JP6374931B2 - 質量標識体 - Google Patents
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Description
。また、本発明は、特定の質量標識体を用いて質量分析により分析を行う方法に関する。
る変化を検出する能力に依存している。かかる変化は、診断手段を提供し、ワクチン及び
薬剤等の治療用化合物の標的についての洞察をもたらす。医療では、核酸、タンパク質、
ステロイド、糖、及び脂質を含む広範囲に亘る生体分子を用いることができる。この状況
では、質量分析計を用いてかかる生体分子を定量的に検出する能力によって、前記生体分
子に関する研究が著しく進展し、ヒト及び動物の疾患、環境分析及びモニタリング、並び
に食品及び飲料の製造に応用される。特に、全ての分類の生体分子をモニタリングするた
めの同位体希釈質量分析において、合成定量レファレンスを提供するための安定同位体の
使用が開発されている。しかし、これら方法は、利用可能な合成標準物質を以前から必要
としているが、これは常に可能である訳ではない。
する広範囲に亘る化学質量タグが開発されている。タグの設計によって、タグセットに含
まれるタグは、同一の化学構造を有するが絶対質量は異なるアイソケミックタグ、又は構
造も絶対質量も同一であるアイソバリックタグのいずれかである。アイソケミックタグは
、一般的に、MSモードにおける定量に用いられるが、一方アイソバリックタグは、固有
の質量を有するレポーターフラグメントを放出するためにMS/MSモードでフラグメン
ト化されなければならない。今日まで、同位体でドープされた質量タグは、主にタンパク
質及び核酸を分析するために使用されている。
た(非特許文献1)。ICAT試薬は、一対の質量タグであり、前記対の一方は、重同位
体によって重量に差をつけた(重)タグであり、他方は置換基を有しない(軽)タグであ
る。2個のサンプルを重タグ又は軽タグのいずれかで標識し、次いで、混合した後、LC
−MSによって分析する。両方のサンプル中に存在するペプチドは、重同位体原子置換数
に比例して異なる質量を有するプレカーサーイオンの対を提供する。アイソケミックタグ
の更なる例としては、4個以下の異なる試薬を提供するICPL試薬が挙げられる。
が、これは、質量スペクトルの複雑性を高めることを犠牲にして達成されるものである。
この制限を克服するため及びタンデム質量分析の特異性の利点を活かすために、アイソバ
リック質量タグが開発された。2000年に導入されてから、アイソバリック質量タグは
、タンパク質及びペプチドにおけるアミン官能基を普遍的に標識した後に複数のサンプル
を混合し同時に分析することによってプロテオミクス発現プロファイリングの手段を改善
している。タグが同一の質量を有するアイソバリックタグであるので、質量スペクトルの
複雑性を高めることがない。その理由は、同一ペプチドの全てのプレカーサーが、クロマ
トグラフィー分離において正確に同一の点で出現し、同一の総質量を有しているためであ
る。タンデム質量分析の前に分子がフラグメント化される場合のみ、固有の質量レポータ
ーが放出されて、各オリジナルサンプルに存在するペプチドの相対量又は絶対量を計算す
ることが可能となる。
の様々な特定の分子がそれぞれ13C及び15Nを含む重同位体で置換されている好適な
タグの具体例が提供されている。特許文献1は、複数のアイソバリックセットを作製して
、個々のタグのサイズを過度に増大させることなしに利用可能な全多重化率を高めるため
のオフセット質量の使用について更に記載している。特許文献2は、更なるアイソバリッ
クタグセットについて記載している。特許文献3は、3−[2−(2,6−ジメチル−ピ
ペリジン−1−イル)−アセチルアミノ]−プロパン酸−(2,5−ジオキソ−ピロリジ
ン−1−イル)−エステル(DMPip−βAla−OSu)を含むアイソバリック質量
タグの更なるセットについて記載している。
標識することができる分子の範囲、及び実現可能なマルチプレックス分析のレベルを更に
改善する必要性が依然として存在する。したがって、本発明の目的は、特に、既に開示さ
れている分子の制限を取り除くための様々な新規アイソバリック質量タグを提供すること
にある。
によって、定量的質量分析データを解釈するためのワークフロー又はソフトウェアを再設
計する必要のない、選択的標識特性及び/又は付加オフセット質量を有する広範な生成物
を開発することができることを見出した。更に、本発明者らは、バイオマーカーの定量及
び/又は臨床アッセイの開発用に、等価なアイソバリック質量タグに直接変換されるとい
うLC−MSにおける定量の利点を提供するアイソケミックタグを開発するために同一の
コア構造を使用可能であることを示した。
応性質量標識体であって、以下の構造を含む反応性質量標識を提供する。
、
a)R1及びR2は、共に
ていてもよく、且つ互いに独立して、H、置換又は非置換の直鎖又は分枝C1−C6アル
キル基、置換又は非置換の脂環式基、置換又は非置換の芳香族基、及び置換又は非置換の
複素環基から選択される;
b)R1及びR3は、共に
は分枝C1−C6アルキル基、置換又は非置換の脂環式基、置換又は非置換の芳香族基、
及び置換又は非置換の複素環基から選択される;
c)R1は、
である;
d)R1は、
(CH2)n−ONH2(式中、nは1〜6である)であり;
前記a)、b)、c)、及びd)において、Aは、以下の構造を含む
X−L−M
(式中、Xは、質量マーカー部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、Mは、質量正
規化部分である))
のに適した部分を指すことを意図する。用語「標識体」は、用語「タグ」の同義語である
。本願全体を通して、用語「タンデム質量タグ(TMT)」は、用語「質量標識体」の同
義語である。
る部分を指すことを意図する。
出される訳ではないが、質量標識体が確実に所望の総質量を有するようにするために存在
する部分を指すことを意図する。質量正規化部分は、構造的には特に限定されず、単に質
量標識体の全体質量を変化させるためのものである。
。しかし、基Aにおける質量マーカー部分Xが、質量標識体の残りの部分に結合すること
も可能である。
的に標識するための新規化合物が調製される。システイン残基の標識は、分析されるサン
プルが非常に複雑である場合に好ましい。現在公知であるアイソバリック質量タグを用い
ると、それぞれリジン残基のN−末端及び側鎖を表すアルファ及びイプシロンアミン基が
標識される。一般的に用いられているプロテオミクスワークフローでは、タンパク質は、
分析前に酵素トリプシンを用いて分解される。この分解を行うと、標識に利用可能な自由
N−末端が生じるので、標識されたペプチドミックスではサンプル全体に複雑性が存在す
る。システインは、出現頻度の比較的低いアミノ酸であり、少数のトリプシン分解ペプチ
ドでしかみられない。システイン残基を標識し、次いで、標識されていない種を除去する
ことによって、トリプシン分解サンプルの複雑性を劇的に低下させることが可能である。
このように複雑性が低下することにより、質量分析によって、より迅速且つ高感度の分析
が可能となるので非常に好ましい。欧州特許第1105517号明細書には、1回の実験
で2つのサンプルを分析することができる、システイン反応性を有する同位体質量タグの
セットが開示されている。本発明では、国際公開第2007/012849号に記載され
ているアミン標識試薬を使用する同じワークフロー及び分析方法を採用できるように、ア
イソバリック質量タグの原理とシステイン標識による複雑性の低下が組み合わせられる。
これは、一般的なプレカーサーを適用することができるため、製造コストの点で、また方
法の開発にかかる時間及びコストの点で大きな利点を有する。
る:プロテオミクス研究において有用な緩衝溶液で用いられることが多い高pHでさえも
システイン残基に対して高い選択性を示す(例えば、トリエチルアンモニウム二炭酸塩
TEAB)、及び水への曝露に対して安定である。更に、この基は、必要な場合、任意の
ジスルフィド還元試薬で処理することによってペプチドから容易に再開裂させることがで
きる。
を有するアイソバリック質量タグのセットが開示されている。アルデヒド基及びケトン基
は、自然界では、ステロイド等の複雑な生物活性分子にみられ、酸化を受けたタンパク質
及び糖タンパク質にも存在している場合がある。したがって、カルボニル基に対して選択
的反応性を有するアイソバリック質量タグは、広範囲に亘って有用となり得る。多数の化
学基が、ケトンと反応可能であり、本発明では、ヒドラジド基及びアミノキシ基をコア分
子に結合させて、カルボニル選択的アイソバリック質量タグのセットを生成する。
。
−ONH2である。
反応性質量標識体であって、以下の構造を含む反応性質量標識体を提供する。
X−L−M−Re
(式中、Xは、質量マーカー部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、Mは、質量正
規化部分であり、Reは、以下の構造を含む生体分子に前記質量標識体を結合させるため
