JP6389295B2 - ポティウイルスに耐性のカボチャ属(Cucurbita)植物 - Google Patents
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Description
遺伝的決定因子の少なくとも1種は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMVおよびPRSVといったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ZNに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号1(5’AGGTTTCATGGGCTTTTAATGG3’)の順方向プライマーおよび配列番号2(5’CGTGAGCCTAAAACGGTTAATG3’)の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、耐性対立遺伝子特異的プローブ:FAM−CACTTCCCAGCCCAAAT−MGB−NFQ(配列番号7)および/または感受性対立遺伝子特異的プローブ:VIC−CACTTTCCAGCCCAAAT−MGB−NFQ(配列番号8)による検出において同定可能であり;ならびに/または
遺伝的決定因子の少なくとも2種は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはMWMV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座W2に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3(5’GGGCAAAGAAGATCTTGTCTAGAAAG3’)の順方向プライマーおよび配列番号4(5’GTTTTTGTGCAGTGTGCATCTGT3’)の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、耐性対立遺伝子特異的プローブ:FAM−TCATTGCACCCAACATG−MGB−NFQ(配列番号9)および/または感受性対立遺伝子特異的プローブ:VIC−TCATTGCACTCAACATGG−MGB−NFQ(配列番号10)による検出において同定可能であり;および/または配列番号5(5’TTGTGTTTATATGTATGTGTGCGAG3’)の順方向プライマーおよび配列番号6(5’TTTCTAGATCTCAGTGTAAGAGAACACA3’)の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、耐性対立遺伝子特異的プローブ:FAM−TTTGTTTGCTTGAGCTGG−MGB−NFQ(配列番号11)および/または感受性対立遺伝子特異的プローブ:VIC−TTTGTTCGATTGAGCTGG−MGB−NFQ(配列番号12)による検出において同定可能であり;ならびに/または
遺伝的決定因子の少なくとも1種は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMV耐性形質、より好ましくはZYMV菌株Nivir耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ni+に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13(5’TTGCATGTTCCTTGGATGGGT3’)の順方向プライマーおよび配列番号14(5’GGCAACCTCTGTCCAATTTCTTTC3’)の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、耐性対立遺伝子特異的プローブ:FAM−AGTTGCGACTTTCCA−MGB−NFQ(配列番号15)および/または感受性対立遺伝子特異的プローブ:TET−AGTTGCGACTTTTCATT−MGB−NFQ(配列番号16)による検出において同定可能である。
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMVおよびPRSV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ZNに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号7および/または配列番号8による検出においてペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)ゲノムに同定可能であり;
および/または遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはMWMV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座W1およびW2に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出および/または配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出においてペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)ゲノムに同定可能であり;ならびに/または
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMV耐性形質、より好ましくはZYMV菌株Nivir耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ni+に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出においてペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)ゲノム中に同定可能である。
遺伝的決定因子は、好ましくはZYMVおよびPRSV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ZNに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号7および/または配列番号8による検出において前記植物のゲノム中に同定可能であり;ならびに/または
遺伝的決定因子は、好ましくはMWMV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座W1および/またはW2に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出;および/または配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出において前記植物のゲノム中に同定可能であり;ならびに/または
