Also, the binding of PSGL-1 / Fc chimera to immobilized P-selectin was evaluated in the presence of LMW fucoidan. The amount of PSGL-1 binding to P-selectin decreased with increasing concentration of fucoidan (IC ₅₀ 5 nM).

Ｐ−セレクチンとのＬＭＷフコイダンの結合．次に、Ｐ−セレクチンの結合を、質量分析及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により解析した。   Binding of LMW fucoidan to P-selectin. Next, the binding of P-selectin was analyzed by mass spectrometry and surface plasmon resonance (SPR).

Ｐ−セレクチンと３つのＬＭＷ硫酸化多糖及び天然デキストランの複合体形成を、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで解析した。生理学的なｐＨ＝７で、Ｐ−セレクチンが結合する（等電点、約６．５）アニオン性チップを使用した。次に、Ｐ−セレクチンをレーザーで脱離させて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦの約１００kDaのブロードピークとして検出した。Ｐ−セレクチンの量は、ＬＭＷフコイダンの存在下で、用量依存的に顕著に減少した。チップへのＰ−セレクチンの保持は、また、ヘパリンによって減少したが、天然デキストラン又は硫酸デキストランとのインキュベーションによる影響は受けなかった。これらの結果は、ＬＭＷフコイダンが、溶液中で、Ｐ−セレクチンと複合体を形成し、それによって、アニオン性表面への保持が妨げられることを示している。   Complex formation of P-selectin with three LMW sulfated polysaccharides and natural dextran was analyzed by SELDI-TOF MS. At physiological pH = 7, an anionic chip to which P-selectin binds (isoelectric point, about 6.5) was used. Next, P-selectin was desorbed with a laser and detected as a broad peak of about 100 kDa of SELDI-TOF. The amount of P-selectin was significantly decreased in a dose-dependent manner in the presence of LMW fucoidan. The retention of P-selectin on the chip was also reduced by heparin but was not affected by incubation with natural dextran or dextran sulfate. These results indicate that LMW fucoidan forms a complex with P-selectin in solution, thereby preventing retention on an anionic surface.

Ｐ−セレクチンとのＬＭＷ硫酸化多糖の結合特性を、表面プラズモン共鳴解析を用いてさらに比較した。ＬＭＷフコイダン、ヘパリン及び硫酸デキストランを、抗ヒトＦｃＩｇＧ又は組み換えヒトＰ−セレクチン／Ｆｃキメラでコートしたセンサーチップにフローした（図２）。全ての多糖が、Ｐ−セレクチンに結合して、そしてコントロールとして使用した抗ヒトＦｃＩｇＧには、より少ない程度で結合した。フコイダンでは、Ｐ−セレクチン対ＩｇＧで得られたシグナルの差異が、ヘパリン又は硫酸デキストランでのものより高く、これは、フコイダンがより良好な選択性を示していることを示唆する（図２Ａ）。１：１Langmuir結合モデルを用いて計算した、Ｐ−セレクチンに対するＬＭＷフコイダン、ヘパリン及び硫酸デキストランの解離定数（図２Ｄ）が、それぞれ、１．２nM、５７７nM及び１１８nMであることが分かった。これらの結果から、ＬＭＷフコイダンが、Ｐ−セレクチンに対し、他の２つの多糖よりも少なくとも２桁高い親和性を有することが確認された。   The binding properties of LMW sulfated polysaccharides with P-selectin were further compared using surface plasmon resonance analysis. LMW fucoidan, heparin and dextran sulfate were flowed onto a sensor chip coated with anti-human FcIgG or recombinant human P-selectin / Fc chimera (FIG. 2). All polysaccharides bound to P-selectin and to a lesser extent to the anti-human FcIgG used as a control. For fucoidan, the difference in signal obtained with P-selectin versus IgG was higher than that with heparin or dextran sulfate, suggesting that fucoidan shows better selectivity (FIG. 2A). The dissociation constants of LMW fucoidan, heparin and dextran sulfate for P-selectin (FIG. 2D) calculated using the 1: 1 Langmuir binding model were found to be 1.2 nM, 577 nM and 118 nM, respectively. These results confirmed that LMW fucoidan has an affinity for P-selectin that is at least two orders of magnitude higher than the other two polysaccharides.

ヒト血小板とのＬＭＷフコイダンの結合．ヘパリンが血小板に結合することが以前に報告されている（J. Hirsh et al., Chest, 2004, 126: 188S-203S; R. Verhaege, Acta Cardiol., 1998, 53: 15-21）。フローサイトメトリー実験を、クエン酸処理したヒト全血とＦＩＴＣ標識ＬＭＷフコイダンをインキュベーションして実施した。代表的実験を図３に報告する。血小板を、側方及び前方散乱並びに蛍光標識した特異的血小板抗体に対する陽性（ＣＤ４１）によりゲーティングした。蛍光が右へシフトしたことから実証されるように、ＦＩＴＣ標識フコイダンが活性化血小板に結合した。非活性化、ＡＤＰ活性化及びＴＲＡＰ活性化血小板に対して、それぞれ３４．７％、５１．４％及び６９．１％の陽性血小板パーセントで示されるように、フコイダン結合は血小板活性化のレベルに伴って増加した。   Binding of LMW fucoidan to human platelets. It has been previously reported that heparin binds to platelets (J. Hirsh et al., Chest, 2004, 126: 188S-203S; R. Verhaege, Acta Cardiol., 1998, 53: 15-21). Flow cytometry experiments were performed by incubating citrated human whole blood with FITC-labeled LMW fucoidan. A representative experiment is reported in FIG. Platelets were gated by side and forward scatter as well as positive for fluorescently labeled specific platelet antibodies (CD41). FITC-labeled fucoidan bound to activated platelets, as evidenced by the shift of fluorescence to the right. Fucoidan binding is at the level of platelet activation, as indicated by the percent positive platelets of 34.7%, 51.4% and 69.1% for unactivated, ADP activated and TRAP activated platelets, respectively. Increased accordingly.

