JP6381013B2 - Method for detecting atopic keratoconjunctivitis - Google Patents
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Description
本発明は、アトピー性角結膜炎の検出方法、当該検出方法に関係する生体試料の分析方法などに関する。 The present invention relates to a detection method for atopic keratoconjunctivitis, a biological sample analysis method related to the detection method, and the like.
アレルギー性結膜炎は、充血や痒みを症状とする角結膜疾患であり、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季カタル、アトピー性角結膜炎などに分類される。 Allergic conjunctivitis is a keratoconjunctival disease with symptoms such as hyperemia and itch, and is classified into seasonal allergic conjunctivitis, perennial allergic conjunctivitis, spring catarrh, atopic keratoconjunctivitis, and the like.
アレルギー性結膜炎のうち、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎及び春季カタルはアトピー性皮膚炎を伴わない疾患である。 Among allergic conjunctivitis, seasonal allergic conjunctivitis, perennial allergic conjunctivitis and spring catarrh are diseases not accompanied by atopic dermatitis.
一方、アトピー性角結膜炎は、主に顔面にアトピー性皮膚炎を伴う疾患であり、重症例では高度の炎症を起こして、円錐角膜、白内障及び網膜剥離といった失明に通じる疾患を合併することもある。このため、アトピー性角結膜炎は、他のアレルギー性結膜炎とは予後や治療方針が大きく異なる疾患である。アトピー性角結膜炎の予後を正確に予測し、また、有効な治療方針を決定するためには、アトピー性角結膜炎の正確な診断が求められる。 On the other hand, atopic keratoconjunctivitis is a disease mainly associated with atopic dermatitis on the face, and in severe cases, it is highly inflammatory and may be accompanied by diseases that lead to blindness such as keratoconus, cataract and retinal detachment. . For this reason, atopic keratoconjunctivitis is a disease whose prognosis and treatment policy differ greatly from other allergic conjunctivitis. In order to accurately predict the prognosis of atopic keratoconjunctivitis and to determine an effective treatment strategy, an accurate diagnosis of atopic keratoconjunctivitis is required.
しかしながら、アトピー性角結膜炎の正確な診断が困難な場合がある。例えば、明らかなアトピー性皮膚炎の合併が認められない場合である。 However, accurate diagnosis of atopic keratoconjunctivitis may be difficult. For example, when no obvious atopic dermatitis complication is observed.
このように正確な診断が困難な場合であっても、専門医が精度よくアトピー性角結膜炎を診断可能な、あるいは、非専門医が簡便かつ正確にアトピー性角結膜炎を診断可能なツールが求められる。 Thus, there is a need for a tool that allows a specialist to accurately diagnose atopic keratoconjunctivitis even when accurate diagnosis is difficult, or a non-specialist to easily and accurately diagnose atopic keratoconjunctivitis.
ここで、近年、ペリオスチンがアトピー性皮膚炎の病態において重要な役割を果たすことが明らかになっている（特許文献１及び非特許文献１）。ペリオスチンの測定方法として、免疫組織学的方法、リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティングなどによる方法が知られている。しかし、これらの方法はいずれも煩雑で、施行可能な施設が限られること、結果を得るまで長時間を要すること、結膜組織を必要とすることなどの問題がある。 Here, in recent years, it has become clear that periostin plays an important role in the pathology of atopic dermatitis (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). Known methods for measuring periostin include immunohistological methods, real-time PCR, Western blotting, and the like. However, all of these methods are complicated, and there are problems such as that the facilities that can be implemented are limited, it takes a long time to obtain a result, and a conjunctival tissue is required.
上記状況に鑑み、本発明は、より簡便かつ正確にアトピー性角結膜炎を検出する方法を提供することを目的とする。 In view of the above situation, an object of the present invention is to provide a method for detecting atopic keratoconjunctivitis more easily and accurately.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アトピー性角結膜炎の患者由来の涙液において、ペリオスチンタンパク質の濃度が高いこと、患者から採取された涙液におけるペリオスチンタンパク質の濃度を分析することにより、より簡便に迅速かつ低侵襲でアトピー性角結膜炎を診断又は検出する際に有用な分析値が得られること、などを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の検出方法、検出薬などを提供する。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that periostin protein concentration is high in tears derived from patients with atopic keratoconjunctivitis, and that periostin proteins in tears collected from patients By analyzing the concentration, it was found that an analytical value useful for diagnosing or detecting atopic keratoconjunctivitis can be obtained more simply, rapidly and less invasively, and the present invention has been completed.
That is, the present invention provides the following detection method, detection drug and the like.
［1] 被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度を測定することを含む、アトピー性角結膜炎の検出方法。
［2] 涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度の上昇が、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われることを示す、上記[1]に記載の方法。
［3] 測定したタンパク質濃度が、涙液中濃度で400ng/mL以上であるときに、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われると判断することを含む、上記[1]に記載の方法。
［4] （i）被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度と、（ii）正常試料におけるペリオスチンタンパク質濃度との比較を行うことを含む、上記[1]に記載の方法。
［5] （i）被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度が（ii）正常試料におけるペリオスチンタンパク質濃よりも高いときに、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われると判断することを含む、上記[4]に記載の方法。
［6] 正常試料が、春季カタルおよび季節性アレルギー性結膜炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患に罹患している患者から採取した涙液である、上記[4]又は[5]記載の方法。
［7] アトピー性角結膜炎の治療を受けている被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度を測定することを含む、治療の有効性を確認する方法。
［8] （i）治療を受けている被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度と、（ii）当該被験者より採取した治療前の涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度との比較を行うことを含む、上記[7]に記載の方法。
［9] （i）治療を受けている被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度が（ii）当該被験者より採取した治療前の涙液におけるペリオスチンタンパク質濃よりも低いときに、治療が有効であると判断することを含む、上記[8]に記載の方法。
［10] 測定が免疫測定法によるものである、上記[1]〜[9]のいずれか1項に記載の方法。
［11] ペリオスチンを認識する抗体を含有する、アトピー性角結膜炎の検出薬。
［12] 上記[11]に記載の検出薬を含有する、アトピー性角結膜炎の検出用キット。
［13] 採取した涙液の分析方法において、涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度を測定することを含む、涙液の分析方法。
［14] ペリオスチンタンパク質濃度の測定が免疫測定法により行われることを特徴とする上記[13]に記載の方法。
[1] A method for detecting atopic keratoconjunctivitis, comprising measuring a periostin protein concentration in tears collected from a subject.
[2] The method according to [1] above, wherein an increase in periostin protein concentration in the tear fluid is suspected of developing atopic keratoconjunctivitis.
[3] The method according to [1] above, comprising determining that it is suspected of developing atopic keratoconjunctivitis when the measured protein concentration is 400 ng / mL or more as a tear concentration. .
[4] The method according to [1] above, comprising comparing (i) a periostin protein concentration in tears collected from a subject and (ii) a periostin protein concentration in a normal sample.
[5] (i) including determining that atopic keratoconjunctivitis is suspected when the periostin protein concentration in tears collected from the subject is higher than (ii) the periostin protein concentration in normal samples The method according to [4] above.
[6] The above-mentioned [4] or [5], wherein the normal sample is tear fluid collected from a patient suffering from at least one disease selected from the group consisting of spring catarrh and seasonal allergic conjunctivitis Method.
[7] A method for confirming the effectiveness of treatment, comprising measuring periostin protein concentration in tears collected from a subject undergoing treatment for atopic keratoconjunctivitis.
[8] The method comprises comparing (i) a periostin protein concentration in tears collected from a subject undergoing treatment with (ii) a periostin protein concentration in tears before treatment collected from the subject. The method according to [7].
[9] (i) The treatment is effective when the periostin protein concentration in the tears collected from the subject undergoing treatment is lower than the (ii) periostin protein concentration in the pre-treatment tears collected from the subject. The method according to [8] above, comprising judging that.
[10] The method according to any one of [1] to [9] above, wherein the measurement is based on an immunoassay.
[11] A detection agent for atopic keratoconjunctivitis, comprising an antibody that recognizes periostin.
[12] A kit for detecting atopic keratoconjunctivitis, comprising the detection agent according to [11] above.
[13] A method for analyzing tears, comprising measuring the periostin protein concentration in tears in the method for analyzing collected tears.
[14] The method according to [13] above, wherein the periostin protein concentration is measured by an immunoassay.
本発明によれば、被験者由来の涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度を分析することで、簡便かつ正確にアトピー性角結膜炎の診断を行う際に有用な分析値を得て、得られた分析値に基づきアトピー性角結膜炎を検出することが可能となる。 According to the present invention, by analyzing the periostin protein concentration in the tear fluid derived from a subject, an analytical value useful for diagnosing atopic keratoconjunctivitis is obtained simply and accurately, and based on the obtained analytical value It becomes possible to detect atopic keratoconjunctivitis.
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
It should be noted that all publications cited in the present specification, for example, prior art documents, publications, patent publications and other patent documents are incorporated herein by reference.
本発明は、被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパクの濃度を測定することを含む、分析方法であり、当該分析結果を指標として用い、アトピー性角結膜炎と関連付けることを特徴とするものである。より具体的には、涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度の上昇が、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われることを示す。 The present invention is an analysis method including measuring the concentration of periostin protein in tear fluid collected from a subject, and is characterized by using the analysis result as an index and associating it with atopic keratoconjunctivitis. More specifically, an increase in periostin protein concentration in tear fluid indicates that it is suspected that atopic keratoconjunctivitis has developed.
本発明者らは、アトピー性角結膜炎を、より簡便に迅速かつ低侵襲で検出できる方法を探索すべく鋭意検討を重ねた。その結果、アトピー性角結膜炎の患者由来の涙液において、ペリオスチンタンパク濃度が健常人又は他のアレルギー性結膜炎患者と比較して高いことなどを見出し、患者の涙液におけるペリオスチンタンパク濃度の分析値が、アトピー性角結膜炎が簡便に迅速かつ低侵襲で診断又は検出（以下、単に「診断」と記載する。）する際に有用であることを見出した。 The inventors of the present invention have made extensive studies to search for a method that can detect atopic keratoconjunctivitis more easily, quickly, and with less invasiveness. As a result, in tears derived from patients with atopic keratoconjunctivitis, the periostin protein concentration was found to be higher than that of healthy people or other allergic conjunctivitis patients, and the analysis value of periostin protein concentration in the patient's tear fluid was The present inventors have found that atopic keratoconjunctivitis is useful for diagnosing or detecting (hereinafter simply referred to as “diagnosis”) simply and rapidly and with minimal invasiveness.
