JP6385607B2 - Dendritic cell vaccine - Google Patents
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Description
本発明は、細胞洗浄液及びこれを用いた細胞の洗浄方法、並びに細胞含有組成物及びその調製方法に関する。 The present invention relates to a cell washing solution, a cell washing method using the same, a cell-containing composition and a method for preparing the same.
従来のがん治療方法である、外科療法（手術）、化学療法（抗がん剤）、放射線療法の３つに加えて、近年、第４のがん治療方法として注目されているのが免疫療法である。
前記免疫療法には、免疫細胞療法、サイトカイン療法、抗体療法などがあるが、これらは、抗がん剤と比較して副作用が少ないと考えられており、その開発が期待されている。
In addition to three conventional cancer treatment methods: surgery (surgery), chemotherapy (anticancer agent), and radiation therapy, in recent years, immunity has attracted attention as the fourth cancer treatment method. It is a therapy.
The immunotherapy includes immune cell therapy, cytokine therapy, antibody therapy and the like, and these are considered to have fewer side effects than anticancer drugs, and their development is expected.
前記免疫細胞療法の中でも、樹状細胞ワクチン療法は、多くの樹状細胞を対象者へ投与することが必要とされている（非特許文献１及び２）。前記樹状細胞ワクチン療法に使用される樹状細胞は、対象者の血液から採取されるが、採取できる血液細胞は限られており、限られた数の細胞から治療に有効な細胞を調製する必要がある。治療に有効な細胞は、細胞洗浄された後、凍結保存状態で医療機関へ搬送され、解凍後、対象者へ投与される。 Among the immune cell therapies, the dendritic cell vaccine therapy requires administration of many dendritic cells to a subject (Non-patent Documents 1 and 2). The dendritic cells used for the dendritic cell vaccine therapy are collected from the blood of the subject, but the blood cells that can be collected are limited, and a therapeutically effective cell is prepared from a limited number of cells. There is a need. Cells that are effective for treatment are washed, transported to a medical institution in a cryopreserved state, and thawed before being administered to a subject.
細胞を洗浄する溶液として、一般的には生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及びウシ胎仔血清が添加されたＰＢＳ等が知られている（特許文献１）。これらの溶液の細胞傷害性は高くないと予想されるが、前記細胞洗浄において、洗浄液として、前記生理食塩水又はＰＢＳ等を使用した場合は、洗浄後の細胞生存率を十分に維持することは困難であった。また、ウシ胎仔血清が添加されたＰＢＳについては、対象者へ投与される細胞を洗浄する場合において、血清が含まれた洗浄液を使用することは好ましくなかった。 Known solutions for washing cells are generally physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), PBS to which fetal bovine serum is added, and the like (Patent Document 1). Although the cytotoxicity of these solutions is not expected to be high, when the physiological saline or PBS is used as a washing solution in the cell washing, it is possible to sufficiently maintain the cell viability after washing. It was difficult. Further, regarding PBS to which fetal bovine serum was added, it was not preferable to use a washing solution containing serum when washing cells to be administered to a subject.
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、洗浄後の細胞生存率が改善される、細胞洗浄液、及びこれを用いた細胞の洗浄方法、並びに細胞生存率の高い細胞含有組成物及びその調製方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to solve the above-described problems and achieve the following objects. That is, the present invention aims to provide a cell washing solution, a cell washing method using the same, a cell-containing composition having a high cell survival rate, and a method for preparing the same, in which the cell viability after washing is improved. And
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液を用いることで洗浄後の細胞生存率が改善されることを確認し、細胞生存率を高めるための細胞洗浄液及び細胞の洗浄方法、並びに細胞生存率の高い細胞含有組成物及びその調製方法を提供できることを確認した。なお、浸透圧比とは、生理食塩水の浸透圧を１としたときの洗浄液の浸透圧をいう。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have confirmed that the cell viability after washing is improved by using a washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 or more and 15 or less. It has been confirmed that a cell washing solution and a cell washing method for enhancing the cell, a cell-containing composition having a high cell viability, and a method for preparing the same can be provided. The osmotic pressure ratio refers to the osmotic pressure of the cleaning liquid when the osmotic pressure of physiological saline is 1.
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞ 血液から目的細胞を調製する細胞調製工程、及び浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液を用いて前記目的細胞を洗浄する細胞洗浄工程を含むことを特徴とする細胞含有組成物の調製方法である。
＜２＞ 前記洗浄液が少なくとも亜鉛を含む前記＜１＞に記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜３＞ 前記洗浄液における亜鉛の濃度が１００ｎｇ／ｍＬから４００ｎｇ／ｍＬである前記＜２＞に記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜４＞ 前記洗浄液における亜鉛の濃度が２００ｎｇ／ｍＬから３００ｎｇ／ｍＬである前記＜２＞に記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜５＞ 前記洗浄液がブドウ糖、アミノ酸、及びチアミンを含む前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜６＞ 前記細胞調製工程が、血液から単球を分離する単球分離処理、前記単球から未成熟樹状細胞を誘導する未成熟樹状細胞誘導処理、及び前記未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を誘導する成熟樹状細胞誘導処理を含む前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜７＞ 前記単球分離処理が、ＣＤ１４陽性細胞を分離する処理である前記＜６＞に記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜８＞ 前記未成熟樹状細胞誘導処理における誘導が、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦによる誘導である前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜９＞ 前記成熟樹状細胞誘導工程処理における誘導が、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＧＥ２及びＯＫ−４３２による誘導である前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜１０＞ 更に前記細胞調製工程が、前記成熟樹状細胞に抗原を感作する抗原感作処理を含み、前記抗原感作処理における感作が、ペプチドによる感作である前記＜６＞から＜９＞のいずれかに記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜１１＞ 更に前記目的細胞を凍結する細胞凍結工程を含む前記＜１＞から＜１０＞のいずれかに記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜１２＞ 前記細胞含有組成物が樹状細胞ワクチンである前記＜１＞から前記＜１１＞のいずれかに記載の細胞含有組成物の調製方法である。
＜１３＞ 浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液を用いて細胞を洗浄する細胞洗浄工程を含むことを特徴とする細胞の洗浄方法である。
＜１４＞ 浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液であることを特徴とする細胞洗浄液である。
＜１５＞ 細胞、及び１００ｎｇ／ｍＬから４００ｎｇ／ｍＬの濃度の亜鉛を含むことを特徴とする細胞含有組成物である。
＜１６＞ 前記細胞含有組成物が樹状細胞ワクチンである＜１５＞に記載の細胞含有組成物である。
The present invention is based on the above findings by the present inventors, and means for solving the above problems are as follows. That is,
<1> A method for preparing a cell-containing composition, comprising: a cell preparation step for preparing a target cell from blood; and a cell washing step for washing the target cell with a washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 to 15. It is.
<2> The method for preparing a cell-containing composition according to <1>, wherein the cleaning liquid contains at least zinc.
<3> The method for preparing a cell-containing composition according to <2>, wherein the concentration of zinc in the washing liquid is 100 ng / mL to 400 ng / mL.
<4> The method for preparing a cell-containing composition according to <2>, wherein the concentration of zinc in the washing liquid is 200 ng / mL to 300 ng / mL.
<5> The method for preparing a cell-containing composition according to any one of <1> to <4>, wherein the cleaning liquid contains glucose, amino acids, and thiamine.
<6> The cell preparation step includes monocyte separation treatment for separating monocytes from blood, immature dendritic cell induction treatment for inducing immature dendritic cells from the monocytes, and maturation from the immature dendritic cells. The method for preparing a cell-containing composition according to any one of <1> to <5>, which comprises a mature dendritic cell induction treatment for inducing dendritic cells.
<7> The method for preparing a cell-containing composition according to <6>, wherein the monocyte separation treatment is a treatment for separating CD14-positive cells.
<8> The method for preparing a cell-containing composition according to any one of <6> to <7>, wherein the induction in the immature dendritic cell induction treatment is induction with IL-4 and GM-CSF.
<9> The cell-containing composition according to any one of <6> to <8>, wherein the induction in the treatment of the mature dendritic cell induction step is induction by IL-4, GM-CSF, PGE2, and OK-432 This is a preparation method.