遺伝的決定因子は、好ましくはZYMV耐性形質、より好ましくはZYMV菌株Nivir耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ni+に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出において前記植物のゲノム中に同定可能である。
a)ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも1種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜するステップであって、前記遺伝的決定因子はペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)のゲノムから入手可能であり、および、ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離するマーカ遺伝子座の少なくとも1種に遺伝的に連鎖し、および、
i.配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー;ならびに/または
ii.配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー;ならびに/または
iii.配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー;ならびに/または
iv.配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、ならびに/または
v.ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離するマーカ遺伝子座を同定可能である順方向および逆方向プライマー、
を含む少なくとも一対のPCRオリゴヌクレオチドプライマーによるPCRにおいて同定可能であるステップ;
b)ステップa)の前記植物とポティウイルスに感受性であるカボチャ植物または前記ポティウイルスの少なくとも1種に対して中レベルの耐性を示すカボチャとを交雑するステップ;ならびに
c)ポティウイルスに対する耐性表現型を発現する前記交雑に由来する子孫を選抜するステップであって、前記耐性表現型は、ステップa)の前記少なくとも1種のマーカ遺伝子座を伴って分離するステップ
を含む、好ましくはMWMV、PRSV、WMVおよびZYMVの少なくとも1種といったポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を生成する方法に関する。
a)好ましくはZYMVおよびMWMVの少なくとも1種といったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも1種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜するステップであって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)のゲノムから入手可能であり、および、ポティウイルス耐性を伴って同時分離する少なくとも1種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖し、および、
i.マーカ遺伝子座がZNである場合、配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー、または;
ii.配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、ならびに/または
iii.マーカ遺伝子座がW2である場合、配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、ならびに/または
iv.マーカ遺伝子座がNi+である場合、配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、
を含む少なくとも一対のPCRオリゴヌクレオチドプライマーによるPCRにおいて同定可能であるステップ;
b)ステップa)の前記植物と、ポティウイルスに感受性であるカボチャ植物または前記ポティウイルスの少なくとも1種に対して中レベルの耐性を示すカボチャ植物とを交雑させるステップ;ならびに
c)ポティウイルスに対する耐性表現型を発現する前記交雑に由来する子孫を選抜するステップであって、前記耐性表現型は、ステップa)の前記少なくとも1種のマーカ遺伝子座を伴って分離するステップ
を含む、いずれかの既述の実施形態によるポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を生成する方法に関する。
a)本明細書に記載のとおり、または、本明細書に記載の方法により植物を得るステップ;
b)前記植物とポティウイルス感受性植物または中度耐性カボチャ植物とを交雑させるステップ;
c)ステップb)の交雑からもたらされる胚芽を救出するステップ;
d)ステップc)の前記胚芽から植物を再生するステップ;ならびに
e)ポティウイルスに対して耐性であるステップd)の植物を選抜するステップ
を含むポティウイルス耐性カボチャ植物を得る方法に関する。
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMVおよびPRSV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ZNに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対(配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマーを用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号7および/または配列番号8による検出において同定可能であり;ならびに/または
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはMWMV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座W2に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対(配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマーを用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出、および/または配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマーを用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出において同定可能であり;ならびに/または
遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMV耐性形質、より好ましくはZYMV菌株Nivir耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ni+に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対(配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマーを用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出において同定可能である。
マーカ遺伝子座がZNである場合、配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー、または;
マーカ遺伝子座がW1である場合、配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、ならびに/または
マーカ遺伝子座がW2である場合、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出;または;
マーカ遺伝子座がNi+である場合、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出
を含む少なくとも一対のPCRオリゴヌクレオチドプライマーによるPCRにおいて同定可能である。
本明細書において用いられるところ、「確立された育種固体群」という句は、例えば、商業的な育種プログラムといった育種プログラムにおいて親によってもたらされるおよび/または親として用いられる可能性のある育種パートナーの一群を指す。確立された育種固体群の構成種は、典型的には、遺伝的および/または表現型的に十分に特徴付けられている。例えば、数々の関心のある表現型形質は、例えば異なる環境条件、複数の位置および/または異なる時間で評価された可能性がある。あるいは、または、加えて、表現型形質の発現に関連する1つ以上の遺伝子座は同定されている可能性があり、育種固体群の構成種の1種以上は、1つ以上の遺伝子座に関して、ならびに、1つ以上の遺伝子座に関連する1つ以上の遺伝子マーカに関して遺伝子型が同定されている可能性がある。
i.配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー、および/または;
ii.配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、および/または;
iii.配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、ならびに/または
iv.配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、
を含む少なくとも一対のPCRオリゴヌクレオチドプライマーによるPCRにおいて同定可能であり、PCR反応において増幅生成物をもたらす前記プライマーは、同等のプライマー対を用いるPCR反応においてペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(そのサンプルが受入番号NCIMB 41727でNCIMB Ltdに寄託されている)から入手可能な対応するPCR増幅生成物のものに対する対立遺伝子とみなされることが可能であるか、または、実質的に同等である分子量もしくはヌクレオチド配列を示す。
i.配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー、ならびに/または;
ii.配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、ならびに/または;
iii.配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、ならびに/または;
iv.配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、
からなるPCRオリゴヌクレオチドプライマーの対を用いるPCR増幅において得られる増幅生成物のヌクレオチド配列を得ることが可能であり、PCR増幅生成物の新たに判定したヌクレオチド配列に基づいて新規のプライマーもしくはプライマー対が設計される。
しかも、本発明による、および、本明細書において上記に開示のマーカはカボチャもしくは他の種の遺伝子地図上に位置されていることが可能であり、ならびに、同一の領域または同族体領域またはオルソログ領域においてマッピングする公知のマーカが新規のマーカの開発の開始点として用いられることが可能である。
−関心領域における他の配列を同定するためのハイブリダイゼーションアプローチにおける開示の配列/マーカの使用。
−関心領域における他の配列を同定するためのPCRアプローチにおける開示の配列/マーカの使用。
−関心領域における他の配列を同定するためのPCRアプローチにおける開示の配列/マーカの使用。
−同一の領域におけるマーカを同定するためのマッピングおよび/または比較マッピングアプローチにおける開示の配列/マーカの使用(他の地図上におけるポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である前記少なくとも1種の遺伝的決定因子の位置決め)。
−追加の配列/マーカ/(候補)遺伝子を同定するための「インシリコ」アプローチにおける開示の配列/マーカの使用。
−物理的マッピングアプローチにおける開示の配列/マーカの使用(物理的地図またはゲノム配列上における前記遺伝的決定因子の位置決め)。
−他の(物理的)地図またはゲノム上における前記少なくとも1種の遺伝的決定因子の位置決めのための開示の配列/マーカの使用。
−遺伝子アプローチによる関心領域におけるマーカの同定を可能とする適切な個体を選抜するための開示の配列/マーカの使用。
−(位置的)候補遺伝子を探索するための開示情報の使用。
ブダペスト条約に基づき、2010年6月14日に、Syngenta Participations AG名義で以下の種子サンプルをNCIMB,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,Scotland,UKに寄託した。
NCIMB 41726 ペポカボチャ(Cucurbita pepo cv.PP415)
NCIMB 41727 ペポカボチャ(Cucurbita pepo cv.268NiW)
1.好ましくはMWMV、PRSV、WMVおよびZYMVの1種以上といったポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも1種の遺伝的決定因子を含む好ましくはペポカボチャ(Cucurbita pepo)である栽培されたカボチャ属(Cucurbita)植物。
a)遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMVおよびPRSV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ZNに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号7および/または配列番号8による検出において同定可能であり;ならびに/または