ここで、「他のアレルギー性結膜炎」とは、アトピー性角結膜炎以外のアレルギー性結膜炎であり、具体的には、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎及び春季カタルが挙げられ、好ましくは、季節性アレルギー性結膜炎及び春季カタルである。 Here, the “other allergic conjunctivitis” is allergic conjunctivitis other than atopic keratoconjunctivitis, and specifically includes seasonal allergic conjunctivitis, perennial allergic conjunctivitis and spring catarrh, preferably Seasonal allergic conjunctivitis and spring catarrh.
本発明におけるペリオスチン（periostin）は、骨芽細胞特異因子２とも呼ばれる、約９０kDaのタンパク質である（OSF2;非特許文献３）。 Periostin in the present invention is a protein of about 90 kDa, also called osteoblast-specific factor 2 (OSF2; Non-Patent Document 3).
ペリオスチンには、alternative splicingによるC末側の長さの違いで区別できるいくつかの転写物が存在することが知られている。ここで、配列番号1に、ヒトのペリオスチン遺伝子の全てのエクソンによる転写産物のDNA配列を示す（Accession No. D13666）。また、ヒトのペリオスチンのその他のsplicing variantのDNA配列の例を、配列番号3、5に示す（それぞれ、Accession No. AY918092、AY140646）。また、配列番号2、4、6に、それぞれ、配列番号1、3、5のポリヌクレオチドによってコードされるペリオスチンのアミノ酸配列を示す。 It is known that periostin has several transcripts that can be distinguished by alternative splicing length differences on the C-terminal side. Here, SEQ ID NO: 1 shows the DNA sequence of transcripts of all exons of the human periostin gene (Accession No. D13666). Examples of DNA sequences of other splicing variants of human periostin are shown in SEQ ID NOs: 3 and 5 (Accession Nos. AY918092 and AY140646, respectively). SEQ ID NOs: 2, 4, and 6 show the amino acid sequences of periostin encoded by the polynucleotides of SEQ ID NOs: 1, 3, and 5, respectively.
本発明の好ましい態様では、配列番号2で表されるアミノ酸配列又はその配列から派生するvariant（例えば、配列番号2、4又は6で表されるアミノ酸配列からなるペリオスチン）を含むペリオスチンが分析の対象として用いられる。 In a preferred embodiment of the present invention, periostin including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a variant derived from the sequence (for example, periostin comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, or 6) is analyzed. Used as
従来、ペリオスチン遺伝子の発現レベルを指標としてアレルギー性疾患を検出できることが知られている（特許文献２及び非特許文献４）。また、ペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定を指標として特発性間質性肺炎(特許文献３及び非特許文献５)、アトピー性皮膚炎（特許文献１、非特許文献１及び非特許文献２）、薬剤性間質性肺炎などの非特発性間質性肺炎（特許文献４及び非特許文献６）、慢性副鼻腔炎（特許文献５及び非特許文献７）、増殖糖尿病網膜症（特許文献６及び非特許文献８）、胆管細胞癌（特許文献７及び非特許文献９）などを検出できることが知られている。 Conventionally, it is known that allergic diseases can be detected using the expression level of the periostin gene as an index (Patent Document 2 and Non-Patent Document 4). In addition, idiopathic interstitial pneumonia (Patent Document 3 and Non-Patent Document 5), atopic dermatitis (Patent Document 1, Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2), drugs, using the measurement of the expression level of periostin gene as an index Non-idiopathic interstitial pneumonia such as interstitial pneumonia (patent document 4 and non-patent document 6), chronic sinusitis (patent document 5 and non-patent document 7), proliferative diabetic retinopathy (patent document 6 and non-patent document 6) It is known that Patent Document 8), cholangiocellular carcinoma (Patent Document 7 and Non-Patent Document 9), and the like can be detected.
しかしながら、アトピー性角結膜炎の患者において涙液のペリオスチンタンパク質濃度が有意に上昇すること、及び、アトピー性角結膜炎の患者と他のアレルギー性結膜炎の患者においては涙液のペリオスチンタンパク質濃度に有意な差が生じることは、従来明らかにされていなかった。 However, there is a significant increase in tear periostin protein concentration in patients with atopic keratoconjunctivitis, and a significant difference in tear periostin protein concentration between patients with atopic keratoconjunctivitis and patients with other allergic conjunctivitis. It has not been clarified in the past that this occurs.
本発明において、アトピー性角結膜炎の診断に有用に活用される分析値は、直接的には、被験者由来の生体試料の内で涙液であり、涙液に含まれるペリオスチンタンパク質の含有量を測定することによりアトピー性角結膜炎の診断に有用な分析値を得ることが可能となる。 In the present invention, the analytical value that is usefully used for the diagnosis of atopic keratoconjunctivitis is directly tear fluid in a biological sample derived from a subject, and the content of periostin protein contained in tear fluid is measured. By doing so, it becomes possible to obtain an analytical value useful for diagnosis of atopic keratoconjunctivitis.
涙液の採取、調製及び保存は公知の方法を適宜用いて行うことができる。例えば、後記の実施例では、涙液は、グラスキャピラリ（リングキャップス；吸引容量10μL）を用いて被験者の目じり側より無刺激の状態で採取した。グラスキャピラリに吸引された涙液は0.6mL マイクロチューブに回収し、これを何度か繰り返した。その後、涙液中に存在する細胞や異物を除去する目的で速やかに遠心分離を行い、上清のみを新しいマイクロチューブに回収した。涙液は少量ずつ小分けし、測定等に使用するまで超低温冷凍庫（マイナス80度）で保存した（Fujishima H, Takeyama M, Takeuchi T, Saito I, Tsubota K. Elevated levels of substance P in tears of patients with allergic conjunctivitis and vernal keratoconjunctivitis. Clin Exp Allergy 27: 372-378,1997）。 Collection, preparation, and storage of tears can be performed using known methods as appropriate. For example, in the examples described later, tears were collected unstimulated from the eyes of the subject using a glass capillary (ring caps; suction volume 10 μL). The tears sucked into the glass capillary were collected in a 0.6 mL microtube, and this was repeated several times. Thereafter, centrifugation was quickly performed for the purpose of removing cells and foreign substances present in the tear fluid, and only the supernatant was collected in a new microtube. Tear fluid was subdivided into small portions and stored in an ultra-low temperature freezer (minus 80 degrees) until use for measurement etc. (Fujishima H, Takeyama M, Takeuchi T, Saito I, Tsubota K. Elevated levels of substance P in tears of patients with allergic conjunctivitis and vernal keratoconjunctivitis. Clin Exp Allergy 27: 372-378, 1997).
ここで、「被験者より採取した涙液」には、涙液自体又はそれに由来する被測定物が含まれる。 Here, “tear fluid collected from a subject” includes tear fluid itself or a measurement object derived therefrom.
涙液自体又はそれに由来する被測定物中のペリオスチンタンパク質の量の具体的な測定は、適宜の方法で行うことが可能であり、例えば、免疫測定法などにより行うことができる。免疫測定法としては、放射免疫測定法（RIA）、免疫蛍光測定法（FIA）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay(EIA)、Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)）などが挙げられる。好ましくは、ELISAで行う。 The specific measurement of the amount of periostin protein in the tear itself or a measurement object derived therefrom can be performed by an appropriate method, for example, by an immunoassay method or the like. Immunoassays include radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence assay (FIA), immunoluminescence assay, enzyme immunoassay (eg, Enzyme Immunoassay (EIA), Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA)), etc. Is mentioned. Preferably, it is performed by ELISA.
RIAで標識に用いる放射性物質としては、例えば、125I、131I、14C、3H、35S、又は32Pを利用することができる。 As a radioactive substance used for labeling by RIA, for example, 125 I, 131 I, 14 C, 3 H, 35 S, or 32 P can be used.
FIAで標識に用いる蛍光物質としては、例えば、Eu（ユーロピウム）、FITC、TMRITC、Cy3、PE、又はTexas−Redなどの蛍光物質を利用することができる。 As a fluorescent substance used for labeling by FIA, for example, a fluorescent substance such as Eu (europium), FITC, TMRITC, Cy3, PE, or Texas-Red can be used.
免疫発光測定法で標識に用いる発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等を用いることができる。 As the luminescent substance used for labeling in the immunoluminescence measurement method, for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like can be used.
酵素免疫測定法で標識に用いる酵素としては、例えば西洋わさびペルオキシターゼ（HRP）、アルカリホファターゼ（ALP）、グルコースオキシターゼ（GO）等を用いることができる。 Examples of enzymes used for labeling in enzyme immunoassay include horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (ALP), glucose oxidase (GO), and the like.
さらに、抗体又は抗原と、これらの標識物質との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。 Furthermore, a biotin-avidin system can also be used for the binding of an antibody or antigen and these labeling substances.
いずれの方法による場合であっても、涙液におけるペリオスチンタンパク質の分析値、すなわちペリオスチンのタンパク質濃度を指標として用い、アトピー性角結膜炎と関連付けるのが好ましい。そして涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度が、所定タンパク質濃度以上となる場合、あるいはアトピー性角結膜炎を発症していない被験者のものに対して高い値を示す場合には、当該涙液が、アトピー性角結膜炎を発症していることが疑われる被験者由来のものであることの有力な根拠として扱うようにしてよい。 Regardless of which method is used, it is preferable to use the analysis value of periostin protein in tears, that is, the protein concentration of periostin as an index, and associate with atopic keratoconjunctivitis. When the periostin protein concentration in the tear fluid is equal to or higher than the predetermined protein concentration, or when the tear fluid shows a high value for a subject who has not developed atopic keratoconjunctivitis, the tear fluid is atopic keratoconjunctivitis. May be treated as a strong ground for being derived from a subject suspected of developing the disease.
涙液がアトピー性角結膜炎を発症していると疑われる被験者由来のものであると判断するための基準となる「所定タンパク質濃度」は、例えば、次のように求めることができ、アトピー性角結膜炎の発症が疑われる患者の涙液におけるペリオスチンタンパク質の量が当該「所定タンパク質濃度」以上となる場合にはアトピー性角結膜炎を発症していると疑われる被験者由来の生体試料であると判断することができる。 The “predetermined protein concentration” that serves as a reference for determining that the tear fluid is derived from a subject suspected of developing atopic keratoconjunctivitis can be obtained, for example, as follows: If the amount of periostin protein in the tear fluid of a patient suspected of developing conjunctivitis is greater than or equal to the “predetermined protein concentration”, it is determined that the sample is a biological sample derived from a subject suspected of developing atopic keratoconjunctivitis be able to.
