JP6388605B2 - 生体分子処理プラットフォーム及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は核酸の配列決定及びタンパク質/ポリペプチドの同定に好適な装置及び方法に関する。
1,000ドルゲノムの恩恵は文献で十分に立証されている(Kaiser, J., "DNA Sequencing - A Plan to Capture Human Diversity in 1000 Genomes," Science 319:395-395 (2008)(非特許文献1); Kuehn, B.M., "1000 Genomes Project Promises Closer Look at Variation in Human Genome," JAMA 300:2715-2715 (2008)(非特許文献2); Mardis, E., "Anticipating the $1,000 Genome," Genome Biol. 7:112 (2006)(非特許文献3); Metzker, M.L., "Emerging Technologies in DNA Sequencing," Genome Res. 15:1767-1776 (2005)(非特許文献4); Schloss, J.," How to Get Genomes at One Ten-Thousandth the Cost," Nature Biotechnol. 26:1113-1115 (2008)(非特許文献5))。重要な帰結のいくつかには、(i)ゲノム全体にわたる配列変異の評価を通じて、さらに効果的な疾患予防に役立ち、診断及び予後診断を改善して、特定の患者と適切な治療法をマッチングさせ得る個別化医療、(ii)ゲノム全体にわたる複雑性の理解;(iii)新しい治療剤の設計;及び(iv)配列変異の型を問わないインビトロ診断(IVD)のための事実上の業界基準の開発が挙げられる。
[本発明1001]
生体分子プロセッサを含む装置であって、各生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバー;
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体;
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素;並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端及び出力端を有し、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも(i)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの入力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと(ii)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの出力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを含む2つ以上のセンサーを含む、1つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、装置。
[本発明1002]
前記1つ以上のバイオリアクターチャンバー内及び前記1つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を生成するように機能的に配置された電場発生器をさらに含む、本発明1001の装置。
[本発明1003]
前記1つ以上の飛行時間型チャネルが、幅50nm以下でありかつ深さ50nm以下である、本発明1001の装置。
[本発明1004]
前記1つ以上の飛行時間型チャネルが、長さ5μm〜250μmである、本発明1001の装置。
[本発明1005]
前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーが、幅100〜1000nmである、本発明1001の装置。
[本発明1006]
前記1つ以上のバイオリアクターチャンバー内の前記支持構造体が、幅50〜900nmである、本発明1001の装置。
[本発明1007]
前記固体基板がポリマー材料で作られている、本発明1001の装置。
[本発明1008]
前記切断酵素がエキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである、本発明1001の装置。
[本発明1009]
前記切断酵素がプロセッシブなエキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである、本発明1008の装置。
[本発明1010]
前記切断酵素がプロテアーゼである、本発明1001の装置。
[本発明1011]
前記2つ以上のセンサーがそれぞれ、貴金属ナノワイヤ、セグメント化されたナノワイヤ、又はナノ粒子から成る、1対の検出電極を含む、本発明1001の装置。
[本発明1012]
各検出電極対が、それらが前記飛行時間型チャネルに接触する狭い断面を有する、本発明1011の装置。
[本発明1013]
前記1つ以上の飛行時間型チャネルが3つ以上のセンサーを含む、本発明1001の装置。
[本発明1014]
前記生体分子プロセッサが、前記固体基板の壁によって画定されるフィーダーチャネルをさらに含み、前記フィーダーチャネルが、前記固体基板の表面の近位にある入力端から前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーの近位にある出力端まで延在する長さを有する、本発明1001の装置。
[本発明1015]
前記フィーダーチャネルの前記入力端の近位にある、前記フィーダーチャネルに接触するセンサーをさらに含む、本発明1014の装置。
[本発明1016]
前記フィーダーチャネルのセンサーが1対の検出電極を含む、本発明1015の装置。
[本発明1017]
前記フィーダーチャネルが、前記入力端と前記出力端の間に1つ以上のエントロピートラップを含む、本発明1014の装置。
[本発明1018]
前記フィーダーチャネルが、幅100nm以下でありかつ深さ100nm以下である、本発明1014の装置。
[本発明1019]
前記1つ以上の飛行時間型チャネルが、電荷中性の親水性壁表面、荷電した親水性壁表面、又は電荷中性の疎水性壁表面を含む、本発明1001の装置。
[本発明1020]
10,000個以上の生体分子プロセッサを含む、本発明1001の装置。
[本発明1021]
100,000個以上の生体分子プロセッサを含む、本発明1001の装置。
[本発明1022]
以下の工程を含む、核酸分子の配列決定の方法:
本発明1001の装置を提供する工程;
前記装置の前記生体分子プロセッサに、1つ以上の核酸分子を含む試料を、前記バイオリアクターチャンバー内の前記固定化された切断酵素が前記試料中の前記1つ以上の核酸分子に結合して前記1つ以上の核酸分子を前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端に1つずつ入る単量体ヌクレオチドへと切断するのに有効な条件下で供給する工程;
切断された前記単量体ヌクレオチドを前記1つ以上の飛行時間型チャネルを通して輸送するために、前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーを横切って及び前記1つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を印加する工程;
前記印加する工程に基づいて、切断された前記単量体ヌクレオチドを、それらが前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過する際に検出する工程;
前記検出する工程に基づいて、切断された各単量体ヌクレオチドが前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過するのにどれくらい時間がかかるかを測定する工程;並びに
前記測定する工程に基づいて前記単量体ヌクレオチドを同定する工程。
[本発明1023]
前記同定する工程に基づいて、前記試料中の前記1つ以上の核酸分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を得る工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記試料中の前記1つ以上の核酸分子のうちの1つより多くのヌクレオチド配列の少なくとも一部を得るために、前記印加する工程、前記検出する工程、前記測定する工程、前記同定する工程を繰り返す工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記繰り返す工程を行って、少なくとも10,000個の核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部を得る、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記繰り返す工程を行って、少なくとも100,000個の核酸分子のヌクレオチド配列又はその一部を得る、本発明1024の方法。
[本発明1027]