の反応性官能基である)
分は、ペプチド及びタンパク質におけるアミン官能基を効率的に標識できるようにスクシ
ンイミドエステル基を有する。スクシンイミド標識反応は、迅速であり且つ比較的低モル
過剰で完了させることができるが、スクシンイミドエステルの加水分解に対して非常に感
受性が高い。細胞表面の標識等の特定の用途では、大部分で水性環境を使用することが必
要であるので、標準的なスクシンイミドエステルの使用は不可能である。スルホン化され
ていない親よりも加水分解に対する耐性が高いスルホ−N−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル(スルホ−NHS)を用いたスクシンイミドエステルの改良が行われている。スル
ホ−NHS種の基の更なる利点は、タンデム質量タグの極性を高め、インタクトな細胞膜
を通して細胞にタグが取り込まれるのを防ぐという点である。その結果、TMTのスルホ
−NHS誘導体は、細胞外タンパク質を特異的に標識することができる。しかし、質量タ
グの製造中に遊離スルホ−NHSを除去すると問題になる場合がある。これを回避するた
めに、本発明者らは、スルホ−テトラフルオロフェニル部分を使用可能であることを見出
した。
応性質量標識体であって、以下の構造を含む反応性質量標識体を提供する。
X−L−M−S−Re
(式中、Xは、質量マーカー部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、Mは、質量正
規化部分であり、Sは、以下の基を含む質量系列修飾基であり、Reは、生体分子に前記
質量標識体を結合させるための反応性官能基である)
ともCH2であり、且つnは1であり;mは、少なくとも1である)
量を有する複数のセットを提供することにより克服することができる。付加質量は、質量
系列修飾基により提供される。この概念は、本明細書に援用される米国特許第7,294
,456号に記載されている。本発明において、本発明者らは、DMPip−βALAコ
ア構造のリンカー領域に更なるベータ−アラニン部分を付加することによってアイソバリ
ック質量タグセットのアレイを開発することができることを見出した。かかる単一のアプ
ローチは、6〜12、18、24、又はそれ以上にサンプルの多重化率を高める迅速且つ
安価な手段を提供する。本発明の主な利点は、アレイに含まれる各アイソバリックセット
における質量レポーターが、国際公開第2007/012849号に開示されている既に
確立されたタンデム質量タグレポーターと正確に同じ挙動を示すという点である。1個又
は2個のベータ−アラニンを組み込むと、更なる不安定なアミド結合が導入されるので、
アミノヘキサン酸を用いる別のアプローチも考えられる。当業者であれば、DMPip−
βALAコア構造に付加質量を導入するための具体的な手段は、特に限定されず、別の手
段も本発明の範囲内であるとみなされることを理解するであろう。
フルオロフェニル部分を含むことが好ましい。
、置換又は非置換の脂環式基、置換又は非置換の芳香族基、或いは置換又は非置換の複素
環基である)
むことが好ましい。
含む。
して0個〜3個の二重結合を含み;各Zは、独立して、N、N(R1)、C(R1)、C
O、CO(R1)、C(R1)2、O、又はSであり;Xは、N、C、又はC(R1)で
あり;各R1は、独立して、H、置換又は非置換の直鎖又は分枝C1−C6アルキル基、
置換又は非置換の脂環式基、置換又は非置換の芳香族基、或いは置換又は非置換の複素環
基であり;yは、0〜10の整数である)
ともCH2であり、且つnは1であり;mは、0を含む任意の正の整数である)
を有する。
ともCH2であり、且つnは1であり;mは、0を含む任意の正の整数である)
を有する。
ともCH2であり、且つnは1であり;mは、0を含む任意の正の整数である)
。
つを有する。
ける各標識体が上に定義された通りであり、各質量正規化部分によって前記質量標識体が
所望の総質量を確実に有し、前記セットが以下の群:
−共通の質量の質量マーカー部分を有する標識体の群であって、前記群における各標識
体が固有の総質量を有する群;又は
−質量マーカー部分を有する標識体の群であって、各質量マーカー部分が前記群におけ
る他の全ての質量マーカー部分とは異なる質量を有し、前記群における各標識体が共通の
総質量を有する群;
のいずれかを含み、前記セットにおける全ての質量標識体が、質量分析によって互いに識
別可能であるセットを提供する。
ー部分を含み、且つ固有の総質量を有する。別の実施形態では、前記セットにおける各標
識体は、固有の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ共通の総質量を有する。
い。しかし、前記セットが2以上、3以上、4以上、又は5以上の標識体を含む場合が好
ましく、6以上の標識体を含む場合がより好ましく、8以上の標識体を含む場合が最も好
ましい。
ー部分、開裂可能リンカー、質量正規化部分、及び質量標識体の任意の他の成分の質量の
合計を指す。
量標識体間で異なっていてもよい。例えば、質量の異なる質量マーカー部分を有するが、
総質量は共通である標識体の群をセットが含む場合、質量正規化部分の質量は、セットに
おける各質量標識体によって異なる。この場合、個々の質量標識体における質量正規化部
分の質量は、共通の総質量から、前記質量標識体における特定の質量マーカー部分の質量
を減じ、更に開裂可能リンカーの質量を減じたものに等しい。共通の質量の質量マーカー
部分を有するが、総質量は異なる標識体の群をセットが含む場合、群中の全ての標識体の
総質量が異なるように質量正規化部分の質量を変動させる必要があることは明らかである
。
たがって、質量分析計によって質量標識体を区別することができる、即ち、個々の質量標
識体に由来するピークを互いに明確に分離することができる。質量マーカー部分又は質量
標識体間の質量差は、異なる質量標識体又は質量マーカー部分に由来するイオンを質量分
析計で区別可能であることを意味する。
M(D)y−L−X(D)z
(式中、Mは、質量正規化部分であり、Xは、質量マーカー部分であり、Dは、質量調
整部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、y及びzは、0以上の整数であり、y+
zは、1以上の整数である)
(a)質量マーカー部分及び/又は質量正規化部分内に位置する同位体置換基、及び
(b)質量マーカー部分及び/又は質量正規化部分に結合している置換原子又は基。
、13C又は18O同位体置換基から選択される。
有するAを含む。
X(*)n−L−M(*)m
(式中、Xは、質量マーカー部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、Mは、質量正
規化部分であり、*は、同位体質量調整部分であり、n及びmは、0以上の整数であり、
前記セットにおける各標識が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固有
の総質量を有する;又は前記セットにおける各標識が、固有の質量を有する質量マーカー
部分を含み、且つ共通の総質量を有する)
量標識体を含む。
ことを表し、前記セットにおける各標識体は、1以上の*を含み、
前記セットにおける各標識体が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固
有の総質量を有する;又は前記セットにおける各標識体が、固有の質量を有する質量マー
カー部分を含み、且つ共通の総質量を有する)
在しないことが好ましい。
、以下の構造を有する6個の反応性質量標識体を含む。
は、以下の構造を有する6個の反応性質量標識体を含む。
する6個の反応性質量標識体を含む。
体のアレイであって、前記アレイにおける任意の1セットの質量標識体の各々の総質量が
、前記アレイの他の全てのセットの質量標識体の各々の総質量と異なるアレイを提供する
。
)を増加させることにある。多重化率を増加させる場合、MS/MS分析におけるサンプ
ル数と感度との間の関係を考慮する必要がある。当業者であれば、MS/MS実験の第1
段階において、有限容量を有するコリジョンセル内に所望の質量電荷比のイオンが蓄積す
ることを理解する。次いで、捕捉されたイオンをフラグメント化し、そのフラグメントを
検出器に通して、質量電荷比及び存在量を求める。含まれているサンプルが多すぎる場合
、検出器に放出されるフラグメント数が機器の検出限界を下回るリスクがある。大まかに
述べると、存在するアイソバリックサンプル数が増えるにつれて、感度は低下する。
列修飾基を含み、任意の1セットの質量標識体の各々における質量系列修飾基は、アレイ
における他の全てのセットの質量標識体の各々における質量系列修飾基と異なる質量を有
する。質量系列修飾基は、セットの質量を互いに分離する。
量系列修飾基を含む。
ともCH2であり、且つnは1であり;mは、少なくとも1であり;異なる数の同位体質
量調整部分*が存在することにより、任意の1セットの質量標識体の各々の質量系列修飾
