JP6395101B2

JP6395101B2 - イミダゾピロロキノリン塩

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Publication number: JP6395101B2
Application number: JP2014068474A
Authority: JP
Inventors: 池本　一人; 一人池本
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2018-09-26
Anticipated expiration: 2034-03-28
Also published as: JP2015189711A

Description

本発明はイミダゾピロロキノリンアルカリ金属塩の技術に関する。

本発明は、イミダゾピロロキノリン（以下、ＩＰＱと略す）のアルカリ金属塩及びその製造法に係わる。イミダゾピロロキノリンは、一般式（１）に示す構造を有し、別名７，１０−ジヒドロ−７−オキソ−イミダゾ［４，５，１−ｉｊ］ピロロ［２，３−ｆ］キノリン−１，３，９−トリカルボン酸である。

ＩＰＱは、細菌に含まれるデヒドロゲナーゼの補酵素ピロロキノリンキノンの誘導体であり、今後、医薬品として、開発しうる重要な物質である。ＩＰＱは食品にも含まれることが知られており（非特許文献１）、栄養強化食品原料として注目されている。また、細胞増殖を促進する効果も知られている。さらにはピロロキノリンキノン（以下、ＰＱＱと略すことがある）と比較して腎毒性および急性毒性試験を大幅に軽減している（特許文献１）。

このＩＰＱは、ピロロキノリンキノンとアミノ酸を反応して得られる方法が知られている（非特許文献２、特許文献２）。これらの方法に記載されているＩＰＱはトリカルボン酸である。トリカルボン酸の場合、３つのカルボン酸がすべてカルボン酸構造で、イオン化していない状態であり、一般的にはフリー体と呼ばれる形である。フリー体とはカルボン酸を有している物質がイオンではなく、カルボン酸構造として存在する状態を示す。

特開平９−６７３７３号公報特開平９−７０２９６号公報

Analytical Biochemistry 269, 317-325 (1999) J.Am.Chem.Soc.,1995 ,117, p3278-3279.

フリー体はイオン性が低く、その為に水への溶解性が低い欠点がある。そのため、溶液として提供する際に沈殿物が生じてしまう欠点があった。このような理由で溶解度を高くする方法が求められている。また、その際にＩＰＱの持つ生物学的な効果が大きく変わらないことも求められている。

また、保存しやすく、取り扱いがより安全になるように安定であることが求められている。特に空気中における熱安定性は重要であり、滅菌、加工の際に分解し難いことは重要である。さらには空気中で熱出して分解するのは燃焼であり、安全上注意しなければならない項目である。

本発明者はＩＰＱの溶解性向上を目的とした。また、熱安定性の向上も目的とした。さらにはその製造方法を目的とした。

本発明者はＩＰＱの溶解性を向上させる方法を鋭意検討した結果、下記一般式（１）で示されるＩＰＱのアルカリ金属塩が溶解性及び熱安定性が向上することを見出し、本発明に至った。

本発明により、溶解性の向上したＩＰＱの塩を使用することが可能になり、食品、医薬品、および化粧品に使用する際に容易に調合することが可能になる。さらに熱安定性が向上することで、滅菌や加工の際の火災、爆発の危険性を減らすことができ、より安全に取り扱うことができる。

ＩＰＱテトラカリウム塩のＮＭＲスペクトルＩＰＱトリカリウム塩のＮＭＲスペクトルＩＰＱトリナトリウム塩のＮＭＲスペクトル

本発明はＩＰＱ分子１に対してアルカリ金属イオンが付加した一般式（２）で示される化合物である。
Ｍ＝アルカリ金属

本発明は一般式（２）で表わされるＩＰＱのアルカリ金属塩である。ＩＰＱに対して付加したアルカリ金属は１，２，３，４個が好ましい。より好ましくは２，３，４個である。更に好ましくは３個である。アルカリ金属はＬｉ, Ｎａ又はＫが好ましく、より好ましくはＮａ又はＫである。

ＩＰＱ分子には水素イオンとして外れる場所が４つあるが、どこが脱離していてもよい。一般的には脱離する場所を特定することは困難であり、結晶状態によっても変化する可能性がある。本発明の塩はアルカリ金属化合物が共存してもよい。また、本発明の塩が含水塩であっても問題がない。
本発明の塩は、溶解度が高く、生体内に大量に存在するイオンである、ＩＰＱトリナトリウム塩、ＩＰＱトリカリウム塩、ＩＰＱテトラカリウム塩、ＩＰＱジナトリウム塩、ＩＰＱジカリウム塩が特に好ましい。