前記測定する工程が、切断された各単量体ヌクレオチドが前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける前記第1及び第2のセンサーのうちの少なくとも一方を通過する際の前記切断された各単量体ヌクレオチドの電気的ピークの振幅を測定することをさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1028]
前記1つ以上の核酸分子が、二本鎖デオキシリボ核酸分子(DNA)、一本鎖DNA分子、1つ以上のメチル化されたヌクレオチド塩基を含むDNA分子、1つ以上の修飾又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を含むDNA分子、リボ核酸(RNA)分子、1つ以上の修飾又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を含むRNA分子、及びRNA/DNAハイブリッド分子から成る群より選択される、本発明1022の方法。
[本発明1029]
前記1つ以上の核酸分子が、長い非コードRNA(lncRNA)、リボソームRNA(rRNA)、小分子核RNA(snoRNA)、マイクロRNA(miRNA)、転移RNA(tRNA)及び小分子干渉RNA(siRNA)から成る群より選択されるRNA分子を含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記1つ以上の核酸分子が二本鎖DNA分子を含み、かつ、前記二本鎖DNA分子の双方の鎖に由来する単量体ヌクレオチドの少なくとも一部が同定される、本発明1028の方法。
[本発明1031]
前記1つ以上の核酸分子が、1つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに/又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を含むDNA分子を含み、前記1つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに/又は損傷を受けたヌクレオチド塩基が、前記測定する工程に基づいて同定される、本発明1028の方法。
[本発明1032]
1つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに/又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を有する少量の核酸分子が、前記少量の核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが前記1つ以上のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、及び変異、並びに/又は損傷を受けたヌクレオチド塩基を有しない、試料中の100〜10,000倍過剰な核酸分子と区別される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記1つ以上の核酸分子が、1つ以上のメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基を含むDNA分子又はRNA分子を含み、かつ、前記1つ以上のメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基が前記測定する工程に基づいて同定される、本発明1028の方法。
[本発明1034]
1つ以上のメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基を有する少量の核酸分子が、前記少量の核酸分子と類似するヌクレオチド配列を有するがメチル化又は修飾されていないヌクレオチド塩基を有する、試料中の100〜10,000倍過剰の核酸分子と区別される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
1つ以上のメチル化又は修飾されていないヌクレオチド塩基を有する少量の核酸分子が、前記少量の核酸分子に類似するヌクレオチド配列を有するがメチル化又は修飾されたヌクレオチド塩基を有する、試料中の100〜10,000倍過剰の核酸分子と区別される、本発明1032の方法。
[本発明1036]
前記供給する工程の前に、前記1つ以上の核酸分子を組織、細胞、血清、血漿、血液、又はエキソソームから単離する工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1037]
前記方法を実施する間に、前記1つ以上の核酸分子の200〜50,000個の単量体ヌクレオチドが同定される、本発明1022の方法。
[本発明1038]
前記同定する工程に基づいて、病態を診断又は予後診断する工程及び遺伝子型又は発生段階を区別する工程をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1039]
前記切断酵素が、エキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである、本発明1022の方法。
[本発明1040]
前記切断酵素が、プロセッシブなエキソヌクレアーゼ又はプロセッシブなエキソリボヌクレアーゼである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記切断酵素が、λ−エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII、T7エキソヌクレアーゼ、XRN−1、RNaseII、及びエキソソーム複合体から選択されるか又はその構成成分である、本発明1039の方法。
[本発明1042]
前記生体分子プロセッサが、前記固体基板の壁によって画定されるフィーダーチャネルをさらに含み、前記フィーダーチャネルが、前記固体基板の表面の近位にある入力端から前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーの近位にある出力端まで延在する長さを有し、
前記方法が、
前記1つ以上の核酸分子を含む前記試料を前記フィーダーチャネルに導入する工程;および
前記フィーダーチャネル内で前記1つ以上の核酸分子を引き延ばすために、前記フィーダーチャネルの長さ方向に電場を印加する工程
をさらに含む、本発明1022の方法。
[本発明1043]
前記フィーダーチャネルが、前記入力端と前記出力端の間に、前記1つ以上の核酸分子の方向を調整するための1つ以上のエントロピートラップをさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記装置が、前記フィーダーチャネルの前記入力端の近位にある、前記フィーダーチャネルに接触するセンサーをさらに含み、
前記方法が、
前記1つ以上の核酸分子を、それらが前記フィーダーチャネルのセンサーを通り抜ける際に検出する工程;および
前記検出する工程の持続時間に基づいて、前記1つ以上の核酸分子の長さを決定する工程
をさらに含む、本発明1042の方法。
[本発明1045]
前記フィーダーチャネルのセンサーが1対の検出電極を含む、本発明1042の方法。
[本発明1046]
以下の工程を含む、1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを同定する方法:
本発明1001の装置を提供する工程;
前記装置の前記生体分子プロセッサに、1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを含む試料を、前記バイオリアクターチャンバー内の前記固定化された切断酵素が前記試料中の前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドに結合して前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを前記1つ以上の前記飛行時間型チャネルの前記入力端に入るより小さなペプチド断片へと切断するのに有効な条件下で供給する工程;
切断された前記ペプチド断片を前記1つ以上の飛行時間型チャネルを通して輸送するために、前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーを横切って及び前記1つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を印加する工程;
前記印加する工程に基づいて、前記ペプチド断片が前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過する際に前記ペプチド断片を検出する工程;
前記検出する工程に基づいて、(i)各ペプチド断片が前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過するのにどれくらい時間がかかるか及び/又は(ii)各ペプチド断片が前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける第1又は第2のセンサーのうちの少なくとも一方を通過する際の各ペプチド断片の電気ピークの振幅を測定する工程;並びに
前記ペプチド断片を測定する前記工程に基づいて、前記試料中の前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドの少なくとも一部を同定する工程。
[本発明1047]
