JP6382311B2 - 損傷組織の再生 - Google Patents
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Description
・創傷を有する個体を提供することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、提供することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と治療上有効量のトロポエラスチンとを接触させることであって、
創傷の再上皮化が創傷の治癒を可能にし、
それにより創傷が治癒する、接触させることと、
を含む、創傷を治癒する方法を提供する。
・創傷を有する個体を提供することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、提供することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と治療上有効量のトロポエラスチンとを接触させることであって、
それにより創傷の再上皮化が改善される、接触させることと、
を含む、創傷の再上皮化を改善するプロセスが提供される。
・瘢痕組織を有する個体を提供することと、
・瘢痕組織に創傷を形成することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、形成することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と治療上有効量のトロポエラスチンとを接触させることであって、
創傷の再上皮化が瘢痕組織を最小限にし、
それにより瘢痕組織が最小限になる、接触させることと、
を含む、瘢痕組織を最小限にする方法が提供される。
・創傷を有する個体を提供することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、提供することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と約0.1mg/ml〜250mg/mlの濃度のトロポエラスチンとを接触させることであって、創傷の再上皮化が創傷の治癒を可能にし、それにより創傷が治癒する、接触させることと、
を含む、創傷を治癒する方法が提供される。この実施形態では、トロポエラスチンは、トロポエラスチンと創縁との持続接触のために創縁に適用可能な形態で使用されるように提供されうる。そのような形態はゲルでありうる。好ましくは、この実施形態では、トロポエラスチンは、好ましくは創床と接触させることなく、約1〜数週間以下の期間にわたり創縁と持続接触した状態で提供される。
・瘢痕組織を有する個体を提供することと、
・瘢痕組織に創傷を形成することであって、創傷が、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞を含むことにより創縁を形成する、形成することと、
・創傷の再上皮化を可能にする期間にわたりトロポエラスチンと創縁との持続接触を可能にする条件で創縁と治療上有効量のトロポエラスチンとを接触させることであって、
創傷の再上皮化が瘢痕組織を最小限にし、
それにより瘢痕組織が最小限になる、接触させることと、
を含む、瘢痕組織を最小限にする方法が提供される。
本研究では、rH TEを併用してまたは併用せずにIntegra真皮テンプレートを適用した後のブタモデルでの全層外科的創傷の真皮再生に及ぼす組換えヒトトロポエラスチン(rH TE)の影響を評価した。2週間での再生真皮の分析により、Integra真皮テンプレート中のrH TEの存在が創傷修復プロセスの改善をもたらすことが明らかにされた。線維芽細胞の数の増加、コラーゲン沈着の上昇、再生真皮組織の血管新生の増加、および再生真皮内で検出されたエラスチン線維のレベルの増加により、改善は顕著であった。これらのイベントは、rH TEの存在により創傷の上皮化の改善をもたらすケラチノサイト増殖の増加を伴った。
テストアイテム
本研究では、以下の3つの製品を評価した。
・ 対照: Integra真皮テンプレート
・ テストA: 10%rH TE(エラスチン化Integra)が組み込まれたIntegra真皮テンプレート
・ テストB: 4%rH TEヒドロゲル上に置かれたIntegra真皮テンプレート
本研究では、以下の画像に示されるように、それぞれ動物の各側に2つずつ4つの創傷部位を有する2匹のブタを利用した。
o 以上の図に記載されるように、5cmの直径を有する4つの全層円形切除創傷を各ブタの上背部に形成した。
o 以上の図に記載されるように、各創傷を対照Integra真皮テンプレートまたはテストアイテムAもしくはBのいずれかで治療した。
o すべての創傷に対してドレッシングを交換する。
o 図1Bに示されるように、創傷の縁から数mm離れた各創傷部位から4mmの生検を採取した。
手術および治療の2週間後、最初に、創傷部位でサンプリングを行った。以上に記載したように、創傷部位の生検を行った。サンプルを病理組織診断および免疫組織化学分析に付して、線維芽細胞の浸潤、コラーゲンおよびエラスチンの沈着、再生組織の血管新生、ならびに上皮の再生を評価した。
Integra真皮テンプレートの線維芽細胞浸潤:
線維芽細胞数は、すべての構築物で増加したが、rH TEの存在下でより上昇した。効果は、rH TEが全構築物に浸透したエラスチン化Integraで最も顕著であった。