<10> The cell preparation step further includes an antigen sensitization treatment for sensitizing the mature dendritic cell with an antigen, and the sensitization in the antigen sensitization treatment is sensitization with a peptide. 9> The method for preparing a cell-containing composition according to any one of 9>.
<11> The method for preparing a cell-containing composition according to any one of <1> to <10>, further including a cell freezing step of freezing the target cell.
<12> The method for preparing a cell-containing composition according to any one of <1> to <11>, wherein the cell-containing composition is a dendritic cell vaccine.
<13> A cell washing method comprising a cell washing step of washing cells using a washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 or more and 15 or less.
<14> A cell washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 or more and 15 or less.
<15> A cell-containing composition comprising cells and zinc at a concentration of 100 ng / mL to 400 ng / mL.
<16> The cell-containing composition according to <15>, wherein the cell-containing composition is a dendritic cell vaccine.
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、洗浄後の細胞生存率が改善される、細胞洗浄液、及びこれを用いた細胞の洗浄方法、並びに細胞生存率の高い細胞含有組成物及びその調製方法を提供することができる。 According to the present invention, the conventional problems can be solved, the object can be achieved, and the cell viability after washing is improved, the cell washing method using the cell washing solution, and the cell survival. A cell-containing composition having a high rate and a method for preparing the same can be provided.
本発明の細胞含有組成物の調製方法は、血液から目的細胞を調製する細胞調製工程、及び浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液を用いて細胞を洗浄する細胞洗浄工程を含み、さらにその他の工程を含むことができる。本発明の細胞の洗浄方法は、前記細胞洗浄工程に相当し、本発明の細胞洗浄液は、前記細胞洗浄工程で使用される浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液に相当する。また、本発明の細胞含有組成物は、本発明の細胞含有組成物の調製方法により好適に調製することができる。したがって、以下に本発明の細胞含有組成物の調製方法を説明することにより、本発明の細胞の洗浄方法、本発明の細胞洗浄液、及び本発明の細胞含有組成物を説明する。 The method for preparing a cell-containing composition of the present invention includes a cell preparation step for preparing target cells from blood, and a cell washing step for washing cells using a washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 to 15, and other steps. Can be included. The cell washing method of the present invention corresponds to the cell washing step, and the cell washing solution of the present invention corresponds to a washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 to 15 used in the cell washing step. Moreover, the cell-containing composition of the present invention can be suitably prepared by the method for preparing the cell-containing composition of the present invention. Therefore, the method for washing the cell of the present invention, the cell washing solution of the present invention, and the cell-containing composition of the present invention will be described below by explaining the method for preparing the cell-containing composition of the present invention.
（細胞含有組成物の調製方法）
本発明の細胞含有組成物の調製方法は、血液から目的細胞を調製する細胞調製工程、及び浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液を用いて前記目的細胞を洗浄する細胞洗浄工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含むことができる。
(Method for preparing cell-containing composition)
The method for preparing a cell-containing composition of the present invention includes a cell preparation step for preparing a target cell from blood, and a cell washing step for washing the target cell with a washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 or more and 15 or less. Depending on the process, other steps can be included.
＜細胞調製工程＞
前記細胞調製工程における血液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、末梢血、骨髄、臍帯血などが挙げられ、これらの中でも、侵襲性が低い点などから末梢血が好ましい。前記末梢血、骨髄、臍帯血などに含まれる細胞としては、末梢血由来の細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞、臍帯血細胞、及び造血幹細胞などが挙げられる。前記造血幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などから生成される。
<Cell preparation process>
There is no restriction | limiting in particular as the blood in the said cell preparation process, According to the objective, it can select suitably, For example, peripheral blood, a bone marrow, umbilical cord blood etc. are mentioned, Among these, from the point with low invasiveness etc. Peripheral blood is preferred. Examples of cells contained in the peripheral blood, bone marrow, umbilical cord blood and the like include peripheral blood-derived cells, peripheral blood mononuclear cells (PBMC), bone marrow cells, umbilical cord blood cells, and hematopoietic stem cells. The hematopoietic stem cells are generated from embryonic stem cells, adult stem cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, and the like.
前記細胞調製工程における目的細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球等の白血球などが挙げられる。 The target cells in the cell preparation step are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, monocytes, macrophages, granulocytes, preferred cells Examples include leukocytes such as neutrophils, eosinophils, and basophils.
前記細胞の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞を分離する処理、分化誘導する処理、及びこれらの組合せなどが挙げられる。 The method for preparing the cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a process for separating cells, a process for inducing differentiation, and a combination thereof.
前記細胞を分離する処理、及び分化誘導する処理の組合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、血液から単球を分離する単球分離処理、単球から未成熟樹状細胞を誘導する未成熟樹状細胞誘導処理、及び未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を誘導する成熟樹状細胞誘導処理を含むことがより好ましく、さらに成熟樹状細胞に抗原を感作する抗原感作処理を含むこともできる。 The combination of the treatment for separating the cells and the treatment for inducing differentiation is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. It is more preferable to include an immature dendritic cell induction treatment for inducing mature dendritic cells, and a mature dendritic cell induction treatment for inducing mature dendritic cells from immature dendritic cells. An antigen sensitizing treatment for sensitization can also be included.
＜＜単球分離処理＞＞
前記単球分離処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、末梢血から単球を分離する処理が好ましく、成分採血により得られる産物（アフェレーシス産物）から単球を分離する処理がより好ましい。
<< Monocyte separation process >>
The monocyte separation treatment is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, a treatment for separating monocytes from peripheral blood is preferable, and monocytes are obtained from products (apheresis products) obtained by component blood collection. More preferably, the treatment of separating
前記分離の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フィコール比重遠心法、磁性ビーズ等を用いる方法、フローサイトメトリーを用いる方法、細胞の接着性を利用する方法、又はこれらの組合せなどが挙げられる。これらの中でも、分離効率の点からフィコール比重遠心法、及び磁性ビーズ等を用いる方法の組合せが好ましい。 The separation method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, Ficoll specific gravity centrifugation, a method using magnetic beads, a method using flow cytometry, and cell adhesion are used. Or a combination thereof. Among these, a combination of Ficoll specific gravity centrifugation and a method using magnetic beads is preferable from the viewpoint of separation efficiency.
前記磁性ビーズ等を用いる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポジティブ選択による分離、ネガティブ選択による分離、又はこれらの組合せなどが挙げられる。これらの中でも、分離効率の点からポジティブ選択による分離が好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as a method using the said magnetic bead etc., According to the objective, it can select suitably, For example, isolation | separation by positive selection, isolation | separation by negative selection, or these combination etc. are mentioned. Among these, separation by positive selection is preferable from the viewpoint of separation efficiency.
前記ポジティブ選択としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、分離効率の点から抗ＣＤ１４抗体が固定化された磁性ビーズを用いてＣＤ１４陽性細胞を分離する方法が好ましい。 The positive selection is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose. From the viewpoint of separation efficiency, a method of separating CD14 positive cells using magnetic beads on which an anti-CD14 antibody is immobilized is preferable. .
前記ネガティブ選択としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、分離効率の点から抗ＣＤ３抗体が固定化された磁性ビーズを用いてＣＤ３陽性細胞を除去する方法が好ましい。 The negative selection is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. From the viewpoint of separation efficiency, a method of removing CD3-positive cells using magnetic beads on which an anti-CD3 antibody is immobilized is preferable. .
＜＜未成熟樹状細胞誘導処理＞＞
前記未成熟樹状細胞誘導処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記単球分離処理により得られた単球の細胞調製培地に、サイトカインを添加して未成熟樹状細胞へ誘導する処理が挙げられる。
<< Immature dendritic cell induction treatment >>
The immature dendritic cell induction treatment is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, a cytokine is added to the cell preparation medium for monocytes obtained by the monocyte separation treatment. And treatment to induce immature dendritic cells.