b)遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子の2種に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはMWMV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座W1および/またはW2に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出、および/または配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出において同定可能であり;ならびに/または
c)遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMV耐性形質、より好ましくはZYMV菌株Nivir耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ni+に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出において同定可能である、
いずれかの既述の実施形態による植物。
a)遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMVおよびPRSV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ZNに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号7および/または配列番号8による検出においてペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)ゲノムに同定可能であり;ならびに/または
b)遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子の2種に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはMWMV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座W1および/またはW2に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出;および/または配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出、
においてペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)ゲノムに同定可能であり;ならびに/または
c)遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMV耐性形質、より好ましくはZYMV菌株Nivir耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ni+に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出、
においてペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)ゲノム中に同定可能である、いずれかの既述の実施形態による植物。
a)遺伝的決定因子は、好ましくはZYMVおよびPRSV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ZNに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号7および/または配列番号8による検出において前記植物のゲノム中に同定可能であり;ならびに/または
b)遺伝的決定因子は、好ましくはMWMV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座W2に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出;
および/または配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出において前記植物のゲノム中に同定可能であり;ならびに/または
c)遺伝的決定因子は、好ましくはZYMV耐性形質、より好ましくはZYMV菌株Nivir耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ni+に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、を用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出において前記植物のゲノム中に同定可能である、
いずれかの既述の実施形態による植物。
a)配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー;
b)配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー;
c)配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー;
d)配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー;
から選択されるPCRオリゴヌクレオチドプライマー対を伴うPCRにおいて増幅されることが可能であるキット。
a)配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー;
b)配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー;
c)配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー;ならびに/または
d)配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー;
から選択されるPCRオリゴヌクレオチドプライマー対を伴うPCRにおいて増幅されることが可能であるDNAマーカ。
a)配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー;
b)配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー;
c)配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー;
d)配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー;