次に、ＴＲＡＰ活性化血小板を、全血中、非蛍光標識ＬＭＷフコイダンの存在下又は非存在下で、蛍光標識抗ＣＤ６２Ｐ抗体とインキュベーションした。平均蛍光強度の減少から示されるように、活性化血小板とのＣＤ６２Ｐ抗体の結合阻害が、ＬＭＷフコイダンの存在下で観測された（図４）。さらに、ＬＭＷフコイダンは、活性化血小板とのＣＤ４１（インテグリンＧＰＩＩｂ）抗体又はＰＡＣ−１（インテグリン複合体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性立体配置に対する）の結合を阻害しなかった。このことは、活性化血小板とのＣＤ６２Ｐ抗体結合に及ぼす効果が特異的であることを示している。まとめると、これらの結果から、ヒト全血で観測された活性化血小板とのＬＭＷフコイダンの結合が、Ｐ−セレクチンにより介在されたことが示される。   TRAP-activated platelets were then incubated with fluorescently labeled anti-CD62P antibody in whole blood in the presence or absence of nonfluorescently labeled LMW fucoidan. Inhibition of CD62P antibody binding to activated platelets was observed in the presence of LMW fucoidan as shown by the decrease in mean fluorescence intensity (FIG. 4). Furthermore, LMW fucoidan did not inhibit binding of CD41 (integrin GPIIb) antibody or PAC-1 (to the active configuration of integrin complex GPIIb / IIIa) with activated platelets. This indicates that the effect on CD62P antibody binding to activated platelets is specific. In summary, these results indicate that the binding of LMW fucoidan to activated platelets observed in human whole blood was mediated by P-selectin.

考察
硫酸化糖質は、様々な生物活性を示すことが知られている（S. Soeda et al., Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1497: 127-137）。硫酸化多糖は、Ｐ−セレクチンリガンド（A. Varki et al., PNAS, 1994, 91: 7390-7397; D. Simonis et al., Biochemistry, 2007, 46: 6156-6164）、例えば、ヘパリン及び修飾ヘパリン（A. Koenig et al., J. Clin. Invest., 1998, 101: 877-889）、高分子量フコイダン及び硫酸デキストラン（M.P. Skinner et al., J. Biol. Chem., 1991, 266: 5371-5374）であると以前に記載された。本研究では、３種の低分子量硫酸化多糖（フコイダン、ヘパリン及び硫酸デキストラン）とＰ−セレクチンの相互作用が、４種類の異なる方法を用いて特徴づけられた。ＬＭＷフコイダンは、炎症障害（K. Senni et al., Arch. Biochem. Biophys., 2006, 445: 56-64）及び心臓血管疾患（33; 34; F. Zemani et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2008, 28: 644-650）の処置に有望な候補である。ＬＭＷヘパリンは、血栓障害の処置に使用される（K.A. Fox et al., Eur. Heart J., 2000, 21: 1440-1449）。また、合成硫酸デキストラン及び模倣薬が、感染疾患などの様々な疾患において、推定薬物として試験された（J. Neyts et al., Biochem. Pharmacol., 1995, 50: 743-751）。 Discussion Sulfated carbohydrates are known to exhibit various biological activities (S. Soeda et al., Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1497: 127-137). Sulfated polysaccharides are P-selectin ligands (A. Varki et al., PNAS, 1994, 91: 7390-7397; D. Simonis et al., Biochemistry, 2007, 46: 6156-6164), such as heparin and modifications Heparin (A. Koenig et al., J. Clin. Invest., 1998, 101: 877-889), high molecular weight fucoidan and dextran sulfate (MP Skinner et al., J. Biol. Chem., 1991, 266: 5371) -5374) was previously described. In this study, the interaction of three low molecular weight sulfated polysaccharides (fucoidan, heparin and dextran sulfate) with P-selectin was characterized using four different methods. LMW fucoidan is found in inflammatory disorders (K. Senni et al., Arch. Biochem. Biophys., 2006, 445: 56-64) and cardiovascular disease (33; 34; F. Zemani et al., Arterioscler. Thromb. Vasc). Biol., 2008, 28: 644-650). LMW heparin is used in the treatment of thrombotic disorders (KA Fox et al., Eur. Heart J., 2000, 21: 1440-1449). Synthetic dextran sulfate and mimetics have also been tested as putative drugs in various diseases such as infectious diseases (J. Neyts et al., Biochem. Pharmacol., 1995, 50: 743-751).