上記「所定タンパク質濃度」を求めるためには、先ず、従来知られる他の診断手法により、アトピー性角結膜炎を発症していると判断される複数の被験者と、アトピー性角結膜炎を発症していないと判断される複数の被験者について、それぞれに由来する涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度を測定し、測定された各ペリオスチンタンパク質濃度を統計処理することにより「所定タンパク質濃度」を求めることが好ましい。このとき、測定の対象となる被験者の例数はそれぞれ2例以上が必要であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、又は100例以上であって、大きな例数を用いることでより信頼できる「所定タンパク質濃度」を求めることができる。 In order to obtain the above-mentioned “predetermined protein concentration”, first, a plurality of subjects determined to have developed atopic keratoconjunctivitis by other diagnostic methods known in the art, and have not developed atopic keratoconjunctivitis It is preferable to determine the “predetermined protein concentration” by measuring the periostin protein concentration in the tear fluid derived from each of a plurality of subjects determined to be and statistically processing each measured periostin protein concentration. At this time, the number of subjects to be measured must be 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more, and use a large number of cases. Thus, a more reliable “predetermined protein concentration” can be obtained.
統計処理としては、例えば、Receiver−Operating−Characteristics（ROC）曲線を用いた解析等が挙げられる。 Examples of the statistical processing include analysis using a Receiver-Operating-Characteristics (ROC) curve.
ここで、ROC曲線から、「所定タンパク質濃度」としての至適閾値（cut−off値）を求める方法としては、Youden index（感度 + 特異度 −1）を用いる方法が一般的である（Akobeng, AK. et al. Acta Paediatrica 96:644-647, 2007）。この方法では、Youden index（感度 + 特異度 −1）が最大となりうる点が感度及び特異度ともにバランスのとれた値を示す点であることから、この診断成績を示す値をcut-off値とし、「所定タンパク質濃度」として採用することが好ましい。 Here, as a method for obtaining an optimum threshold (cut-off value) as a “predetermined protein concentration” from the ROC curve, a method using Youden index (sensitivity + specificity−1) is generally used (Akobeng, AK. Et al. Acta Paediatrica 96: 644-647, 2007). In this method, the point where the Youden index (sensitivity + specificity -1) can be maximized is a point that shows a balanced value for both sensitivity and specificity. The “predetermined protein concentration” is preferably employed.
なお、従来知られる他の診断手法によりアトピー性角結膜炎を発症していないと判断される被験者においても、例えば、他のアレルギー疾患などで涙液中のペリオスチンタンパク質の濃度が上昇する可能性があることから、上記の統計処理において、特にアトピー性角結膜炎を発症していない群について、特異なペリオスチンタンパク質濃度を示す例は統計処理から除外することが望ましい。 In addition, even in a subject who is determined not to develop atopic keratoconjunctivitis by other conventionally known diagnostic methods, the concentration of periostin protein in tears may increase due to other allergic diseases, for example. Therefore, in the above statistical processing, it is desirable to exclude an example showing a specific periostin protein concentration from the statistical processing, particularly for a group that does not develop atopic keratoconjunctivitis.
本発明において、アトピー性角結膜炎の発症を疑う基準となるペリオスチンタンパク質の「所定タンパク質濃度」について、本発明者の検討によれば、涙液における濃度として、例えば60 ng/mL、65 ng/mL、70 ng/mL、75 ng/mL、80 ng/mL、81 ng/mL、82 ng/mL、83 ng/mL、84 ng/mL、85 ng/mL、86 ng/mL、87 ng/mL、88 ng/mL、89 ng/mL、90 ng/mL、91 ng/mL、92 ng/mL、93 ng/mL、94 ng/mL、95 ng/mL、96 ng/mL、97 ng/mL、98 ng/mL、99 ng/mL、100 ng/mL、105 ng/mL、110 ng/mL、115 ng/mL、120 ng/mL、125 ng/mL、130 ng/mL、135 ng/mL、140 ng/mL、145 ng/mL、150 ng/mL、160 ng/mL、170 ng/mL、 180 ng/mL、190 ng/mL、200ng/mL、250 ng/mL、300ng/mL、350 ng/mL、400ng/mL、450 ng/mL、500ng/mL、600ng/mL、700ng/mL、800ng/mL、900ng/mL、1000ng/mL、1100ng/mL、1200ng/mL、1300ng/mL、1400ng/mL、1500ng/mL、1600ng/mL、1700ng/mL、1800ng/mL、1900ng/mL又は2000ng/mLであり、好ましくは、87 ng/mL、88 ng/mL、89 ng/mL、90 ng/mL、91 ng/mL、92 ng/mL、93 ng/mL、94 ng/mL、95 ng/mL、96 ng/mL、97 ng/mL、98 ng/mL、99 ng/mL、100 ng/mL、105 ng/mL、110 ng/mL、115 ng/mL、120 ng/mL、125 ng/mL、130 ng/mL、135 ng/mL、140 ng/mL、145 ng/mL、150 ng/mL、160 ng/mL、170 ng/mL、 180 ng/mL、190 ng/mL、200ng/mL、250 ng/mL、300ng/mL、350 ng/mL、400ng/mL、450 ng/mL、500ng/mL、600ng/mL、700ng/mL、800ng/mL、900ng/mL、1000ng/mL、1100ng/mL、1200ng/mL、1300ng/mL、1400ng/mL、1500ng/mL、1600ng/mL、1700ng/mL、1800ng/mL、1900ng/mL又は2000ng/mLであり、典型的には、87ng/ml、好ましくは、400ng/mLが挙げられる。診断を受ける患者の涙液中のペリオスチンタンパク質濃度が、上記「所定タンパク質濃度」以上であるときには、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われると判断できる。 In the present invention, the `` predetermined protein concentration '' of the periostin protein, which is a criterion for suspected the onset of atopic keratoconjunctivitis, according to the study of the present inventors, as the concentration in tears, for example, 60 ng / mL, 65 ng / mL 70 ng / mL, 75 ng / mL, 80 ng / mL, 81 ng / mL, 82 ng / mL, 83 ng / mL, 84 ng / mL, 85 ng / mL, 86 ng / mL, 87 ng / mL 88 ng / mL, 89 ng / mL, 90 ng / mL, 91 ng / mL, 92 ng / mL, 93 ng / mL, 94 ng / mL, 95 ng / mL, 96 ng / mL, 97 ng / mL 98 ng / mL, 99 ng / mL, 100 ng / mL, 105 ng / mL, 110 ng / mL, 115 ng / mL, 120 ng / mL, 125 ng / mL, 130 ng / mL, 135 ng / mL 140 ng / mL, 145 ng / mL, 150 ng / mL, 160 ng / mL, 170 ng / mL, 180 ng / mL, 190 ng / mL, 200 ng / mL, 250 ng / mL, 300 ng / mL, 350 ng / mL, 400 ng / mL, 450 ng / mL, 500 ng / mL, 600 ng / mL, 700 ng / mL, 800 ng / mL, 900 ng / mL, 1000 ng / mL, 1100 ng / mL, 1200 ng / mL, 1300 ng / mL, 1400 ng / mL, 1500 ng / mL, 1600 ng / mL, 1700 ng / mL, 1800 ng / mL, 1900 ng / mL or 2000 ng / mL, preferably 87 ng / mL, 88 ng / mL 89 ng / mL, 90 ng / mL, 91 ng / mL, 92 ng / mL, 93 ng / mL, 94 ng / mL, 95 ng / mL, 96 ng / mL, 97 ng / mL, 98 ng / mL, 99 ng / mL, 100 ng / mL, 105 ng / mL, 110 ng / mL, 115 ng / mL, 120 ng / mL, 125 ng / mL, 130 ng / mL, 135 ng / mL, 140 ng / mL, 145 ng / mL, 150 ng / mL, 160 ng / mL, 170 ng / mL, 180 ng / mL, 190 ng / mL, 200 ng / mL, 250 ng / mL, 300 ng / mL, 350 ng / mL, 400 ng / mL, 450 ng / mL, 500 ng / mL, 600 ng / mL, 700 ng / mL, 800 ng / mL, 900 ng / mL, 1000 ng / mL, 1100 ng / mL, 1200 ng / mL, 1300 ng / mL, 1400 ng / mL, 1500 ng / mL 1600 ng / mL, 1700 ng / mL, 1800 ng / mL, 1900 ng / mL or 2000 ng / mL, typically 87 ng / ml, preferably 400 ng / mL. When the periostin protein concentration in the tear fluid of a patient undergoing diagnosis is equal to or higher than the “predetermined protein concentration”, it can be determined that atopic keratoconjunctivitis is suspected.
なお、上述した涙液における「所定タンパク質濃度」は例示であり、本発明が実施される際に各実施者により予め上記した手法によって適切な「所定タンパク質濃度」が求められることが望ましいことはいうまでもない。 Note that the above-mentioned “predetermined protein concentration” in tears is an example, and it is desirable that an appropriate “predetermined protein concentration” is obtained in advance by the above-described technique by each practitioner when the present invention is implemented. Not too long.
また、涙液が、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われる被験者由来のものであると判断するための基準を提供する手法として、以下のような手法を採用することもできる。 In addition, as a technique for providing a reference for determining that the tear is derived from a subject suspected of developing atopic keratoconjunctivitis, the following technique may be employed.
すなわち、(i)被験者から採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度と、(ii)正常試料におけるペリオスチンタンパク質濃度との比較を行う。 That is, (i) the periostin protein concentration in tears collected from a subject is compared with (ii) the periostin protein concentration in a normal sample.