前記サイトカインとしては、未成熟樹状細胞へ分化誘導できるものであれば特に制限はなく、例えば、インターロイキン４（ＩＬ−４）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、又はこれらの組合せが挙げられる。これらの中でも、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの組合せが好ましく、安全性の点から組み換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）及び組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）の組合せがより好ましい。 The cytokine is not particularly limited as long as it can induce differentiation into immature dendritic cells. For example, interleukin 4 (IL-4), granulocyte monocyte colony stimulating factor (GM-CSF), or these Combinations are mentioned. Among these, a combination of IL-4 and GM-CSF is preferable, and a combination of recombinant human IL-4 (rhIL-4) and recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF) is more preferable from the viewpoint of safety.
前記ＩＬ−４の終濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、３０ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、４０ｎｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、４５ｎｇ／ｍＬ以上が特に好ましい。また、前記ＩＬ−４の終濃度の上限値としては、５００ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、６０ｎｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、５５ｎｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。 The lower limit of the final concentration of IL-4 is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1 ng / mL or more, more preferably 30 ng / mL or more, and 40 ng / mL or more. More preferably, 45 ng / mL or more is particularly preferable. The upper limit of the final concentration of IL-4 is preferably 500 ng / mL or less, more preferably 100 ng / mL or less, still more preferably 60 ng / mL or less, and particularly preferably 55 ng / mL or less.
前記ＧＭ−ＣＳＦの終濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、３０ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、４０ｎｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、４５ｎｇ／ｍＬ以上が特に好ましい。また、前記ＧＭ−ＣＳＦの終濃度の上限値としては、５００ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、６０ｎｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、５５ｎｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。 The lower limit of the final concentration of GM-CSF is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1 ng / mL or more, more preferably 30 ng / mL or more, and 40 ng / mL or more. More preferably, 45 ng / mL or more is particularly preferable. Moreover, as an upper limit of the final concentration of the said GM-CSF, 500 ng / mL or less is preferable, 100 ng / mL or less is more preferable, 60 ng / mL or less is more preferable, 55 ng / mL or less is especially preferable.
前記細胞調製培地としては、単球、及び／又は未成熟樹状細胞を調製できるものであれば特に制限はなく、例えば、ＩＭＤＭ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、又はＡＩＭ Ｖ培地、ＣｅｌｌＧｒｏ培地が挙げられる。これらの中でもＡＩＭ Ｖ培地がより好ましい。 The cell preparation medium is not particularly limited as long as it can prepare monocytes and / or immature dendritic cells. For example, IMDM medium, MEM medium, DMEM medium, DMEM / F12 medium, RPMI-1640 medium , X-VIVO15 medium, AIM V medium, or CellGro medium. Among these, AIM V medium is more preferable.
前記細胞調製培地には、その他の添加物を添加することができる。
前記その他の添加物としては、例えば、抗生物質、血清などが挙げられる。
前記血清としては、ウシ胎仔血清、ヒトＡＢ型血清、又は献血ヒト血清アルブミンなどの血清が挙げられるが、得られた細胞を対象者へ投与する目的を考慮して、これらの血清は添加されないことが好ましい。
Other additives can be added to the cell preparation medium.
Examples of the other additives include antibiotics and serum.
Examples of the serum include fetal bovine serum, human AB type serum, or blood donated human serum albumin serum, but these serums should not be added in consideration of the purpose of administering the obtained cells to the subject. Is preferred.
前記未成熟樹状細胞誘導処理における調製期間の下限値としては、未成熟樹状細胞へ誘導できる期間であれば特に制限はないが、１日間以上が好ましく、２日間以上がより好ましく、３日間以上がさらに好ましく、５日間以上が特に好ましい。また、前記調製期間の上限値としては、２０日間以下が好ましく、１０日間以下がより好ましく、７日間以下がさらに好ましく、６日間以下が特に好ましい。 The lower limit of the preparation period in the immature dendritic cell induction treatment is not particularly limited as long as it can be induced into immature dendritic cells, but is preferably 1 day or more, more preferably 2 days or more, and 3 days. The above is more preferable and 5 days or more is particularly preferable. Moreover, as an upper limit of the said preparation period, 20 days or less are preferable, 10 days or less are more preferable, 7 days or less are more preferable, and 6 days or less are especially preferable.
前記未成熟樹状細胞誘導処理における調製条件としては、未成熟樹状細胞へ誘導できる条件であれば特に制限はなく、例えば、５％から２０％のＣＯ２存在下３７℃で調製する条件などが挙げられる。 The preparation conditions in the immature dendritic cell induction treatment are not particularly limited as long as they can be induced into immature dendritic cells. For example, conditions for preparation at 37 ° C. in the presence of 5% to 20% CO 2, etc. Is mentioned.
前記細胞調製培地に、サイトカインを添加する方法における培地交換頻度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、より簡便な方法を提供する点から前記未成熟樹状細胞誘導処理において、サイトカインを添加した後、培地交換を行わないことが好ましい。 The frequency of medium replacement in the method of adding cytokine to the cell preparation medium is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. However, the immature dendritic cells are provided in terms of providing a simpler method. In the induction treatment, it is preferable not to perform medium exchange after adding cytokine.
＜＜成熟樹状細胞誘導処理＞＞
前記成熟樹状細胞誘導処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記未成熟樹状細胞誘導処理により得られた未成熟樹状細胞の細胞調製培地に、サイトカイン、エイコサノイド、溶連菌の菌体、又はこれらの組合せを添加して成熟樹状細胞へ誘導する処理が挙げられる。これらの中でも、エイコサノイド、及び溶連菌の菌体の組合せ、又はサイトカイン、エイコサノイド、及び溶連菌の菌体の組合せを添加して成熟樹状細胞へ誘導する処理が好ましい。
<< Mature dendritic cell induction treatment >>
The mature dendritic cell induction treatment is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, the cell preparation medium of immature dendritic cells obtained by the immature dendritic cell induction treatment can be used. , Cytokines, eicosanoids, streptococcal cells, or a combination of these, and induction into mature dendritic cells. Among these, a combination of eicosanoids and streptococcal cells or a combination of cytokines, eicosanoids and streptococcal cells and inducing mature dendritic cells is preferable.
前記サイトカインとしては、成熟樹状細胞へ分化誘導できるものであれば特に制限はなく、例えば、インターロイキン４（ＩＬ−４）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン６（ＩＬ−６）又はこれらの組合せが挙げられる。これらの中でも、誘導効率の点からＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの組合せが好ましく、安全性の点から組み換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）及び組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）の組合せがより好ましい。 The cytokine is not particularly limited as long as it can induce differentiation into mature dendritic cells. For example, interleukin 4 (IL-4), granulocyte monocyte colony stimulating factor (GM-CSF), tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 6 (IL-6), or combinations thereof. Among these, the combination of IL-4 and GM-CSF is preferable from the viewpoint of induction efficiency, and the combination of recombinant human IL-4 (rhIL-4) and recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF) is preferable from the viewpoint of safety. More preferred.
前記エイコサノイドとしては、成熟樹状細胞へ分化誘導できるものであれば特に制限はなく、例えば、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ロイコトリエン、トロンボキサン、又はこれらの組合せが挙げられる。これらの中でも、誘導効率の点からＰＧＥ２が好ましい。 The eicosanoid is not particularly limited as long as it can induce differentiation into mature dendritic cells, and examples thereof include prostaglandin E2 (PGE2), leukotriene, thromboxane, and combinations thereof. Among these, PGE2 is preferable from the viewpoint of induction efficiency.
前記菌体としては、成熟樹状細胞へ分化誘導できるものであれば特に制限はないが、誘導効率の点から溶連菌の菌体が好ましく、溶連菌の乾燥菌体がより好ましく、ピシバニール（ＯＫ−４３２）がさらに好ましい。 The cells are not particularly limited as long as they can induce differentiation into mature dendritic cells, but from the viewpoint of induction efficiency, cells of streptococcus are preferable, dry cells of streptococcus are more preferable, and Pisibanil (OK-432). Is more preferable.