ＳＬｅ^ｘ／Ｐ−セレクチン結合の阻害を、結合アッセイ実験により定量した。多糖は以下のような順位で示される：（ＩＣ_５０）：フコイダン（２０nM）＞ヘパリン（４００nM）＞硫酸デキストラン（２５，０００nM）。比較として、Koenig等により、ヘパリンが、ヘパリンフラグメントのサイズに依存して、８２〜２４００μMのＩＣ_５０で、シアリルルイスＸとのＰ−セレクチン結合を阻害した阻害アッセイが確立された（A. Koenig et al., J. Clin. Invest., 1998, 101: 877-889）。しかし、彼らの研究では、シアリルルイスＸが固定されたが、一方で、本アプローチ法においては、固定されたのはＰ−セレクチンである。Ｐ−セレクチンに結合するＬＭＷフコイダンの機能的な重要性は、糖タンパク質とその天然リガンドＰＳＧＬ−１間の相互作用の妨害により明らかとなった。 Inhibition of SLe ^x / P-selectin binding was quantified by binding assay experiments. The polysaccharides are shown in the following order: (IC ₅₀ ): fucoidan (20 nM)> heparin (400 nM)> dextran sulfate (25,000 nM). For comparison, Koenig et al. Established an inhibition assay in which heparin inhibited P-selectin binding to sialyl Lewis X with an IC ₅₀ of 82-2400 μM, depending on the size of the heparin fragment (A. Koenig et al , J. Clin. Invest., 1998, 101: 877-889). However, in their study, sialyl Lewis X was immobilized, whereas in this approach, it was P-selectin that was immobilized. The functional importance of LMW fucoidan binding to P-selectin was revealed by interfering with the interaction between the glycoprotein and its natural ligand PSGL-1.

ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて、Ｐ−セレクチンとＬＭＷ多糖の複合体形成を明らかとした。このツールにより、トロンビン及びプロテアーゼネキシン−Ｉとのヘパリン及びフコイダンの結合を実証することができる（B. Richard et al., Thromb. Haemost., 2006, 95: 229-235）。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ実験は、溶液中で、ＬＭＷフコイダンが、生理学的なｐＨで、用量依存的に、Ｐ−セレクチンと複合体を形成したことが示された。複合体形成により、アニオン性表面へのＰ−セレクチン保持が減少した。   SELDI-TOF mass spectrometry was used to reveal complex formation between P-selectin and LMW polysaccharide. This tool can demonstrate the binding of heparin and fucoidan to thrombin and protease nexin-I (B. Richard et al., Thromb. Haemost., 2006, 95: 229-235). SELDI-TOF MS experiments showed that in solution, LMW fucoidan complexed with P-selectin in a dose-dependent manner at physiological pH. Complex formation reduced P-selectin retention on the anionic surface.

ヘパリン又はフコイダンなどの硫酸化多糖と様々なタンパク質の相互作用は、以前に、表面プラズモン共鳴（BIAcore（登録商標））で研究された（32; H. Yu et al., Biochim. Biophys. Acta, 2005, 1726: 168-176）。例えば、ＳＬｅ^ｘ模倣薬が、Ｋ_Ｄ１１４μMでＰ−セレクチンに結合することが示され（M.E. Beauharnois et al., Biochemistry, 2005, 44: 9507-9519）、そして、ＰＳＧＬ−１が、Ｋ_Ｄ３２０nMでＰ−セレクチンに結合することが示された（P. Mehta et al., J. Biol. Chem., 1998, 273: 32506-32513）。ここで計算されたＰ−セレクチンに対するＬＭＷヘパリンの解離定数、Ｋ_Ｄ約５００nMが、Simonis等の研究での水晶振動子マイクロバランス測定で決定された３種の未分画ヘパリンと同じ範囲にある（Biochemistry, 2007, 46: 6156-6164）。興味深いことに、この結果は、ナノモル範囲のＫ_Ｄを示すＬＭＷフコイダンが、他のＬＭＷ多糖、ＰＳＧＬ−１及びＳＬｅ^ｘ模倣薬と比較した場合、最も有効で選択的なＰ−セレクチンリガンドであることを実証した。さらに、Ｐ−セレクチン／ＬＭＷフコイダン相互作用は、Ｌ−セレクチン／ＧｌｙＣＡＭ−１相互作用よりも強固であり、また、血管内皮の白血球ローリングに関与している。この相互作用の相互作用定数は、Nicholson等により１０８μMと決定された（J. Biol.Chem., 1998, 273: 763-770）。 The interaction of various proteins with sulfated polysaccharides such as heparin or fucoidan was previously studied with surface plasmon resonance (BIAcore®) (32; H. Yu et al., Biochim. Biophys. Acta, 2005, 1726: 168-176). For example, SLe ^x _mimetics, K D _114μM in shown to bind P- selectin (ME Beauharnois et al, Biochemistry, 2005, 44:. 9507-9519), and, is _PSGL-1, K D 320nM Have been shown to bind to P-selectin (P. Mehta et al., J. Biol. Chem., 1998, 273: 32506-32513). Wherein the dissociation constant of LMW heparin on the calculated P- selectin, K _D of about 500nM is in the same range as three unfractionated heparin determined by quartz crystal microbalance measurements in studies of the Simonis ( Biochemistry, 2007, 46: 6156-6164). Interestingly, that this result, LMW fucoidan showing a _{K D} in the nanomolar range, other LMW polysaccharide, when compared with PSGL-1 and SLe ^x mimetics, the most effective and selective P- selectin ligand Proved. Furthermore, the P-selectin / LMW fucoidan interaction is stronger than the L-selectin / GlyCAM-1 interaction and is involved in leukocyte rolling of the vascular endothelium. The interaction constant for this interaction was determined to be 108 μM by Nicholson et al. (J. Biol. Chem., 1998, 273: 763-770).