「正常試料」（あるいは、「対照試料」ともいう）は、アトピー性角結膜炎を発症していないと判断される被験者から採取した涙液である。アトピー性角結膜炎を発症していないと判断される被験者としては、健常人の他、アトピー性角結膜炎以外の疾患（例、他のアレルギー性結膜炎、好ましくは、春季カタル又は季節性アレルギー性結膜炎）を発症している者でもよい。本発明のいくつかの態様では、正常試料は、健常人から採取した涙液である。本発明の別のいくつかの態様では、正常試料は、他のアレルギー性結膜炎、好ましくは、春季カタル及び季節性アレルギー性結膜炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患に罹患している患者から採取した涙液である。「正常試料におけるペリオスチンタンパク質濃度」として、例えば、アトピー性角結膜炎を発症していないと判断される複数の被験者に由来する涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度を測定してペリオスチンタンパク質濃度の平均値を求め、そのアトピー性角結膜炎を発症していない被験者における平均値を採用してもよい。平均値を求める際においては、測定の対象となる被験者の例数は2例以上が必要であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、又は100例以上であって、大きな例数を用いることでより信頼できる平均値を求めることができる。 A “normal sample” (also referred to as “control sample”) is tear fluid collected from a subject who is determined not to develop atopic keratoconjunctivitis. Subjects who are judged not to develop atopic keratoconjunctivitis include healthy individuals and diseases other than atopic keratoconjunctivitis (eg, other allergic conjunctivitis, preferably spring catarrh or seasonal allergic conjunctivitis) It may be a person who develops. In some embodiments of the invention, the normal sample is tear fluid collected from a healthy person. In some other aspects of the invention, the normal sample is from a patient suffering from at least one disease selected from the group consisting of other allergic conjunctivitis, preferably spring catarrh and seasonal allergic conjunctivitis. It is the collected tears. As `` periostin protein concentration in a normal sample '', for example, by measuring the periostin protein concentration in tears derived from a plurality of subjects determined not to develop atopic keratoconjunctivitis, find the average value of periostin protein concentration, You may employ | adopt the average value in the test subject who does not develop the atopic keratoconjunctivitis. When determining the average value, the number of subjects to be measured needs to be 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more, large examples A more reliable average value can be obtained by using the number.
そして、(i)被験者から採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度が、(ii)正常試料におけるペリオスチンタンパク質濃度よりも高いときに、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われると判断することができる。 And, when (i) the periostin protein concentration in tears collected from the subject is higher than (ii) the periostin protein concentration in normal samples, it can be determined that atopic keratoconjunctivitis is suspected. .
この場合において、より好ましくは、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われると判断するための基準を提供する手法として、以下のような手法を採用する。先ず、従来知られる他の診断手法により、アトピー性角結膜炎を発症していると判断される複数の被験者と、アトピー性角結膜炎を発症していないと判断される複数の被験者について、それぞれに由来する涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度を測定し、それぞれの被験者群毎に測定されたペリオスチンタンパク質濃度の平均値を求める。そして、アトピー性角結膜炎を発症している被験者における平均値をA、アトピー性角結膜炎を発症していない被験者における平均値をBとしたとき、C＝［（A−B）／B］x 100（％）を求める。ここで求められるC値は、アトピー性角結膜炎を発症していないと判断される被験者由来の涙液に対してアトピー性角結膜炎の患者由来の涙液において増加するペリオスチンタンパク質濃度の平均値であり、この値を基準としてアトピー性角結膜炎の発症の有無を判断することができる。 In this case, more preferably, the following method is adopted as a method for providing a reference for determining that it is suspected that atopic keratoconjunctivitis has been developed. First, for each of a plurality of subjects determined to develop atopic keratoconjunctivitis and a plurality of subjects determined not to develop atopic keratoconjunctivitis by other conventionally known diagnostic methods The periostin protein concentration in the tear fluid to be measured is measured, and the average value of the periostin protein concentration measured for each subject group is obtained. When the average value in subjects who have developed atopic keratoconjunctivitis is A and the average value in subjects who have not developed atopic keratoconjunctivitis is B, C = [(A−B) / B] × 100 (%) Is calculated. The C value obtained here is the average value of the periostin protein concentration that increases in tears from patients with atopic keratoconjunctivitis versus tears from subjects who are judged not to develop atopic keratoconjunctivitis Based on this value, the presence or absence of onset of atopic keratoconjunctivitis can be determined.
つまり、アトピー性角結膜炎の発症が疑われる患者に由来する涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度を測定し、その測定値がB x （C／100＋１）で求められる値Dを上回る場合には、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われると判断できる。 In other words, if the periostin protein concentration is measured in tears derived from a patient suspected of developing atopic keratoconjunctivitis, and the measured value exceeds the value D required by B x (C / 100 + 1), then the atopic angle It can be judged that conjunctivitis is developed.
上記A及びB値を求める際においては、測定の対象となる被験者の例数はそれぞれ2例以上が必要であり、例えば、5例以上、10例以上、50例以上、又は100例以上であって、大きな例数を用いることでより信頼できるA及びB値を求めることができる。A及びB値の信頼性が増すことにより、A及びB値に基づいて求められる、C及びD値の信頼性も増す。 When determining the A and B values, the number of subjects to be measured must be 2 or more, for example, 5 or more, 10 or more, 50 or more, or 100 or more. By using a large number of examples, more reliable A and B values can be obtained. As the reliability of the A and B values increases, the reliability of the C and D values obtained based on the A and B values also increases.
本発明に係る分析値結果は、上記例示したような判断手法により、アトピー性角結膜炎を発症していることが疑われる被験者由来の涙液を、アトピー性角結膜炎を発症していないと判断される被験者由来の涙液（例、他のアレルギー性結膜炎患者由来の涙液、健常人由来の涙液など）から鑑別する際に有用であって、簡便に迅速かつ低侵襲でアトピー性角結膜炎を検出することを可能とする。 The analysis result according to the present invention is determined by the determination method as exemplified above for tears derived from a subject suspected of developing atopic keratoconjunctivitis, not having developed atopic keratoconjunctivitis. It is useful when differentiating from tears derived from subjects (eg, tears from other allergic conjunctivitis patients, tears from healthy individuals, etc.) It is possible to detect.
本発明による分析結果は、例えばアトピー性角結膜炎の確定診断を行う場合の補助とすることができる。アトピー性角結膜炎の確定診断を行う場合には、上記分析結果に加えて、理学所見の結果、画像的検査、組織学的検査、生化学的検査、微生物学的検査などからなる群から選択される少なくとも1つと組み合わせて、総合的に判断するようにしてもよい。 The analysis result according to the present invention can be used as an aid when performing a definitive diagnosis of atopic keratoconjunctivitis, for example. When a definitive diagnosis of atopic keratoconjunctivitis is made, it is selected from the group consisting of the results of physical findings, imaging examination, histological examination, biochemical examination, microbiological examination, etc. in addition to the above analysis results. In combination with at least one of the above, a comprehensive judgment may be made.
ここで、前述のように、ペリオスチンを指標として、アレルギー性疾患、特発性間質性肺炎、アトピー性皮膚炎、薬剤性間質性肺炎などの非特発性間質性肺炎、慢性副鼻腔炎、増殖糖尿病網膜症、胆管細胞癌などを検出できることが知られている。しかしながら、上記分析結果に加えて、理学所見の結果、画像的検査、組織学的検査、生化学的検査、微生物学的検査などからなる群から選択される少なくとも1つと組み合わせて、総合的に判断することで、これらの疾患から、アトピー性角結膜炎を区別することができる。 Here, as described above, using periostin as an index, allergic diseases, idiopathic interstitial pneumonia, atopic dermatitis, non-idiopathic interstitial pneumonia such as drug-induced interstitial pneumonia, chronic sinusitis, It is known that proliferative diabetic retinopathy and cholangiocellular carcinoma can be detected. However, in addition to the above analysis results, a comprehensive judgment is made in combination with at least one selected from the group consisting of the results of physical findings, image examination, histological examination, biochemical examination, microbiological examination, etc. Thus, atopic keratoconjunctivitis can be distinguished from these diseases.
また、アトピー性角結膜炎の患者の涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度が、炎症の沈静化により減少し、重症化により増加することを利用して、本発明に係る分析方法は、各患者におけるアトピー性角結膜炎の程度とその変化を把握する方法としても用いることができる。つまり、本発明に係る分析方法により、又は、他の診断方法により、アトピー性角結膜炎を発症していると疑われると判断された患者の生体試料について、継続的に本発明に係る分析方法を適用することにより、当該患者におけるアトピー性角結膜炎の程度の変化を検出して経過を明らかにすることにより、当該患者になされる各種治療方法の妥当性等を知る手段として用いることができる。
具体的には、本発明は、アトピー性角結膜炎の治療を受けている被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度を測定することを含む、治療の有効性を確認する方法を提供する。より具体的には、涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度の減少が、アトピー性角結膜炎の治療が有効であることを示す。
Further, by utilizing the fact that the periostin protein concentration in the tear fluid of patients with atopic keratoconjunctivitis decreases due to the sedation of inflammation and increases due to the severity, the analysis method according to the present invention provides an atopic angle in each patient. It can also be used as a method for grasping the degree of conjunctivitis and its change. That is, the analysis method according to the present invention is continuously applied to a biological sample of a patient that is determined to be suspected of developing atopic keratoconjunctivitis by the analysis method according to the present invention or by another diagnostic method. By applying it, it is possible to use it as a means of knowing the appropriateness of various treatment methods applied to the patient by detecting the change in the degree of atopic keratoconjunctivitis in the patient and clarifying the course.
Specifically, the present invention provides a method for confirming the effectiveness of treatment, comprising measuring the periostin protein concentration in tears collected from a subject undergoing treatment for atopic keratoconjunctivitis. More specifically, a decrease in periostin protein concentration in tears indicates that treatment of atopic keratoconjunctivitis is effective.
この場合、（i）治療を受けている被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度と、（ii）当該被験者より採取した治療前の涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度との比較を行う。測定の対象となる被験者の例数は、前述と同様である。 In this case, (i) the periostin protein concentration in the tear fluid collected from the subject undergoing treatment is compared with (ii) the periostin protein concentration in the tear fluid before treatment collected from the subject. The number of subjects to be measured is the same as described above.
そして、（i）治療を受けている被験者より採取した涙液におけるペリオスチンタンパク質濃度が（ii）当該被験者より採取した治療前の涙液におけるペリオスチンタンパク質濃よりも低いときに、治療が有効であると判断することができる。この場合において、治療が有効であると判断する手法は、例えば、前述の「アトピー性角結膜炎を発症していると疑われると判断するための基準を提供する手法」と同様の手法により行うことができる。 And (i) the treatment is effective when the periostin protein concentration in the tears collected from the subject undergoing treatment is lower than (ii) the periostin protein concentration in the tears before treatment collected from the subject. Judgment can be made. In this case, for example, the method for determining that the treatment is effective should be performed by the same method as the above-described “method for providing a criterion for determining that atopic keratoconjunctivitis is suspected to have occurred”. Can do.