図2に示されるヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色ならびにバーヘフ−ワンギーソン(VVG)染色により実証されるように、線維芽細胞レベルの上昇は、rH TEの存在下でコラーゲン沈着の増加をもたらした。
病理組織診断により再生真皮内の血管新生のレベルを評価した。図5に記載されるように、皮下組織から開始して表皮の方向に順次移動することにより、生検切片組織の異なるレベルで血管の数を顕微鏡下で評価した。図5に提示されたデータから分かるように、Integra真皮テンプレート内のrH TEの存在(エラスチン化Integra)は、とくにIntegra真皮テンプレートで治療された部位と比較して、表在性真皮の方向に再生組織内の血管の数の増加をもたらした。4%rH TEゲル上のIntegra真皮テンプレートで治療された部位でも、類似の傾向が見られた。
創傷部位での上皮の再生は、他のテストアイテムおよび対照アイテムよりも優れたエラスチン化Integraの最も顕著な利点の1つであった。表2に詳述されるようにおよび図6に示されるように、エラスチン化Integraは、2週目までに創傷部位のほとんど完全な再上皮化をもたらし、より自然な真皮−表皮接合の指標となる類表皮突起の存在を伴った。
データは、図7に示されるモデルにより説明される。このモデルでは、rH TEは、エラスチン化Integra内に組み込まれた場合、生物学的刺激を真皮修復プロセスに提供する。これは、より高いレベルの線維芽細胞浸潤、再生組織の血管新生、および創傷部位の上皮化をもたらす。これらの利点は、エラスチン化Integraの使用により皮膚移植の必要性が排除されることを意味する。トロポエラスチンは、単球(血管新生に寄与し、たとえば、線維細胞に分化する)および線維芽細胞を含む組織修復プロセスに関与する細胞に対して走化性であるので、この生物学的刺激は、組織修復プロセスに寄与する際のrH TEの既知の性質と一致する[Almine et al.,2012]。
本研究では、それぞれ動物の各側に2つずつ4つの直径5cmの円形創傷部位を有するブタを利用した。各ブタに対して、一方の側の2つの創傷を市販の皮膚テンプレート製品で覆い、他方の側の2つの創傷をテストアイテムA、B、またはCのいずれかで治療した。
o 以上の図に記載されるように、5cmの直径を有する4つの全層円形切除創傷を各ブタの上背部に形成した。
o 各創傷を対照皮膚テンプレートまたはテストアイテムA、B、もしくはCのいずれかで治療した。
o すべての創傷に対してドレッシングを交換する。
o 図1Bに示されるように、創傷の縁から数mm離れた各創傷部位から4mmの生検を採取した。
手術および治療の2週間後、最初に、創傷部位でサンプリングを行った。以上に記載したように、創傷部位の生検を行った。サンプルを病理組織診断および免疫組織化学分析に付して、線維芽細胞の浸潤、コラーゲンおよびエラスチンの沈着、再生組織の血管新生、ならびに上皮の再生を評価した。
1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFP)中の20%(w/v)タンパク質溶液で、さまざまな割合のトロポエラスチンおよびコラーゲンを組み合わせた。これらは、100%トロポエラスチン、80%トロポエラスチンと20%コラーゲン、60%トロポエラスチンと40%コラーゲン、50%トロポエラスチンと50%コラーゲン、および100%コラーゲンを含んでいた。ブラント18ゲージ針を備えたシリンジに溶液を充填し、シリンジポンプを用いて3ml h1の流量に調整した。針を20kV正電源に接続し、20cmのコレクター距離にある接地された直径30mmの円形黄銅コレクターに方向付けた。エレクトロスパン足場を化学架橋して水性環境でその構造を安定化させた。足場をオープンステージデシケーター内に配置し、個別の25%(v/v)水性グルタルアルデヒド溶液からの蒸気により架橋し、次いで、0.2Mグリシン溶液中に一晩浸漬することによりクエンチした。次いで、足場をPBS中で繰返し洗浄した。Rnjak− Kovacina,J.et al.Acta Biomater.2012 Oct;8(10):3714−22を参照されたい。このアイテムは、以下のテストアイテムBよりも有意に架橋される。それは、細胞浸潤に対してより適合しやすい傾向がある。
0.05M酢酸(pH3.2)中で10%w/wトロポエラスチンと混合されたI型ウシコラーゲンの白色共沈物をフリーズドライにより高多孔性白色膜に変換した。液体窒素中で初期棚温度スナップ凍結を調整することにより、平均細孔直径の制御を達成した。続いて、乾燥固体を24時間にわたり105℃および6kPa真空に暴露し、コラーゲンのポリペプチド鎖間に共有結合架橋を導入した。0.05M酢酸中に0.25%水性グルタルアルデヒドを含有する浴に構築物を浸漬し、コラーゲンをさらに共有結合架橋させた。構築物を24時間にわたり脱イオン水中で濯いだ。Kanematsu,A.,et al.Biomaterials.2004 Aug;25(18):4513−20を参照されたい。これは、以上のテストアイテムAよりも耐分解性である傾向がある。