アルカリ金属の置換数が増加するに従い、溶解度は上昇する傾向にある。アルカリ金属が０では酸性を示し、水への溶解度は非常に低いが、置換数が上昇するに従い、ｐＨはアルカリ側になり、溶解性は上昇する。ＩＰＱ塩のアルカリ金属はｐＨによって置換数が変わると考えられ、酸性からアルカリ性になるに従い置換数が上昇する。ナトリウム、リチウムに置いて溶解度が最も向上するアルカリ金属数は３である。また、カリウムに置いては3よりも４で溶解度はさらに向上する。これよりも過剰にカリウムを水酸化カリウムとして加えても溶解度は向上する。アルカリ金属塩での傾向は一般的には類似するが、予想と異なり、カリウムは特異的に溶解度が向上する。溶解度を上げるのにカリウムイオンが含まれるのは好ましい。

本発明の塩を作るためにはＩＰＱを作る必要がある。容易に製造する方法はピロロキノリンキノン又はその塩をグリシンと反応させることである。反応は有機溶媒、水どちらでも使用でき、水溶液で反応させるのが好ましい。加温状態で行うのが好ましい。好ましくは２０から１８０℃であり、より好ましくは５０から１３０℃である。この範囲とすることにより反応物が適度な時間で出来、工業的に好ましい。また、温度を上げる場合、加圧容器が必要になり費用がかかる。

反応時に使用する際のピロロキノリンキノンの濃度は０．１重量％から３０重量％で行うのがよい。グリシンはピロロキノリンキノンの０．３から１０倍の重量を混合すればよい。反応の際のｐＨは特に制限されないが２−７で反応が進行しやすい。反応は溶液、懸濁状態で行うことが出来る。反応の進行は液体クロマトグラフィーやペーパークロマトグラフィー等の一般的な分析手法が使用できる。反応液は通常の方法で精製することができる。再結晶やクロマトグラフィーで純度を上げる。また、酸を加えてｐＨを２以下にすることでＩＰＱのフリー体を作ることができ、これはアルカリ金属イオンを含んでおらず、塩の原料として使用しやすい。

本発明の塩はＩＰＱのフリー体とアルカリ金属化合物を中和することで形成することができる。用いるＩＰＱのフリー体は純度が９０％以上であることが好ましく、純度９５％以上であることが好ましい。純度をこの範囲とすることにより、不純物の影響で熱分解、溶解性の変化が生じる懸念が無く好ましい。は1から４を作ることができる。中和の場合、アルカリ金属イオンのＩＰＱのフリー体に対し加えるモル比は、欲しいＩＰＱ塩のＩＰＱ／塩のモル比と同等で良く、アルカリ金属塩を加えた後、溶媒を除去することで作ることができる。また、溶媒を除去する代わりに、調合時のｐＨを調整し、析出させることでも得ること出来る。

使用できるアルカリ金属化合物はアルカリ金属水酸化物、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属重炭酸塩、アルカリ金属アルコキシドが使用できる。好ましくはアルカリ金属水酸化物である。アルカリ金属としてはリチウム、カリウム、ナトリウムが使用でき、好ましくはナトリウム、カリウムである。中和は水、有機溶媒中で行えばよく好ましくは水である。中和した後、塩の取り出しは溶媒の除去、再結晶で行えばよい。
置換数を変えたアルカリ金属塩を作製する方法は、ＩＰＱフリー体とアルカリ金属水酸化物を作製したい置換数に合わせたモル比で水と混合し、減圧して水を除去することで容易に得ることができる。ＩＰＱのフリー体は水に溶解しないが、アルカリ金属化合物を混合することで溶解度が上がり、水に溶解しやすくなる。

または所定のｐＨにした後に塩析や水溶性有機溶媒を加え、塩を析出させることでも得ることができる。特にトリナトリウム塩、トリリチウム塩は６から１４のｐＨで再結晶を行うことで得られる。好ましくは７から１２で再結晶を行うことで不純物を除去することができ好ましい。また、カリウムの場合、アルカリ領域で溶解度が上昇することから、ＩＰＱに対してトリカリウム以上で溶媒を除去したものが好ましい。
本発明の塩形成を行うことで副次的な効果として高純度にすることも可能になる。

具体的な製造法について記載する。ＩＰＱのフリー体、アルカリ金属化合物、水を混合する。この時の温度は０から１２０℃が使用できるが、好ましくは２０−１００℃である。一般的には温度を上げるほうが溶けやすいため、５０−９５℃の範囲で混合することが好ましい。混合は攪拌を行う方が均一性の面から好ましい。混合物が完全に溶解することが好ましい。混合物は０．０１から９６時間に置いた後に、水を除去する。除去は減圧乾燥、スプレードライ、凍結乾燥等使用できる。乾燥した粉末がＩＰＱの塩として使用できる。