前記サイトカイン、エイコサノイド、及び溶連菌の菌体の組合せとしては、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＧＥ２及びＯＫ−４３２の組合せが好ましく、安全性の点から組み換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）、組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）、ＰＧＥ２及びＯＫ−４３２の組合せがより好ましい。 As a combination of the cytokine, eicosanoid, and streptococcus, a combination of IL-4, GM-CSF, PGE2 and OK-432 is preferable. From the viewpoint of safety, recombinant human IL-4 (rhIL-4), recombinant A combination of human GM-CSF (rhGM-CSF), PGE2 and OK-432 is more preferred.
前記ＩＬ−４は使用しない場合もあるが、使用する場合の前記ＩＬ−４の終濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、３ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、４ｎｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、４．５ｎｇ／ｍＬ以上が特に好ましい。また、前記ＩＬ−４の終濃度の上限値としては、５０ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、６ｎｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、５．５ｎｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。 The IL-4 may not be used, but the lower limit of the final concentration of IL-4 when used is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. mL or more is preferable, 3 ng / mL or more is more preferable, 4 ng / mL or more is more preferable, and 4.5 ng / mL or more is particularly preferable. Further, the upper limit of the final concentration of IL-4 is preferably 50 ng / mL or less, more preferably 10 ng / mL or less, further preferably 6 ng / mL or less, and particularly preferably 5.5 ng / mL or less.
前記ＧＭ−ＣＳＦは使用しない場合もあるが、使用する場合の前記ＧＭ−ＣＳＦの終濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、３ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、４ｎｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、４．５ｎｇ／ｍＬ以上が特に好ましい。また、前記ＧＭ−ＣＳＦの終濃度の上限値としては、５０ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、６ｎｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、５．５ｎｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。 Although the GM-CSF may not be used, the lower limit of the final concentration of the GM-CSF when used is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. mL or more is preferable, 3 ng / mL or more is more preferable, 4 ng / mL or more is more preferable, and 4.5 ng / mL or more is particularly preferable. Moreover, as an upper limit of the final concentration of the said GM-CSF, 50 ng / mL or less is preferable, 10 ng / mL or less is more preferable, 6 ng / mL or less is further more preferable, 5.5 ng / mL or less is especially preferable.
前記ＰＧＥ２の終濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、３０ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、４０ｎｇ／ｍＬ以上がさらに好ましく、４５ｎｇ／ｍＬ以上が特に好ましい。また、前記ＰＧＥ２の終濃度の上限値としては、５００ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、６０ｎｇ／ｍＬ以下がさらに好ましく、５５ｎｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。 The lower limit of the final concentration of PGE2 is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1 ng / mL or more, more preferably 30 ng / mL or more, and even more preferably 40 ng / mL or more. 45 ng / mL or more is particularly preferable. The upper limit of the final concentration of PGE2 is preferably 500 ng / mL or less, more preferably 100 ng / mL or less, still more preferably 60 ng / mL or less, and particularly preferably 55 ng / mL or less.
前記ＯＫ−４３２の終濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ＫＥ／ｍＬ以上が好ましく、０．０５ＫＥ／ｍＬ以上がより好ましく、０．０８ＫＥ／ｍＬ以上がさらに好ましく、０．１ＫＥ／ｍＬ以上が特に好ましい。また、前記ＯＫ−４３２の終濃度の上限値としては、１０ＫＥ／ｍＬ以下が好ましく、１．０ＫＥ／ｍＬ以下がより好ましく、０．５ＫＥ／ｍＬ以下がさらに好ましく、０．２ＫＥ／ｍＬ以下が特に好ましい。 The lower limit of the final concentration of OK-432 is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.01 KE / mL or more, more preferably 0.05 KE / mL or more, and 0 0.08 KE / mL or more is more preferable, and 0.1 KE / mL or more is particularly preferable. Further, the upper limit of the final concentration of OK-432 is preferably 10 KE / mL or less, more preferably 1.0 KE / mL or less, further preferably 0.5 KE / mL or less, and particularly preferably 0.2 KE / mL or less. preferable.
前記細胞調製培地としては、未成熟樹状細胞、及び／又は成熟樹状細胞を調製できるものであれば特に制限はなく、例えば、ＩＭＤＭ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、又はＡＩＭ Ｖ培地が挙げられる。これらの中でもＡＩＭ Ｖ培地がより好ましい。 The cell preparation medium is not particularly limited as long as immature dendritic cells and / or mature dendritic cells can be prepared. For example, IMDM medium, MEM medium, DMEM medium, RPMI-1640 medium, X- Examples include VIVO15 medium or AIM V medium. Among these, AIM V medium is more preferable.
前記細胞調製培地には、その他の添加物を添加することができる。
前記その他の添加物としては、例えば、抗生物質、血清などが挙げられる。
前記血清としては、ウシ胎仔血清、ヒトＡＢ型血清、又は献血ヒト血清アルブミンなどの血清が挙げられるが、得られた細胞を対象者へ投与する目的を考慮して、これらの血清は添加されないことが好ましい。
Other additives can be added to the cell preparation medium.
Examples of the other additives include antibiotics and serum.
Examples of the serum include fetal bovine serum, human AB type serum, or blood donated human serum albumin serum, but these serums should not be added in consideration of the purpose of administering the obtained cells to the subject. Is preferred.
前記成熟樹状細胞誘導処理における調製期間の下限値としては、成熟樹状細胞へ誘導できる期間であれば特に制限はないが、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１日以上がさらに好ましい。また、前記調製期間の上限値としては、７日以下が好ましく、５日以下がより好ましく、３日以下がさらに好ましく、１日が特に好ましい。 The lower limit of the preparation period in the mature dendritic cell induction treatment is not particularly limited as long as it can be induced into mature dendritic cells, but it is preferably 6 hours or longer, more preferably 12 hours or longer, and one day or longer. Further preferred. Moreover, as an upper limit of the said preparation period, 7 days or less are preferable, 5 days or less are more preferable, 3 days or less are further more preferable, and 1 day is especially preferable.
前記成熟樹状細胞誘導処理における調製条件としては、成熟樹状細胞へ誘導できる条件であれば特に制限はなく、例えば、５％から２０％のＣＯ２存在下３７℃で調製する条件などが挙げられる。 The conditions for preparing the mature dendritic cell induction treatment are not particularly limited as long as they can be induced into mature dendritic cells, and examples include conditions for preparation at 37 ° C. in the presence of 5% to 20% CO 2. It is done.
前記成熟樹状細胞誘導処理における培地交換頻度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、より簡便な方法を提供する目的から、前記未成熟樹状細胞誘導処理において、サイトカインを添加した後、培地交換を行わないことが好ましい。 The frequency of medium replacement in the mature dendritic cell induction treatment is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For the purpose of providing a simpler method, in the immature dendritic cell induction treatment, It is preferable not to exchange the medium after adding the cytokine.
＜＜抗原感作処理＞＞
前記抗原感作処理としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記成熟樹状細胞誘導処理により得られた成熟樹状細胞に、抗原を感作する抗原感作処理が挙げられる。
<< Antigen sensitization treatment >>
The antigen sensitization treatment is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, the antigen sensitization for sensitizing an antigen to a mature dendritic cell obtained by the mature dendritic cell induction treatment may be used. The cropping process is mentioned.
前記抗原としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、がん抗原、アレルゲン、自己免疫疾患に関連する自己抗原等、感染症に関連する抗原、又はこれらの組合せが挙げられる。 The antigen is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. For example, cancer antigens, allergens, autoantigens related to autoimmune diseases, etc., antigens related to infectious diseases, or combinations thereof Is mentioned.
前記抗原の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、タンパク質、ペプチドなどが挙げられるが、これらの中でも、感作効率の点からペプチドであることが好ましい。
前記がん抗原としては、安全性の点から人工がん抗原が好ましく、種々のがん細胞における発現率の高さの点からＷＴ１ペプチドがより好ましい。
前記ＷＴ１ペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、表１に記載のペプチドが挙げられるが、これらの中でも、配列番号６、配列番号７、配列番号１０を用いることが好ましい。前記ＷＴ１ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を混合してもよいし、２種以上を連結してもよい。
The type of the antigen is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include proteins and peptides. Among these, peptides are preferable from the viewpoint of sensitization efficiency. .