から選択されるPCRオリゴヌクレオチドプライマー対を伴うDNA断片の増幅によるPCRにおいて入手可能であるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドはポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である遺伝的決定因子に統計的に相関し、それ故、遺伝的に連鎖するDNAマーカを含有し、および、前記ポリヌクレオチドは、同一のプライマー対を伴うPCRにおいてペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)から入手可能である増幅生成物に対応するが、ただし、対応するマーカ遺伝子座は、前記ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)植物に未だ存在しており、および/または、その対立遺伝子とみなされることが可能である。
a)前記実施形態のいずれか1つによる第1のカボチャ植物を得るステップ;
b)前記第1のカボチャ植物と第2のカボチャ植物とを交雑するステップであって、前記第2のカボチャ植物が前記対立遺伝子を欠いているステップ;ならびに
c)ポティウイルスに対する高い耐性を発現し、および、前記ポティウイルス耐性を伴って同時分離する少なくとも1種のDNAマーカを含む、交雑に由来する植物を同定するステップ;ならびに
d)任意により、前記植物を単離するステップ、ならびに
e)任意により、前記植物を第1または第2のカボチャ植物と戻し交雑するステップ
を含む方法。
a)前記実施形態のいずれか1つによる第1のカボチャ植物を得るステップ;
b)前記第1のカボチャ植物と第2のカボチャ植物とを交雑するステップであって、前記第2のカボチャ植物は前記遺伝的決定因子を欠いているステップ;ならびに
c)ポティウイルスに対する高い耐性を発現し、および、前記ポティウイルス耐性を伴って同時分離する少なくとも1種のDNAマーカを含む、交雑に由来する植物を同定するステップ;ならびに
d)前記ポティウイルス耐性を伴って同時分離する少なくとも1種のDNAマーカを含む子孫種子を前記交雑から収穫するステップ
を含む、前記実施形態のいずれかによる植物の種子を得る方法。
a)配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー;
b)配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー;
c)配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー;ならびに/または
d)配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、
から選択されるPCRオリゴヌクレオチドプライマー対を伴うDNA断片の増幅によるPCRにおいて同定可能である、実施形態27または28のいずれか1つによる方法。
a)ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも1種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜するステップであって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)のゲノムから入手可能であり、および、ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離する少なくとも1種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖しており、および、
i.配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー;
ii.配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー;
iii.配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー;
iv.配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー;
v.前記ポティウイルス耐性表現型の少なくとも1種を伴って同時分離するマーカ遺伝子座を同定可能である順方向および逆方向プライマー、
を含む少なくとも一対のPCRオリゴヌクレオチドプライマーによるPCRにおいて同定可能であるステップ;
b)ステップa)の前記植物と、ポティウイルスに対して感受性であるか、または、前記ポティウイルスの少なくとも1種に対して中レベルの耐性を発現するカボチャ植物とを交雑させるステップ;ならびに
c)ポティウイルスに対する耐性表現型を発現する子孫を前記交雑から選抜するステップであって、前記耐性表現型は、ステップa)の前記少なくとも1種のマーカ遺伝子座を伴って分離するステップ
を含む好ましくはMWMV、PRSV、WMVおよびZYMVの1種以上といったポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を生成する方法。
a)ポティウイルスに対する耐性を方向づけするまたは制御することが可能である少なくとも1種の遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜するステップであって、前記遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)のゲノムから入手可能であり、および、ポティウイルスに対する耐性を伴って同時分離する少なくとも1種のマーカ遺伝子座に遺伝的に連鎖しており、および、
i.配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、マーカ遺伝子座がZNである場合、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー;
ii.配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、マーカ遺伝子座がW1である場合、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー;
iii.配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、マーカ遺伝子座がW2である場合、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー;
iv.配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、マーカ遺伝子座がNi+である場合、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、
を含む少なくとも一対のPCRオリゴヌクレオチドプライマーによるPCRにおいて同定可能であるステップ;