前記試料の前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドから切断された前記ペプチド断片の(i)及び(ii)の測定値を、既知のタンパク質又はポリペプチドの切断により生成されたペプチド断片の対応する測定値と比較する工程をさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記供給する工程の前に、生体試料から前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを濃縮又は単離する工程をさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1049]
前記濃縮又は単離する工程が、アフィニティー精製、リガンド結合、又は抗体に基づく濃縮を用いて実施される、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドが、Gタンパク質共役型受容体、核内受容体、電位依存性イオンチャネル、リガンド依存性イオンチャネル、受容体チロシンキナーゼ、増殖因子、プロテアーゼ、配列特異的プロテアーゼ、ホスファターゼ、プロテインキナーゼ、生物活性のある脂質、サイトカイン、ケモカイン、ユビキチンリガーゼ、ウイルス調節因子、細胞***タンパク質、足場タンパク質、DNA修復タンパク質、細菌リボソーム、ヒストン脱アセチル化酵素、アポトーシス制御因子、シャペロンタンパク質、セリン/スレオニンプロテインキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、増殖因子受容体、プロテアソーム、シグナル伝達タンパク質複合体、タンパク質/核酸輸送体、及びウイルスカプシドから成る群より選択される、本発明1046の方法。
[本発明1051]
前記供給する工程の前に、1つ以上の細胞内区画から前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドを単離又は濃縮する工程をさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1052]
前記1つ以上のタンパク質又はポリペプチドが1つ以上の修飾されたアミノ酸残基を含み、前記測定する工程が前記1つ以上のアミノ酸の修飾を同定する、本発明1046の方法。
[本発明1053]
前記アミノ酸の修飾が、メチル化、アセチル化、及びリン酸化から選択される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記切断酵素がプロテアーゼである、本発明1046の方法。
[本発明1055]
前記切断酵素が、プロテイナーゼK、黄色ブドウ球菌(S. aureus)V−8プロテアーゼ、トリプシン、リジンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、及びキモトリプシンプロテアーゼから成る群より選択される、本発明1054の方法。
[本発明1056]
以下の工程を含む、試料中の複数の核酸分子のうちの1つ以上を同定する方法:
そのそれぞれの相補的な核酸分子とそれぞれハイブリッド形成した1つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程であって、前記1つ以上の核酸分子及びそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれが、標的特異的部分とヘアピン形成に好適な一本鎖3'アダプター部分とを含む、工程;
前記試料を、前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の3'アダプター部分がヘアピンを形成するのに有効な条件に供する工程;
ポリメラーゼを提供する工程;
伸長混合物を形成させるために、1つ以上の3'ヘアピン化核酸分子及びその相補体を前記ポリメラーゼと混合する工程;
1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を形成させるために、前記1つ以上の核酸分子及びその相補体を、それらのそれぞれの3'ヘアピン化領域から伸長させる工程;並びに
前記試料中の1つ以上の核酸分子を同定するために、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程。
[本発明1057]
前記方法が、前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を1つ以上の生体分子プロセッサに導入する工程をさらに含み、
前記生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバー;
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体;
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素;並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端と出力端を有し、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも(i)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと(ii)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記出力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを含む2つ以上のセンサーを含む、1つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記ポリメラーゼが、前記伸長させる工程の間に、前記1つ以上の核酸分子を、そのそれぞれの相補体核酸分子から解離させる、本発明1056の方法。
[本発明1059]
前記ポリメラーゼが、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記伸長させる工程の前に、前記1つ以上の3'ヘアピン化核酸分子及びその相補体を変性させる工程をさらに含む、本発明1056の方法。
[本発明1061]
前記1つ以上の完全長ヘアピン化核酸分子の5'末端がリン酸化されている、本発明1056の方法。
[本発明1062]
前記試料を提供する工程が、
1つ以上の核酸分子及びその相補体を含む試料を提供する工程;並びに
前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の前記標的特異的部分に前記アダプター部分を付加する工程
を含む、本発明1056の方法。
[本発明1063]
前記アダプター部分又はその相補体が、前記1つ以上の核酸分子又はその相補体の前記標的特異的部分に、リガーゼ、ポリメラーゼ、リコンビナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、エンドヌクレアーゼ、DNA修復酵素、及び逆転写酵素から成る群より選択される1種以上の酵素を用いて付加される、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記アダプター部分が、1種以上の一意のヌクレオチド配列タグをさらに含む、本発明1056の方法。
[本発明1065]
前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の完全長ヘアピン化核酸分子のヘアピン化部分に移動度変更因子(mobility modifier)を付加する工程をさらに含む、本発明1056の方法。
[本発明1066]
以下の工程を含む、試料中の複数の核酸分子のうちの1つ以上を同定する方法:
そのそれぞれの相補的な核酸分子とそれぞれハイブリッド形成した1つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程であって、前記1つ以上の核酸分子及びそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれが、標的特異的部分、5'アダプター部分、及び3'アダプター部分を含み、前記5'及び3'アダプター部分がそれぞれヘアピン形成に好適である、工程;
1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の収集物を形成させるために、前記1つ以上の核酸分子をその相補体から変性させる工程であって、前記1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体のそれぞれの5'及び3'アダプター部分のヘアピン配列がヘアピンを形成する、工程;
複数の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体を提供する工程であって、各捕捉オリゴヌクレオチドプローブが前記1つ以上の核酸分子又はその相補体の標的特異的部分の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、工程;
変性させた前記一本鎖核酸分子及びその相補体のうちの1つ以上を、前記固体支持体上に固定化されたそれらの相補的な捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程;
ポリメラーゼを提供する工程;
前記ポリメラーゼを、ハイブリッド形成させた前記核酸分子及びその相補体のうちの1つ以上を含有する前記固体支持体に接触させる工程;
1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を形成させるために、前記1つ以上の核酸分子又はその相補体を、それらのそれぞれの3'ヘアピン化領域から伸長させる工程であって、それによって前記1つ以上の核酸分子が前記捕捉オリゴヌクレオチド及び前記固体支持体から遊離する、工程;並びに