As the cancer antigen, an artificial cancer antigen is preferable from the viewpoint of safety, and a WT1 peptide is more preferable from the viewpoint of high expression rate in various cancer cells.
There is no restriction | limiting in particular as said WT1 peptide, According to the objective, it can select suitably, For example, although the peptide of Table 1 is mentioned, Among these, sequence number 6, sequence number 7, sequence number 10 Is preferably used. The WT1 peptide may be used alone or in combination of two or more, or two or more may be linked.
前記抗原は、細胞調製培地に添加して用いることができる。
前記細胞調製培地としては、成熟樹状細胞を調製できるものであれば特に制限はないが、ＩＭＤＭ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＣｅｌｌＧｒｏ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地、又はＡＩＭ Ｖ培地が好ましく、これらの中でもＡＩＭ Ｖ培地がより好ましい。
The antigen can be used by being added to a cell preparation medium.
The cell preparation medium is not particularly limited as long as mature dendritic cells can be prepared, but IMDM medium, MEM medium, DMEM medium, DMEM / F12 medium, CellGro medium, RPMI-1640 medium, X-VIVO15 medium Or AIM V medium is preferable, and among these, AIM V medium is more preferable.
前記細胞調製培地には、その他の添加物を添加することができる。
前記その他の添加物としては、例えば、抗生物質、血清などが挙げられる。
前記血清としては、例えば、ウシ胎仔血清、ヒトＡＢ型血清、又は献血ヒト血清アルブミンなどの血清が挙げられるが、得られた細胞を対象者へ投与する目的を考慮して、これらの血清は添加されないことが好ましい。
Other additives can be added to the cell preparation medium.
Examples of the other additives include antibiotics and serum.
Examples of the serum include sera such as fetal bovine serum, human AB type serum, or donated human serum albumin. In consideration of the purpose of administering the obtained cells to a subject, these sera are added. Preferably not.
前記抗原感作処理における温度条件としては、感作できる条件であれば特に制限はないが、３７℃が好ましい。
前記抗原感作処理としては、回転しないで静置で感作させてもよく、手動で混和することにより感作させてもよく、回転装置により回転させてもよい。前記抗原感作処理における回転条件としては、感作できる条件であれば特に制限はないが、１ｒｐｍ以上５０ｒｐｍ以下が好ましく、５ｒｐｍ以上２０ｒｐｍ以下がより好ましく、８ｒｐｍがさらに好ましい。
The temperature condition in the antigen sensitization treatment is not particularly limited as long as it can be sensitized, but is preferably 37 ° C.
As the antigen sensitization treatment, sensitization may be performed by standing without rotation, sensitization by manual mixing, or rotation by a rotating device. The rotation condition in the antigen sensitization treatment is not particularly limited as long as it can be sensitized, but is preferably 1 rpm to 50 rpm, more preferably 5 rpm to 20 rpm, and further preferably 8 rpm.
＜細胞洗浄工程＞
前記細胞洗浄工程は、浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液を用いて細胞を洗浄する工程である。本発明の細胞の洗浄方法は、前記細胞洗浄工程に相当する。
<Cell washing process>
The cell washing step is a step of washing cells using a washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 or more and 15 or less. The cell washing method of the present invention corresponds to the cell washing step.
前記細胞洗浄工程における洗浄としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、遠心による洗浄、及びプレート上での洗浄などが挙げられる。これらの中でも、洗浄効率の点から、遠心による洗浄が好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as washing | cleaning in the said cell washing process, According to the objective, it can select suitably, For example, the washing | cleaning by centrifugation, the washing | cleaning on a plate, etc. are mentioned. Among these, from the viewpoint of washing efficiency, washing by centrifugation is preferable.
前記遠心の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、回転速度は１００Ｇから１０００Ｇが好ましく、２００Ｇから８００Ｇがより好ましく、３００Ｇから５００Ｇがさらに好ましく、遠心時間は、３０秒間から１０分間が好ましく、１分間から５分間がより好ましい。
遠心温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、冷蔵（２℃〜８℃）が好ましい。
前記遠心による細胞の洗浄回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１回から５回が好ましく、３回がより好ましい。
The centrifugation conditions are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. The rotation speed is preferably 100G to 1000G, more preferably 200G to 800G, further preferably 300G to 500G, and the centrifugation time is , Preferably 30 seconds to 10 minutes, more preferably 1 minute to 5 minutes.
There is no restriction | limiting in particular as centrifugation temperature, Although it can select suitably according to the objective, Refrigeration (2 degreeC-8 degreeC) is preferable.
There is no restriction | limiting in particular as the frequency | count of washing | cleaning of the cell by the said centrifugation, Although it can select suitably according to the objective, 1 to 5 times is preferable and 3 times is more preferable.
前記細胞洗浄工程において洗浄される細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球等の白血球などが挙げられる。
前記細胞は、前記細胞調製工程により、好適に調製することができる。
The cells to be washed in the cell washing step are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, monocytes, macrophages, granulocytes And white blood cells such as neutrophils, eosinophils and basophils.
The cells can be suitably prepared by the cell preparation step.
前記細胞の洗浄後の細胞生存率としては、特に制限はないが、従来使用している生理食塩水を用いて洗浄した場合の細胞生存率を１００％とした場合と比較して０．１％以上高い生存率を示すことが好ましく、１０％以上高い生存率を示すことがさらに好ましい。 The cell viability after washing of the cells is not particularly limited, but is 0.1% compared to the case where the cell viability when washed with a physiological saline solution used conventionally is 100%. It is preferable that the survival rate is high as described above, and it is more preferable that the survival rate is 10% or more.
＜＜浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液＞＞
前記浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液は、浸透圧比が特定されている洗浄液である。本発明の細胞洗浄液は、前記浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液に相当する。
<< Cleaning liquid with osmotic pressure ratio of 2 to 15 >>
The cleaning liquid having an osmotic pressure ratio of 2 or more and 15 or less is a cleaning liquid whose osmotic pressure ratio is specified. The cell washing solution of the present invention corresponds to a washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 or more and 15 or less.
前記洗浄液の浸透圧比としては、２以上１５以下であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３以上１５以下が好ましく、３以上１０以下がより好ましい。 The osmotic pressure ratio of the cleaning liquid is not particularly limited as long as it is 2 or more and 15 or less, and can be appropriately selected according to the purpose, but is preferably 3 or more and 15 or less, and more preferably 3 or more and 10 or less.
前記浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液に含まれる成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、電解質、ブドウ糖、アミノ酸、ビタミン類、又はこれらの組合せが挙げられる。これらの中でも、電解質を含むもの、又は、ブドウ糖、アミノ酸、及びチアミンを含むものが好ましく、電解質、ブドウ糖、アミノ酸、及びチアミンを含むものがさらに好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as a component contained in the washing | cleaning liquid whose osmotic pressure ratio is 2-15, It can select suitably according to the objective, For example, electrolyte, glucose, an amino acid, vitamins, or these combination is mentioned. It is done. Among these, those containing an electrolyte or those containing glucose, amino acid, and thiamine are preferable, and those containing an electrolyte, glucose, amino acid, and thiamine are more preferable.
前記電解質としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩素、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リン、亜鉛、又はこれらの組合せなどが挙げられる。これらの中でも、亜鉛を含むものが好ましく、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩素、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リン、及び亜鉛を含むものがより好ましい。 Examples of the electrolyte include sodium, potassium, magnesium, calcium, chlorine, sulfuric acid, acetic acid, lactic acid, citric acid, phosphorus, zinc, and combinations thereof. Among these, those containing zinc are preferable, and those containing sodium, potassium, magnesium, calcium, chlorine, sulfuric acid, acetic acid, lactic acid, citric acid, phosphorus, and zinc are more preferable.
前記亜鉛の濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１００ｎｇ／ｍＬ以上４００ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、２００ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましい。 There is no restriction | limiting in particular as a lower limit of the density | concentration of the said zinc, Although it can select suitably according to the objective, 100 ng / mL or more and 400 ng / mL or less are preferable, and 200 ng / mL or more and 300 ng / mL or less are more preferable.