b)ステップa)の前記植物と、ポティウイルスに対して感受性であるか、または、前記ポティウイルスの少なくとも1種に対して中レベルの耐性を発現するカボチャ植物とを交雑させるステップ;ならびに
c)ポティウイルスに対する耐性表現型を発現する子孫を前記交雑から選抜するステップであって、前記耐性表現型は、ステップa)の前記少なくとも1種のマーカ遺伝子座を伴って分離するステップ
を含む実施形態31による好ましくはZYMVおよびMWMVの少なくとも1種といったポティウイルスに対する耐性を示すカボチャ植物を生成する方法。
a)雄性不稔性雌株および雄性稔性植物を植えるステップであって、前記雄性不稔性雌株または雄性稔性植物の一方が既述の実施形態1〜13のいずれかの植物であるステップ、
b)両方の系統間で他家受粉させるステップ、
c)植物を実どまりするまで育成するステップ、
d)果実を採取するステップ、ならびに
e)ハイブリッド種子を得るステップ
を含むポティウイルスに対して耐性であるカボチャのハイブリッド種子を生成する方法。
a)いずれかの既述の実施形態の植物を得るステップ、または、いずれかの既述の実施形態の方法により植物を得るステップ;
b)前記植物とポティウイルス感受性植物または中度耐性カボチャ植物とを交雑させるステップ;
c)ステップb)の交雑からもたらされる胚芽を救出するステップ;
d)ステップc)の前記胚芽から植物を再生するステップ;ならびに
e)好ましくはZYMVおよびMWMVの少なくとも1種といったポティウイルスに耐性であるステップd)の植物を選抜するステップ
を含むポティウイルス耐性カボチャ植物を得る方法。
a)いずれかの既述の実施形態のいずれか1つの植物、または、いずれかの既述の実施形態のいずれか1つの方法により得た植物の種子を播種するステップ;および
b)果実を形成するために前記植物を育種し、および、前記植物によって形成された果実を収穫するステップ
を含むポティウイルスに対して耐性のカボチャ果実を得る方法。
a)遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMVおよびPRSV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座ZNに遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマーを用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号7および/または配列番号8による検出において同定可能であり;ならびに/または
b)遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)中に存在する対応する遺伝的決定因子の少なくとも1種に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはMWMV耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座W1および/またはW2に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマーを用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出;
および/または配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマーを用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出において同定可能であり;ならびに/または
c)遺伝的決定因子は、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)に存在する対応する遺伝的決定因子に対して相補性であり、前記対応する遺伝的決定因子は、好ましくはZYMV耐性形質、より好ましくはZYMV菌株Nivir耐性形質といったポティウイルス耐性形質を伴って同時分離するマーカ遺伝子座Ni+に遺伝的に連鎖しており、および、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマーを用いるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出において同定可能である。
i.マーカ遺伝子座がZNである場合、配列番号7および/または配列番号8による検出を伴う、配列番号1の順方向プライマーおよび配列番号2の逆方向プライマー;
ii.マーカ遺伝子座がW1である場合、配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー;
iii.マーカ遺伝子座がW2である場合、配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー;
iv.マーカ遺伝子座がNi”である場合、配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、
を含む少なくとも一対のPCRオリゴヌクレオチドプライマーによるPCRにおいて同定可能である。
カボチャにおいてZYMVおよびMWMV耐性遺伝子に密接に連鎖するマーカの発見
1.1 材料
マーカを発見するために、ZYMV−(R系統[PP452]×S系統[TOSCA])およびMWMV(S系統[PP477]×R系統[PP477/(PP415/(PP419/(Nigeria/PP432)])耐性遺伝子についてニホンカボチャ(Cucurbita moschata cv Nigeria)から分離するF2個体群を作成し、サンプルとし;ならびに、それぞれZYMVおよびMWMV耐性に係るこれらの対応するF3後代表現型を作成し、サンプルとした。
ランダム増幅型多型体DNA(RAPD)マーカを用いる集団分離分析(Bulked Segregant Analysis)(BSA)(Operon technologies,Alameda,Calif.;および、University of British Columbia,Vancouver,Canada製);を対向する耐性および感受性表現型を伴う異なるF2DNAプールで実施した。BSAスクリーニングから示された候補マーカ(F2RおよびSバルク間で明らかな存在/不在パターンを示すRAPDバンド)をF2固体群の個体構成種において連鎖についてさらに試験し;最も密接に連鎖したマーカをさらに特異的なアッセイの構築のために選抜した。
すべての植物DNAを酢酸カリウム+プロテイナーゼKプロトコルに準拠して単離した。対立遺伝子配列決定のために、3つ以下の異なるPCRプライマーの組み合わせを選抜したRAPD候補断片の5’および3’端部で設計した。これらのマーカのPCR生成物およびDNA配列を耐性および感受性系統のパネルからの系統を用いて得た。
1. 標準的なDNA抽出酢酸カリウム+プロテイナーゼKプロトコルでDNAゲノムを単離。最終的に、150μlのDNA溶液を得た。
2分間 94℃
15秒間 94℃
1分間 60℃