本発明の物質はハードカプセル、ソフトカプセル、錠剤の形態で提供することができる。その際、他の添加物等と混合して良い。
高い水溶性を利用して飲料、点滴液、注射液として使用することもできる。乳化物と混合し、化粧用クリーム、ケーキに配合することも容易である。また、米、麦の粉と混合も容易でそれを利用した食品に使用することができる。

本実施例は特に断りがない限り、和光純薬製の試薬を用いた。吸光度測定にはＵＶスペクトルメーター島津製ＵＶ１８００を使用した。LC条件：259nm, 40℃、YMC−Pack ODS−A 150mm, 4.6mm, 30mM 酢酸−70mM酢酸アンモニウム、ＬＣ２010

実施例１原料ＩＰＱの合成
ＰＱＱジナトリウム（三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱ）100ｇとグリシン200ｇを水０．５Ｌと混合した。ｐＨ４.８であった。30分後、泡が出て混合物は固まった。この混合物を70℃に加熱して、3日反応させた。反応液に10重量％ＮａＣｌ水を１０００ｇ加え濾過した。濾過で得た固体に25重量％ＮａＯＨ水１２０ｇと水３０ｇ混合した。ｐＨ１０．８、70℃に加温して一晩放置後、濾過し、2−プロパノールで洗った。固形分をエタノール４００ｍｌで洗った。水５００ｍｌに固形分を加え、NaOH４１．５ｇ混合し(pH10.3), 70℃1晩入れた。氷で冷やし、濾過、２−プロパノールで洗浄した。固体を減圧乾燥70℃して６５．８ｇ得た。ＩＰＱトリナトリウムであることがＬＣ，Ｎａイオン分析よりわかった。
このＩＰＱトリナトリウム１．０ｇを水１０ｇと混合する。70℃に０．５時間入れる。2N 塩酸10ｇ加える。70℃に1時間入れる。室温にして遠心分離。上澄みを捨て、2N 塩酸10ｇいれて混合。70℃に1時間入れる。室温にして遠心分離。上澄みを捨てる。2-プロパノール４ｍｌ加え、遠心分離を行った。減圧乾燥70℃２時間。オレンジ色０．８８ｇ Na分析によりナトリウムが除去されＩＰＱのフリー体になっていることを示した。該フリー体の純度は99％であった。

実施例ＩＰＱ塩合成
実施例１で得たＩＰＱフリー体０．６８ｇと水５０ｇと２Mアルカリ水酸化物水溶液を作製したい置換数のモル比になるように調製し、７０℃で３０分混合させた後、エバポレーターで水を除去して固体を得た。その結果を以下の表１に示す。M／ＩＰＱはそのモル比を示している。
塩形成の確認はLC分析、およびイオンクロマトグラフィー、イオン電極を用いて上記のアルカリ金属イオン／ＩＰＱになっていることを確認した。LC分析、NMRより上記の生成物は分解等が見られないことから、目的の塩を形成していた。また、強アルカリになるテトラ、ペンタカリウム塩においても分解物はなく、安定であった。
ＩＰＱテトラカリウム塩、ＩＰＱトリカリウム塩、ＩＰＱトリナトリウム塩について1H−NMR(D2O, TSP)を測定した。各サンプル10ｍｇを重水に約０．６ｍＬと混合した。溶け残りがある場合、遠心分離して固体をなるべく除去して測定を行った。結果を図１〜３に示す。ＩＰＱテトラカリウム塩は6.96、8.06、9.13ppm、ＩＰＱトリカリウム塩は7.07、8.13、9.23ppm、ＩＰＱトリナトリウム塩は7.24, 8.20, 9.35ppmにピークを確認出来た。このピークは構造と矛盾しなかった。
また、テトラカリウム塩の水溶液に塩酸を加えて、ＩＰＱフリー体を発生させた。このＩＰＱフリー体を重DMSOで測定した結果、DMSO−d6: 7.31(d), 8.35, 9.13 で文献値におおよそ一致した。 (J. Am. Soc.1995, 117, 3279; 7.25, 8.29, 9.23)

