JP6378622B2 - 高活性セロビオヒドロラーゼ - Google Patents
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Description
(アクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)のゲノムDNA抽出)
アクレモニウム・セルロリティカスH1株(FERM BP−11508、以下「H1株」と略記する。)を、PDB寒天培地(PDA培地(BD Difco社製、PDA broth)に1.5%(質量/容量)アガロースを添加した平板培地)上に植菌して30℃で1週間培養した。得られた菌体を、寒天ごと直径5mmで切り出してPDA培地に植菌し、30℃、130rpmで浸透培養を行った。培養物を15000rpmで10分間遠心分離処理することによって菌体を回収した。さらに、回収した菌体をPDA培地により洗浄を2回繰り返して、菌体サンプルを取得した。
得られたゲノムDNAを鋳型とし、配列番号3、4(下記表1参照。)で表すプライマー1、2を用い、PCRによって、野生型セロビオヒドロラーゼをコードする配列を増幅した。DNAポリメラーゼは、KOD-plus(東洋紡社製)を用い、PCRは、94℃、2分間を1サイクルした後、96℃、20秒間、次いで60℃、30秒間、さらに72℃、5分間を30サイクルすることにより行った。得られたPCR産物は、QIAquick PXR purification kit(QIAGEN社製)を用いて精製した。得られたアクレモニウム・セルロリティカスの野生型セロビオヒドロラーゼのアミノ酸配列は配列番号1に示す。
大腸菌プラスミドであるpBR322に、麹菌アスペルギルス・オリゼ由来の硝酸還元酵素遺伝子niaD、麹菌由来agdA遺伝子のターミネーター領域、麹菌由来enoA遺伝子のプロモーター領域を組み込んだベクター、pBR−enoAP−agdAT−niaDを作製した。硝酸還元酵素遺伝子niaDを発現することにより、硝酸存在下でも麹菌が生育可能になるプラスミドが導入された菌を選択することができる。以下に簡単に調製方法を述べる。
pBR−enoAP−agdAT−niaDを制限酵素SmaIを用いて消化し、pBRenoAP−agdAT−niaDのSmaI処理断片を得た。
変異型セロビオヒドロラーゼは、セロビオヒドロラーゼ遺伝子の5’側から変異部位、および、変異部位から遺伝子の3’側の2断片をPCRによって作製した。得られた2断片のDNAを、pBR−enoAP−agdAT−niaDに組み込むことによって構築した。この際、変異部位を含むプライマーがアニールするように設計されているため、変異型セロビオヒドロラーゼ遺伝子は、pBR−enoAP−agdAT−niaDに組み込まれた時点で変異部位を含む以外は、5’側から3’側まで、野生型セロビオヒドロラーゼと同じアミノ酸配列を備えてつながった状態になる。
アクレモニウム・セルロリティカスのセロビオヒドロラーゼの立体構造をもとに、配列番号1で表されるアミノ酸配列を備えた、アクレモニウム由来のセロビオヒドロラーゼのトンネル構造内に位置する30箇所のアミノ酸をアラニンに置換し、その活性を解析し酵素活性が向上するものを選択した。30箇所の置換のうち野生型セロビオヒドロラーゼに比べて活性の向上が見られたのは6箇所であった。
定法であるPEG−カルシウム法(Mol.Gen.Genet.,vol.218,p.99~104(1989年))により、上記野生型セロビオヒドロラーゼが組み込まれたプラスミドpBR−enoAP−CBH−agdAT−niaD、あるいは変異を導入したプラスミドを用いて、麹菌アスペルギルス・オリゼniaD300株(niaD欠損株、独立行政法人酒類総合研究所より入手。)を形質転換した。ツアペクドックス(Czapek−Dox)培地(3%(質量/容量)デキストリン、0.1%(質量/容量)リン酸2水素カリウム、0.2%(質量/容量)塩化カリウム、0.05%(質量/容量)硫酸マグネシウム、0.001%(質量/容量)硫酸鉄、0.3%(質量/容量)硝酸ナトリウム)で生育できる株を選択することにより、形質転換体(野生型および変異型セロビオヒドロラーゼ麹菌形質転換株)を得た。
作製したセロビオヒドロラーゼ麹菌形質転換株を、ツアペクドックス培地で胞子形成させ、滅菌水で胞子を回収した。500mL容三角フラスコに入った100mLのPD液体培地(2%(質量/容量)デキストリン、1%(質量/容量)ポリペプトン、0.1%(質量/容量)カザミノ酸、0.5%(質量/容量)リン酸2水素カリウム、0.05%(質量/容量)硫酸マグネシウム、0.1%(質量/容量)硝酸ナトリウム)に最終胞子濃度1×104/mLとなるように植菌した。30℃で3日間の液体培養を行い、セロビオヒドロラーゼ、又はアミノ酸変異を有するセロビオヒドロラーゼを培地中に分泌発現させた。培養後の当該培養液を酵素サンプルとした。当該酵素サンプルは、SDS−PAGE解析により確認し、タンパク質定量を行って用いた。
反応基質として、微結晶性セルロース(メルク社製)を使用した。また、検量線は、10mM(mmol/L)グルコース溶液を200mM酢酸バッファー(pH5.5)で適宜希釈して調製した4点の希釈系列(0.5〜5.0mM)の測定値から作成した。
62番目のアスパラギン(N)をアラニン(A)に置換した変異体N062Aが、野生型と比較して活性が向上していたことから、62番目のアミノ酸を疎水性、酸性、アルカリ性等、性質の異なるアミノ酸に置換し、その活性を測定した。
リグノセルロース系バイオマスである稲藁を微粉砕したものに2.5%(質量/質量)の硫酸水溶液を質量比が1:10となるように混合し、150℃の温度で10分間保持して糖化前処理を行った後、水酸化ナトリウム水溶液を用いてpHを5.8に調整し、50℃で1日乾燥した。その後、ハンマーで細かく粉砕したものを活性測定の反応基質として用いた。
Claims (3)
- 向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼを作製する方法であって、
配列番号1で表されるセロビオヒドロラーゼのN末から62番目のアミノ酸であるアスパラギン、
又はグリコヒドロラーゼファミリーのGH7に分類されるセロビオヒドロラーゼにおける、配列番号1の62番目の位置に相当する位置のアスパラギンをアラニンに置換することを特徴とする向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼを作製する方法。 - 向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼであって、
配列番号1で表されるセロビオヒドロラーゼのN末から62番目のアミノ酸であるアスパラギン、
又はグリコヒドロラーゼファミリーのGH7に分類されるセロビオヒドロラーゼにおける、配列番号1の62番目の位置に相当する位置のアスパラギンをアラニンに置換した変異を含むことを特徴とするセロビオヒドロラーゼ。 - 向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼであって、
請求項2の向上した活性を備えたセロビオヒドロラーゼの配列が、
配列番号2で表されるものであることを特徴とするセロビオヒドロラーゼ。
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