40×
5分間 72℃
1.5.1. ZYMV−Nigeria
順方向プライマー:5’AGGTTTCATGGGCTTTTAATGG3’(配列番号1)
逆方向プライマー:5’CGTGAGCCTAAAACGGTTAATG3’(配列番号2)
耐性対立遺伝子特異的プローブ:FAM−CACTTCCCAGCCCAAAT−MGB−NFQ(配列番号7)
感受性対立遺伝子特異的プローブ:VIC−CACTTTCCAGCCCAAAT−MGB−NFQ(配列番号8)
Ni+
順方向プライマー:5’TTGCATGTTCCTTGGATGGGT3’(配列番号13)
逆方向プライマー:5’GGCAACCTCTGTCCAATTTCTTTC3’(配列番号14)
耐性対立遺伝子特異的プローブ:FAM−AGTTGCGACTTTCCA−MGB−NFQ(配列番号15)
感受性対立遺伝子特異的プローブ:TET−AGTTGCGACTTTTCATT−MGB−NFQ(配列番号16)
1.5.2.1 QTL1
順方向プライマー:5’GGGCAAAGAAGATCTTGTCTAGAAAG3’(配列番号3)
逆方向プライマー:5’GTTTTTGTGCAGTGTGCATCTGT3’(配列番号4)
耐性対立遺伝子特異的プローブ:FAM−TCATTGCACCCAACATG−MGB−NFQ(配列番号9)
感受性対立遺伝子特異的プローブ:VIC−TCATTGCACTCAACATGG−MGB−NFQ(配列番号10)
1.5.2.1 QTL2
順方向プライマー:5’TTGTGTTTATATGTATGTGTGCGAG3’(配列番号5)
逆方向プライマー:5’TTTCTAGATCTCAGTGTAAGAGAACACA3’(配列番号6)
耐性対立遺伝子特異的プローブ:FAM−TTTGTTTGCTTGAGCTGG−MGB−NFQ(配列番号11)
感受性対立遺伝子特異的プローブ:VIC−TTTGTTCGATTGAGCTGG−MGB−NFQ(配列番号12)
病害試験プロトコル
2.1 プロトコルの使用
以下のプロトコルは、カボチャならびにカボチャ属の一種(Cucurbita sp.)およびキュウリ(Cucumis sativus sp.)におけるすべてのウイルス(CMV、ZYMV、WMV、MWMV)について適用可能である。
新鮮な感染させた葉(1g)を計量した。次いで、葉を小刀で細かく切り、紙製の計量トレイ上に置いた。この計量トレイを無水物カルシウムクロリドを含有するペトリ皿(55mm)上に置いた。箱をパラフィルムでシールした。菌株の名前、保存日および調製した新たな葉の重量を箱に記し、箱の数を記録した。ペトリ皿は冷蔵庫の「野菜」用の引き出しの中で保持した。
感受性品種群の1つ以上のテリーヌ(terrine)を播種した。接種は、植物が「子葉」段階にある時に、無水調製物(以下の試験体の接種を参照のこと)から行った。1週間〜10日後、最初の症状が見られることとなり、ウイルスが最も活動的な段階である。
感染した若い葉をテリーヌから摘み取った。1グラムの葉に対して、0.1グラムのコールおよび4ccの緩衝剤溶液を調製した。コールおよび最後に緩衝剤溶液を添加する前に、葉を粉砕した。カーボランダムをミックスにまいた。1グラムの新鮮な葉に、2〜3テリーヌを接種可能であった(1テリーヌ=80〜100植物)。
接種材料を氷床上においた。植物に子葉段階で接種した。子葉に接種材料をこすりつけ、必要に応じて毎回溶液を新しくした。15分間乾燥させた後、次いで、植物に水をやった。最初の解読は接種の5〜6日後に行った。次いで、2回目の解読は、情報を確認し完全なものとするために7〜10日後に行うことが可能であった。試験を終了するために、葉をプラスチックバッグ中に密閉し、生物学用廃棄物に入れた。試験を行うための最良の温度条件は日中は25℃±2℃および夜間は20℃±2℃である。
0〜8日目 増殖のテリーヌの播種
0〜2日目 テリーヌの接種
0日目 試験体の播種
0+6日目 試験体の接種
0+14日目 解読開始
0+30日目 試験終了
ペポカボチャ(Cucurbita pepo)におけるポティウイルス病理学試験用のガイドライン
3.1 評価ガイドライン
以下のガイドラインを用いて、葉および果実におけるZYMV、WMV、PRSV、MWMV感染症の程度を判定した。解読、評価および格付けを第3葉展開期から成植物期(植物学的に熟した果実を伴う)までの作物にわたって行った。
Claims (12)
- MWMV及びZYMVに対する耐性を方向づける3種の劣性遺伝的決定因子を含む、栽培されたペポカボチャ(Cucurbita pepo)植物であって、前記3種の劣性遺伝的決定因子が、
a)遺伝的決定因子マーカ遺伝子座W1およびW2であって、MWMV耐性形質を伴って同時分離し、かつ、それぞれ、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、によるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出において、および配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、によるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能である遺伝的決定因子マーカ遺伝子座W1およびW2、ならびに
b)遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位Ni+であって、前記ZYMVに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、によるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能である遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位Ni+、
であり、
前記3種の遺伝的決定因子が、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727として、NCIMBに寄託されている)のゲノムから得られることを特徴とするペポカボチャ植物。 - 前記遺伝的決定因子が、相互に独立に分離する、請求項1に記載の植物。
- カボチャ植物である、請求項1または2に記載の植物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の植物から得られ得る植物材料であって、葉、茎、根、花もしくは花部、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞もしくは組織培養物、または特に植物に育成された場合に依然としてポティウイルス耐性表現型を示す前記植物のその他の部分または生成物であることを特徴とする植物材料。
- ZYMVおよびMWMV耐性カボチャ植物を育成できることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載のカボチャ植物の種子。
- ZYMVおよびMWMV耐性カボチャ植物を育成するための請求項5に記載の種子の使用。