基は、アレイにおける他の全てのセットの質量標識体の各々における質量系列修飾基と異
なる質量を有する)
a)質量標識体の第1のセットであって、前記セットにおける各質量標識体が、以下の
構造を有する質量修飾基を含む第1のセットと、
構造を有する質量修飾基を含む第2のセットと、
構造を有する質量修飾基を含む第3のセット。
標識体の使用を提供する。
定することにより生体分子を検出することを含み、前記質量標識体が上に定義された質量
標識体である方法を提供する。
1. 上に定義された反応性質量標識体と生体分子とを反応させる工程と、
2. 標識された前記生体分子を分離する工程と、
3. 前記生体分子に関連付け可能な前記質量標識体を質量分析によって同定する工程
。
質量分析によって検出するために生体分子を標識するための本発明の反応性質量標識体
は、以下に定義される質量標識体Aと、質量標識体の生体分子に対する結合を促進するか
又は結合させるための反応性官能基とを含む。本発明の好ましい実施形態では、反応性官
能基は、質量標識体と、生体分子における適切な官能基とを共有結合的に反応させる。前
記生体分子としては、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸
、ペプチド、ポリペプチド、又はステロイドホルモンが挙げられるが、これらに限定され
ない。反応性官能基は、リンカーを介して質量標識体に結合してもよく、前記リンカーは
、開裂可能であってもなくてもよい。反応性官能基は、質量標識体の質量マーカー部分に
結合してもよく、質量標識体の質量正規化部分に結合してもよい。
ることができる。最も単純な実施形態では、反応性官能基は、N−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステルであってもよい。しかし、本発明者らは、アミノ基以外の官能基と反応する
ことができる様々な質量標識体を提供する必要があることを認識していた。
。具体的には、これら反応性官能基は、システイン残基のチオール基と反応するように設
計される。システイン残基と反応することができる本発明の反応性基の例は、図1に示さ
れるマレイミド、ハロアセチル、及び2−ジチオピリジン基である。システインのチオー
ル基は、マレイミド基の二重結合に求核付加され、ハロアセチル又は2−ジチオピリジン
基で求核置換される。
とができる反応性官能基を有する質量標識体を設計した。具体的には、これら反応性官能
基は、ステロイドホルモンのカルボニル基又はヒドロキシル基と反応するように設計され
る。生体分子におけるカルボニル基又はヒドロキシル基と反応することができる本発明の
反応性基は、ヒドラジド又は−CONH−(CH2)n−ONH2(式中、nは1〜6で
あり、好ましくは、nは3である、即ち、アミノキシプロピルアミド(図5、6、9、及
び10を参照されたい))である。これら基は、カルボニル基と反応して、それぞれヒド
ラゾン又はO−アルキルオキシムを形成する。
体であって、以下の構造を含む標識体を提供する。
、
a)R1及びR2は、共に
ていてもよく、且つ互いに独立して、H、置換又は非置換の直鎖又は分枝C1−C6アル
キル基、置換又は非置換の脂環式基、置換又は非置換の芳香族基、及び置換又は非置換の
複素環基から選択される;
b)R1及びR3は、共に
は分枝C1−C6アルキル基、置換又は非置換の脂環式基、置換又は非置換の芳香族基、
及び置換又は非置換の複素環基から選択される;
c)R1は、
である;
d)R1は、
であり、R2は、Aであり、R3は、存在せず、Zは、Oであり、Bは、−NH2又は−
(CH2)n−ONH2(式中、nは1〜6である)であり;
前記a)、b)、c)、及びd)において、Aは、以下の構造を含む
X−L−M
(式中、Xは、質量マーカー部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、Mは、質量正
規化部分である))
N原子、P原子、O原子、S原子、若しくはハロゲン原子(例えば、F、Cl、Br、又
はI)等の、周期律表の第IIIA族、第IVA族、第VA族、第VIA族若しくは第V
IIA族のいずれかに属する1以上の原子及び/又は任意の有機基を含んでいてもよい。
は、直鎖、分枝鎖、又は環状基を含んでいてもよい。これとは独立に、炭化水素基は、脂
肪族基又は芳香族基を含んでいてもよい。また、独立に、炭化水素基は、飽和基又は不飽
和基を含んでいてもよい。
官能基を含んでいてもよい。炭化水素が直鎖又は分枝鎖基を含む場合、1以上の一級、二
級、及び/又は三級のアルキル基を含んでいてもよい。炭化水素が環状基を含む場合、芳
香環基、脂環式基、複素環基、及び/又はこれら基の縮合環誘導体を含んでいてもよい。
したがって、環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、
ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール
、インドール、イミダゾール、チアゾール、及び/又はオキサゾール基、並びに上記基の
位置異性体を含んでいてもよい。
化水素基が好ましい。したがって、炭化水素基は、低級炭化水素(炭素数1〜6)又は高
級炭化水素(炭素数7以上、例えば、炭素数7〜40)であってもよい。環状基の環にお
ける原子数は、特に限定されないが、環状基の環は、3〜10個の原子、例えば、3、4
、5、6、又は7個の原子を含むことが好ましい。
N原子、P原子、O原子、S原子、又はハロゲン原子(例えば、F、Cl、Br、又はI
)等の、周期律表の第IIIA族、第IVA族、第VA族、第VIA族又は第VIIA族
のいずれかに属する1以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。したがって、置換基は、ヒ
ドロキシ基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン
基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、サルフェート基、スルホン酸基
、及びリン酸基等の、有機化学において一般的な官能基のいずれかのうちの1以上を含ん
でいてもよい。また、置換基は、これら基の誘導体、例えば無水カルボン酸及びカルボン
酸ハロゲン化物等を含んでいてもよい。
合わせを含んでいてもよい。
標識体は、マレイミド基を含む。
リジン基を含む。
アセチル基を含む。ハロ基は、ヨード又はブロモであることが好ましい。
NH2である。
。しかし、基Aにおける質量マーカー部分Xが、質量標識体の残りの部分に結合すること
も可能である。
のに適した部分を指すことを意図する。用語「標識体」は、用語「タグ」の同義語である
。本願全体を通して、用語「タンデム質量タグ(TMT)」は、用語「質量標識体」の同
義語である。
本発明の状況で用いられる質量マーカー部分という用語は、質量分析によって検出され
る部分を指すことを意図する。
合を導入することによってマーカーのフラグメント化部位を制御することができるように
、フラグメント化耐性であることが好ましい。
して0個〜3個の二重結合を含み;各Zは、独立して、N、N(R1)、C(R1)、C
O、CO(R1)(即ち、−O−C(R1)−又は−C(R1)−O−)、C(R1)2
、O、又はSであり;Xは、N、C、又はC(R1)であり;各R1は、独立して、H、
置換又は非置換の直鎖又は分枝C1−C6アルキル基、置換又は非置換の脂環式基、置換
又は非置換の芳香族基、或いは置換又は非置換の複素環基であり;yは、0〜10の整数
である;Lは、アミド結合を含む開裂可能リンカーであり;Mは、質量正規化部分である
)
O原子、S原子、若しくはハロゲン原子(例えば、F、Cl、Br、又はI)等の、周期
律表の第IIIA族、第IVA族、第VA族、第VIA族若しくは第VIIA族のいずれ
かに属する1以上の原子及び/又は任意の有機基を含んでいてもよい。
は、直鎖、分枝鎖、又は環状基を含んでいてもよい。これとは独立に、炭化水素基は、脂
肪族基又は芳香族基を含んでいてもよい。また、独立に、炭化水素基は、飽和基又は不飽
和基を含んでいてもよい。
官能基を含んでいてもよい。炭化水素が直鎖又は分枝鎖基を含む場合、1以上の一級、二
級、及び/又は三級のアルキル基を含んでいてもよい。炭化水素が環状基を含む場合、芳
香環基、脂環式基、複素環基、及び/又はこれら基の縮合環誘導体を含んでいてもよい。
したがって、環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、
ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール
、インドール、イミダゾール、チアゾール、及び/又はオキサゾール基、並びに上記基の
位置異性体を含んでいてもよい。
化水素基が好ましい。したがって、炭化水素基は、低級炭化水素(炭素数1〜6)又は高
級炭化水素(炭素数7以上、例えば、炭素数7〜40)であってもよい。環状基の環にお
ける原子数は、特に限定されないが、環状基の環は、3〜10個の原子、例えば、3、4