天然の分画ヘパリンが、ＨＬ−６０細胞において、Ｐ−セレクチンと相互作用することが示された（Y. Gao et al., Mol. Cells, 2005, 19: 350-355）。精製タンパク質を使用して観測されたＰ−セレクチンとのフコイダンの結合が、より複雑な条件で起こるかどうかを測定するために、全血でのＬＭＷ多糖とヒト血小板の相互作用を分析した。フローサイトメトリーを用いて、ＬＭＷフコイダンが活性化血小板に結合することが明らかとなり、その結合レベルが血小板活性化の程度と相関することが明らかとなった。さらに、ＬＭＷフコイダンが、活性化ヒト血小板との抗Ｐ−セレクチン抗体の結合を阻害することができた。   Natural fractionated heparin has been shown to interact with P-selectin in HL-60 cells (Y. Gao et al., Mol. Cells, 2005, 19: 350-355). In order to determine if the fucoidan binding to P-selectin observed using purified protein occurred in more complex conditions, the interaction of LMW polysaccharide and human platelets in whole blood was analyzed. Using flow cytometry, it was revealed that LMW fucoidan binds to activated platelets and that the level of binding correlates with the degree of platelet activation. Furthermore, LMW fucoidan was able to inhibit the binding of anti-P-selectin antibody to activated human platelets.

実施例２：血小板活性化及び集積のin vivoシンチグラフィー検出のための、Ｐ−セレクチン標的イメージング剤としての^９９ｍＴｃ標識フコイダン
フコイダンを、溶液中での古典的なスズの反応を使用して、テクネチウム−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）で標識した。簡潔に述べると、４μLの塩化第一スズ、その後、２μLの水素化ホウ素カリウムを、１０μLのフコイダン（１mg/mL、ＭＷ＝７２００）に添加した。これらの試薬を混合した直後に、この混合物に５０μLの^９９ｍＴｃ（１５〜３０mCiに相当）を緩やかに添加した。インキュベーションを１時間実施して、標識反応を完了した。薄層ペーパークロマトグラフィー及び溶離剤としてメチルケトンを用いて標識に関して検査した。標識率は、１００％であった。 Example 2: ^99m Tc-labeled fucoidan as a P-selectin targeted imaging agent for in vivo scintigraphic detection of platelet activation and accumulation Fucoidan was converted to technetium using a classical tin reaction in solution. Labeled with -99m ( ^99m Tc). Briefly, 4 μL of stannous chloride followed by 2 μL of potassium borohydride was added to 10 μL of fucoidan (1 mg / mL, MW = 7200). Immediately after mixing these reagents, 50 μL of ^99m Tc (corresponding to 15-30 mCi) was slowly added to the mixture. Incubation was performed for 1 hour to complete the labeling reaction. Tested for labeling using thin layer paper chromatography and methyl ketone as eluent. The labeling rate was 100%.

心内膜炎疣贅、動脈瘤及び心房内血栓のラットモデルを、血小板活性化及びフィブリン形成を伴う臨床症状の動物モデルとして用いた。１μgの^９９ｍＴｃ標識フコイダンの静脈内注射により、血小板が多く含まれる心内膜炎疣贅（図５）、心房（図６）及び動脈瘤血栓（図７）をin vivoで可視化することができた。これらのin vivoデータは、ex vivoオートラジオグラフィーにより確認し、シグナルが、バックグラウンドに対して８〜１０の非常に高い定量的シグナル比で、組織学的に弁疣贅又は血栓と正確に共局在化していることが示された。 Rat models of endocarditis warts, aneurysms and intra-atrial thrombi were used as animal models of clinical symptoms with platelet activation and fibrin formation. Intravenous injection of 1 μg of ^99m Tc-labeled fucoidan can visualize in vivo platelet-rich endocarditis warts (Figure 5), atrium (Figure 6) and aneurysm thrombus (Figure 7) It was. These in vivo data are confirmed by ex vivo autoradiography, and the signal is histologically accurately shared with valve warts or thrombus at a very high quantitative signal ratio of 8-10 over background. It was shown to be localized.

セレクチンイメージングのための放射性トレーサーとしてのフコイダンの開発は、いくつかの段階で検討することができる：（１）正確に活性化された内皮細胞（虚血再かん流モデル）によるＰ−セレクチンの過剰発現を可視化することができる；（２）慢性的に刺激された内皮細胞（高血圧のＬ−ＮＡＭＥモデル）によるＥ−セレクチンの過剰発現を可視化することができる；そして（３）三次リンパ節形成（ラットの大動脈同種移植）及び自己免疫性心筋炎でＬ−セレクチン集積を可視化することができるか否か。   The development of fucoidan as a radiotracer for selectin imaging can be examined in several stages: (1) P-selectin excess by correctly activated endothelial cells (ischemic reperfusion model) Expression can be visualized; (2) overexpression of E-selectin by chronically stimulated endothelial cells (L-NAME model of hypertension) can be visualized; and (3) tertiary lymph node formation ( Whether or not L-selectin accumulation can be visualized in rat aortic allografts) and autoimmune myocarditis.