- MWMVおよびZYMVに対する耐性を方向づける3種の劣性遺伝的決定因子を含むカボチャ植物の種子を得る方法であって、
a)MWMVおよびZYMVに対する耐性を方向づける前記遺伝的決定因子を含む第1のカボチャ植物を得る工程、
b)前記第1のカボチャ植物と第2のカボチャ植物とを交雑する工程であって、前記第2のカボチャ植物が、前記遺伝的決定因子を欠いている工程、
c)MWMVおよびZYMVに対する高い耐性を示し、かつ前記MWMVおよびZYMV耐性を伴って同時分離する少なくとも1種のDNAマーカを含む、交雑に由来する植物を同定する工程、および
d)前記MWMVおよびZYMV耐性を伴って同時分離する少なくとも1種のDNAマーカを含む子孫種子を前記交雑から収穫する工程、
を含み、
前記遺伝的決定因子が、以下、
i)遺伝的決定因子マーカ遺伝子座W1およびW2であって、MWMV耐性形質を伴って同時分離し、かつ、それぞれ、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、によるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出において、および配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、によるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能である遺伝的決定因子マーカ遺伝子座W1およびW2、ならびに
ii)遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位Ni+であって、前記ZYMVに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、によるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能である遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位Ni+、
であることを特徴とする方法。 - MWMVおよびZYMVに対する耐性を示すカボチャ植物の生産方法であって、
a)MWMVおよびZYMVに対する耐性を方向づける3種の劣性遺伝的決定因子を含むカボチャ植物を選抜する工程であって、前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727として、NCIMBに寄託されている)のゲノムから入手され、
前記遺伝的決定因子が、以下、
i)遺伝的決定因子マーカ遺伝子座W1およびW2であって、MWMV耐性形質を伴って同時分離し、かつ、それぞれ、オリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、によるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号9および/または配列番号10による検出において、および配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、によるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号11および/または配列番号12による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能である遺伝的決定因子マーカ遺伝子座W1およびW2、ならびに
ii)遺伝的決定因子マーカ遺伝子座位Ni+であって、前記ZYMVに対する耐性形質を伴って同時分離し、かつオリゴヌクレオチドプライマー対、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、によるDNA断片の増幅によるPCR、続いて、配列番号15および/または配列番号16による検出において、前記植物の前記ゲノム中に同定可能であるマーカ遺伝子座位Ni+、
である工程、
b)工程a)の前記植物と、MWMVおよびZYMVに対して感受性であるか、または、MWMVおよびZYMVに対して中レベルの耐性を示すカボチャ植物とを交雑させる工程;ならびに
c)MWMVおよびZYMVに対する耐性表現型を示す子孫を前記交雑から選抜する工程であって、前記耐性表現型は、工程a)の前記1種のマーカ遺伝子座を伴って分離する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - MWMVおよびZYMVに対して耐性であるカボチャのハイブリッド種子を産生する方法であって、
a.雄性不稔性雌植物および雄性稔性植物を植える工程であって、前記雄性不稔性雌植物または雄性稔性植物の一方が請求項1〜3のいずれか一項に記載の植物である工程、
b.両方の系統間で他家受粉させる工程、
c.前記植物を実どまりするまで育成する工程、
d.前記果実を採取する工程、および
e.前記ハイブリッド種子を得る工程、
を含むことを特徴とする方法。 - MWMVおよびZYMV耐性カボチャ植物を得る方法であって、
a.請求項1〜3のいずれか一項に記載の植物と他の植物との交雑に由来する生育不能な種間胚芽を提供する工程、
b.前記胚芽を救出する工程、
c.工程b)の前記胚芽から植物を再生する工程、および
d.MWMVおよびZYMVに対して耐性である工程c)の植物を選抜する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - MWMVおよびZYMVに対する耐性を方向づける3種の劣性遺伝的決定因子を含むカボチャ植物の同定方法であって、前記遺伝的決定因子が、ペポカボチャ(C.pepo cv.268NiW)(その代表種子は受入番号NCIMB 41727でNCIMBに寄託されている)のゲノムから入手され、前記MWMVおよびZYMV耐性表現型を伴って同時分離し、かつ、以下、
i) マーカ遺伝子座位が、W1である場合には、配列番号9および/または配列番号10による検出を伴う、配列番号3の順方向プライマーおよび配列番号4の逆方向プライマー、および
ii) マーカ遺伝子座が、W2である場合には、配列番号11および/または配列番号12による検出を伴う、配列番号5の順方向プライマーおよび配列番号6の逆方向プライマー、および
iii) マーカ遺伝子座がNi+である場合には、配列番号15および/または配列番号16による検出を伴う、配列番号13の順方向プライマーおよび配列番号14の逆方向プライマー、
を含む少なくとも1対のPCRオリゴヌクレオチドプライマーによってPCRにおいて同定できることを特徴とする方法。 - MWMVおよびZYMVに対し耐性であるカボチャ果実を得る方法であって、
a)請求項5に記載の植物の種子を播種する工程、および
b)前記植物を育種して、果実を生産し、かつ前記植物によって生産された前記果実を収穫する工程、
を含むことを特徴とする方法。
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