、5、6、又は7個の原子を含むことが好ましい。
N原子、P原子、O原子、S原子、又はハロゲン原子(例えば、F、Cl、Br、又はI
)等の、周期律表の第IIIA族、第IVA族、第VA族、第VIA族又は第VIIA族
のいずれかに属する1以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。したがって、置換基は、ヒ
ドロキシ基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン
基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、サルフェート基、スルホン酸基
、及びリン酸基等の、有機化学において一般的な官能基のいずれかのうちの1以上を含ん
でいてもよい。また、置換基は、これら基の誘導体、例えば無水カルボン酸及びカルボン
酸ハロゲン化物等を含んでいてもよい。
合わせを含んでいてもよい。
開裂が生じる箇所によっては質量マーカー部分が他の基を含んでいてもよいことを意味す
る。アミド結合のCOとNHとの間のアミド結合でリンカーの開裂が生じる1つの実施形
態では、質量マーカー部分は、以下に示すようにCO基を更に含んでいてもよい。
以下に示すようにCO基及びNH基を更に含んでいてもよい。
基のみを含む。
である。
ある。また、XはCが好ましい。環状単位に存在しないZはSが好ましい。
1)2である。また、XはNが好ましい。また、環状単位に存在しないZは、C(R1)
2が好ましい。
。アミド結合のCOとNHとの間のアミド結合でリンカーの開裂が生じる1つの実施形態
では、上記質量マーカー部分は、以下に示すようにCO基を更に含んでいてもよい。
は、以下に示すようにCO基及びNH基を更に含んでいてもよい。
基のみを含む。
。アミド結合のCOとNHとの間のアミド結合でリンカーの開裂が生じる1つの実施形態
では、上記質量マーカー部分は、以下に示すようにCO基を更に含んでいてもよい。
は、以下に示すようにCO基及びNH基を更に含んでいてもよい。
基のみを含む。
リンカーの構造は、開裂可能である限り特に限定されない。リンカーは、アミド結合を
含むことが好ましい。開裂可能リンカーは、衝突よって開裂可能なリンカーが好ましい。
リンカーは、アミド結合からなることがより好ましい。
めに用いることができるリンカー基について言及する。本発明の質量標識体とそれに共有
結合している生体分子との間に導入される様々なリンカーが当該技術分野において知られ
ている。これらリンカーの一部は、開裂可能であってもよい。Maskos,U.&So
uthern,E.M. Nucleic Acids Research20:167
9−1684,1992に開示されている通り、オリゴエチレングリコール若しくはポリ
エチレングリコール又はこれらの誘導体をリンカーとして用いてもよい。コハク酸系リン
カーも広く用いられているが、これらは、オリゴヌクレオチドの標識を含む用途にはあま
り適していない。その理由は、一般的に、塩基に対して不安定であるので、多数のオリゴ
ヌクレオチド合成機で用いられている塩基を介した脱保護工程に不適合であるためである
。
二官能性リンカーであり、オリゴヌクレオチドに対して本発明を使用するのに好ましいリ
ンカーである。同様に、6−アミノヘキサノールは、適切に官能化された分子を結合させ
るのに有用な二官能性試薬であり、これも好ましいリンカーである。
ることができる。オルト−ニトロベンジル基、特に、2−ニトロベンジルエステル及び2
−ニトロベンジルアミンは、ベンジルアミン結合で開裂する光開裂可能リンカーとして知
られている。開裂可能リンカーについての概説は、様々な光開裂可能リンカー及び化学的
開裂可能リンカーを網羅しているLloyd−Williams et al.,Tet
rahedron 49,11065−11133,1993を参照されたい。
アミノ酸の標識を含む用途において本発明と共に用いることができる開裂可能リンカーと
してビニルスルホン化合物が開示されている。この出願の内容は、参照することによって
援用される。
ンカーとして、ケイ素化合物の使用が開示されている。また、これらリンカーは、特にオ
リゴヌクレオチドの標識を含む用途において本発明と共に用いることができる。この出願
の内容は、参照することによって援用される。
本発明の質量標識体の質量正規化部分の構造は、質量標識体が所望の総質量を確実に有
するのに適している限り特に限定されない。しかし、質量正規化部分は、直鎖又は分枝C
1−C20置換若しくは非置換の脂肪族基及び/又は1以上の置換若しくは非置換のアミ
ノ酸を含むことが好ましい。
C1、C2、C3、C4、C5置換又は非置換の脂肪族基、更により好ましくはC1、C
2、又はC5置換又は非置換の脂肪族基、或いはC1メチル置換基を含む。
酸であってもよく、自然界に存在しないアミノ酸であってもよい。好ましいアミノ酸は、
アラニン、β−アラニン、及びグリシンである。
原子、S原子、若しくはハロゲン原子(例えば、F、Cl、Br、又はI)等の、周期律
表の第IIIA族、第IVA族、第VA族、第VIA族若しくは第VIIA族のいずれか
に属する1以上の原子及び/又は任意の有機基を含んでいてもよい。
は、直鎖、分枝鎖、又は環状基を含んでいてもよい。これとは独立に、炭化水素基は、脂
肪族基又は芳香族基を含んでいてもよい。また、独立に、炭化水素基は、飽和基又は不飽
和基を含んでいてもよい。
官能基を含んでいてもよい。炭化水素が直鎖又は分枝鎖基を含む場合、1以上の一級、二
級、及び/又は三級のアルキル基を含んでいてもよい。炭化水素が環状基を含む場合、芳
香環基、脂環式基、複素環基、及び/又はこれら基の縮合環誘導体を含んでいてもよい。
したがって、環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、
ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール
、インドール、イミダゾール、チアゾール、及び/又はオキサゾール基、並びに上記基の
位置異性体を含んでいてもよい。
化水素基が好ましい。したがって、炭化水素基は、低級炭化水素(炭素数1〜6)又は高
級炭化水素(炭素数7以上、例えば、炭素数7〜40)であってもよい。環状基の環にお
ける原子数は、特に限定されないが、環状基の環は、3〜10個の原子、例えば、3、4
、5、6、又は7個の原子を含むことが好ましい。
N原子、P原子、O原子、S原子、又はハロゲン原子(例えば、F、Cl、Br、又はI
)等の、周期律表の第IIIA族、第IVA族、第VA族、第VIA族又は第VIIA族
のいずれかに属する1以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。したがって、置換基は、ヒ
ドロキシ基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン
基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、サルフェート基、スルホン酸基
、及びリン酸基等の、有機化学において一般的な官能基のいずれかのうちの1以上を含ん
でいてもよい。また、置換基は、これら基の誘導体、例えば無水カルボン酸及びカルボン
酸ハロゲン化物等を含んでいてもよい。
合わせを含んでいてもよい。
本発明の第1、第2、第3、第4、及び第5の態様は、質量分析によって分析する前に
標識ペプチドを選択的に濃縮する手段を更に組み込めることが好ましい。かかる濃縮に用
いられる具体的な方法は、特に限定されず、親和性捕捉リガンドの組み込みを含む多くの
かかる方法が当該技術分野において周知である。親和性捕捉リガンドは、高度に特異的な
結合パートナーを有するリガンドである。これら結合パートナーは、リガンドでタグ付け
された分子を選択的に捕捉することができる。親和性リガンドでタグ付けされた分子が固
相担体に選択的に捕捉され得るように、固相担体を結合パートナーで誘導体化することが
好ましい。好ましい親和性捕捉リガンドはビオチンであり、これは、当該技術分野におい
て公知である標準的な方法によって本発明の質量標識体に導入することができる。特に、
リジン残基は、質量マーカー部分又は質量正規化部分の後に組み込むことができ、これら
部分を介してアミン反応性ビオチンが質量標識体に結合することができる(例えば、Ge
ahlen R.L.et al.,Anal Biochem 202(1):68−
67,“A general method for preparation of
peptides biotinylated at the carboxy ter
minus.”1992;Sawutz D.G.et al.,Peptides12
(5):1019−1012,“Synthesis and molecular c
haracterization of a biotinylated analog
ue of [Lys]bradykinin.”1991;Natarajan S.