前記試料中の1つ以上の核酸分子を同定するために、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程。
[本発明1067]
前記方法が、前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を1つ以上の生体分子プロセッサに導入する工程をさらに含み、
前記生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバー;
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体;
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するようにバイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素;並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端と出力端を有し、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも(i)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと(ii)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記出力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを含む2つ以上のセンサーを含む、1つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、本発明1066の方法。
[本発明1068]
前記試料を提供する工程が、
1つ以上の核酸分子及びその相補体を含む試料を提供する工程;並びに
前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の前記標的特異的部分に前記アダプター部分を付加する工程
を含む、本発明1066の方法。
[本発明1069]
前記アダプター部分又はその相補体が、前記1つ以上の核酸分子又はその相補体の前記標的特異的部分に、リガーゼ、ポリメラーゼ、リコンビナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、エンドヌクレアーゼ、DNA修復酵素、及び逆転写酵素から成る群より選択される1種以上の酵素を用いて付加される、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記アダプター部分が、1種以上の一意のヌクレオチド配列タグをさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1071]
前記完全長ヘアピン化標的核酸分子の5'末端がリン酸化されている、本発明1066の方法。
[本発明1072]
前記配列決定する工程の前に、前記完全長ヘアピン化核酸分子のヘアピン化部分に移動度変更因子を付加する工程をさらに含む、本発明1066の方法。
[本発明1073]
以下の工程を含む、試料中の複数の標的核酸分子のうちの1つ以上を同定する方法:
そのそれぞれの相補的な核酸分子とそれぞれハイブリッド形成した1つ以上の核酸分子を含有する試料を提供する工程であって、前記1つ以上の核酸分子及びそのハイブリッド形成した相補体のそれぞれが、標的特異的部分、5'アダプター部分、及び一本鎖ホモポリマー反復配列を含む3'アダプター部分を含む、工程;
1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の収集物を形成させるために、前記1つ以上の核酸分子をその相補体から変性させる工程;
前記1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の3'末端に対して相補的な複数のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程;
ポリメラーゼを提供する工程;
伸長混合物を形成させるために、前記1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の収集物を前記ポリメラーゼ及びプライマーと混合する工程;
前記オリゴヌクレオチドプライマーを、それらの相補的な、前記1つ以上の一本鎖核酸分子及びその相補体の3'末端とハイブリッド形成させる工程;
1つ以上の完全長の二本鎖核酸分子を形成させるために、ハイブリッド形成させた前記プライマーを伸長させる工程;並びに
前記試料中の1つ以上の核酸分子を同定するために、前記1つ以上の完全長の二本鎖核酸分子の少なくとも一部を配列決定する工程。
[本発明1074]
前記方法が、前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の完全長のヘアピン化核酸分子を1つ以上の生体分子プロセッサに導入する工程をさらに含み、
前記生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバー;
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体;
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素;並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端と出力端を有し、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも(i)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと(ii)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記出力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを含む2つ以上のセンサーを含む、1つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、本発明1073の方法。
[本発明1075]
前記試料を提供する工程が、
前記1つ以上の核酸分子及びその相補体を含む試料を提供する工程;
前記3'及び5'アダプター部分を、前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の前記標的特異的部分に付加する工程;並びに
前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の、一本鎖ホモポリマー反復配列を有する3'アダプター部分を伸長させる工程
を含む、本発明1073の方法。
[本発明1076]
前記付加する工程及び伸長させる工程が、リガーゼ、ポリメラーゼ、リコンビナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、エンドヌクレアーゼ、DNA修復酵素、及び逆転写酵素から成る群より選択される1種以上の酵素を用いて実施される、本発明1075の方法。
[本発明1077]
前記アダプター部分が、1種以上の一意のヌクレオチド配列タグを含む、本発明1073の方法。
[本発明1078]
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、3'アダプターに特異的な部分及び3'ホモポリマー反復配列に特異的な部分を含む、本発明1073の方法。
[本発明1079]
前記5'アダプター部分が5'リン酸部分を含む、本発明1073の方法。
[本発明1080]
複数の固定化された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体を提供する工程であって、各捕捉オリゴヌクレオチドプローブが前記1つ以上の核酸分子及びその相補体の標的特異的部分の領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、工程;並びに
標的特異的な濃縮を達成するために、前記混合する工程の前に前記1つ以上の変性させた一本鎖核酸分子及びその相補体を前記固体支持体上でそれらの相補的な固定化された捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させる工程であって、前記伸長させる工程の前に又はその間に前記1つ以上の核酸分子及びその相補体が前記固体支持体の前記捕捉オリゴヌクレオチドから解離する、工程
をさらに含む、本発明1073の方法。
[本発明1081]
前記ポリメラーゼが、前記伸長させる工程の間に、前記1つ以上の核酸分子及びその相補体を、前記固体支持体の前記捕捉オリゴヌクレオチドから解離させる、本発明1080の方法。
[本発明1082]
前記ポリメラーゼが、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性又は鎖置換活性を有する、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記オリゴヌクレオチドプライマーをハイブリッド形成させる工程の後かつ前記伸長させる工程の前に、前記固体支持体の前記捕捉オリゴヌクレオチドから前記1つ以上の核酸分子及びその相補体を変性させる工程をさらに含む、本発明1080の方法。