実施例３：フコイダンコートＵＳＰＩＯ粒子の調製
本出願人は、フコイダンをＵＳＰＩＯ粒子にコートする５つの異なる戦略を開発した。 Example 3 Preparation of Fucoidan Coated USPIO Particles Applicants have developed five different strategies for coating fucoidan onto USPIO particles.

第一の戦略は、非修飾フコイダンの存在下での鉄粒子の合成に関する。出願人は、以前に記載のデキストランを用いた合成方法（R.S. Molday et al., J. Immunol. Methods, 1982, 52: 353-367）を適用してデキストランＭＷ４００００をフコイダンＭＷ５０５００に換えた。フコイダンコート鉄ナノ粒子が得られた。しかし、これらの粒子は、水に不安定であった。   The first strategy concerns the synthesis of iron particles in the presence of unmodified fucoidan. Applicant replaced the dextran MW 40000 with the fucoidan MW 50500 by applying the previously described synthetic method using dextran (R.S. Molday et al., J. Immunol. Methods, 1982, 52: 353-367). Fucoidan coated iron nanoparticles were obtained. However, these particles were unstable to water.

第二の戦略は、非修飾フコイダンを用いた酸性磁性流体のコーティングを含む。フコイダンを、酸性磁性流体とインキュベーションした。水性媒体（ｐＨ７．４）では安定であるが、イオン強度０．１５Ｍの緩衝液では不安定なフコイダンコート鉄ナノ粒子を得て、これは多くのアプリケーションで使用される。この合成は、クロスリンカーの存在下で達成することができ（A. San Juan et al., J. Biomed. Mater Res.A, 2007, 82: 354-362）、ナノ粒子の安定性を向上させることができた。   The second strategy involves the coating of acidic ferrofluids with unmodified fucoidan. Fucoidan was incubated with acidic ferrofluid. Fucoidan-coated iron nanoparticles are obtained that are stable in aqueous media (pH 7.4) but unstable in buffers with an ionic strength of 0.15 M and are used in many applications. This synthesis can be achieved in the presence of a crosslinker (A. San Juan et al., J. Biomed. Mater Res. A, 2007, 82: 354-362), improving the stability of the nanoparticles I was able to.

リンカーを介した、マグヘマイトγＦｅ_２Ｏ_３ナノ粒子へのフコイダンのグラフティング（戦略３）、デキストランコートマグヘマイトγＦｅ_２Ｏ_３ナノ粒子、即ち、カルボキシメチルデキストラン又はＣＭＤでコートされたマグヘマイトγＦｅ_２Ｏ_３ナノ粒子へのフコイダンのカップリング（戦略４）、又は酸化デキストランでコートされたマグヘマイトγＦｅ_２Ｏ_３ナノ粒子へのフコイダンのカップリング（戦略５）に基づく他の３つの戦略が開発された。これらの戦略の全てにおいて、第一工程は、一級アミンを用いて、フコイダンの還元末端を官能基化することであり、これにより、その後の反応をフコイダンの鎖構造、従って、Ｐ−セレクチンに対する親和性を変更することなく行うことを可能にする。 Grafting fucoidan to maghemite γFe ₂ O ₃ nanoparticles via a linker (strategy 3), dextran-coated maghemite γFe ₂ O ₃ nanoparticles, ie maghemite γFe ₂ O ₃ nanoparticles coated with carboxymethyldextran or CMD Three other strategies have been developed based on the coupling of fucoidan to particles (strategy 4) or the coupling of fucoidan to maghemite γFe ₂ O ₃ nanoparticles coated with dextran oxide (strategy 5). In all of these strategies, the first step is to functionalize the reducing end of the fucoidan with a primary amine, thereby allowing the subsequent reaction to affect the fucoidan chain structure and hence the affinity for P-selectin. Allows to do without changing gender.

戦略３では、以前に記載されたようにして（French patent No. 2 736 197; N. Fauconnier et al., J. Colloid Interface Sci., 1997, 194: 427-433）、鉄ナノ粒子をジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）を用いてチオール化し、次に、ヘテロ二官能性リンカー、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）（J. Roger et al., Eur. Phys. J. Applied Phys., 1999, 5: 321-325）を用いて、ジスルフィド架橋でアミノ化フコイダンに連結させた。ＬＭＷフコイダン（ＭＷ＝７２００）でコートされた鉄ナノ粒子が得られ、これはイオン強度０．１５Ｍの通常の水性緩衝液（ｐＨ７．４）で安定であることが示された。   In Strategy 3, iron nanoparticles were dimercapto as previously described (French patent No. 2 736 197; N. Fauconnier et al., J. Colloid Interface Sci., 1997, 194: 427-433). Thiolated with succinic acid (DMSA) and then a heterobifunctional linker, N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) (J. Roger et al., Eur. Phys. J. Applied Phys., 1999, 5: 321-325) and linked to aminated fucoidan via a disulfide bridge. Iron nanoparticles coated with LMW fucoidan (MW = 7200) were obtained, which were shown to be stable in normal aqueous buffer (pH 7.4) with an ionic strength of 0.15M.