et al.,Int J Pept Protein Res40(6):567−5
67,“Site−specific biotinylation.A novel
approach and its application to endothel
in−1 analogues and PTH−analogue.”,1992を参
照されたい)。イミノビオチンも適用可能である。例えば単量体及び四量体のアビジン及
びストレプトアビジンを含むビオチン用の様々なアビジンカウンターリガンドが利用可能
であり、これらは全て多くの固相担体において利用可能である。
部分、及びc−mycエピトープ等の多数のペプチドエピトープが挙げられ、これらに対
するカウンターリガンドとして選択的モノクローナル抗体が存在する。Ni2+イオンに
容易に結合するヘキサヒスチジン等の金属イオン結合リガンドも適用可能である。例えば
、イミノ二酢酸でキレートされたNi2+イオンを提示するクロマトグラフィー樹脂が市
販されている。これら固定化されたニッケルカラムを用いて質量標識体を捕捉することが
できる。更なる選択肢として、親和性捕捉官能基は、適切に誘導体化された固相支持体と
選択的に反応することができる。例えば、ボロン酸は、隣接するシス−ジオール、及びサ
リチルヒドロキサム酸等の化学的に類似するリガンドと選択的に反応することが知られて
いる。
生体分子という用語は、特に限定されず、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリ
ペプチド、アミノ酸、核酸、ホルモン、代謝産物、及び炭化水素が挙げられる。ステロイ
ドは、ホルモンの重要な分類である。ステロイドホルモンの例としては、エストロゲン、
プロゲステロン、及びテストステロンが挙げられる。血漿、血清、尿、又は唾液等の体液
中のホルモンを正確に分析及び定量することがより重要になってきている。例えば、エス
トロゲン及びエストロゲン様化合物は、ホルモン代替療法において重要な役割を果たして
いる。また、エストロゲン及びエストロゲン様化合物の分析及び定量は、乳癌等のエスト
ロゲンに関連する疾患の管理にも役立つ。
別の態様では、本発明は、2以上の反応性質量標識体のセットであって、前記セットに
おける各標識体が上に定義された通りであり、各質量正規化部分によって前記質量標識体
が所望の総質量を確実に有し、前記セットが以下の群:
−共通の質量の質量マーカー部分を有する標識体の群であって、前記群における各標識
体が固有の総質量を有する群;又は
−質量マーカー部分を有する標識体の群であって、各質量マーカー部分が前記群におけ
る他の全ての質量マーカー部分とは異なる質量を有し、前記群における各標識体が共通の
総質量を有する群;
のいずれかを含み、前記セットにおける全ての質量標識体が、質量分析によって互いに識
別可能であるセットを提供する。
ー部分を含み、且つ固有の総質量を有する(第1の標識型)。別の実施形態では、前記セ
ットにおける各標識体は、固有の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ共通の総質
量を有する(第2の標識型)。
の標識が質量分析によって識別可能である限り、両方の種類の標識を含んでいてもよい。
構造を有し、前記セットにおける各質量正規化部分が共通の基本構造を有し、前記セット
における各質量標識体が1以上の質量調整部分を含み、且つ前記質量調整部分が、前記質
量マーカー部分の基本構造及び/又は前記質量正規化部分の基本構造に結合しているか又
は位置していることが好ましい。この実施形態では、前記セットにおける全ての質量マー
カー部分が異なる数の質量調整部分を含み、前記セットにおける全ての質量標識体が、同
数の質量調整部分を有する。
、主鎖、又はコアを有する構造を共有していることを意味する。骨格は、上記式の質量マ
ーカー部分又は上に定義された質量正規化部分を含むが、アミド結合によって結合されて
いる多数のアミノ酸を更に含んでいてもよい。しかし、アリールエーテル単位等の他の単
位が存在していてもよい。骨格又は主鎖は、共通の基本構造を変化させることなしに、前
記骨格又は主鎖から懸垂している置換基を含んでいてもよく、前記骨格又は主鎖の中に原
子若しくは同位体置換を含んでいてもよい。
い。しかし、前記セットが2以上、3以上、4以上、又は5以上の標識体を含むことが好
ましく、6以上の標識体を含むことがより好ましく、8以上の標識体を含むことが最も好
ましい。
ー部分、開裂可能リンカー、質量正規化部分、及び質量標識体の任意の他の成分の質量の
合計を指す。
量標識体間で異なっていてもよい。例えば、質量の異なる質量マーカー部分を有するが、
総質量は共通である標識体の群をセットが含む場合、質量正規化部分の質量は、セットに
おける各質量標識体によって異なる。この場合、個々の質量標識体における質量正規化部
分の質量は、共通の総質量から、前記質量標識体における特定の質量マーカー部分の質量
を減じ、更に開裂可能リンカーの質量を減じたものに等しい。共通の質量の質量マーカー
部分を有するが、総質量は異なる標識体の群をセットが含む場合、群中の全ての標識体の
総質量が異なるように質量正規化部分の質量を変動させる必要があることは明らかである
。
たがって、質量分析計によって質量標識体を区別することができる、即ち、個々の質量標
識体に由来するピークを互いに明確に分離することができる。質量マーカー部分又は質量
標識体間の質量差は、異なる質量標識体又は質量マーカー部分に由来するイオンを質量分
析計で区別可能であることを意味する。
M(D)y−L−X(D)z
(式中、Mは、質量正規化部分であり、Xは、質量マーカー部分であり、Dは、質量調
整部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、y及びzは、0以上の整数であり、y+
zは、1以上の整数である。Mは、フラグメント化耐性基が好ましく、Lは、別の分子又
は原子との衝突によってフラグメント化しやすいリンカーであり、Xは、プレイオン化さ
れたフラグメント化耐性基が好ましい。)
トの全てのメンバーについて同一である。MとXとは、同じ基本構造又はコア構造を有す
ることが好ましく、この構造は、質量調整部分によって修飾される。質量調整部分は、M
とXとの質量の合計がセットにおける全ての質量標識体について確実に同じになるが、各
Xが確実に異なる(固有の)質量を有するようにする。
(a)質量マーカー部分及び/又は質量正規化部分内に位置する同位体置換基、及び
(b)質量マーカー部分及び/又は質量正規化部分に結合している置換原子又は基。
、13C又は18O同位体置換基から選択される。
有するAを含む。
X(*)n−L−M(*)m
(式中、Xは、質量マーカー部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、Mは、質量正
規化部分であり、*は、同位体質量調整部分であり、n及びmは、0以上の整数であり、
前記セットにおける各標識が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固有
の総質量を有する;又は前記セットにおける各標識が、固有の質量を有する質量マーカー
部分を含み、且つ共通の総質量を有する)
識体は、0、1、又はそれ以上の*を含み、
前記セットにおける各標識体が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固
有の総質量を有する;又は前記セットにおける各標識体が、固有の質量を有する質量マー
カー部分を含み、且つ共通の総質量を有する)
前記セットにおける各標識体が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固
有の総質量を有する;又は前記セットにおける各標識体が、固有の質量を有する質量マー
カー部分を含み、且つ共通の総質量を有する)
前記セットにおける各標識体が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固
有の総質量を有する;又は前記セットにおける各標識体が、固有の質量を有する質量マー
カー部分を含み、且つ共通の総質量を有する)。
量標識体を含む。
ことを表し、前記セットにおける各標識体は、0、1、又はそれ以上の*を含み、
前記セットにおける各標識体が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固
有の総質量を有する;又は前記セットにおける各標識体が、固有の質量を有する質量マー
カー部分を含み、且つ共通の総質量を有する)
、以下の構造を有する6個の反応性質量標識体を含む。
は、以下の構造を有する6個の反応性質量標識体を含む。
する6個の反応性質量標識体を含む。
本発明の更なる態様では、上に定義された質量標識体の2以上のセットを含む質量標識
体のアレイであって、前記アレイにおける任意の1セットの質量標識体の各々の総質量が
、前記アレイの他の全てのセットの質量標識体の各々の総質量と異なるアレイを提供する
。
列修飾基を含み、任意の1セットの質量標識体の各々における質量系列修飾基は、アレイ
における他の全てのセットの質量標識体の各々における質量系列修飾基と異なる質量を有
する。
アイソバリック質量タグの多重化率を6〜8に高めることによってプロテオミクス研究
の改善がもたらされることから、アイソバリック質量タグの多重化容量を更に高めること
が望まれている。全ての利用可能な原子が置換された場合、現在のTMTコア構造は潜在
的に9重セットまで可能であるが、対応するレポーターイオンの強度が低下するので、ア
イソバリック試薬の任意のセットにおいて6を遥かに超えて多重化率を高めると定量の性
能が悪影響を受ける可能性がある。このレベルを超えると、多くのタンパク質で検出限界
を下回り、定量の正確性が低下する可能性がある。更に、より高い多重化率を有するアイ