前記ブドウ糖の濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｇ／Ｌ以上が好ましく、４．５ｇ／Ｌ以上がより好ましく、１０ｇ／Ｌ以上がさらに好ましく、７０ｇ／Ｌ以上が特に好ましい。また、前記ブドウ糖の濃度の上限値としては、２００ｇ／Ｌ以下が好ましく、１５０ｇ／Ｌ以下がより好ましく、１００ｇ／Ｌ以下がさらに好ましく、７５ｇ／Ｌ以下が特に好ましい。 The lower limit of the glucose concentration is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 1 g / L or more, more preferably 4.5 g / L or more, and further preferably 10 g / L or more. Preferably, 70 g / L or more is particularly preferable. Moreover, as an upper limit of the density | concentration of the said glucose, 200 g / L or less is preferable, 150 g / L or less is more preferable, 100 g / L or less is further more preferable, 75 g / L or less is especially preferable.
前記アミノ酸の濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、総遊離アミノ酸量として、１．０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１０ｇ／Ｌ以上がより好ましく、２０ｇ／Ｌ以上がさらに好ましく、３０ｇ／Ｌ以上が特に好ましい。また、前記アミノ酸の濃度の上限値としては、２００ｇ／Ｌ以下が好ましく、１００ｇ／Ｌ以下がより好ましく５０ｇ／Ｌ以下がさらに好ましく、４０ｇ／Ｌ以下が特に好ましい。 The lower limit of the amino acid concentration is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. The total free amino acid amount is preferably 1.0 g / L or more, more preferably 10 g / L or more, 20 g / L or more is more preferable, and 30 g / L or more is particularly preferable. The upper limit of the amino acid concentration is preferably 200 g / L or less, more preferably 100 g / L or less, still more preferably 50 g / L or less, and particularly preferably 40 g / L or less.
前記チアミンの濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、１．０ｍｇ／Ｌ以上がより好ましく、１．５ｍｇ／Ｌ以上がさらに好ましく、１．９ｍｇ／Ｌ以上が特に好ましい。また、前記チアミンの濃度の上限値としては、２０ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、１０ｍｇ／Ｌ以下がより好ましく、５．０ｍｇ／Ｌ以下がさらに好ましく、４．０ｍｇ／Ｌ以下が特に好ましい。 The lower limit of the thiamine concentration is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.1 mg / L or more, more preferably 1.0 mg / L or more, and 1.5 mg / L L or more is more preferable, and 1.9 mg / L or more is particularly preferable. Further, the upper limit of the thiamine concentration is preferably 20 mg / L or less, more preferably 10 mg / L or less, further preferably 5.0 mg / L or less, and particularly preferably 4.0 mg / L or less.
前記浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液は、適宜調製したものを使用してもよいし、市販品、又は市販品に蒸留水を加えて調製したものを使用してもよい。
前記市販品としては、例えば、ビーフリード輸液（株式会社大塚製薬工場製）、及びパレプラス輸液（エイワイファーマ株式会社製）などが挙げられる。
As the washing liquid having an osmotic pressure ratio of 2 or more and 15 or less, an appropriately prepared solution may be used, or a commercially available product or a solution prepared by adding distilled water to a commercially available product may be used.
Examples of the commercially available products include Befreed Infusion (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) and Pare Plus Infusion (Ai Pharma Co., Ltd.).
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞を凍結する細胞凍結工程、細胞の凍結物を解凍する細胞解凍工程、培養上清検査工程、品質検査工程などが挙げられる。
<Other processes>
The other steps are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, a cell freezing step for freezing cells, a cell thawing step for thawing frozen cells, a culture supernatant inspection step, Examples include quality inspection processes.
＜＜細胞凍結工程＞＞
前記細胞凍結工程は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞を保存液に懸濁し、凍結する工程が挙げられる。
<< Cell freezing process >>
There is no restriction | limiting in particular in the said cell freezing process, According to the objective, it can select suitably, For example, the process of suspending a cell in a preservation | save liquid and freezing is mentioned.
前記保存液としては、適宜調製したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。
前記市販品としては、例えば、セルバンカーシリーズ（ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ １、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ １ｐｌｕｓ、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ ２、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ ＧＭＰ ｇｒａｄｅ、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ ＤＭＳＯ Ｆｒｅｅ ＧＭＰ ｇｒａｄｅ）（タカラバイオ株式会社製）などが挙げられる。
As the preservative solution, an appropriately prepared product or a commercially available product may be used.
Examples of the commercial products include Cell Banker Series (CELLBANKER 1, CELLBANKER 1plus, CELLBANKER 2, STEM-CELLBANKER GMP grade, STEM-CELLBANKER DMSO Free GMP grade) (manufactured by Takara Bio Inc.).
前記凍結の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、−８０℃での凍結保存、液体窒素（気相及び液相）での凍結保存が挙げられる。これらの中でも、細胞傷害性を低減する点から−８０℃で凍結保存した後、液体窒素（気相及び液相）で凍結保存する方法が好ましい。 The freezing condition is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include cryopreservation at −80 ° C. and cryopreservation in liquid nitrogen (gas phase and liquid phase). Among these, from the viewpoint of reducing cytotoxicity, a method of cryopreserving at −80 ° C. and then cryopreserving with liquid nitrogen (gas phase and liquid phase) is preferable.
＜＜細胞解凍工程＞＞
前記細胞解凍工程は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結保存された樹状細胞を３０℃から４０℃にて解凍する工程が挙げられる。
<< Cell thawing process >>
The cell thawing step is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a step of thawing a cryopreserved dendritic cell at 30 ° C. to 40 ° C.
前記凍結解凍後の細胞生存率としては、特に制限はないが、一般的に使用される生理食塩水を用いて洗浄した場合の細胞生存率を１００％とした場合と比較して５％以上高い生存率を示すことが好ましい。 The cell viability after freezing and thawing is not particularly limited, but it is 5% or more higher than the case where the cell viability when washed with generally used physiological saline is 100%. It is preferable to show the survival rate.
＜＜培養上清検査工程＞＞
前記培養上清検査工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未成熟樹状細胞が誘導できているか否かを確認する目的で行う、未成熟樹状細胞誘導処理における培養上清検査、成熟樹状細胞が誘導できているか否かを確認する目的で行う、成熟樹状細胞誘導処理における培養上清検査などが挙げられる。
前記培養上清検査の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法などが挙げられる。
<< Culture supernatant inspection process >>
The culture supernatant test step is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, an immature dendritic tree is used for the purpose of confirming whether immature dendritic cells can be induced. Examples include culture supernatant test in cell induction treatment, culture supernatant test in mature dendritic cell induction treatment, and the like performed for the purpose of confirming whether mature dendritic cells can be induced.
There is no restriction | limiting in particular as the method of the said culture supernatant test, According to the objective, it can select suitably, For example, ELISA, Western blotting etc. are mentioned.
＜＜品質検査工程＞＞
前記品質検査工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、無菌試験、エンドトキシン試験、マイコプラズマ否定試験、フローサイトメトリー試験などが挙げられる。
<< Quality inspection process >>
There is no restriction | limiting in particular as said quality inspection process, According to the objective, it can select suitably, For example, a sterility test, an endotoxin test, a mycoplasma negative test, a flow cytometry test etc. are mentioned.
＜細胞含有組成物＞
以上の工程により本発明の細胞含有組成物が調製される。
前記細胞含有組成物は、少なくとも細胞及び亜鉛を含み、更に必要に応じて、その他の成分を含む。
前記細胞含有組成物は細胞凍結物の形態をとってもよい。
<Cell-containing composition>
The cell-containing composition of the present invention is prepared by the above steps.
The cell-containing composition contains at least cells and zinc, and further contains other components as necessary.
The cell-containing composition may take the form of a frozen cell.
＜＜細胞＞＞
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球等の白血球などが挙げられる。
前記細胞含有組成物に含まれる前記細胞の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生細胞数で１×１０５個／ｍＬ以上が好ましく、１×１０６個／ｍＬ以上がより好ましく、５×１０６個／ｍＬ以上がさらに好ましく、１×１０７個／ｍＬ以上が特に好ましい。
<< cells >>
The cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, T cells, B cells, NK cells, dendritic cells, monocytes, macrophages, granulocytes, neutrophils, eosinophils Examples include leukocytes such as spheres and basophils.