また、本発明は、更にペリオスチンを認識する抗体を含む、アトピー性角結膜炎の診断薬を包含する。当該診断薬は、涙液中のペリオスチンタンパク質濃度を測定してアトピー性角結膜炎を検出するために用いられる。当該発明において使用されるペリオスチンを認識する抗体としては、当業者に周知のものであってもよく、例えば、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Milstein C, et al., 1983, Nature 305(5934): 537-40）等が挙げられる。例えば、ペリオスチンに対するポリクローナル抗体は、抗原（ペリオスチン又はその部分ペプチド）を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により分離して得られる血清中に含まれるものをそのまま使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して用いることもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させて得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。 The present invention further includes a diagnostic agent for atopic keratoconjunctivitis, which further comprises an antibody that recognizes periostin. The diagnostic agent is used for measuring periostin protein concentration in tear fluid to detect atopic keratoconjunctivitis. The antibody recognizing periostin used in the present invention may be one well known to those skilled in the art. For example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody (Milstein C, et al., 1983, Nature 305 (5934): 537-40). For example, a polyclonal antibody against periostin should be used as it is in serum obtained by taking out blood of a mammal sensitized with an antigen (periostin or a partial peptide thereof) and separating it from this blood by a known method. Can do. Alternatively, if necessary, a fraction containing a polyclonal antibody can be further isolated from this serum and used. In order to obtain a monoclonal antibody, a hybridoma obtained by removing immune cells from a mammal sensitized with the above antigen and fusing the cells with myeloma cells, etc. is cloned, and the antibody is recovered from the culture and monoclonal antibody is recovered. It can be an antibody.
本発明に係るペリオスチンを認識する抗体を含むアトピー性角結膜炎の診断薬は、容器およびラベルを含むことによりペリオスチンを認識する抗体を含むアトピー性角結膜炎の診断キットとされてもよい。当該キットは、涙液中のペリオスチンタンパク質濃度を測定してアトピー性角結膜炎を検出するために用いられる。当該容器上の又は容器に伴うラベルには、キットがアトピー性角結膜炎の検出又は診断に使用されることが示されていてもよい。また、他のアイテム、例えば、使用説明書等がさらに含まれていてもよい。 The diagnostic agent for atopic keratoconjunctivitis containing an antibody recognizing periostin according to the present invention may be a diagnostic kit for atopic keratoconjunctivitis containing an antibody recognizing periostin by including a container and a label. The kit is used to detect atopic keratoconjunctivitis by measuring the periostin protein concentration in tear fluid. The label on or associated with the container may indicate that the kit is used for detection or diagnosis of atopic keratoconjunctivitis. In addition, other items such as instructions for use may be further included.
上記本発明に係るアトピー性角結膜炎の診断薬、及びアトピー性角結膜炎の診断キットは、涙液中のペリオスチンタンパク質濃度を測定してアトピー性角結膜炎を検出するために用いられ、例えば、上記したような本発明に係るアトピー性角結膜炎の検出又は診断方法に用いることができる。
また、上記本発明に係るアトピー性角結膜炎の診断薬、及びアトピー性角結膜炎の診断キットは、上記したようなアトピー性角結膜炎の患者の経過を観察する際にも使用できることはいうまでもない。
The diagnostic agent for atopic keratoconjunctivitis according to the present invention and the diagnostic kit for atopic keratoconjunctivitis are used for detecting atopic keratoconjunctivitis by measuring the periostin protein concentration in tear fluid, for example, as described above. Such a method for detecting or diagnosing atopic keratoconjunctivitis according to the present invention can be used.
In addition, it goes without saying that the diagnostic agent for atopic keratoconjunctivitis and the diagnostic kit for atopic keratoconjunctivitis according to the present invention can be used when observing the course of a patient with atopic keratoconjunctivitis as described above. .
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
実施例１:
事前にインフォームド・コンセントを得た被験者より採取した涙液におけるペリオスチン濃度の分析は、抗ペリオスチン抗体を用いるELISA法により以下のように行った。
Example 1:
The analysis of periostin concentration in tears collected from subjects who obtained informed consent in advance was performed by ELISA using an anti-periostin antibody as follows.
涙液中に存在する細胞や異物を除去する目的で速やかに遠心分離を行い、上清のみを新しいマイクロチューブに回収し、その後−80度（摂氏）で保存した。サンプルが集まったところで、ELISA法にて測定した。 Centrifugation was quickly performed for the purpose of removing cells and foreign substances present in the tears, and only the supernatant was collected in a new microtube and then stored at −80 degrees (Celsius). When samples were collected, they were measured by ELISA.
その際、涙液ペリオスチン濃度が10 ng/ml以上の場合と10 ng/ml未満の場合に分けて分析を行った。ここで、涙液ペリオスチン濃度が10 ng/ml以上の場合と10 ng/ml未満の場合とは、次のようにして分けた。まず、下記「涙液ペリオスチン濃度が10 ng/ml以上の場合」の方法を用いて涙液ペリオスチン濃度測定を行い、涙液ペリオスチン濃度が10 ng/ml未満の場合は、さらに高感度で測定できる、下記「涙液ペリオスチン濃度が10 ng/ml未満の場合（高感度法）」の方法を用いて、より正確に涙液ペリオスチン濃度を測定した。 At that time, the analysis was performed separately for cases where the tear periostin concentration was 10 ng / ml or more and less than 10 ng / ml. Here, the case where the tear periostin concentration was 10 ng / ml or more and the case where it was less than 10 ng / ml were divided as follows. First, the tear periostin concentration is measured using the method of “when the tear periostin concentration is 10 ng / ml or more” below. If the tear periostin concentration is less than 10 ng / ml, it can be measured with higher sensitivity. The tear periostin concentration was measured more accurately by using the method described below “when the tear periostin concentration is less than 10 ng / ml (high sensitivity method)”.
涙液ペリオスチン濃度が10 ng/ml以上の場合：
ELISA用96穴プレートのウェルに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS) [137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1.47 mM リン酸二水素カリウム及び8.04 mM リン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液(pH 7.4)]で2 μg/mlに希釈したSS18A（ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体）を100 μl注入し、25°Cで12時間以上静置して、SS18Aをウェル底に吸着させた。ウェルを洗浄液[0.05% Tween-20を含有するPBS]で3回洗浄した後、ブロッキング液[0.5% カゼイン、100 mM 塩化ナトリウム及び0.1% アジ化ナトリウムを含有する50 mM Tris緩衝液（pH8.0）]を250 μl注入し、4°Cで12時間以上静置した。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、ブロッキング液と同一組成の検体希釈溶液で201倍に希釈した涙液を100 μl注入し、25°Cで12時間以上静置して、涙液中のペリオスチンをウェルに吸着しているSS18Aに捕捉させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、ブロッキング液と同一組成の緩衝液で50 ng/mlに希釈したPODで標識されたSS17B（ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体）を100 μl注入し、25°Cで90分静置して、SS18Aに捕捉されたペリオスチンにPOD標識SS17Bを結合させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、HRPの基質液[0.8 mM TMBZ、2.5 mM 過酸化水素、30 mM リン酸水素二ナトリウム及び 20 mM クエン酸緩衝液]を100 μl注入し、25°Cで10分間反応させた後、0.7N 硫酸により反応を停止させた。その後、吸光度計を用いて450 nmの吸光度を測定した。また、精製ペリオスチンタンパク質の希釈系列を同様に測定して、このELISA法におけるペリオスチン濃度−吸光度標準曲線を作成した。涙液を測定した吸光度を、作成した標準曲線に当てはめ、涙液中のペリオスチン濃度を算出した。
If the tear periostin concentration is 10 ng / ml or more:
The wells of a 96-well plate for ELISA were mixed with phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate (pH 7.4)] was injected with 100 μl of SS18A (rat monoclonal anti-periostin antibody) diluted to 2 μg / ml, and allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours or longer to adsorb SS18A to the well bottom. The wells were washed three times with a washing solution [PBS containing 0.05% Tween-20], and then a blocking solution [50 mM Tris buffer (pH 8.0 containing 0.5% casein, 100 mM sodium chloride and 0.1% sodium azide). )] Was injected and left at 4 ° C for 12 hours or longer. After washing the wells with the washing solution 5 times, inject 100 μl of tear fluid diluted 201-fold with the sample dilution solution with the same composition as the blocking solution, and let stand at 25 ° C for 12 hours or more, and periostin in tear fluid Was captured by SS18A adsorbed in the wells. The wells were washed 5 times with a washing solution, and then 100 μl of POD-labeled SS17B (rat monoclonal anti-periostin antibody) diluted to 50 ng / ml with a buffer solution having the same composition as the blocking solution was injected, and 90 ° C. at 90 ° C. After standing still, POD-labeled SS17B was bound to periostin captured by SS18A. After washing the wells with the washing solution 5 times, inject 100 μl of HRP substrate solution [0.8 mM TMBZ, 2.5 mM hydrogen peroxide, 30 mM disodium hydrogen phosphate and 20 mM citrate buffer] at 25 ° C. After reacting for 10 minutes, the reaction was stopped with 0.7N sulfuric acid. Thereafter, the absorbance at 450 nm was measured using an absorptiometer. Further, a dilution series of purified periostin protein was measured in the same manner, and a periostin concentration-absorbance standard curve in this ELISA method was prepared. The absorbance obtained by measuring tear fluid was applied to the prepared standard curve, and the periostin concentration in the tear fluid was calculated.