ソバリックな試薬1セットの製造コストは、非常に高くなると考えられる。
することによってアイソバリックTMT6重試薬の複数のセットを提供することである。
米国特許第7,294,456号明細書は、アイソバリック質量タグを質量系列修飾基に
結合させることによってアイソバリック質量セットのアレイを提供するための1つのアプ
ローチを記載している。米国特許第7,294,456号明細書に提供されている例は、
フッ素、メチル基又は様々な数の環状アリールエーテルによる様々なレベルの置換を使用
する。これらアプローチは所望の目的を達成するが、質量系列修飾基に同一ではない構造
を使用すると、クロマトグラフィーの保持時間に影響を与えたり、1次元又は2次元のゲ
ル電気泳動で共遊走したりするリスクがある。
体でドープされた質量系列修飾基が開発されている。更に、既存の質量標識体に質量系列
修飾基を付加する合成方法を用いて、複数のセットの合成を簡略化し、且つペプチドのM
S/MSスペクトルのサイレント領域に存在することが知られている同じコア構造及びレ
ポーター種(質量マーカー部分)を保持する。
域という用語は、標識されたペプチドのフラグメント化によって生成されるフラグメント
の存在に関連するピークによって引き起こされるバッククラウンド「ノイズ」の少ない質
量スペクトルの領域を指すことを意図する。MS/MSスペクトルは、緩衝試薬、変性剤
、及び界面活性剤等の汚染物質がMS/MSスペクトルに現れないように、MSモードに
おける1つのピークのフラグメント化によって得られる。このように、MS/MSモード
における定量は有利である。したがって、サイレント領域という用語は、検出される生体
分子に関連するピークによって引き起こされる「ノイズ」の少ない質量スペクトルの領域
を指すことを意図する。検出される生体分子がペプチド又はタンパク質である場合、質量
スペクトルのサイレント領域は、200ダルトン未満である。検出される生体分子がDN
A、RNA、オリゴヌクレオチド、又は核酸塩基である場合、質量スペクトルのサイレン
ト領域は500ダルトン未満である。
、18、24、及び30個の個々の質量タグを有する2、3、4、又は更には5セットの
TMT6重セットを生成することができる。かかるセットは、同じ試薬中で組み合わせら
れた同位体的且つアイソバリックな特徴を有するので、多重化容量が高まる。
修飾基の性質は特に限定されない。質量系列修飾基は、既存のTMTコア分子に容易にカ
ップリングできるように遊離アミノ基を有することが好ましい。質量系列修飾基は、タン
パク質、核酸、脂質、又は糖における官能基と反応することができる反応性基を更に有す
ることが更に好ましい。或いは、質量系列修飾基は、かかる反応性を提供するために容易
に誘導体化することができる。
れは、遊離アミン含有質量シリーズ変更試薬と容易に反応することができる遊離カルボキ
シル酸部分を含有する。
体であって、以下の構造を含む質量標識体を提供する。
X−L−M−S−Re
(式中、Xは、質量マーカー部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、Mは、質量正
規化部分であり、Sは、以下の基を含む質量系列修飾基であり、Reは、前記質量標識体
を前記生体分子に結合させるための反応性官能基である。
ともCH2であり、且つnは1であり;mは、少なくとも1であり、mは、1〜10であ
ってよく、1〜5が好ましく、1又は2がより好ましく、1が最も好ましい))
2がより好ましく、1が最も好ましい)
れる任意の反応性官能基を含む質量標識体に質量系列修飾基を組み込むことができること
が理解される。反応性官能基は、上記a)〜d)のいずれかに定義されるものであること
が好ましい。
子のアミン基と反応するように設計される。
換又は非置換の脂環式基、置換又は非置換の芳香族基、或いは置換又は非置換の複素環基
から選択される)
列修飾基を含む。
ともCH2であり、且つnは1であり;mは、少なくとも1であり;任意の1セットの質
量標識体の各々の質量系列修飾基は、様々な数の同位体質量調整部分*が存在することに
よって、アレイにおける他の全てのセットの質量標識体の各々における質量系列修飾基と
は異なる質量を有する)
−βAlaジペプチジル質量系列修飾基が調製される。別の実施形態では、様々なレベル
の重同位体原子と交換することができるアミノヘキサン酸質量系列修飾基が調製される。
基は、様々な数の同位体質量調整部分*が存在することによって、アレイにおける他の全
てのセットの質量標識体の各々における質量系列修飾基とは異なる質量を有する)
a)質量標識体の第1のセットであって、前記セットにおける各質量標識体が、以下の
構造を有する質量修飾基を含む第1のセットと;
構造を有する質量修飾基を含む第2のセットと;
を有する質量修飾基を含む第3のセットとを含む。
構造のアレイを示す。図11では、βAla−βAlaジペプチジル質量系列修飾基を強
調している。図12は、アレイの様々な構成要素についての合成ストラテジを示す。個々
の合成は、出発形態が異なるレベルの同位体置換を有するDMP−bALA及びbALA
基本単位であることを必要とする。同位体質量タグのセットのアレイを形成するために、
DMP−βALA基は、国際公開第2007/012849号パンフレットに開示されて
いる通常のTMT2重置換又はTMT6重置換を有する。この方法によって、4重、6重
、12重、又は18重のアレイが形成される。別の同位体置換を組み込んで、異なるオフ
セット質量及び/又は多重化率を得ることができることが理解されるであろう。
するための比較的容易な経路が提供されるが、それは、更なる開裂可能なアミド結合をタ
グに導入することを含む。これらは、質量分析計においてフラグメント化され、MS/M
Sスペクトルにおいて更なるイオンを生成する。これは多くの用途では特に不都合がある
訳ではないが、かかる更なるフラグメント化を避けることが好ましい場合がある。1つの
別のアプローチは、アミノヘキサン酸等の単長鎖アミノ酸を使用することである。アミノ
ヘキサン酸は、安定な重同位体等価物で置換することができる9個の原子を有し、これが
10Da以下の質量差をもたらす。本発明のこの態様を立証するために、アミノヘキサン
酸の軽い形態又は重い形態で伸長されたコアDMP−βALAを用いて一対の同位体TM
Tを合成した。図13は、2つの可能な構造を示し、重同位体置換を有するアミノヘキサ
ン酸における原子が所望のオフセット質量をもたらすことを示す。図14は、アミノヘキ
サン酸質量標識体を合成する方法を示す。
本発明は、質量標識された生体分子を提供する。また、本発明は、質量標識された生体
分子のセット及びアレイを提供する。
好ましく、各組み合わせは、質量標識体のセットにおける各質量標識体の存在若しくは不
在及び/又は生体分子に結合している各質量標識体の量によって識別される。上述の通り
、これは、本発明の「混合モード」と呼ばれるが、その理由は、質量標識体の混合物に生
体分子が結合することができるためである。
質量分析計の必須の特徴は以下の通りである。
導入系→イオン源→質量分析計→イオン検出器→データ捕捉システム
本発明の幾つかの態様では、質量分析法による分析前にサンプルの複雑さを軽減するた
めに、クロマトグラフィー又は電気泳動によって分離することが好ましい。各種の質量分
析法技術は、特にキャピラリーゾーン電気泳動法及びHPLC(高速液体クロマトグラフ
ィー)等の分離技術に対応している。但し、固体表面から物質を除去するMALDI及び
FAB(後述する)等のイオン化技術は、クロマトグラフィーによる分離にあまり適して
いないので、分離が必要な場合はイオン化源の選択が若干制限される。殆どの目的におい
て、これらのうちの1つによりクロマトグラフィーによる分離と質量分析とをインライン
で接続するには非常に多くのコストがかかっていた。動的FABやエレクトロスプレー、
熱スプレー及びAPCI等のスプレーによるイオン化技術は全て、クロマトグラフィーに
よる分離と容易にインラインで対応しており、かかる液体クロマトグラフィー質量分析を
実施するための装置は市販されている。
多くの生物学的な質量分析計の用途では、所謂ソフトイオン化技術が使用される。これ
により、タンパク質及び核酸等の大きな分子をほぼ無傷でイオン化することができる。そ
して、液相技術を用いると、大きな生体分子を穏やかなpHの低濃度溶液で、質量分析計
に導入することができる。多数の技術が本発明を用いるのに適しており、例えば、ESI
−MS(エレクトロスプレーイオン化質量分析法)、FAB(高速原子衝撃イオン化質量
分析法)、MALDI−MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法)及び
APCI−MS(大気圧化学イオン化質量分析法)が挙げられる。ただし、これらに限定
されるものではない。
エレクトロスプレーイオン化法には、アナライト生体分子の希釈溶液を質量分析計にお
いて「微細化」する、即ち、微細スプレーとして注入する必要がある。例えば、充填され
た針の先端から乾燥窒素流及び静電場に溶液を噴霧する。イオン化のメカニズムは完全に
は明らかになっていないが、概して以下のようなものであると考えられている。溶媒が窒
素流において蒸発し、小さな液滴となり、アナライト分子を濃縮させる。殆どの生体分子
は実効電荷を有していることから、溶解した分子の静電反発が高まる。蒸発するにつれ、
この反発は最終的に液滴の表面張力よりも大きくなり、液滴が小さな液滴に分解される。
このプロセスは、時にクーロン爆発とも呼ばれる。静電場は、液滴の表面張力を更に上昇
させ、噴霧プロセスを容易にするのに役立つ。小さな液滴になっても蒸発が継続し、結果
として、全ての溶媒のように、生体分子が本質的に気相となるまで繰り返し爆発が起こる
。この技術は他の技術と比べ、イオン化の過程においてイオンに付加するエネルギーが比