[本発明1084]
前記配列決定する工程の前に、前記1つ以上の伸長させた完全長の二本鎖標的核酸分子の3'末端に移動度変更因子を付加する工程をさらに含む、本発明1073の方法。
本発明の第1の態様は、生体分子プロセッサを含む装置を対象とする。各生体分子プロセッサは、固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバーと、各バイオリアクターチャンバーにおいて当該固体基板に取り付けられた支持構造体とを含む。当該生体分子プロセッサはまた、当該支持構造体に固定化された切断酵素であって、当該切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素も有する。当該生体分子プロセッサはまた、当該固体基板内に形成されかつ1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルも有する。当該1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれは入力端と出力端を有し、当該1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれは、(i)当該1つ以上の飛行時間型チャネルの入力端の近位にある、当該1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと(ii)当該1つ以上の飛行時間型チャネルの出力端の近位にある、当該1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを少なくとも含む2つ以上のセンサーを有する。
GMP:242μs(マイクロ秒)
AMP:246μs
CMP:254μs
TMP:266μs
以下の実施例及びシミュレーションの結果は、電気クロマトグラフィを用いた単一のモノヌクレオチドの飛行時間同定のプロセスを表す。dNMPおよびイオンの相互作用のために、CHARMM27力場(その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Foloppe & MacKerell, "All-Atom Empirical Force Field for Nucleic Acids: I. Parameter Optimization Based on Small Molecule and Condensed Phase Macromolecular Target Data," J. Comput. Chem. 21:86-104 (2000))を、水についての剛体CHARMM TIP3Pモデルと共に用いた。静電気学についての短距離のカットオフは1.0nmであった。Lennard−Jonesの相互作用は0.8〜1.0nmの間隔でゼロに切り替えた。長距離静電相互作用については、シミュレーションボックスの長さを非周期方向については3倍とした、平板体系用に補正した三次元の粒子-粒子-粒子-メッシュ法を用いた(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるYeh & Berkowitz, "Ewald Summation for Systems with Slab Geometry," J. Chem. Phys. 111:3155-3162 (1999))。
によって与えられ、式中、Lボックスは外部から加えられた力の方向(x)に沿ったシミュレーションボックスの長さであり、A流体は加えられた力の方向に垂直の面(yz面)における流体の面積である。a=263.592nm/ns2を選択し、かつシミュレーションシステムを記述するパラメータの固有値(すなわち、流れ領域の原子の数及びその質量、流れに垂直な面積、及びシミュレーションボックスの長さ)を用いると、ナノスリットにおける流れを駆動する圧力勾配はおよそdp/dx=2.836バール/nmである。加えられた力は、最大流速約1.5m/sを特徴とする、z方向を横切るほぼ放物線の速度プロファイルを生成する。MDシミュレーションでは、アクセス可能な相対的に短い時間(普通はわずか数百ナノ秒)のため、ナノ規模の流れの典型的な速度に比べてそのように速い速度でのシミュレーションが必要である。後で考察されるように、非常に速い速度にもかかわらず、dNMPの壁への吸着及び壁からの脱着を記述する特徴的なパラメータは、流れによる実質的な影響を受けないようである。定常状態の条件が達成されるのを可能にするために、各流れシミュレーションの最初の15nsを解析から捨てた。平衡シミュレーションでは、1nsの平衡時間を捨てた。
吸脱着の時間を測定するのに用いるアルゴリズムを、下壁に対する単回の吸脱着事象についての図35にて説明し、以下のように実施した。先ず、長さ0.5nsの移動平均を用いてdwを平滑化した(d平滑と表示した)。d1と表示されている、d平滑が±0.8nmと交差した点を画定した。これはPMF曲線が平坦になり始めるおよその位置である(図36)。これらの点を、それらが±0.8nmの境界と交差した方向によって、吸着事象の前であるか又は脱着事象の後であると仮定した。ステップの残りは元々の非平滑化dwを用いた。d1と同じ時間だがdwに対応する点のセット(d2と表示する)を画定した。d2から出発し、PMF曲線(図36)における最小点から離れて、dwの値≧1.0nmまで、時間における前方(脱着)又は後方(吸着)にデータをトレースした。次いでトレースの方向を逆転させ、dw≦d上(上壁に近づく場合)まで、dw≦d下(下壁に近づく場合)まで、又はデータの開始又は終了に達するまで、トレースを実施した。ほとんどの場合、d上及びd下を、PMF曲線(図36)における大域的最小点よりもわずかに壁に近い0.42nmに設定した。場合によっては、明らかな吸脱着事象が見逃されないように、それらの1つを微修正する必要があった。これは必要であった。なぜなら、各壁における原子の構成は異なるので、各壁の吸着はわずかに異なっていたからである。当然、アルゴリズムは、事象を正確に捕捉するために当初のd上及びd下を手動で調整することがないように、当該d上及びd下を決定するように工夫され得る。しかしながら、正確な出発値は吸着及び脱着の時間の最終的な値に影響しなかった。このトレースから得られた点をd3として示した。d3又はデータセットの最初の時間若しくは最後の時間に等しい時間で繰り返しがあった場合、これらの点は吸着事象又は脱着事象の近傍ではないd2点に対応したので、これらの点を排除した。点を排除した後、dNMPが上壁及び下壁に吸着した際のdwの平均値を、吸着点及び脱着点としてのd3を用いて算出した。次いでトレースステップを繰り返したが、ただし、d上及びd下を、算出したばかりの当該平均値と置き換え、d3を更新し、吸着中のdwの平均値を再算出した。2〜3回繰り返した後、d3を一定値に変換した。平滑化及びd1を決定するためのdw=0.8nmの選択によって、表面からの短い時間又は距離の逸脱が脱着事象として分類されるのが排除され、当初のd3を決定するためのd上及びd下の当初の選択によって、dNMPが表面から跳ね返った事象が吸着事象として分類されるのが妨げられた。
図36に示すPMFにおける不確定度を、各ビンにおける生成時間を3つの部分に分割することによって算出した。さらに、これらの部分から、次いで、各モノヌクレオチドについて3つのPMF曲線を生成した。これによって、得られる平均化されたPMF曲線上の各点の平均値及び平均値の標準偏差を評価することが可能になった。4つのPMFでの最大値の位置における及び平均吸着自由エネルギーにおける不確定度を推定するために、以下の数値誤差伝搬法を用いた:(i)曲線上の各点についての平均値及び平均値の標準偏差が各ビンについての正規分布を規定すると仮定した;(ii)各点についての分布から100,000個の無作為試料を取って100,000個のPMF曲線を生成した。PMFでの最大値の位置における及び平均吸着自由エネルギーにおける不確定度は、100,000個の最大値からの100,000個の自由エネルギー曲線と、これらの曲線から算出された平均吸着自由エネルギーから得られた。不確定度は標準偏差の2倍であると見なされた。
流れの方向における全体平均速度及びその不確定度は以下を用いて算出した。
式中、f吸着は、各dNMPについて、全シミュレーションの吸着時間を、全シミュレーションの合計時間で割ったものである。
図35にて定義される軸2の、最も近位の壁表面の平面に対する平均角度を、dwの関数として、平衡と非平衡双方の場合において、吸着については図41にて、脱着については図42にて示す。(以下の)表7は、吸着期間中か脱着期間中かに関わりなく、dNMPが吸着している間に算出された軸2の平均角度を示す。軸2について図41及び42で示す所与のヌクレオチドについての吸着及び脱着の曲線は、角度の変化がノイズと同等であるので、容易には互いに区別できない。ヌクレオチドが吸着中に壁の近くにある場合、dNMPにおける最も疎水性の側が概して壁に近いが、dTMPは例外である。メチル基は疎水性であるが、非平面のメチル基は、ヌクレオチドにおける当該基が存在する側を壁から離す。壁の近くの軸2の配向度は、脱着の間、さほど強くない。ノイズのレベルを考えると、dAMP、dCMP、又はdGMPについての軸2の角度において有意な最小値又は最大値はない。dTMPについては、疎水性のメチルと表面との相互作用が、吸着中及び脱着中の軸2の角度に有意な最大値をもたらす。脱着についてのdTMPの最大角度は、平衡の場合、吸着についての角度よりも小さい。また、この最大値は、非平衡の場合に比べて平衡の場合に小さい。dTMPの脱着の場合、軸2の角度は、最大値の後に最小値も存在する。