実施例ＩＰＱ塩の水,エタノールへの溶解度測定（30℃）
作製した各ＩＰＱのアルカリ金属塩30ｍｇに水１ｍｌ加え、30℃に1時間以上おいた。遠心分離後、上澄みを希釈して420 nmの吸光度より溶解度を算出した。すべてが溶けた場合、サンプルを追加した。結果を表２に示す。同様の方法でエタノールを使用して溶解度を測定した。その結果を以下の表３に示す。
ＩＰＱ塩は水への溶解度がフリー体と比較して非常に大きい。特にＩＰＱに対してアルカリ金属が３以上で高くなっている。また、ＩＰＱカリウム塩ではカリウムイオンが４，５個入ることでナトリウム、リチウムには見られない特異的な溶解度の上昇が生じた。生化学的な効果を考えるとＩＰＱトリナトリウム塩、ＩＰＱトリカリウム塩、ＩＰＱテトラカリウム塩、ＩＰＱペンタカリウム塩が好ましい。
ＩＰＱ塩はすべてエタノールへの溶解度は水よりもかなり小さい。ＩＰＱフリー体と比較して、置換数１，２が溶けやすく、目的に応じて塩を選択することができる。

実施例熱分析
作製した各ＩＰＱのアルカリ金属塩をリガク社製Thermo plus EVO TG8120を使用して熱重量分析(TG)、示差熱分析(DSC)を行った。空気気流下で室温から１０℃／分の速度で上昇させた。発熱を伴い分解し始める温度を燃焼開始温度とした。結果を表４に示す。
これよりＩＰＱの塩はＩＰＱのフリー体に比べて燃焼温度が高いか燃焼することなく、また分解し難くかった。つまり、本発明のアルカリ金属塩はＩＰＱフリー体に比べて火災、爆発の危険性が低い上に、分解し難く安定であることが分かる。

実施例１６再結晶法によるＩＰＱＮａ_３の合成
ＰＱＱジナトリウム（三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱ）１２０ｇとグリシン８０ｇを水０．３２Ｌと混合し７０℃に加熱して、１日反応させた。反応液にエタノールを２００ｇ加え濾過した。濾過で得た固体に２５重量％ＮａＯＨ水４８ｇと水４００ｇ混合した。７０℃に加温して一晩放置後、濾過し、固形分をエタノール４００ｍｌで洗った。固体を７０℃で減圧乾燥行い、１１５．９ｇ得た。この固体１．０ｇを水１０ｇと混合する。７０℃に０．５時間入れる。２N 塩酸10ｇ加える。７０℃に1時間入れる。室温にして遠心分離。上澄みを捨て、２N 塩酸10ｇいれて混合。７０℃に1時間入れる。室温にして遠心分離。上澄みを捨てる。２−プロパノール４ｍｌ加え、遠心分離を行った。７０℃２時間減圧乾燥を行い、オレンジ色０．８０ｇのＩＰＱフリー体を得た。液体クロマトグラフィーで分析した結果、主に合成原料のピロロキノリンキノンが不純物として含まれ、純度９４％のＩＰＱフリー体であった。得られたＩＰＱフリー体０．５ｇを水酸化ナトリウム０．２５ｇと共に水３ｍｌと混合した。ｐＨ試験紙では１１以上であった。７０℃に加温して１晩おいた。室温に冷やし、遠心分離機を使用して上澄みを除去し、２−プロパノールで洗浄した。これを減圧乾燥し、０．４５ｇの固体を得た。ＩＰＱトリナトリウム塩であることがナトリウム、ＵＶ分析の結果わかった。また、ＬＣ分析では９９％の純度であり、純度が上がっていた。

実施例細胞活性試験
ヒト子宮がん細胞HeLa細胞を使用した。５％ＣＯ_２濃度、３７℃のインキュベーターで培養した。細胞を９６ウェルに１０００個／ウェルなるように撒き、１晩培養した。
使用したサンプルはＩＰＱフリー体、ＩＰＱトリナトリウム塩、ＩＰＱトリカリウム塩、ＩＰＱトリリチウム塩、ＩＰＱテトラカリウム塩を２ｇ／Ｌになるように水に溶解または懸濁したサンプルを使用して３１．２５から１０００mg／ＭＬになるように加えた。さらに１日後に同仁化学製cell counting kit ８を使用して細胞数を測定した。
全てのサンプルで細胞数への影響は同じであった。すなわちアルカリ金属塩になることで溶解度は変わるが細胞への影響は変わっていないことが分かった。

本発明のＩＰＱの塩は食品、機能性食品、飼料、医薬品、化粧品等の分野で有効である。

Claims

一般式（１）で表される化合物。
ｎ＝３
Ｍ＝アルカリ金属
アルカリ金属がＮａ，Ｋ，Ｌｉのいずれかである請求項１に記載の化合物。
トリナトリウム塩である請求項１に記載の化合物。
トリカリウム塩である請求項１に記載の化合物。
請求項１−４のいずれかに記載の化合物を含む食品。
請求項１−４のいずれかに記載の化合物を含む飼料。
請求項１−４のいずれかに記載の化合物を含む医薬品。
請求項１−４のいずれかに記載の化合物を含む化粧品。