較的少量であり、集団内のエネルギーが比較的狭い範囲に分布するので、質量標識体の使
用において特に重要である。適切に配置された電極による電場を使用することにより、イ
オンが加速しイオン化室から出てくる。電場の極性を変化させて、陰イオン又は陽イオン
を抽出してもよい。これら電極間の電位差によって、質量分析機に導入されるのが陽イオ
ンであるか陰イオンであるかが決定され、また、これらイオンを質量分析計に入れる運動
エネルギーも決定される。このことは、質量分析計におけるイオンのフラグメント化を考
慮する場合に重要である。イオン集団に付加されるエネルギーが多いほど、アナライト分
子とイオン源に存在する浴ガスとの衝突によりフラグメント化が生じやすくなる。イオン
化室からのイオンを加速させるのに用いられる電場を調整することにより、イオンのフラ
グメント化を制御することができる。標識した生体分子からタグを取り除く手段としてイ
オンのフラグメント化が用いられる場合、これは特に有利である。エレクトロスプレーイ
オン化法は、LC−MS(液体クロマトグラフィー質量分析法)と呼ばれる液体クロマト
グラフィーとインラインで用いることができるので特に有利である。
MALDIでは、大きくモル過剰である光励起性「マトリックス」に生体分子溶液を包
埋する必要がある。適切な周波数を有するレーザー光を用いることにより、マトリックス
が励起されて、捕捉されている生体分子と共にマトリックスが急速に蒸発する。プロトン
が酸性マトリックスから生体分子に移動すると、特に飛行時間(TOF)質量分析等の陽
イオン質量分析で検出できるプロトン化形態の生体分子を増加させることができる。MA
LDI−TOFによって陰イオン質量分析も行うことができる。この技術だと、イオンに
大量の並進エネルギーを与えることができるにも関わらず、余分なフラグメント化を誘導
せずにすむ傾向がある。また、加速電圧をフラグメント化の制御に再度用いることもでき
る。
高速原子衝撃(FAB)を用いて、比較的不揮発性である分子の気化及びイオン化する
ための多くの技術を説明する。これら技術では、サンプルとキセノン原子又はセシウムイ
オンの高エネルギービームとの衝突により表面からサンプルが脱離する。そして、一般的
には不揮発性材料(例えば、m−ニトロベンジルアルコール(NBA)又はグリセロール
)である単純マトリックスの表面をサンプルでコーティングする。FAB技術も液相導入
系に対応しており、キャピラリー電気泳動導入系又は高圧液体クロマトグラフィー系から
溶出する液体はフリットを通過し、アナライト溶液でフリット表面を本質的にコーティン
グし、原子衝撃により前記フリット表面から前記アナライト溶液をイオン化させる。
タンパク質のタグを同定するために、本発明では衝突解離によるペプチドのフラグメン
ト化を用いる。様々な質量分析機を用いて、ペプチドをフラグメント化し、そのフラグメ
ントの質量を決定することができる。
タンデム型質量分析計によって、衝突解離(CID)により所定の質量電荷比を有する
イオンを選択し、フラグメント化することが可能である。次いで、フラグメントを検出し
、選択したイオンの構造情報を得ることができる。タンデム型質量分析計でCIDにより
ペプチドを分析すると、特徴的な開裂パターンが観察され、これによってペプチド配列を
決定することができる。天然ペプチドは、一般的に、ペプチド主鎖のアミド結合において
無作為にフラグメント化し、そのペプチドに特徴的なイオンシリーズが得られる。イオン
の電荷がイオンのN末端フラグメントに保持される場合、n番目のペプチド結合における
開裂に対するCIDフラグメントシリーズはan、bn、cn等と表される。同様に、電
荷がイオンのC末端フラグメントに保持される場合、フラグメントシリーズはxn、yn
、zn等と表される。
C末端にリジン又はアルギニン側鎖を有するペプチドを生成するので、タンデム質量分析
にとって好ましい開裂剤である。これは二重荷電イオンの形成に有利であり、前記二重荷
電イオンは分子の両末端に荷電中心が存在する。CIDを行うと、これら二重荷電イオン
からC末端イオンシリーズ及びN末端イオンシリーズが生成され、これを手がかりにして
ペプチド配列を決定する。一般的に、所与ペプチドのCIDスペクトルでは、1又は2の
イオンシリーズしかみられない。四重極装置に通常用いられる低エネルギー衝突では、N
末端フラグメントのbシリーズ及びC末端フラグメントのyシリーズのいずれかが多い。
二重荷電イオンを分析する場合には両方のシリーズが検出されることが多いが、一般には
yシリーズイオンがbシリーズよりも多い。
ロン構造が形成され、プロトン化アミド結合が開裂するというメカニズムを通してペプチ
ドがフラグメント化される(Schlosser A.and Lehmann W.D
. J.Mass Spectrom.35:1382−1390,“Five−mem
bered ring formation in unimolecular rea
ctions of peptides:a key structural elem
ent controlling low−energy collision ind
uced dissociation”,2000)。
む三連四重極型である。この衝突四重極は2つの質量分析機の四重極間のイオンガイドと
して機能する。ガスを衝突四重極に導入して、第1の質量分析機からのイオン気流と衝突
させることができる。第1の質量分析機は、質量電荷比に基づいて、フラグメント化が行
われる衝突セルを通過するイオンを選択する。フラグメントイオンは、第3の四重極で分
離され、検出される。誘起開裂は、タンデム分析機以外のジオメトリーで実施されてもよ
い。イオントラップ質量分析計は、トラップされたイオンが衝突するガスをトラップに導
入することを通してフラグメント化を促進する。イオントラップは、一般的にヘリウム等
の浴ガスを含有するが、例えばネオンを更に加えることによりフラグメント化が促進され
る。同様に、トラップされたイオンをフォトン誘導フラグメント化することもできる。他
の好ましいジオメトリーは、高走査速度の四重極と高感度のレフレクトロンTOF質量分
析機とを接続してフラグメント化生成物を同定する四重極/直交飛行時間タンデム装置で
ある。
。セクター型質量分析機は2の別々の「セクター」からなり、電気セクターがイオンビー
ムに焦点を合わせると、イオンビームがイオン源を離れ、電場により同じ運動エネルギー
を持つイオン流となる。磁気セクターは、質量に基づいてイオンを分離し、検出器でスペ
クトルを生成する。タンデム質量分析では、電気セクターが第1の質量分析機として設け
られ、磁気セクターが第2の質量分析機として設けられ、これら2つのセクター間に衝突
セルが設けられるこの種の2つのセクター型質量分析機を使用することができる。衝突セ
ルで分離された2つの完全なセクター型質量分析機は、質量タグ付けされたペプチドの分
析にも使用することができる。
イオントラップ質量分析機は四重極質量分析機に関連している。一般的に、イオントラ
ップは3つの電極で構成され、円筒状電極及び各端の「キャップ」電極により空洞が形成
される。円筒状電極に交流高周波電位を印加し、キャップ電極にはDC又はAC電位でバ
イアスをかける。空洞に注入されたイオンは、円筒状電極の振動電場により安定した円軌
道に拘束される。しかし、特定のイオンは、所与の振幅の振動電位に対して不安定な軌道
をとり、トラップから放出される。振動高周波電位を変化させることによって、トラップ
に注入されたイオンのサンプルを質量電荷比に従ってトラップから連続的に放出すること
ができる。次いで、放出されたイオンを検出することにより、質量スペクトルが得られる
。
ヘリウムで稼働する。これにより、装置の解像度及び感度の両方が増加し、また、トラッ
プに入ったイオンは、浴ガスとの衝突を通して浴ガスの周囲温度まで本質的に冷却される
。衝突すると、サンプルをトラップに導入したときのイオン化は増加するが、それと共に
イオン軌道の振幅及び速度が低下して前記イオン軌道がトラップの中心付近に保持される
。これは、振動電位を変更すると、軌道が不安定になったイオンは、低下した循環イオン
に比べてより急速にエネルギーを獲得し、緊密な束となってトラップから飛び出し、その
結果、より狭く且つより大きなピークが生じることを意味する。
、多重質量分析計のジオメトリーに類似させることによって、トラップされたイオンを複
雑に分析することができる。サンプル由来の単一の質量種はトラップに保持できる。即ち
、他の全ての種をトラップから放出させることができ、第1の振動周波上に第2の振動周
波を重ねることにより保持した種を慎重に励起することができる。次いで、励起されたイ
オンは浴ガスと衝突し、十分に励起されるとフラグメント化する。次いで、このフラグメ
ントを更に分析することができる。他のイオンを放出し、次いでフラグメントイオンを励
起してフラグメント化することにより、更に分析するためにフラグメントイオンを保持す
ることも可能である。更なる分析を行うのに十分なサンプルが存在する限り、このプロセ
スを繰り返してもよい。留意すべき点として、これらの装置は、一般的に、フラグメント
化が誘導された後のフラグメントイオンを高い割合で保持する。これらの装置及びFTI
CR質量分析計(後述する)は、線形質量分析計においてみられる空間分解タンデム質量
分析ではなく、時間分解タンデム質量分析の形態を表すものである。
FTICR質量分析計は、イオンサンプルが空洞内に保持されるという点でイオントラ
ップに類似する特徴を有する。しかし、FTICR MSでは、交差電磁場により高真空
室にイオンがトラップされる。箱の2つの側面を形成する一対の平板電極によって電場が
形成される。この箱は超伝導磁石の磁場に収容される。前記磁石は、2枚の平板、即ちト
ラッピングプレートと共に、前記トラッピングプレート間に有し、且つ印加された磁場に