モノヌクレオチドの飛行時間(TOF)分布を分離するのに必要な最小のチャネル長Lの決定についての詳細は、以下のとおりである。飛行時間分布についての従来の形態は想定しなかった。代わりに、台形法則を用いて長さ0.5nm(dTOF)の軌跡セグメントにわたる飛行時間分布の確率ヒストグラムの数値積分によって連続分布関数(CDF)を推定した。その後、各CDFが値0.00135(μ−δ−)及び0.99865(μ+δ+)に達した点(μは平均TOFである)を、線形補間によって推定した。これらの点は試料分布の幅を画定する。以下の方程式では、これらの点はTOF分布の境界と見なされた。数値0.00135及び0.99865は、どれだけの重複が許されるかを画定し、分布の分離において精度の増減を得るために変化し得る。単純化するために、この解析では、主文書で画定されたDTOF0.5×Nを、正規化された形態で使用した(すなわち、無作為変数TOFの値をすべてNで割った)。その結果、正規化された形態では、任意のヌクレオチドαについてのDTOF0.5×Nは、平均TOF値μαを特徴とし、Nの平方根と共に減少する幅を有する。ヌクレオチドの各対(α、β)の分布が重複しないために必要なNα,βの最小値は、方程式(S9)と(S10)の組み合わせである方程式(S11)によって与えられる。必要な最小のチャネル長(L)は方程式(S12)によって与えられる。
平衡シミュレーションの目的は、流れのない状況での個々のdNMPの吸脱着のメカニズム及びエネルギー特性を調べることである。各dNMPについて、異なる壁構成で幾つかのシミュレーションを実行した(表8を参照)。各シミュレーションの持続時間は約65nsであったが、4つのdNMPすべて及び種々の壁構成のすべてについての合計シミュレーション時間は約966nsであった。個々のdNMPとスリット壁との相互作用は、ナノスリットを横切るそれらの自由エネルギープロファイルによって最良に説明される。反応座標(平均力又はPMFのポテンシャル)の関数としての、基準状態に対する自由エネルギーの差異ΔFは、dNMPが反応座標の所与の値に位置する確率Prに関連する。dNMPが平滑な表面に吸着する又はそれから脱着する確率が対象であったので、反応座標は、z=±1.5nmに位置する最も近いスリット壁平面からdNMPの質量中心までの距離dwと見なされた。自由エネルギープロファイルは、Pr(dw)の値を用いて
によって与えられ、式中、kはBoltzmannの定数であり、Tは温度であり、dw,refはナノスリットの中心(z=0)における壁から離れて選択される基準状態である。
の位置によって区切ることができる。自由エネルギープロファイル及び対応する大域的最小値ΔFmin(表6に示す)によって、dNMPと壁との相互作用の強度の直接的な尺度が得られるが、スカラーパラメータΔF吸着(いわゆる吸着の正味自由エネルギー)は、実験との比較にさらに適する(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるRaut et al., "Molecular Dynamics Simulations of Peptide-Surface Interactions," Langmuir 21:1629-1639 (2005))。自由エネルギープロファイルから、吸着の正味自由エネルギーΔF吸着は
のように、吸着した状態のdNMPを特徴づける状態すべての自由エネルギーの加重和を評価することによって得られる。この方程式では、ΔF吸着及びΔFはkTの単位で表される。C吸着は吸着領域における濃度であり、Cバルクは壁から離れたバルク溶液における濃度である。下付き文字iはビン番号を示す。(dw)iは、幅(Δdw)iを有するビンiの位置である。Priは、dNMPが所与のビンにある確率を表す。PDi=Pri/(Δdw)iは所与のビンにおける正規化された確率密度を表す。表6は、エネルギー特性及びdNMPのスリット疎水性壁への吸着の吸着領域の範囲を特徴づける関連する量の概要を提供する。
吸着及び脱着の統計的特性及び動力学的特性を他の特性(例えば飛行時間)と関連づけることは大いに興味深い。シミュレーション結果の解析は、dNMPが吸着している間、相対的に疎水性の核酸塩基の環は表面上でほぼ平坦である傾向があり、親水性のリン酸基は表面から離れる方向にあり、糖も表面と何らかの接触を有したことを示している。(図34Aを参照)。表面への核酸塩基のこの疎水性の接着は、窒化ケイ素ナノポアを介したDNA鎖の輸送のシミュレーションにおいて以前観察されており(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるAksimentiev et al., Biophys. J. 87: 2086-2097 (2004))、グラフェンシートについては、グラフェンナノポアを介したDNA鎖の輸送のシミュレーションにおいて以前観察されている(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWells et al., Nano Lett. 12: 4117-4123 (2012))。図37は、流れシミュレーション中のdNMPの質量中心の軌道のz成分の50ns間のセグメントを示す。平衡シミュレーションについての軌道も同様である。吸着事象の頻度及び長さの差異によって示されるように、4つのdNMPの軌道の間には明瞭な差異がある。吸着及び脱着の統計データを定量するために、吸着及び脱着の時間を決定する手法を導入し、上で詳細に説明している。
でのPMF曲線におけるバリア(表6を参照)は、核酸塩基における糖末端とは反対側の末端(dNMPにおける最後に表面から離れる部分)の吸脱着に関連する。
表8はシミュレーションから算出された種々の量を示す。これらは、とりわけ、(i)4つのdNMPのそれぞれについて、非平衡の場合の吸着時間の割合が平衡の場合とほぼ同じであることを示している。これは、dNMPの吸着/脱着の挙動がこれらのシミュレーションで使用される相対的に高速の流速によっては有意に変化しないことを示している。使用される流速は、それでも、秒速数百メートルの桁である分子の最大瞬時熱運動速度に比べると小さい。(ii)dCMP及びdTMPの飛行時間がたった50nmの移動距離であっても上手く分離され、これは、例えば、これらのシミュレーションで使用されるもののような非荷電の疎水性表面は、これら2つのdNMPを区別するのに十分であることを意味する。これは、ヌクレオチドの疎水性の差異(G<C<A<T)に起因し得る(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるShih et al., "Hydrophobicities of the Nucleic Acid Bases: Distribution Coefficients from Water to Cyclohexane," J. Mol. Biol. 280:421-430 (1998) and Munoz-Muriedas et al., "A Hydrophobic Similarity Analysis of Solvation Effects on Nucleic Acid Bases," J. Mol. Model. 13:357-365 (2007))。チミンは疎水性のメチル基を有するのに対して、シトシンは親水性のアミン基を有する。(iii)疎水性の増加傾向は飛行時間の増加傾向と合致したが、例外としてdGMPとdCMPの順序が逆転した。これは、dNMPと壁の相互作用が原因である。吸着中のdGMP−壁のエネルギー(Vヌクレオチド―壁)の大きさは、吸着中のdCMP−壁のエネルギーより大きかった。核酸塩基における様々な基と壁表面との間に強い特異的な相互作用はないので、及び核酸塩基は表面上でほぼ平坦に存在するので、Vヌクレオチド―壁は、核酸塩基における溶媒がアクセス可能な表面積(A塩基)と同じ傾向に従う。グアニンはシトシンより大きな面積を有するので、dGMPはdCMPよりも壁との接触でより大きな面積を有し、より大きなVヌクレオチド―壁を有する。(iv)dAMPは、dGMPより2倍多い吸着事象を有したが、吸着している時間の割合はやや小さく、飛行時間はdGMPより長かった。これは、dGMPの方が、再び脱着又は吸着する前に、より長い時間にわたって壁に吸着又は脱離しているという事実、及び、dGMPの方がやや大きな壁滑り速度を有したという事実から生じた。表8で示すデータを表6で示すデータと比較すると、平衡シミュレーションから算出された自由エネルギーは予想された傾向を示しており、吸着自由エネルギーの最小値又は平均値が小さいほど飛行時間が長いことが示されている。dGMP及びdAMPについての自由エネルギーは、これに対する例外である。
1壁構成の数(シミュレーション)
2全構成の合計シミュレーション時間
3各構成についての流れの方向での移動距離
41nmの移動当たりの吸着事象の数
5吸着している時間の割合、非平衡
650nmの距離にわたる飛行時間
7流れの方向における平均速度
8吸着している間の流れの方向における平均速度
9吸着している間のdNMP−壁の位置エネルギー
10溶媒がアクセス可能な核酸塩基の表面積
11吸着している時間の割合、平衡