戦略４では、ＣＭＤ（ＭＷ＝１５０００）を酸性磁性流体とインキュベーションして、イオン強度０．１５Ｍの通常の水性緩衝液（ｐＨ７．４）で安定なＣＭＤコート鉄ナノ粒子を得た。アミノ化フコイダンを、標準的なアミンカップリング化学（ＥＤＣ／ＮＨＳ系で）を用いて、これらのナノ粒子にグラフティングする。   In Strategy 4, CMD (MW = 15000) was incubated with acidic ferrofluid to obtain CMD-coated iron nanoparticles that were stable in normal aqueous buffer (pH 7.4) with an ionic strength of 0.15M. Aminated fucoidan is grafted onto these nanoparticles using standard amine coupling chemistry (in the EDC / NHS system).

戦略５では、アミノ化フコイダンを、シッフ塩基を形成して、酸化デキストランコートナノ粒子にグラフティングする。   In strategy 5, the aminated fucoidan forms a Schiff base and is graphed to oxidized dextran coated nanoparticles.

実施例４：フコイダンコートの音響的に活性なマイクロバブル及びリポソームの調製
超音波ベースのイメージング造影剤にフコイダンをグラフティングするために、いくつかの戦略を調査する。第一のアプローチ法では、Villanueva等により以前に記載された標準的なアミンカップリング化学を用いて（Circulation, 1998, 98: 1-5）、アミノ化フコイダンを、リン脂質ベースのパーフルオロブタン封入マイクロバブルにグラフティングする。簡潔に述べると、パーフルオロブタンを、ホスファチジルコリン、界面活性剤、ホスファチジルエタノールアミン誘導体及び１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で活性化したカルボキシル基を含有するリン脂質誘導体を含む水性媒体に超音波処理で分散させて、次に、アミノ化フコイダンを、一級アミノ基を介してアミン結合形成により共有結合させた。 Example 4: Preparation of Fucoidan Coated Acoustically Active Microbubbles and Liposomes Several strategies are investigated for grafting fucoidan on ultrasound-based imaging contrast agents. The first approach uses standard amine coupling chemistry previously described by Villanueva et al. (Circulation, 1998, 98: 1-5) and encapsulates aminated fucoidan with phospholipid-based perfluorobutane. Graft into microbubbles. Briefly, phospholipid derivatives containing carboxyl groups activated with perfluorobutane with phosphatidylcholine, a surfactant, a phosphatidylethanolamine derivative and 1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Dispersed by sonication in the aqueous medium containing, then the aminated fucoidan was covalently linked by amine bond formation via primary amino groups.

第二の戦略は、ビオチン化フコイダンを、Weller等により以前に記載されたような多段工程のアビジン／ビオチン架橋化学により（Biotechnol. Bioeng., 2005, 92: 780-788）、リン脂質ベースのパーフルオロブタン封入マイクロバブルにグラフティングすることである。簡潔に述べると、ホスファチジルコリン、ステアリン酸ポリエチレングリコール及びホスファチジルエタノールアミンのビオチン化誘導体を含有する食塩水を、パーフルオロブタンと共に超音波処理した。得られたマイクロバブルを、ストレプトアビジン、次に、飽和量のビオチン化フコイダンとインキュベーションした。   The second strategy is to use biotinylated fucoidan by a multi-step avidin / biotin cross-linking chemistry as previously described by Weller et al. (Biotechnol. Bioeng., 2005, 92: 780-788). Grafting into fluorobutane-encapsulated microbubbles. Briefly, saline containing phosphatidylcholine, polyethylene glycol stearate and biotinylated derivatives of phosphatidylethanolamine was sonicated with perfluorobutane. The resulting microbubbles were incubated with streptavidin and then with a saturating amount of biotinylated fucoidan.

ビオチン化フコイダンを、アミノ化ヘパリンのビオチン化に関してOsmond等により以前に記載された方法（Anal. Biochem., 202, 310(2), 199-207）を用いて得た。簡潔に述べると、スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸−（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）を、アミノ化フコイダンの０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝８）の溶液に、アミノ化フコイダンとスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンのモル比１〜１０で添加した。混合物をボルテックスして、４℃で一晩振とうした後、再蒸留水に対して透析（１０００Daをカットオフ）して凍結乾燥した。   Biotinylated fucoidan was obtained using the method previously described by Osmond et al. (Anal. Biochem., 202, 310 (2), 199-207) for biotinylation of aminated heparin. Briefly, sulfosuccinimidyl-6- (biotinamide) hexanoic acid- (sulfo-NHS-LC-biotin) was added to a solution of aminated fucoidan in 0.1 M carbonate buffer (pH = 8). The aminated fucoidan and sulfo-NHS-LC-biotin were added at a molar ratio of 1-10. The mixture was vortexed and shaken overnight at 4 ° C., then dialyzed against double-distilled water (1000 Da cut-off) and lyophilized.