There is no restriction | limiting in particular as the density | concentration of the said cell contained in the said cell containing composition, Although it can select suitably according to the objective, 1 * 10 < 5 > / mL or more is preferable at the number of living cells, and 1 * 10 6 pieces / mL or more are more preferable, 5 × 10 6 pieces / mL or more are more preferable, and 1 × 10 7 pieces / mL or more are particularly preferable.
＜＜亜鉛＞＞
前記細胞含有組成物における亜鉛の濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１００ｎｇ／ｍＬ以上４００ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、２００ｎｇ／ｍＬ以上３００ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましい。
<< Zinc >>
There is no restriction | limiting in particular as a lower limit of the density | concentration of zinc in the said cell containing composition, Although it can select suitably according to the objective, 100 ng / mL or more and 400 ng / mL or less are preferable, and 200 ng / mL or more and 300 ng / mL are preferable. The following is more preferable.
＜＜その他の成分＞＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、電解質、ブドウ糖、アミノ酸、ビタミン類、医薬品として許容される担体、免疫原性増強剤などが挙げられる。
前記担体としては、生細胞を懸濁することができるいずれかの溶液であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、培地、血清等などが挙げられる。
前記免疫原性増強剤としては、免疫原性を増強するために用いることができるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サイトカイン、細菌毒素、結核菌菌体成分等の免疫促進剤、ミョウバン、フロイントアジュバント、その他のアジュバント剤などが挙げられる。
<< Other ingredients >>
The other components are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. Examples thereof include electrolytes, glucose, amino acids, vitamins, pharmaceutically acceptable carriers, and immunogenicity enhancers. .
The carrier is not particularly limited as long as it is a solution capable of suspending living cells, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, physiological saline, PBS, medium, serum, etc. Is mentioned.
The immunogenicity enhancer is not particularly limited as long as it can be used to enhance immunogenicity, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, cytokines, bacterial toxins, tuberculosis bacteria Examples include immune promoters such as bacterial cell components, alum, Freund's adjuvant, and other adjuvants.
前記細胞含有組成物は樹状細胞ワクチンであってもよい。 The cell-containing composition may be a dendritic cell vaccine.
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）細胞含有組成物の調製
−細胞調製工程−
−−単球分離処理−−
健康なボランティア被験者からヒト末梢血が採取された。前記ヒト末梢血採取は、アフェレーシスにより行われ、血液成分分離装置（ＣＯＭ．ＴＥＣ、フレゼニウス社製）を用いて行われた。
得られたヒト末梢血をフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて比重遠心処理後、単核球層を回収し、遠心操作により血小板除去後、抗ＣＤ１４抗体が固定化された磁気ビーズ（ｃｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ１４マイクロビーズ、ミルテニーバイオテク社製）を添加し、４℃で１５分間ゆるやかに攪拌しながら反応させた。その後、磁気分離カラム（ＬＳカラム）を用いて、ＣＤ１４を表面に発現する細胞（ＣＤ１４陽性細胞）を回収し、細胞懸濁液１を調製した。
(Example 1) Preparation of cell-containing composition-cell preparation step-
--Monocyte separation process--
Human peripheral blood was collected from healthy volunteer subjects. The human peripheral blood collection was performed by apheresis and was performed using a blood component separation device (COM.TEC, manufactured by Fresenius).
The resulting human peripheral blood was subjected to specific gravity centrifugation using Ficoll (Ficoll-paque PREMIUM, manufactured by ThermoFisher Scientific), the mononuclear cell layer was recovered, and after removing platelets by centrifugation, the anti-CD14 antibody immobilized magnetic Beads (cliniMACS CD14 microbeads, manufactured by Miltenyi Biotech) were added and reacted at 4 ° C. with gentle stirring for 15 minutes. Then, using a magnetic separation column (LS column), cells expressing CD14 on the surface (CD14 positive cells) were collected, and a cell suspension 1 was prepared.
−−未成熟樹状細胞誘導処理−−
前記細胞懸濁液１を、ＡＩＭ Ｖ培地（ＡＩＭ Ｖ ｍｅｄｉｕｍ ＣＴＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に終濃度５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−４（ＭＡＣＳ ＧＭＰ ｒｈＩＬ−４、ミルテニーバイオテク社製）及び終濃度５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（ＭＡＣＳ ＧＭＰ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ミルテニーバイオテク社製）となるよう添加した培地に懸濁し、調製容器（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＴＣシャーレ、グライナー社製）に播種して、５％のＣＯ２存在下３７℃で６日間培養し、細胞懸濁液２を調製した。
--Immature dendritic cell induction treatment--
The cell suspension 1 was added to AIM V medium (AIM V medium CTS, manufactured by ThermoFisher Scientific) at a final concentration of 50 ng / mL rhIL-4 (MACS GMP rhIL-4, manufactured by Miltenyi Biotech) and a final concentration of 50 ng / mL. Suspended in a medium added to become rhGM-CSF (MACS GMP rhGM-CSF, manufactured by Miltenyi Biotech), seeded in a preparation container (Advanced TC Petri dish, manufactured by Greiner), and in the presence of 5% CO 2. Cell suspension 2 was prepared by culturing at 37 ° C. for 6 days.
−−成熟樹状細胞誘導処理−−
前記細胞懸濁液２を回収後、遠心処理し、ペレットを終濃度５ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−４（ＭＡＣＳ ＧＭＰ ｒｈＩＬ−４、ミルテニーバイオテク社製）、終濃度５ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（ＭＡＣＳ ＧＭＰ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ミルテニーバイオテク社製）、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＰＧＥ２、及び終濃度０．１ＫＥ／ｍＬのＯＫ−４３２を添加したＡＩＭ Ｖ培地（ＡＩＭ Ｖ ｍｅｄｉｕｍ ＣＴＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に懸濁した後、調製容器（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＴＣシャーレ、グライナー社製）に播種し、５％のＣＯ２存在下３７℃で翌日まで培養し、細胞懸濁液３を調製した。
-Mature dendritic cell induction treatment-
After the cell suspension 2 was collected, it was centrifuged, and the pellet was subjected to rhIL-4 (MACS GMP rhIL-4, manufactured by Miltenyi Biotech) with a final concentration of 5 ng / mL, rhGM-CSF (MACS with a final concentration of 5 ng / mL). GMP rhGM-CSF (manufactured by Miltenyi Biotech), AIM V medium (AIM V medium CTS, Thermo Fisher Scientific) supplemented with PGE2 having a final concentration of 50 ng / mL and OK-432 having a final concentration of 0.1 KE / mL. After turbidity, seeded in a preparation container (Advanced TC Petri dish, manufactured by Greiner) and cultured in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. until the next day to prepare a cell suspension 3.
−−抗原感作処理−−
前記細胞懸濁液３を回収後、配列番号６、配列番号７、及び配列番号１０のペプチドを混合した、ＷＴ１ペプチド（Ａｎｙｇｅｎ社製）を添加し、感作させた。
-Antigen sensitization treatment-
After the cell suspension 3 was recovered, a WT1 peptide (Anygen) mixed with peptides of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10 was added for sensitization.