dNMPの飛行時間の信頼できる分離を達成するのに必要なチャネル長を、対応するMD軌道の全長からサンプリングした0.5nmのセグメントにわたるdNMPの飛行時間分布(DTOF0.5)から算出した。これらの軌道の全長は、dTMPとdAMPについては128nmであり、dCMPについては150nmであり、dGMPについては192nmである(表8の1行目と3行目を参照)。0.5nmの選択は任意であり、0.5〜50.0nmの間の他の長さを使用してほぼ同じ結果が得られる。
MDシミュレーションではdNMP当たりの最小解析時間10μs台でマイクロメートルの桁の短い距離にわたってdNMPを分離することができるが、現実的な流速は2〜3桁小さいであろう。それらの条件下では、拡散のために飛行時間分布の有意により大きな広がりがあるだろう。このサブセクションでは、必要なチャネル長及びdNMP当たりの最小解析時間に対する拡散の影響を推定する。おそらく、現実的な流速の効果を推定する最良の方法(極めて高価なMDシミュレーションを遅い流速で行うのは問題外として)は、Carrらによって導入された戦略を使用することであり、それには、3つのデカルト次元すべてにおいてdNMPと壁の間の平均力のポテンシャル(PMF)を算出し、次いで、得られた力をブラウン動力学(BD)シミュレーションにおける位置の関数として用いることが含まれる(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるCarr et al., Lab Chip 11: 3766-3773 (2011))。平衡PMF計算により算出された力は非平衡条件下では厳密には正しくないが、Carrらは、BDシミュレーションとMDシミュレーション(圧力により駆動された流れを伴う)は良く一致すること示した(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるCarr et al., Lab Chip 11: 3766-3773 (2011))。この3DのPMF+BD戦略の利点は、PMFの計算は高価であるが、BDシミュレーションにはMDシミュレーションと比べてはるかに大きな時間規模とチャネル幅を可能にする単一のdNMPのみが含まれることである。
以下の仮定を用いた:
(1)壁からの任意の距離でのdNMPのすべての拡散性は同じであり、4.44×10−6cm2/sである環状AMPの拡散性(その全体が参照によって本明細書に組み入れられるDworkin et al., J. Biol. Chem. 252:864-865 (1977))に等しい。
(2)dNMPの速度プロファイルは、最大速度(vmax)が0.048cm/sである放物線状であるが、当該最大速度は、1000V/cmの電場のもとでバルク水溶液における電気泳動によってdNMPが移動する速度くらいであり、吸着中のdNMPの平均位置以下のdwの値についての速度はゼロである。滑り速度をゼロと仮定することはおそらく正しくないが、遅い速度で且つ粗い壁で滑り速度の平均速度に対する比はMDシミュレーションよりもはるかに小さいであろう。異なる形状の速度プロファイルを仮定することは平均速度を幾分変えるであろうが、推定値の桁を変えることはない。
(3)流れの方向(x)における平均速度は
である。
これは方程式2に類似しており、vx,i(ビンiにおける流れの方向での速度)及びdw CL(スリットの中心線における壁からの距離)を除いて同じ記号を使用する。方程式3の使用は、当該確率は流れの状況において平衡シミュレーションと同じであると仮定する。非常に速い速度での非平衡MDシミュレーションにおいてさえ吸着時間の割合が類似することを考えると、これは正当な仮定である。
(4)所与のチャネルの長さL、平均速度
及び拡散性Dについては、飛行時間の確率密度分布は
であり、それはまさに、時間依存性の平均位置が
である一次元拡散についての分布である。
(5)分布の許される重複はMDシミュレーションの解析で用いたものと同じであった。
を有すると仮定し、それは壁によって影響されないと仮定する。第2のdNMP型を
を有すると仮定し、第3及び第4の型を上記の考えられる所与の仮定5の範囲までは分布のすべてが互いに混み合うようにさらに遅い速度
を有すると仮定する。Δvxを変化させることによってΔt解析の最小値を見つけることができる。vmax=0.048cm/sでは、Δt解析の最小値は約5.0sであり、Lは約1.29mmである。vmax=0.48cm/sでは、Δt解析の最小値は約50msであり、Lは約129μmである。
DNAにおいて一般に見いだされる4つのデオキシdNMP5'一リン酸を、その飛行時間及び動力学を比較するために、不規則なLennard−Jones炭素原子で構成された3nm幅のナノスリットにて水溶液中でシミュレーションを行った。溶液は、物体力(圧力差又は毛管力により誘導されるものと類似する流れを誘導することが知られている)によって作動させた。比較のために、及びdNMPをスリット壁に吸着させる自由エネルギーを算出するために、外力がない場合も考慮した。dNMPは流れがなくてもナノ秒範囲内で吸着し、脱着する。流れはdNMPの吸着及び脱着の挙動に大きな影響を有さず、dNMPが吸着する時間の割合は、平衡シミュレーションと非平衡シミュレーションでほぼ同じであった。疎水性の炭素スリット壁を用いて最も疎水性のdNMP(dTMP)及び最も親水性のdNMPの1つ(dCMP)の飛行時間が容易に分離されるということは、飛行時間がほぼ同じなのでdAMP及びdGMPにおける化学基の壁表面における他の基との相互作用も重要であろうが、壁物質の濡れ性を改変することがナノチャネルを通るdNMPの飛行時間に基づいてdNMP間を識別することにおいて高い信頼性を達成する有望な方法であり得る。dAMP及びdGMPに関する重要な疑問は、平衡条件に比べて流れの条件下での脱着の間の質的に異なるその挙動がその飛行時間を分離する能力において役割を担うかどうか及びこの挙動が現実的な装置で使用されるはるかに遅い速度で持続するかどうかである。現実的な流速での拡散の効果の解析は、dNMPの速度がdNMP当たり理に適った最小解析時間を得るために比較的に速くすべきであることを示している。
λ−エキソヌクレアーゼ(λ−Exo)を熱可塑性(PMMA)固相表面に固定化した。λ−Exoに10×反応緩衝液(670mMのグリシン−KOH,pH9.4,25mMのMgCl2,0.1%(v/v)のTritonX−100)(Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD)を提供した。使用前に精製工程を実施しなかった。
λ−Exoで修飾した反応器内で二本鎖λ−DNA(48,502bp)(New England Biolabs, Ipswich, MA)を種々の時間インキュベートした(当該時間は、所望の滞留時間を提供するのに適当な速度でλ−DNA溶液をポンプで流体力学的に固相反応器を通すことによって選択した)。ポンプによる流体力学的な輸送は、機械的なポンプ(PHD2000シリンジポンプ, Harvard Apparatus, Holliston, MA)を用いて制御した。反応器アッセイは、特注の熱電温度計加熱ステージによって37℃に温度制御した。下流の解析のために当該装置の流出口にて流出物を回収した。
固定化されたλ−Exoの消化速度を測定するために、リアルタイム蛍光モニタリングを採用した。この試験で利用した顕微鏡は、Zeiss100×/1.3 NA油浸対物レンズ及びAndor iXon3 EMCCDカメラを備えたZeiss Aviovert200M倒立顕微鏡(75WのXeランプ, Zeiss, Germany)から成った。分析の間、組み立てられたPMMA装置を顕微鏡試料台に保持するために、特注のマウントを機械製作した。全ての画像の取得及び解析は、MetaMorph Advanced7.7.6.0ソフトウエア (Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA)及びImageJ1.46(National Institutes of Health, Bethesda, MD)を用いて行った。これらの実験での使用のために、補因子を含まないλ−Exo 10×反応緩衝液(pH9.4での超純水中のグリシン−KOH、0.1%(v/v)TritonX−100)を調製し、dsDNAの酵素消化の開始を制御した。λ−Exo酵素をPMMAに連結させた後、1:50の色素対塩基対の比でYOYO(登録商標)−1標識したλ−DNAを反応器内で約3時間インキュベートして、酵素−DNA複合体を生成した。25mMのMgCl2補因子を含有する反応緩衝液(1×)を当該装置に導入し、37℃に加熱した後、酵素活性のリアルタイムモニタリングのために画像化した(図48を参照)。試薬及びdsDNAをポンプで反応器に通すことを可能にするために、PHD2000シリンジポンプ(Harvard Apparatus, Holliston, MA)を用いた。エポキシを介した流入口/流出口のリザーバへの密封ピーク配管によってポンプを反応器に接続し、流入口の管はルアーロックコネクタを用いてシリンジに接続した。
254nmでのUV検出と共にBeckman Coulter CE機器を用いてキャピラリー電気泳動(CE)を行った。Molex Polymicro Technologies(Phoenix, AZ)製の内径50μmのコーティングなし溶融シリカをCE(全長=33cm、有効長さ=20cm)に用いた。0.1MのNaOHで30分間、CEカラムを予備調整し、濾過した0.5×TBE緩衝液(18MΩの超純水中の45mMのTris,45mMのホウ酸塩,1mMのEDTA,pH8.3)で洗い流すことによってすすいだ。最終的に、0.5×TBE、pH8.3における2%(w/v)ポリビニルピロリドン(PVP,Mr=40,000; Sigma Aldrich St. Louis, MO)を含有する動的コーティングによってキャピラリー表面を処理し、電気浸透流を抑えた。CEの泳動用緩衝液は、カチオン性界面活性剤、この場合、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)も含有した。10kVで180sの動電注入によって試料の導入を行った。CEは、天然のデオキシヌクレオチド一リン酸(dNMP、メチル化Cを含む4種)について1μMの濃度で行った。