最後に、第三のアプローチ法は、Hamilton等により以前に記載されたようなチオール化学を用いて（Circulation, 2002, 105: 2772-2778）、フコイダンを音響的に活性なリポソームにグラフティングすることである。簡潔に述べると、成分リン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジル−グリセロール、ホスファチジルエタノールアミン誘導体及びコレステロール）をクロロホルムに溶解させ、混合し、得られた膜を水中で超音波処理して、リポソームを形成した；アミノ化フコイダンを、３−（２−ピリジルチオ）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）と反応させた。次に、フコイダン誘導体をジチオスレイトール溶液で還元した後、チオール化フコイダンをリポソームにコンジュゲートさせた。   Finally, a third approach is to graph fucoidan into acoustically active liposomes using thiol chemistry as previously described by Hamilton et al. (Circulation, 2002, 105: 2772-2778). It is. Briefly, the component phospholipids (phosphatidylcholine, phosphatidyl-glycerol, phosphatidylethanolamine derivatives and cholesterol) were dissolved in chloroform and mixed, and the resulting membrane was sonicated in water to form liposomes; Fucoidan was reacted with 3- (2-pyridylthio) propionic acid-N-hydroxysuccinimide ester (SPDP). Next, after the fucoidan derivative was reduced with a dithiothreitol solution, the thiolated fucoidan was conjugated to a liposome.

実施例５：Ｘ線ラジオグラフィーのためのヨウ素化チロシンで置換したフコイダン
フコイダンの放射性標識のための他の可能性は、多糖の還元性末端にチロシン残基をグラフティングした後、ヨウ化ナトリウムを使用することである。置換工程は、実施例１に記載のアミノ化工程と同様である。 Example 5: Fucoidan Substituted with Iodinated Tyrosine for X-Ray Radiography Another possibility for radiolabeling fucoidan is that after grafting a tyrosine residue on the reducing end of the polysaccharide, sodium iodide is added. Is to use. The substitution step is the same as the amination step described in Example 1.

簡潔に述べると、２００mgの多糖及び１００mgのＮａＢＨ_３ＣＮを、１．６mLの２．５Ｍチロシン塩酸塩溶液に添加した。６０℃で２４時間後、この混合物に１００mgのＮａＢＨ_３ＣＮを添加して、反応をさらに４８時間行った。試料を、再蒸留水に対して透析し（１０００Daをカットオフ）、凍結乾燥した；０．５０±０．０５チロシン／多糖鎖のグラフティングの修飾フコイダンを、収率５０〜７０％で回収した。 Briefly, 200 mg polysaccharide and 100 mg NaBH ₃ CN were added to 1.6 mL of 2.5 M tyrosine hydrochloride solution. After 24 hours at 60 ° C., 100 mg of NaBH ₃ CN was added to the mixture and the reaction was carried out for a further 48 hours. Samples were dialyzed against double-distilled water (1000 Da cut-off) and lyophilized; 0.50 ± 0.05 tyrosine / polysaccharide chain grafted modified fucoidan was recovered in 50-70% yield. .

ヨウ素化を、クロラミン−Ｔを用いて以下のように行った：２０μM修飾フコイダン（１４．５mg）の０．０５Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）（４５０μL）を、ＮａＩ溶液（８％（w/v）ＰＢＳ溶液、１５０μL）に添加した後、３５０μLのクロラミン−Ｔ溶液（４０mg/mL、ＰＢＳ）を添加した。混合物をボルテックスして、４℃で一晩振とうした。次に、反応混合物を再蒸留水に対して透析し（１０００Daをカットオフ）、凍結乾燥して、ヨウ素化修飾フコイダンを定量的収率で得た。   Iodination was performed with chloramine-T as follows: 20 μM modified fucoidan (14.5 mg) in 0.05 M phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4) (450 μL) in NaI solution. (8% (w / v) PBS solution, 150 μL) followed by 350 μL of chloramine-T solution (40 mg / mL, PBS). The mixture was vortexed and shaken at 4 ° C. overnight. The reaction mixture was then dialyzed against double distilled water (1000 Da cut off) and lyophilized to give iodinated modified fucoidan in quantitative yield.

他の実施態様
本発明の他の実施態様が、本明細書に開示された本発明の詳述又は実施から考察されることは、当業者にとって明らかであろう。明細書及び実施例は、例示的な目的としてのみ考慮され、本発明の真の範囲が以下の特許請求の範囲により示されることが意図される。 Other Embodiments It will be apparent to those skilled in the art that other embodiments of the present invention are contemplated from the detailed description or practice of the invention disclosed herein. It is intended that the specification and examples be considered as exemplary only and that the true scope of the invention be indicated by the following claims.

Claims (11)