涙液ペリオスチン濃度が10 ng/ml未満の場合（高感度法）：
ELISA用96穴プレートのウェルに、リン酸緩衝生理食塩水(PBS) [137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1.47 mM リン酸二水素カリウム及び8.04 mM リン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液(pH 7.4)]で2 μg/mlに希釈したSS18A（ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体）を100 μl注入し、25°Cで12時間以上静置して、SS18Aをウェル底に吸着させた。ウェルを洗浄液[0.05% Tween-20を含有するPBS]で3回洗浄した後、ブロッキング液[0.5% カゼイン、100 mM 塩化ナトリウム及び0.1% アジ化ナトリウムを含有する50 mM Tris緩衝液（pH8.0）]を250 μl注入し、4°Cで12時間以上静置した。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、ブロッキング液と同一組成の検体希釈溶液で201倍に希釈した涙液を100 μl注入し、25°Cで12時間以上静置して、涙液中のペリオスチンをウェルに吸着しているSS18Aに捕捉させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、ブロッキング液と同一組成の緩衝液で50 ng/mlに希釈したビオチンで標識されたSS17B（ラットモノクローナル抗ペリオスチン抗体）を100 μl注入し、25°Cで90分静置して、SS18Aに補足されたペリオスチンにビオチン標識SS17Bを結合させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、15,000倍に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）で標識されたストレプトアビジン[streptavidin-PolyHRP40 (Stereospecific Detection Technologies社)]を100 μl注入し、25°Cで60分静置して、ビオチン標識SS17Bと結合させた。ウェルを洗浄液で5回洗浄した後、HRPの基質液[0.8 mM TMBZ、2.5 mM 過酸化水素、30 mM リン酸水素二ナトリウム及び 20 mM クエン酸緩衝液]を100 μl注入し、25°Cで10分間反応させた後、0.7 N 硫酸により反応を停止させた。その後、吸光度計を用いて450 nm（主波長）、550 nm（副波長）の吸光度を測定した。また、精製ペリオスチンタンパク質の希釈系列を同様に測定して、このELISA法におけるペリオスチン濃度−吸光度標準曲線を作成した。涙液を測定した吸光度を、作成した標準曲線に当てはめ、涙液中のペリオスチン濃度を算出した。
If the tear periostin concentration is less than 10 ng / ml (high sensitivity method):
The wells of a 96-well plate for ELISA were mixed with phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate (pH 7.4)] was injected with 100 μl of SS18A (rat monoclonal anti-periostin antibody) diluted to 2 μg / ml, and allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours or longer to adsorb SS18A to the well bottom. The wells were washed three times with a washing solution [PBS containing 0.05% Tween-20], and then a blocking solution [50 mM Tris buffer (pH 8.0 containing 0.5% casein, 100 mM sodium chloride and 0.1% sodium azide). )] Was injected and left at 4 ° C for 12 hours or longer. After washing the wells with the washing solution 5 times, inject 100 μl of tear fluid diluted 201-fold with the sample dilution solution with the same composition as the blocking solution, and let stand at 25 ° C for 12 hours or more, and periostin in tear fluid Was captured by SS18A adsorbed in the wells. The wells were washed 5 times with a washing solution, and then 100 μl of biotinylated SS17B (rat monoclonal anti-periostin antibody) diluted to 50 ng / ml with a buffer of the same composition as the blocking solution was injected, and 90 ° C at 25 ° C was injected. After standing still, biotin-labeled SS17B was bound to periostin supplemented with SS18A. The wells were washed 5 times with a washing solution, and then 100 μl of 15,000-fold diluted horseradish peroxidase (HRP) -labeled streptavidin [streptavidin-PolyHRP40 (Stereospecific Detection Technologies)] was injected for 60 minutes at 25 ° C. The mixture was allowed to stand to bind to biotin-labeled SS17B. After washing the wells with the washing solution 5 times, inject 100 μl of HRP substrate solution [0.8 mM TMBZ, 2.5 mM hydrogen peroxide, 30 mM disodium hydrogen phosphate and 20 mM citrate buffer] at 25 ° C. After reacting for 10 minutes, the reaction was stopped with 0.7 N sulfuric acid. Thereafter, the absorbance at 450 nm (primary wavelength) and 550 nm (subwavelength) was measured using an absorptiometer. Further, a dilution series of purified periostin protein was measured in the same manner, and a periostin concentration-absorbance standard curve in this ELISA method was prepared. The absorbance obtained by measuring tear fluid was applied to the prepared standard curve, and the periostin concentration in the tear fluid was calculated.
ここで、上記SS18AおよびSS17Bは、次のように作製したものである。すなわち、ウィスターラット（日本チャールスリバー株式会社）の足底部にリコンビナントペリオスチンタンパク質を注入し、３日後膝窩、鼠径、腸骨リンパ節を取り出し、Sp2/Oミエローマ細胞と融合した。生育した融合細胞株の中から２つのクローンを確立し、SS18A、SS17Bと命名した。尚、リコンビナントペリオスチンタンパク質として、Journal of Allergy Clinical Immunology, vol.118, 98−104, 2006に記載の方法によって調製したものを用いた。 Here, the SS18A and SS17B are manufactured as follows. That is, recombinant periostin protein was injected into the sole of Wistar rat (Nippon Charles River Co., Ltd.). Three days later, popliteal, inguinal and iliac lymph nodes were taken out and fused with Sp2 / O myeloma cells. Two clones were established from the grown fused cell lines and were named SS18A and SS17B. A recombinant periostin protein prepared by the method described in Journal of Allergy Clinical Immunology, vol. 118, 98-104, 2006 was used.
上記方法により、従来法によりアトピー性角結膜炎に罹患していると診断された被験者(AKC)と、アトピー性角結膜炎の罹患が見られない健常人(control)及び他のアレルギー性結膜炎を罹患していると診断された被験者(VKC: 春季カタル及びSAC: 季節性アレルギー性結膜炎)について、涙液中のペリオスチン濃度(ng/ml)の測定を行った結果を図1に示す。なお、今回の解析においてはタリムス点眼液を投与中の患者については除外した。図1に示す通り、アトピー性角結膜炎患者(AKC)( 30例)の涙液中のペリオスチン濃度の中央値は、451.0ng/mLであった。一方、健常人(control)(18例)、春季カタル(VKC)患者(6例)及び季節性アレルギー性結膜炎(SAC)患者(18例)の涙液中のペリオスチン濃度の中央値は、それぞれ、0.2ng/mL、46.1ng/mL及び10.9ng/mLであった。アトピー性角結膜炎(AKC)において、健常人(control)、春季カタル(VKC)患者および季節性アレルギー性結膜炎(SAC)患者それぞれと比較して涙液中のペリオスチン濃度が有意に高いことが確認できた（Kruskal-Wallis検定（p<0.001）後、各群をMann-Whitney検定(p<0.05)）。 By the above method, subjects (AKC) diagnosed as suffering from atopic keratoconjunctivitis by conventional methods, healthy individuals who are not found to suffer from atopic keratoconjunctivitis (control), and other allergic conjunctivitis FIG. 1 shows the results of measurement of periostin concentration (ng / ml) in tear fluid of subjects diagnosed as having (VKC: spring catarrh and SAC: seasonal allergic conjunctivitis). In this analysis, patients taking Talimus ophthalmic solution were excluded. As shown in FIG. 1, the median periostin concentration in tears of patients with atopic keratoconjunctivitis (AKC) (30 cases) was 451.0 ng / mL. On the other hand, the median periostin concentration in tears of healthy persons (control) (18 cases), spring catarrh (VKC) patients (6 cases) and seasonal allergic conjunctivitis (SAC) patients (18 cases), respectively, They were 0.2 ng / mL, 46.1 ng / mL and 10.9 ng / mL. In atopic keratoconjunctivitis (AKC), it can be confirmed that the periostin concentration in tears is significantly higher than that in healthy individuals (control), spring catarrhal (VKC) patients, and seasonal allergic conjunctivitis (SAC) patients. (After Kruskal-Wallis test (p <0.001), each group was Mann-Whitney test (p <0.05)).
上記により測定された涙液中のペリオスチン濃度に関して、母集団（涙液中ペリオスチン濃度を測定した全例（72例））からアトピー性角結膜炎を抽出しうる至適閾値（cut−off値）を探すためにReceiver−Operating−Characteristics（ROC）曲線を用いて検討を行った。すなわち、以下のようにcut−off値の設定と、設定したcut−off値を用いた場合の診断精度の測定を行った。 Regarding the periostin concentration in tears measured as described above, the optimal threshold (cut-off value) at which atopic keratoconjunctivitis can be extracted from the population (all cases where periostin concentration in tears was measured (72 cases)) In order to search, it examined using the Receiver-Operating-Characteristics (ROC) curve. That is, the cut-off value was set as described below, and the diagnostic accuracy was measured when the set cut-off value was used.
先ず、涙液中ペリオスチン濃度の測定結果に基づき、ROC解析を行った。その結果、ROC曲線下面積（area under curve [AUC]）は0.917（95%CI, 0.855−0.980）で統計学的に有意であり（P < 0.001、t検定）、cut−off値の候補として、87 ng/mLが設定できた。 First, ROC analysis was performed based on the measurement result of periostin concentration in tears. As a result, the area under curve [AUC] is 0.917 (95% CI, 0.855-0.980) and is statistically significant (P <0.001, t-test). , 87 ng / mL could be set.
尚、アトピー性角結膜炎患者群（n＝30）について平均値の95％信頼区間の上限値を求めたところ、上限値は1968 ng/mlであった。 In addition, when the upper limit value of the 95% confidence interval of the average value was determined for the atopic keratoconjunctivitis patient group (n = 30), the upper limit value was 1968 ng / ml.
涙液中のペリオスチンタンパク質濃度のcut-off値を87 ng/mlに設定した場合、感度83.3 %、特異度88.1 %である。このことから、cut-off値を 87 ng/mlに設定した場合には、アトピー性角結膜炎を比較的高い精度で検出できることが分かった。 When the cut-off value of the periostin protein concentration in tears is set to 87 ng / ml, the sensitivity is 83.3% and the specificity is 88.1%. This indicates that atopic keratoconjunctivitis can be detected with relatively high accuracy when the cut-off value is set to 87 ng / ml.
本実施例においては、上記設定したcut−off値を「所定タンパク質濃度」に設定することにより、アトピー性角結膜炎を高精度で検出できることが示唆された。 In this example, it was suggested that the atopic keratoconjunctivitis can be detected with high accuracy by setting the above-mentioned cut-off value to “predetermined protein concentration”.
実施例2：涙液中ペリオスチン濃度とアトピー性角結膜炎の重症度との関係
本実施例においては、アトピー性角結膜炎患者由来の涙液中ペリオスチン濃度とアトピー性角結膜炎の重症度との関係を検討した。
アトピー性角結膜炎の症状の重症度と関連する指標としては、結膜増殖の程度（増殖スコア）、角膜上皮障害の有無などが挙げられる。そして、増殖スコアがより高い場合、あるいは角膜上皮障害がある場合、アトピー性角結膜炎の症状がより重症であると考えられる。
Example 2: Relationship between tear periostin concentration and severity of atopic keratoconjunctivitis In this example, the relationship between tear periostin concentration from atopic keratoconjunctivitis patients and severity of atopic keratoconjunctivitis investigated.
Indicators related to the severity of symptoms of atopic keratoconjunctivitis include the degree of conjunctival proliferation (growth score), the presence or absence of corneal epithelial disorder, and the like. When the proliferation score is higher or when there is corneal epithelial disorder, the symptoms of atopic keratoconjunctivitis are considered to be more severe.