−細胞洗浄工程−
１×１０７個の感作後の細胞を遠心処理し、ペレットに、表２に組成を示した洗浄液１（ビーフリード輸液（株式会社大塚製薬工場製）に蒸留水を添加することにより浸透圧比２に調整した洗浄液）を５ｍＬ加え、５００Ｇ、５分で遠心した。上清を４．５ｍＬ除去し、洗浄液１を４．５ｍＬ加えた。この洗浄を、合計３回行い、細胞含有組成物１を調製した。
−−細胞生存率の測定−−
洗浄前及び洗浄後の細胞の一部をＰＩ／ＡＯ蛍光色素（Ｃａｔ：Ｆ２３００１、Ｌｏｇｏｓ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で染色し、細胞カウンター（ｌｕｎａ ＦＬ（ＴＭ）、Ｌｏｇｏｓ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて細胞数を計測した。細胞生存率は、前記ＰＩ／ＡＯ蛍光色素により、染色されなかったものを生細胞とし、染色されたものを死細胞として評価し、それぞれ２回測定を行い、平均値を算出した。洗浄前の全細胞数に対する生細胞の割合（％）、及び洗浄後の全細胞数に対する生細胞の割合（％）を表２に示した。
-Cell washing process-
1 × 10 7 cells after sensitization were centrifuged, and osmotic pressure ratio was obtained by adding distilled water to the washing solution 1 (Befreed Infusion (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)) shown in Table 2 on the pellet. 5 mL of the washing solution adjusted to 2) was added, and centrifuged at 500 G for 5 minutes. 4.5 mL of the supernatant was removed, and 4.5 mL of washing solution 1 was added. This washing was performed three times in total to prepare a cell-containing composition 1.
--Measurement of cell viability--
A portion of the cells before and after washing is stained with a PI / AO fluorescent dye (Cat: F23001, manufactured by Logos biosystems), and the number of cells is determined using a cell counter (luna FL (TM), manufactured by Logos biosystems). Measured. The cell viability was evaluated as a living cell by using the PI / AO fluorescent dye as an unstained cell and a dead cell as a dead cell. Table 2 shows the ratio (%) of the living cells to the total number of cells before washing, and the ratio (%) of the living cells to the total number of cells after washing.
（実施例２）
実施例１に記載の、洗浄液１を、洗浄液２（パレプラス輸液、エイワイファーマ株式会社製：浸透圧比３）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で細胞含有組成物２を調製し、評価した。評価結果を表２に示した。
(Example 2)
A cell-containing composition 2 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the cleaning liquid 1 described in Example 1 was changed to the cleaning liquid 2 (Pare Plus Infusion, AY Pharma Co., Ltd .: osmotic pressure ratio 3). ,evaluated. The evaluation results are shown in Table 2.
（実施例３）
実施例１に記載の、洗浄液１を、洗浄液３（ビーフリード輸液、株式会社大塚製薬工場製：浸透圧比３）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で細胞含有組成物３を調製し、評価した。評価結果を表２に示した。
(Example 3)
A cell-containing composition 3 was prepared in the same manner as in Example 1 except that the cleaning liquid 1 described in Example 1 was changed to the cleaning liquid 3 (Befreed Infusion, Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd .: osmotic pressure ratio 3). And evaluated. The evaluation results are shown in Table 2.
（実施例４）
実施例１に記載の、洗浄液１を、洗浄液４（ビーフリード輸液（株式会社大塚製薬工場製）にグルコースを添加することにより浸透圧比５に調整した洗浄液）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で細胞含有組成物４を調製し、評価した。評価結果を表２に示した。
Example 4
Example 1 except that the cleaning liquid 1 described in Example 1 was changed to the cleaning liquid 4 (cleaning liquid adjusted to an osmotic pressure ratio 5 by adding glucose to Befreed Infusion (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)). A cell-containing composition 4 was prepared and evaluated in the same manner. The evaluation results are shown in Table 2.
（実施例５）
実施例１に記載の、洗浄液１を、洗浄液５（ビーフリード輸液（株式会社大塚製薬工場製）にグルコースを添加することにより浸透圧比１０に調整した洗浄液）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で細胞含有組成物５を調製し、評価した。評価結果を表２に示した。
(Example 5)
Example 1 except that the cleaning liquid 1 described in Example 1 was changed to the cleaning liquid 5 (cleaning liquid adjusted to an osmotic pressure ratio of 10 by adding glucose to Befreed Infusion (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)). A cell-containing composition 5 was prepared and evaluated in the same manner. The evaluation results are shown in Table 2.
（実施例６）
実施例１に記載の、洗浄液１を、洗浄液６（ビーフリード輸液（株式会社大塚製薬工場製）にグルコースを添加することにより浸透圧比１５に調整した洗浄液）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で細胞含有組成物６を調製し、評価した。評価結果を表２に示した。
(Example 6)
Example 1 except that the cleaning liquid 1 described in Example 1 was changed to the cleaning liquid 6 (cleaning liquid adjusted to an osmotic pressure ratio of 15 by adding glucose to Befreed Infusion (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.)). A cell-containing composition 6 was prepared and evaluated in the same manner. The evaluation results are shown in Table 2.
（比較例）
実施例１に記載の、洗浄液１を、洗浄液７（生理食塩水、株式会社大塚製薬工場製：浸透圧比１）に変更した以外は、実施例１と同様の方法で細胞含有組成物７を調製し、評価した。評価結果を表２に示した。
(Comparative example)
A cell-containing composition 7 was prepared in the same manner as in Example 1, except that the cleaning solution 1 described in Example 1 was changed to a cleaning solution 7 (saline, manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd .: osmotic pressure ratio 1). And evaluated. The evaluation results are shown in Table 2.
表２の最下段には、洗浄液７を用いて洗浄した場合の洗浄後の細胞生存率に対する、各洗浄液を用いて洗浄した場合の洗浄後の細胞生存率の比率を示した。
表２の結果から、本発明の浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液を用いて調製された細胞含有組成物１〜６は、洗浄後の細胞生存率が非常に高いことが分かる（実施例１〜６参照）。これに対して、浸透圧比が２未満の洗浄液を用いて調製された細胞含有組成物７は、洗浄後の細胞生存率が低いことが分かる（比較例１参照）。したがって、本発明の浸透圧比が２以上１５以下の洗浄液は、浸透圧比が２未満の洗浄液に比し、格別顕著な効果を奏するものである。
なお、本発明により得られた細胞含有組成物１〜６は、いずれも２７０ｎｇ／ｍＬの濃度の亜鉛を含むことをＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析計、検出限界：１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ）により確認した。
The bottom row of Table 2 shows the ratio of the cell viability after washing when washed with each washing solution to the cell viability after washing when washing with the washing solution 7.
From the results in Table 2, it can be seen that the cell-containing compositions 1 to 6 prepared using a washing solution having an osmotic pressure ratio of 2 to 15 of the present invention have a very high cell viability after washing (Example 1). To 6). On the other hand, it can be seen that the cell-containing composition 7 prepared using a washing solution having an osmotic pressure ratio of less than 2 has a low cell viability after washing (see Comparative Example 1). Therefore, the cleaning liquid having an osmotic pressure ratio of 2 or more and 15 or less according to the present invention has a particularly remarkable effect as compared with a cleaning liquid having an osmotic pressure ratio of less than 2.
It should be noted that the cell-containing compositions 1 to 6 obtained by the present invention all contain zinc at a concentration of 270 ng / mL by ICP-MS (inductively coupled plasma mass spectrometer, detection limit: 1 ng / mL to 10 ng / mL). mL).
Claims (1)
前記樹状細胞の細胞生存率が、生理食塩水を用いて洗浄した場合の細胞生存率を１００％とした場合と比較して１０％以上高く、
前記樹状細胞が、浸透圧比が３以上１５以下の洗浄液で洗浄後の樹状細胞であり、
前記洗浄液が、亜鉛、ブドウ糖、アミノ酸、及びチアミンを含み、
前記洗浄液における亜鉛の濃度が、２００ｎｇ／ｍＬから４００ｎｇ／ｍＬであり、
前記洗浄液が、グルコースを用いて浸透圧比が調整されたものであることを特徴とする樹状細胞ワクチン。 Comprising dendritic cells and zinc at a concentration of 200 ng / mL to 400 ng / mL;
Cell viability of the dendritic cells, rather high 10% or more as compared with the case of the cell survival rate when washed with saline as 100%,
The dendritic cells are dendritic cells after washing with a washing solution having an osmotic pressure ratio of 3 or more and 15 or less,
The cleaning solution contains zinc, glucose, amino acids, and thiamine;
The concentration of zinc in the cleaning solution is 200 ng / mL to 400 ng / mL;
A dendritic cell vaccine characterized in that the washing solution has an osmotic pressure ratio adjusted with glucose .
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