ナノインプリントリソグラフィ(NIL)を用いてPMMAナノ流体装置を製作した。手短には、ナノチャネルに基づく流体装置は3つの主な部分、すなわち(a)リザーバと幅75μm及び深さ20μmの輸送チャネルを含むマイクロ流体ネットワーク、(b)ナノチャネルの流入口における勾配のついたインターフェース(漏斗様の流入口は30μmから75nmに減る幅と10μmから75nmに減る深さを持つ16の台形プリズムから成る)及び(c)幅75nm及び深さ75nmであるナノチャネルのアレイから成った。
上述のようにナノチャネルを調製した。しかしながら、この場合は、チャネルは、熱NILを用いて環状オレフィンコポリマー(COC)で製作した。ナノチャネルは長さ100μmで100nm×100nmであった。当該チャネルを、同じくCOCで作製されたカバー板と同様にO2プラズマで処理し、当該装置を、未変性の熱可塑性物質のガラス転移温度よりやや低い温度78℃で熱組み立てした。これらの実験については暗視野顕微鏡を用いて単一分子を追跡した。当該分子は、クエン酸イオンでコーティングされた直径10nmの単一の銀(Ag)ナノ粒子(NP)から成り、当該コーティングによって当該Ag−NP表面に負の電荷が付与されていた。当該Ag−NPを陰極リザーバに入れ、種々の電場強度で陽極リザーバへと電気泳動した。当該電気泳動は、ナノチャネルにおける電気的二重層の厚さを減らすために10mMのKClも加えたTBE緩衝液(1×、pH=8.0)にて行った。
PMMAナノ流体装置の製作を、上で記載したように行った。倒立顕微鏡(Zeiss Axiovert 200)を用いて、当該装置を介したDNAの移動事象の光学的測定を行った。蛍光顕微鏡をEMCDDカメラ(iXon3 888 Andor)に装着した。電気的測定のための流体チップを遮蔽するのに2つのファラデーケージを用い、一方は試料台を遮蔽するのに用い、他方は顕微鏡全体を覆った。MetaMorph(Molecular Devices)によって、ビデオ画像の記録及び処理を行った。ビデオ記録中、EMCCDのオーバーラップモードを用いた(シャッター時間:5ms〜20ms)。
セグメント化されたナノワイヤにナノギャップを生成するために2ステップの手法を開発した。これらステップには、(1)多重セグメント化されたナノワイヤを電着することと、(2)埋め込まれた犠牲層からギャップを電気化学的にエッチングすることが含まれる。電着技法の実証として、ナノ多孔性のポリカーボネート鋳型(Whatman、約108ナノポア/cm2、100nmの公称孔直径を持つ)を2つの電極セルの陰極として用いた。導電性電極を作製するために、ポリカーボネート鋳型の一方の面を金でスパッタリングした。陽極は白金メッシュであった。以下の順序、すなわちFeNiCo/Au/Cu/Au/FeNiCoで5つのナノワイヤセグメントを製作した。FeNiCoナノワイヤセグメントがナノワイヤの最上部と最下部であり、他のワイヤを磁気的に操作する手段として役立った。FeNiCoは、−25mA/cm2(20%の多孔性)、0.5のデューティーサイクル及び2秒間のオン/オフ時間のパルス堆積を用いて、0.72Mのスルファミン酸ニッケル、0.155Mの硫酸第一鉄、0.005Mの硫酸コバルト、0.5Mホウ酸、0.001Mのラウリル硫酸ナトリウム、0.011Mのアスコルビン酸を含有する電解質からpH2及び40℃の温度で堆積させた、Feが豊富な合金(約64重量%のFe,31重量%のNi,5重量%のCo)であった。金のセグメントは市販の金溶液(TG-25E RTU, Technic Inc.)を用いて−1mA/cm2の電流密度で60℃の温度にて製作した。銅の中間層は−3mA/cm2にて定電流で堆積させた。銅電解質は0.15M硫酸銅、0.01Mの硫酸ナトリウム、0.45Mのクエン酸ナトリウム及び0.40Mのホウ酸を含有した。堆積の後、膜をジクロロメタンに溶解し、次いでエタノールで3回洗浄した。銅は犠牲層として役立ち、堆積の時間はギャップのサイズに比例した。第2のステップでは、導電性炭素表面に置いたナノワイヤをエッチングすることによって銅層の溶解を電気化学的に制御した。印加された作動電位はSCEに対して+0.1Vであり、溶液は銅のメッキに使用したものと同じクエン酸−ホウ酸電解質であった。
Claims (14)
- 生体分子プロセッサを含む装置であって、各生体分子プロセッサが、
固体基板によって画定される1つ以上のバイオリアクターチャンバー;
各バイオリアクターチャンバー内にありかつ前記固体基板に取り付けられた支持構造体;
前記支持構造体に固定化された切断酵素であって、前記切断酵素と機能的に結合したバイオポリマー分子の単量体単位又は多量体単位を切断するように前記バイオリアクターチャンバー内に機能的に配置された、切断酵素;並びに
前記固体基板内に形成されかつ前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーに流体的に連結された1つ以上の飛行時間型チャネルであって、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが入力端及び出力端を有し、前記1つ以上の飛行時間型チャネルのそれぞれが、少なくとも(i)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの入力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第1のセンサーと(ii)前記1つ以上の飛行時間型チャネルの出力端の近位にある、前記1つ以上の飛行時間型チャネルに接触する第2のセンサーとを含む2つ以上のセンサーを含む、1つ以上の飛行時間型チャネル
を含む、装置。 - 前記1つ以上のバイオリアクターチャンバー内及び前記1つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を生成するように機能的に配置された電場発生器をさらに含む、請求項1に記載の装置。
- 前記1つ以上の飛行時間型チャネルが、幅50nm以下でありかつ深さ50nm以下である、請求項1に記載の装置。
- 前記1つ以上の飛行時間型チャネルが、長さ5μm〜250μmである、請求項1に記載の装置。
- 前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーが、幅100〜1000nmである、請求項1に記載の装置。
- 前記1つ以上のバイオリアクターチャンバー内の前記支持構造体が、幅50〜900nmである、請求項1に記載の装置。
- 前記固体基板がポリマー材料で作られている、請求項1に記載の装置。
- 前記切断酵素がエキソヌクレアーゼ又はエキソリボヌクレアーゼである、請求項1に記載の装置。
- 前記2つ以上のセンサーがそれぞれ、貴金属ナノワイヤ、セグメント化されたナノワイヤ、又はナノ粒子から成る、1対の検出電極を含む、請求項1に記載の装置。
- 前記1つ以上の飛行時間型チャネルが3つ以上のセンサーを含む、請求項1に記載の装置。
- 前記生体分子プロセッサが、前記固体基板の壁によって画定されるフィーダーチャネルをさらに含み、前記フィーダーチャネルが、前記固体基板の表面の近位にある入力端から前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーの近位にある出力端まで延在する長さを有する、請求項1に記載の装置。
- 前記1つ以上の飛行時間型チャネルが、電荷中性の親水性壁表面、荷電した親水性壁表面、又は電荷中性の疎水性壁表面を含む、請求項1に記載の装置。
- 10,000個以上の生体分子プロセッサを含む、請求項1に記載の装置。
- 以下の工程を含む、核酸分子の配列決定の方法:
請求項1に記載の装置を提供する工程;
前記装置の前記生体分子プロセッサに、1つ以上の核酸分子を含む試料を、前記バイオリアクターチャンバー内の前記固定化された切断酵素が前記試料中の前記1つ以上の核酸分子に結合して前記1つ以上の核酸分子を前記1つ以上の飛行時間型チャネルの前記入力端に1つずつ入る単量体ヌクレオチドへと切断するのに有効な条件下で供給する工程;
切断された前記単量体ヌクレオチドを前記1つ以上の飛行時間型チャネルを通して輸送するために、前記1つ以上のバイオリアクターチャンバーを横切って及び前記1つ以上の飛行時間型チャネルの長さ方向に電場を印加する工程;
前記印加する工程に基づいて、切断された前記単量体ヌクレオチドを、それらが前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過する際に検出する工程;
前記検出する工程に基づいて、切断された各単量体ヌクレオチドが前記1つ以上の飛行時間型チャネルにおける少なくとも第1及び第2のセンサーを通過するのにどれくらい時間がかかるかを測定する工程;並びに
前記測定する工程に基づいて前記単量体ヌクレオチドを同定する工程。
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