(1) 涙液中ペリオスチン濃度と増殖スコアとの関係
図2に、実施例1に記載の方法に従って測定した下記3群の患者おける涙液中ペリオスチン(POSTN)濃度(ng/ml)を示す。
(1) Relationship between tear periostin concentration and proliferation score FIG. 2 shows the periostin (POSTN) concentration (ng / ml) in tears in the following three groups of patients measured according to the method described in Example 1.
(a) 増殖スコア(proliferation score)1-0のアトピー性角結膜炎患者 (score =1-0、7例)
(b) 増殖スコア3-2のアトピー性角結膜炎患者 (score =3-2、23例)
(a) Patients with atopic keratoconjunctivitis with a proliferation score of 1-0 (score = 1-0, 7 cases)
(b) Patients with atopic keratoconjunctivitis with a proliferation score of 3-2 (score = 3-2, 23 patients)
ここで、増殖スコアは、次のように求めた。増殖スコアは直径１mm以上の結膜巨大乳頭がどれほどの範囲に認められたかで判断した。直径１mm以上の結膜乳頭が上眼瞼結膜の1/3以下に認められたものをScore=1とし、それ以下はScore=0とした。また、直径１mm以上の結膜乳頭が上眼瞼結膜の1/2以下に認められたものをScore＝2とし、それ以上認められたものをScore＝3とした。（Wakamatsu TH, Satake Y, Igarashi A, Dogru M, Ibrahim OM, Okada N, Fukagawa K, Shimazaki J, Fujishima H: IgE and eosinophil cationic protein (ECP) as markers of severity in the diagnosis of atopic keratoconjunctivitis, Br J Ophthalmol, 96:581-586, 2012）。 Here, the proliferation score was determined as follows. The proliferation score was judged by the extent to which conjunctival giant papillae with a diameter of 1 mm or more were observed. A score of 1 or less of the conjunctival papilla with a diameter of 1 mm or more was observed in 1/3 or less of the upper eyelid conjunctiva, and Score = 0 was set below that. In addition, score = 2 was defined as one in which conjunctival papilla with a diameter of 1 mm or more was observed in 1/2 or less of the upper eyelid conjunctiva, and score = 3 was defined as more than that. (Wakamatsu TH, Satake Y, Igarashi A, Dogru M, Ibrahim OM, Okada N, Fukagawa K, Shimazaki J, Fujishima H: IgE and eosinophil retaining protein (ECP) as markers of severity in the diagnosis of atopic keratoconjunctivitis, Br J Ophthalmol , 96: 581-586, 2012).
したがって、「増殖スコア1-0」とは、直径１mm以上の結膜乳頭が上眼瞼結膜の1/3以下に認められたものであることを指し、「増殖スコア3-2」とは直径１mm以上の結膜乳頭が上眼瞼結膜の1/3以上に認められたものであることを指す。増殖スコアが高いことは、症状がより重いことを示す。
増殖スコア1-0の患者の涙液中ペリオスチン濃度の中央値は27.9ng/mlであり、増殖スコア3-2の患者の涙液中ペリオスチン濃度の中央値は678.8ng/mlであった。増殖スコア3-2の患者の涙液中ペリオスチン濃度は増殖スコア1-0の患者と比較して有意に高かった（p<0.001、Mann-Whitney検定）。
Therefore, “Proliferation score 1-0” means that the conjunctival papilla with a diameter of 1 mm or more was found in 1/3 or less of the upper eyelid conjunctiva, and “Proliferation score 3-2” was 1 mm or more in diameter. The conjunctival papilla is found in more than 1/3 of the upper eyelid conjunctiva. A higher proliferation score indicates more severe symptoms.
The median periostin concentration in tears of patients with a growth score of 1-0 was 27.9 ng / ml, and the median concentration of periostin in tears of patients with a growth score of 3-2 was 678.8 ng / ml. Periostin concentrations in tears of patients with a proliferation score of 3-2 were significantly higher than those with a proliferation score of 1-0 (p <0.001, Mann-Whitney test).
このことは、涙液中ぺリオスチン濃度が高い群では、結膜に増殖性変化が見られる重症のアトピー性角結膜炎患者が多いことを示す。 This indicates that there are many patients with severe atopic keratoconjunctivitis with proliferative changes in the conjunctiva in the group with high periostin concentration in tears.
(2) 涙液中ペリオスチン濃度と角膜上皮障害の有無との関係
図3に、実施例１に記載の方法に従って測定した下記２群の患者おける涙液中ペリオスチン(POSTN)濃度(ng/ml)を示す。
(2) Relationship between tear periostin concentration and presence or absence of corneal epithelial disorder Figure 3 shows the periostin (POSTN) concentration in tears (ng / ml) in the following 2 groups of patients measured according to the method described in Example 1 Indicates.
(a) 角膜上皮障害の無いアトピー性角結膜炎患者（SPK(-)、7例）
(b) 角膜上皮障害の有るアトピー性角結膜炎患者（SPK(+)、19例）
(a) Patients with atopic keratoconjunctivitis without corneal epithelial disorder (SPK (-), 7 cases)
(b) Patients with atopic keratoconjunctivitis with corneal epithelial disorder (SPK (+), 19 cases)
ここで、角膜上皮障害の有無は、通常の方法に従って医師が確認した。具体的には、眼科専門医によるフルオレセイン染色を用いた細障灯顕微鏡検査によって角膜上皮障害の有無を確認した。 Here, the presence or absence of corneal epithelial disorder was confirmed by a doctor according to a normal method. Specifically, the presence or absence of corneal epithelial disorder was confirmed by microscopic examination using a fluorescein stain by an ophthalmologist.
角膜上皮障害の無い患者(SPK(-))の涙液中ペリオスチン濃度の中央値は130.3 ng/mlであり、角膜上皮障害の有る患者(SPK(+))の患者の涙液中ペリオスチン濃度の中央値は629.3ng/mlであった。SPK(+)の患者の涙液中ペリオスチン濃度はSPK(-)の患者と比較して有意に高かった（p<0.01、Mann-Whitney検定）。 The median tear periostin concentration in patients without corneal epithelial disorder (SPK (-)) is 130.3 ng / ml, and the periostin concentration in tears of patients with corneal epithelial disorder (SPK (+)) The median was 629.3 ng / ml. The periostin concentration in tears of SPK (+) patients was significantly higher than that of SPK (-) patients (p <0.01, Mann-Whitney test).
このことは、涙液中のぺリオスチン濃度が高い場合には、角膜上皮障害を有する重症のアトピー性角結膜炎である可能性が高いことを示す。 This indicates that there is a high possibility of severe atopic keratoconjunctivitis with corneal epithelial disorder when the periostin concentration in tears is high.
上記結果を総合して検討すると、症状がより重症であるほど、アトピー性角結膜炎患者由来の涙液における涙液中ペリオスチン濃度がより高くなる傾向にあることが分かった。 When the above results were comprehensively examined, it was found that the more severe the symptoms, the higher the periostin concentration in tears in tears from patients with atopic keratoconjunctivitis.
参考例1：結膜組織におけるペリオスチン発現
(1) 免疫染色
結膜組織におけるペリオスチンの発現レベルを確認するため、健常人及びアトピー性角結膜炎患者におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルを、組織染色により確認した。組織染色は、具体的には、次のように行った。
アトピー性角結膜炎患者由来の結膜巨大乳頭組織および正常結膜組織を、それぞれ文書による同意説明を行った上で外科的切除により採取した。各組織片を生理食塩水で軽く洗った後、速やかにOCTコンパウンドを用いて凍結標本ブロックを作成し、超低温冷凍庫（マイナス８０度(摂氏)）で保存した。これらの染色凍結標本ブロックをクリオスタットにて５μmの厚さで薄切し、スライドグラスに貼付し、標本切片を作成した。標本切片を冷アセトン液中に浸して固定した後、内因性のペルオキシダーゼの除去のため3%過酸化水素を添加したメタノール液を湿潤箱の中で10分反応させた。標本切片をPBSで5分間洗浄した後、Vectastain universal Elite ABCキット（ベクターラボラトリーズ社）に添付のブロッキング用正常血清を用いて、30分間反応させ、さらにブロッキング用正常血清を用いて3000倍に希釈した抗ペリオスチン抗体（ab14041、アブカム社）を一晩反応させた。標本切片をPBSで5分間ずつ2回洗浄した後、ビオチン化2次抗体（キット添付）を規定のとおり希釈し、30分間反応させた。標本切片を同様に洗浄し、規定通り希釈したVECTORSTAIN ABC Reagent（キット添付）を、30分間反応させた。さらに標本切片を同様に洗浄した後、発色基質（DAB substrate kit for peroxidase、ベクターラボラトリーズ社）を用いてペリオスチンタンパク質の検出を行った。対比染色としては、ヘマトキシリン液を用いた。
Reference Example 1: Periostin expression in conjunctival tissue
(1) Immunostaining In order to confirm the expression level of periostin in the conjunctival tissue, the expression level of the periostin gene in healthy subjects and patients with atopic keratoconjunctivitis was confirmed by tissue staining. Specifically, tissue staining was performed as follows.
Giant conjunctival papillary tissue and normal conjunctival tissue from patients with atopic keratoconjunctivitis were collected by surgical excision after giving written consent. After each tissue piece was gently washed with physiological saline, a frozen specimen block was quickly prepared using an OCT compound and stored in an ultra-low temperature freezer (minus 80 degrees Celsius). These stained frozen specimen blocks were sliced with a cryostat to a thickness of 5 μm and affixed to a slide glass to prepare specimen sections. After the specimen section was immersed and fixed in a cold acetone solution, a methanol solution to which 3% hydrogen peroxide had been added was reacted for 10 minutes in a wet box in order to remove endogenous peroxidase. The sample section was washed with PBS for 5 minutes, then reacted with normal serum for blocking attached to Vectastain universal Elite ABC kit (Vector Laboratories) for 30 minutes, and further diluted 3000 times with normal serum for blocking. Anti-periostin antibody (ab14041, Abcam) was reacted overnight. After the sample section was washed twice with PBS for 5 minutes each, the biotinylated secondary antibody (attached to the kit) was diluted as specified and allowed to react for 30 minutes. Sample sections were washed in the same manner and reacted with VECTORSTAIN ABC Reagent (provided with the kit) diluted as specified for 30 minutes. Further, the specimen sections were washed in the same manner, and then the periostin protein was detected using a chromogenic substrate (DAB substrate kit for peroxidase, Vector Laboratories). As counterstaining, hematoxylin solution was used.