本質的に国際公開第2012068619号パンフレットに記載されるとおり、全長トロポエラスチンをヒアルロン酸ゲルに組み込んで、使用前にシリンジに充填した。ゲルを暴露創床の表面上に適用し、次いで、トロポエラスチンを省略したがテストアイテムBに対して記載されたように生成されたコラーゲンスポンジで覆った。
背を横切って10ヶ所までの2cm×2cm部位でブタをそれぞれ治療した。各部位に以下の3つの治療方法の1つを施した。
1)部位A: 治療される皮膚領域を横切って約2mmずつ離間させてマイクロコアリング針を用いて刺創を施した。針処置後、1%〜5%w/vトロポエラスチンタンパク質を含有するゲルを治療領域に局所適用し、Tegadermドレッシングにより所定の位置に保持することにより、ゲルの維持および刺傷部位への移行を可能にした。
2)部位B: 皮下注射針を用いて刺創を施した。各刺傷は、皮膚組織の上側真皮中への0.05〜0.5mlの1〜5%w/vトロポエラスチンゲルの注射を含んでいた。治療される皮膚領域を横切って約2mm離間させて刺傷/注射を施し、続いて、創傷ドレッシングを施した。
3)部位C: クロスハッチング注射技術を用いて上側真皮中への0.5〜2mlの1〜5%w/vトロポエラスチンゲルの留置を施し、続いて、約2mm離間させてマイクロコアリング針を用いて治療領域を横切って刺創を施した。
皮膚への局所適用薬剤の送達を支援する垂直チャネルをフラクショナルレーザーリサーフェイシングにより約3mmの深さで皮膚内に形成する。背を横切って10ヶ所までの2cm×2cm部位でブタをそれぞれ治療した。本質的にHaedersdal et al. 2010(Lasers Surg Med.42(2):113−22)により記載されるとおり、フラクショナルシングルホールCO2レーザーを用いて各部位を治療した。レーザー処置に続いて、テスト部位に以下のいずれかを施した。
・ 1〜5%w/vトロポエラスチンを含有するヒアルロン酸ゲル、または
・ ヒアルロン酸ゲル対照
Almine et al 2012.Elastin Signaling in Wound Repair.Birth Defects Research(Part C)96:248−257。
Claims (11)
- 創傷を治癒するため、または創傷の再上皮化を改善するためのトロポエラスチン組成物において、
該トロポエラスチン組成物は、治療上有効量のトロポエラスチン、および組成物からのトロポエラスチンの持続放出を可能にする架橋ヒアルロン酸ゲルを含み、
該トロポエラスチン組成物は、それが、創傷の再上皮化を可能にする期間にわたり創縁と持続接触するのを可能にする条件で創縁と接触させられ、
創縁は、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞の形態であり、
創傷の再上皮化は、創傷の治癒を可能にする、
トロポエラスチン組成物。 - 前記トロポエラスチン組成物が、前記トロポエラスチン組成物と前記創縁との持続接触を可能にする粘度または接着性を有するゲルの形態である、請求項1に記載のトロポエラスチン組成物。
- 前記トロポエラスチン組成物が、固相の頂端表面上に提供され、かつ前記固相が、前記固相の頂端表面を前記創縁にアライメントさせることにより前記トロポエラスチン組成物と前記創縁との持続接触を可能にするように創床に配置される、請求項1に記載のトロポエラスチン組成物。
- 前記固相が、ドレッシング、ステント、足場、バルキング剤、またはプロテーゼである、請求項3に記載のトロポエラスチン組成物。
- トロポエラスチン組成物の溶液が、前記溶液からの溶媒の蒸発を可能にし、それによりトロポエラスチンと前記創縁との持続接触を可能にする条件で前記創縁上にスプレーされることにより、前記トロポエラスチン組成物が前記創縁と接触させられる、請求項1に記載のトロポエラスチン組成物。
- 前記創縁に提供されるトロポエラスチンの治療上有効量が、約0.1mg〜250mg/mlである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
- 前記トロポエラスチン組成物が、約1〜2週間以下の期間にわたり前記創縁と持続接触した状態で提供される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
- 前記トロポエラスチン組成物が、創床と接触させられない、請求項1〜7のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
- 前記トロポエラスチン組成物が、架橋トロポエラスチンを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のトロポエラスチン組成物。
- 創傷を治癒するため、または創傷の再上皮化を改善するためのトロポエラスチン組成物において、
該トロポエラスチン組成物は、組成物からのトロポエラスチンの持続放出を可能にするように、治療上有効量のトロポエラスチン、および架橋コラーゲンを含み、
該トロポエラスチン組成物は、それが、創傷の再上皮化を可能にする期間にわたり創縁と持続接触するのを可能にする条件で創縁と接触させられ、
創縁は、創傷の周りに位置する複数の表皮細胞の形態であり、
創傷の再上皮化は、創傷の治癒を可能にする、
トロポエラスチン組成物。 - 前記トロポエラスチン組成物が、架橋トロポエラスチンを含む、請求項10に記載のトロポエラスチン組成物。
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