少なくとも一つの検出可能な部分と会合する少なくとも一つのフコイダン部分を含むイメージング剤であって、イメージング剤が、セレクチン標的であり、少なくとも一つの検出可能な部分が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）により検出可能であり、少なくとも一つの検出可能な部分が、極小超常磁性酸化鉄粒子（ＵＳＰＩＯ）を含み、少なくとも一つのフコイダン部分が、２０００〜８０００Daの平均分子量を有する、イメージング剤。 An imaging agent comprising at least one fucoidan moiety associated with at least one detectable moiety , wherein the imaging agent is a selectin target and at least one detectable moiety is detectable by magnetic resonance imaging (MRI) An imaging agent wherein at least one detectable moiety comprises minimal superparamagnetic iron oxide particles (USPIO) and at least one fucoidan moiety has an average molecular weight of 2000-8000 Da . 少なくとも一つのフコイダン部分が、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン及びＥ−セレクチンからなる群から選択される少なくとも一つのヒトセレクチンと、０．１ｎＭ〜５００ｎＭ、好ましくは、０．５ｎＭ〜１０ｎＭ、さらに好ましくは、１ｎＭ〜５ｎＭの解離定数で結合する、請求項１に記載のセレクチン標的イメージング剤。 At least one fucoidan moiety is at least one human selectin selected from the group consisting of P-selectin, L-selectin and E-selectin, and 0.1 nM to 500 nM, preferably 0.5 nM to 10 nM, more preferably The selectin target imaging agent according to claim 1, which binds with a dissociation constant of 1 nM to 5 nM. 有効量の請求項１又は２に記載の少なくとも一つのセレクチン標的イメージング剤又は生理学的に許容しうるその塩及び少なくとも一つの薬学的に許容されうる担体を含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition comprising an effective amount of at least one selectin target imaging agent or physiologically acceptable salt thereof according to claim 1 or 2 and at least one pharmaceutically acceptable carrier. インビトロのセレクチンの検出及び／又はイメージングにおける使用のための、請求項１又は２に記載のイメージング剤。 The imaging agent according to claim 1 or 2 for use in in vitro selectin detection and / or imaging. セレクチンが関与する臨床症状のインビトロの診断における使用のための、請求項１又は２に記載のイメージング剤。 The imaging agent according to claim 1 or 2 , for use in in vitro diagnosis of a clinical condition involving selectin. セレクチンが関与する臨床症状が、血栓症、心筋虚血／再かん流傷害、脳卒中及び虚血脳外傷、神経変性障害、腫瘍転移及び腫瘍増殖並びに関節リウマチからなる群のメンバーである、請求項５に記載の使用のための、イメージング剤、又はその医薬組成物。 Clinical symptoms selectin is involved, thrombosis, myocardial ischemia / reperfusion injury, it is a member of the group consisting of stroke and ischemic brain trauma, neurodegenerative disorders, tumor metastasis and tumor growth, as well as rheumatoid arthritis, according to claim 5 An imaging agent or a pharmaceutical composition thereof for use according to 1 . 生物試料におけるセレクチンの異常発現の存在をインビトロで検出するための方法であって、
生物試料を、有効量の請求項１又は２に記載のセレクチン標的イメージング剤又は請求項３に記載の医薬組成物と接触させる工程、及び
画像技術を用いて、イメージング剤に結合する任意のセレクチンを検出する工程
を含む、方法。 A method for detecting in vitro the presence of an abnormal expression of selectin in a biological sample , comprising:
Contacting a biological sample with an effective amount of a selectin-targeted imaging agent according to claim 1 or 2 or a pharmaceutical composition according to claim 3 , and any selectin that binds to the imaging agent using imaging techniques A method comprising the step of detecting. インビトロの生物試料が、細胞、体液及び生物組織からなる群から選択される、請求項７に記載のインビトロの方法。 8. The in vitro method of claim 7 , wherein the in vitro biological sample is selected from the group consisting of cells, body fluids and biological tissues. インビトロの生物試料が、セレクチンが関与する臨床症状を有する疑いがある患者から得られた生物試料であり、前記方法が、セレクチンが関与する前記臨床症状を診断するために用いられるか、又はインビトロの生物試料が、セレクチンが関与する臨床症状についての処置を受けている患者から得られた生物試料である、請求項７に記載のインビトロの方法。 The in vitro biological sample is a biological sample obtained from a patient suspected of having a clinical condition involving selectin , and the method is used to diagnose the clinical condition involving selectin or in vitro 8. The in vitro method of claim 7 , wherein the biological sample is a biological sample obtained from a patient undergoing treatment for a clinical condition involving selectin . セレクチンが関与する臨床症状が、血栓症、心筋虚血／再かん流傷害、脳卒中及び虚血脳外傷、神経変性障害、腫瘍転移及び腫瘍増殖並びに関節リウマチからなる群のメンバーである、請求項９に記載の方法。 Clinical symptoms selectin is involved, thrombosis, myocardial ischemia / reperfusion injury, is a member of the group consisting of stroke and ischemic brain trauma, neurodegenerative disorders, tumor metastasis and tumor growth, as well as rheumatoid arthritis, according to claim 9 The method described in 1. 患者におけるセレクチンが関与する臨床症状のインビトロ診断のためか又はインビトロの生物試料におけるセレクチンの異常発現の検出のためのキットであって、２０００〜８０００Daの平均分子量を有するフコイダン部分、ＭＲＩにより検出可能であり、かつＵＳＰＩＯを含む検出可能な部分、及び請求項１又は２に記載のセレクチン標的イメージング剤を調製するための説明書、及び、場合により、さらに、セレクチン標的イメージング剤を用いる臨床症状を診断するための説明書及び/又はセレクチン標的イメージング剤を用いるインビトロで生物学的試料におけるセレクチンの異常発現を検出するための説明書を含む、キット。 A kit for in vitro diagnosis of clinical symptoms involving selectin in a patient or for detection of aberrant expression of selectin in an in vitro biological sample , a fucoidan moiety having an average molecular weight of 2000-8000 Da, detectable by MRI A detectable moiety comprising and containing USPIO, and instructions for preparing the selectin-targeted imaging agent of claim 1 and 2 , and optionally further diagnosing clinical symptoms using the selectin-targeted imaging agent Instructions for detecting and / or instructions for detecting abnormal expression of selectin in a biological sample in vitro using a selectin-targeted imaging agent .