図4は、結膜組織における免疫組織染色の結果を示す写真である。具体的には、アトピー性角結膜炎患者（Patient 1及びPatient 2）由来の結膜巨大乳頭組織、及び健常人(control)由来の正常結膜組織における免疫染色の結果を示す。図4中、上段は、ヘマトキシリン・エオジン染色(HE染色)の結果を示し、下段は、抗ペリオスチン (Anti-periostin) 抗体を用いた染色の結果を示す。 FIG. 4 is a photograph showing the results of immunohistochemical staining in the conjunctival tissue. Specifically, the results of immunostaining in a conjunctival giant papillary tissue derived from patients with atopic keratoconjunctivitis (Patient 1 and Patient 2) and normal conjunctival tissue derived from a healthy person (control) are shown. In FIG. 4, the upper row shows the results of hematoxylin and eosin staining (HE staining), and the lower row shows the results of staining using an anti-periostin antibody.
上記組織免疫染色により、ペリオスチンの発現部位が茶色に染まる（図4の下段）。染色の結果、アトピー性角結膜炎患者由来の結膜巨大乳頭においてペリオスチンタンパク質量が高いことが分かった。例えば、図4のPatient 1及びPatient 2の下段の写真を見ると、アトピー性角結膜炎患者ではペリオスチンが強く発現していることが分かる。
一方、対照群として用いた健常人では、ペリオスチンタンパク質量がきわめて低かった（図4のcontrolの下段）。
The tissue immunostaining stains the periostin expression site in brown (bottom of FIG. 4). As a result of staining, it was found that the amount of periostin protein was high in the conjunctival giant papillae derived from patients with atopic keratoconjunctivitis. For example, in the lower photograph of Patient 1 and Patient 2 in FIG. 4, it can be seen that periostin is strongly expressed in patients with atopic keratoconjunctivitis.
On the other hand, in healthy individuals used as a control group, the amount of periostin protein was extremely low (lower part of control in FIG. 4).
(2) mRNA量
結膜組織におけるペリオスチンの発現レベルを確認するため、健常人及びアトピー性角結膜炎患者におけるペリオスチン遺伝子の発現レベルを、mRNA量を測定することにより確認した。mRNA量の測定は、具体的には次のようにして行った。
(2) mRNA level In order to confirm the expression level of periostin in the conjunctival tissue, the expression level of the periostin gene in healthy subjects and patients with atopic keratoconjunctivitis was confirmed by measuring the amount of mRNA. Specifically, the amount of mRNA was measured as follows.
アトピー性角結膜炎患者由来の結膜巨大乳頭組織および正常結膜組織片を、1.5mLのマイクロチューブに回収し、RNA抽出用組織保存専用液（RNA later、キアゲン社）を入れて冷蔵（4度(摂氏)）で一晩浸潤させた後、抽出を行うまで超低温冷凍庫（マイナス８０度(摂氏)）で保存した。Total RNA抽出の際、組織を専用のペッスルを用いて十分に破砕した後、1mLのISOGEN（ニッポンジーン社）で溶解し、ボルテックスにより撹拌させた。200μLのクロロホルムを加え、さらによく撹拌させた後、4度(摂氏)に冷却した遠心機で１５分間、15,000rpmの条件で遠心分離を行った。この時、水層を新しい1.5mLのマイクロチューブに回収し、500μLの2-プロパノールおよび2μLグリコーゲン溶液（10mg/ml）を入れてボルテックスにより撹拌させた後、同様に10分間、15,000rpmの条件で遠心分離した。この時形成されたペレットを、上清を除去後500μLの80%エタノール溶液で洗浄し、SpeedVac（減圧濃縮装置、サーモサイエンティフィック社）を用いて完全に乾燥させた。さらにペレットを滅菌蒸留水にて溶解後、RNeasy mini kit（QIAGEN社）を用いて規定のとおりにtotal RNAのclean upおよびDNase処理を行った。滅菌蒸留水にて溶出させた各組織由来のtotal RNAは、濃度測定後、一定量（〜1μg）をiScript cDNA Synthesis Kit (バイオラッド社)を用いてcDNA合成した。これらをSYBR Green Realtime PCR Master Mix (東洋紡社)試薬およびヒトペリオスチン遺伝子(mRNA)を特異的に認識させるように設計したプライマーを用い、Bio-Rad CFX96にて各組織における遺伝子発現を定量解析した。PCRプログラムは初期活性化（95℃、1分）と、2ステップのサイクリング（変性；95℃、5秒、アニーリング/エクステンション；60℃、15秒）を組み合わせた方法を用い、サイクル数は40で設定した。この際、内標準コントロール遺伝子としてGAPDHを用い、ペリオスチン遺伝子の発現量を補正した。本検討に用いたペリオスチン遺伝子のプライマーの配列は以下のとおりである。
ペリオスチン
プライマー１：GATGGAGTGCCTGTGGAAAT (配列番号7)
プライマー２：AACTTCCTCACGGGTGTGTC (配列番号8)
Collect conjunctival giant papillary tissue and normal conjunctival tissue fragment from atopic keratoconjunctivitis patients in a 1.5 mL microtube, and put in a tissue preservation solution for RNA extraction (RNA later, Qiagen) and refrigerate (4 degrees Celsius) )) And then stored in an ultra-low temperature freezer (minus 80 degrees Celsius) until extraction. During total RNA extraction, the tissue was sufficiently crushed using a dedicated pestle, dissolved with 1 mL of ISOGEN (Nippon Gene), and vortexed. After adding 200 μL of chloroform and further stirring, it was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes in a centrifuge cooled to 4 degrees (Celsius). At this time, the aqueous layer was collected in a new 1.5 mL microtube, 500 μL of 2-propanol and 2 μL glycogen solution (10 mg / ml) were added, and the mixture was vortexed and then similarly stirred for 10 minutes at 15,000 rpm. Centrifuged. The pellet formed at this time was washed with 500 μL of an 80% ethanol solution after removing the supernatant, and completely dried using SpeedVac (vacuum concentrator, Thermo Scientific). Further, the pellet was dissolved in sterilized distilled water, and then total RNA was cleaned up and DNase treated as specified using RNeasy mini kit (QIAGEN). The total RNA derived from each tissue eluted with sterilized distilled water was subjected to concentration measurement, and then a fixed amount (˜1 μg) was synthesized with cDNA using iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). Using these primers designed to specifically recognize the SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo) reagent and the human periostin gene (mRNA), the gene expression in each tissue was quantitatively analyzed with Bio-Rad CFX96. The PCR program uses a combination of initial activation (95 ° C, 1 minute) and two-step cycling (denaturation; 95 ° C, 5 seconds, annealing / extension; 60 ° C, 15 seconds), with 40 cycles. Set. At this time, GAPDH was used as an internal standard control gene, and the expression level of the periostin gene was corrected. The sequences of the periostin gene primers used in this study are as follows.
Periostin Primer 1: GATGGAGTGCCTGTGGAAAT (SEQ ID NO: 7)
Primer 2: AACTTCCTCACGGGTGTGTC (SEQ ID NO: 8)
図5は、結膜組織におけるペリオスチン発現量(mRNA量)を測定した結果を示すグラフである。図5中、AKCは、アトピー性角結膜炎の結膜巨大乳頭であり、controlは、健常人由来の正常結膜粘膜組織である。 FIG. 5 is a graph showing the results of measurement of periostin expression level (mRNA level) in conjunctival tissue. In FIG. 5, AKC is a conjunctival giant papillae of atopic keratoconjunctivitis, and control is a normal conjunctival mucosa tissue derived from a healthy person.
上記mRNA量の測定の結果、アトピー性角結膜炎患者由来の結膜巨大乳頭において、正常結膜粘膜組織と比較して、ペリオスチン遺伝子の発現レベルが亢進していることを確認できた。 As a result of the measurement of the amount of mRNA, it was confirmed that the expression level of the periostin gene was increased in the conjunctival giant papillae derived from patients with atopic keratoconjunctivitis as compared with normal conjunctival mucosal tissue.
以上、実施例に示した通り、アトピー性角結膜炎の患者由来の涙液においてペリオスチンタンパク質の濃度が増加していることが見出され、被験者由来の涙液におけるペリオスチンタンパク質の濃度を分析することにより、アトピー性角結膜炎についての診断に有用な情報とすることができる。特に、アトピー性角結膜炎患者では、涙液中のペリオスチン濃度が他のアレルギー性結膜炎に比しても高値であることから、涙液中のペリオスチンタンパク質の分析値は、アトピー性角結膜炎と他のアレルギー性結膜炎を分離して検出する際に有用であることが示された。また、涙液中のペリオスチンタンパク質の濃度は、アトピー性角結膜炎の重症度に応じて増加することから、涙液中のペリオスチンタンパク質の分析値は、アトピー性角結膜炎の重症度を測定するのにも有用であることが示されたことも示された。 As described above, as shown in the examples, it was found that the concentration of periostin protein was increased in tears derived from patients with atopic keratoconjunctivitis, and by analyzing the concentration of periostin protein in tears derived from subjects Information useful for diagnosis of atopic keratoconjunctivitis can be obtained. In particular, in patients with atopic keratoconjunctivitis, the periostin concentration in tears is higher than that in other allergic conjunctivitis. It has been shown to be useful in isolating and detecting allergic conjunctivitis. In addition, the concentration of periostin protein in tears increases with the severity of atopic keratoconjunctivitis, so the analysis of periostin protein in tears can be used to measure the severity of atopic keratoconjunctivitis. It has also been shown to be useful.
さらに、参考例１における免疫組織染色及びmRNA量の測定する方法と比較して、涙液においてペリオスチンタンパク質の濃度を分析し、アトピー性角結膜炎を検出する方法は、簡便に行えることが確認できた。 Furthermore, it was confirmed that the method of detecting atopic keratoconjunctivitis can be easily performed by analyzing the concentration of periostin protein in tear fluid as compared with the method of measuring immunohistological staining and mRNA amount in Reference Example 1. .
配列番号７:合成DNA
配列番号８:合成DNA
SEQ ID NO: 7: synthetic DNA
SEQ ID NO: 8: synthetic DNA
Claims (12)
12. A kit for detecting atopic keratoconjunctivitis, which contains the detection agent according to claim 11 and is used to measure a periostin protein concentration in tears collected from a subject.
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