直交する円軌道に注入されたイオンを拘束する。箱の他の対向する側面を形成する2枚の
「送信板」に高周波パルスを印加すると、イオンはより大きな軌道に励起される。イオン
のサイクロイド運動により、「受信板」を含む箱の残り2つの対向する側面に対応する電
場が発生する。イオンは、励起パルスによってより大きな軌道に励起されるが、イオンの
固有運動が衝突によって失われるにつれこの軌道は崩壊する。受信板によって検出された
対応シグナルは、FT(フーリエ変換)分析により質量スペクトルに変換される。
施することができる。対象の単一種を除く全てのイオンをトラップから放出することがで
きる。衝突ガスをトラップに導入し、フラグメント化を誘起することができる。次いで、
フラグメントイオンを分析することができる。一般的に、フラグメント化生成物と浴ガス
とが結合すると、「受信板」によって検出されたシグナルのFT分析によって分析する場
合に解像度が低くなる。しかし、フラグメントイオンを空洞から放出させ、例えば四重極
タンデム分析器で分析することができる。
本発明の好ましい実施形態では、質量分析によって分析する前に、標識された生体分子
をクロマトグラフィーで分離する。これは、ペプチドをクロマトグラフィーカラムから溶
出しながらペプチドをインライン分析するために質量分析計に直接接続することができる
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いることが好ましい。HPLCによって様
々な分離技術を行うことができるが、質量分析前にペプチド分離するには逆相クロマトグ
ラフィーが一般的な方法である。別の分離方法は、溶出サンプルを自動的に分析するため
に質量分析計に直接接続することができるキャピラリーゾーン電気泳動である。これら及
び他の分画技術を用いて、質量分析前の生体分子の混合物の複雑性を低下させることがで
きる。直交分離等、分離技術を組み合わせて用いてもよい。
本発明の更なる態様は、質量分析による分析方法において上に定義された反応性質量標
識体を使用することによって提供される。
記生体分子を検出することを含み、前記質量標識体が上に定義された質量標識体である分
析方法も提供される。
1. 上に定義された反応性質量標識体と生体分子とを反応させる工程と;
2. 標識された前記生体分子を分離する工程と;
3. 前記生体分子に関連付け可能な前記質量標識体を質量分析によって同定する工程。
2.は、逆相高圧液体クロマトグラフィー、カチオン交換、又はサイズ排除クロマトグラ
フィーによって、標識されたアナライトから標識されていないアナライトを分離すること
を含む。
<ジメチルピペリジン−βアラニン−ジチオピリジン:システイン反応性質量標識体の合
成>
DMPip−βALA−Osu構造の便利な特徴は、スクシンイミドエステル反応基と
反応させることによって別の反応性を容易に生じさせることができる点である。したがっ
て、出発点及び一般的に入手可能な基本単位として国際公開第2007/012849号
パンフレットに既に開示されている、公知のTMT(タンデム質量タグ又は質量標識体)
構造を用いて、アミノ反応性化合物をそれぞれのシステイン反応性化合物に変換するもう
1つの工程のみを必要とする反応スキームを設計した。本発明者らは、先ず、収率の高い
単一反応で市販の化合物からジチオピリジン修飾試薬を合成した。次いで、この試薬をD
MPip−βALA−Osuと反応させて、DMPip−βALA−DTP試薬を生成し
た(図2を参照されたい)。HPLC、MS、及びMS/MSによる分析から正確な構造
及び純度が>90%であることが明らかになった。
<DMPip−βALA−DTPを用いる合成ペプチドの標識>
次いで、品質の制御されているDMPip−βALA−DTP試薬を適用して標識プロ
トコールを開発した。UV読み取り型HPLCによって反応の進行を容易にモニタリング
できるように、個々のシステイン含有ペプチド(H−Vat−Ala−Thr−Val−
Cys−Leu−Pro−Arg−OH)を選択した。本質的に完全に標識されるプロト
コールを開発した。0.1%SDSを含む100μLのTEAB(100mM、pH8.
5)に50μgのBSAを溶解させた。55℃で1時間、1mMのトリス[2−カルボキ
シエチル]ホスフィン*HClで還元した後、5mMのDMPip−βALA−DTP(
200mMのメタノール原液として提供される)でCys残基を標識した。RP及びSC
Xカートリッジを用いて反応混合物を精製することによって、高度に精製された形態の修
飾ペプチドが得られた。図3は、標識反応における個々の種のHPLCモニタリングを示
す。
<ステロイド分析のための質量標識体の合成>
ホルモンの分析は、一般的に、放射免疫測定法及び比色分析又は化学発光酵素免疫測定
法により実施される。しかし、現在の免疫測定法は、アッセイ1回当たり1つのステロイ
ドホルモンしか定量検出できないという制限があり、特異性に欠ける場合があり、また、
かかる交差反応性の結果として、異なる製造業者のキットを用いた場合、同一サンプルの
定量結果に最高15倍の差がみられる場合があり不都合である。
GC−MS)である。GC−MSは、高感度且つ特異的であるが、サンプル調製が面倒で
時間がかかる。液体クロマトグラフィー・質量分析(LC−MS)及び液体クロマトグラ
フィー・タンデム質量分析は、同様に特異的であり、多くの場合上記のような複雑なサン
プル誘導体化工程を行わなくてもよいより簡便なサンプル調製アプローチを提供する。近
年、ステロイドホルモンの測定について、異なるイオン源を用いるLC−MSに基づく方
法が多数報告されている。複数の反応モニタリングモード(MRM)における安定な同位
体希釈タンデムMSによって、単一サンプル中の多数のステロイドを迅速且つ同時に定量
することが可能となる。一般的に、かかるアッセイの場合、ステロイドは、カルボニル官
能基においてジラールPヒドラゾンに誘導体化され、ピコグラム未満のレベルの高い感度
を有するタンデムMSによって同定することができる。カルボニル基でステロイドを誘導
体化することが特に好ましいが、ピコリニル又はジメチルグリシンエステルへの誘導体化
等、ヒドロキシル基における他の誘導体化を用いてもよい。用いられる誘導体化に関わら
ず、この方法は、中性ステロイドの定量に特に有用である。
、依然として、一度に1サンプルしか分析することができないという制限がある。同時に
複数のサンプルにおける複数のステロイドを分析することができる別の誘導体化試薬を提
供することが好ましい。或いは、質量タグを用いて幾つかのサンプル及びレファレンス標
準物質からステロイドを誘導体化できることが特に望ましく、これによって単一アッセイ
で全てのサンプルを混合及び複合分析することが可能となる。現在知られているTMT試
薬は、かかる混合能を提供するが、カルボニル基又はヒドロキシル基を介してステロイド
を標識するために必要な反応性基が欠けている。
するために、カルボニル反応性を有する新規アイソバリックタンデム質量タグを調製した
。
Tコア分子をジ−(N,N’−スクシンイミジル)カーボネート(DSC)で活性化し、
ヒドラジンと反応させて、ジメチルピペリジン−βアラニン−ヒドラジンタグを形成した
。
性化し、Boc−保護アミノキシプロピルアミンと反応させて、アミノキシプロピル反応
性基を形成した。これらのタグを用いて、ステロイドを誘導体化して、それぞれヒドラゾ
ン又はO−アルキルオキシムを得た。これらは、LC−タンデムMSによって定量化され
る。TMTタグの使用は、現在の分析方法を超える幾つかの利点をもたらす。塩基部分を
導入することによって、LC−MSにおいて中性ステロイドでさえもイオン化でき、感度
が改善される。前記タグは、カルボニル基を有する全てのステロイドと反応するので、単
一サンプル中の多数のステロイドを分析することができる。アイソバリック形態では、こ
れら試薬は、1回の実験で幾つかのサンプルを同時に定量し、比較することができる。
。
<DMPip−βAla−ヒドラジドによるステロイドの標識>
テストステロン、ナンドロロン、及びベータメタソンという3つのステロイドを、同位
体でドープされていないDMPip−βAla−ヒドラジドで標識し、LC−MS/MS
分析に供した。この分析について簡潔に述べる。まず、10mgのこれらステロイド混合
物を1mLのC2H5OH/CH3CO2H/H2O(7:1:2)に溶解させた。これ
に、10mgのDMPip−βAla−ヒドラジドを添加し、混合物を30分間70℃で
加熱した。標識が完了した後、Sep−PAK C18カラムに通すことによって混合物
を清浄化し、その後、LTQ−Orbitrap(Thermo Scientific
)を用いて、LC−MS/MSにより分析した。図7から、誘導体化ステロイド混合物の
MSプロファイルを示し、テストステロン(T+H)、ナンドロロン(N+H)、及びベ
ータメタソン(B+H)のピークが明らかに示されていることがわかった。
生じ、ステロイドを同定することができた。更に、m/zが126.1Daである、固有
のDMPip−βAla−ヒドラジドタグから誘導されたイオンが生じた。このフラグメ
ントは、コアTMT質量標識体分子の質量レポーター基(質量マーカー部分)であり、同
定されたステロイドの定量に用いられる。一連のアイソバリックDMPip−βAla−
ヒドラジドタグを用いる場合、幾つかのステロイド含有サンプルを標識し、次いで、後続
の分析のために前記サンプルを混合することができる。この場合、TMT誘導レポーター
イオンの存在量により、それぞれのサンプルにおいて同定されたステロイドが定量される
。図8は、ナンドロロン及びテストステロンのMS/MSプロファイルを示す。
<例示的なTMTアレイ試薬の性能>
βアラニン及びアミノヘキサン酸で伸長された試薬は、両方とも、有機溶媒及び有機水
性溶媒への可溶性、並びに標識効率の点で、標準的なTMT試薬と非常に類似する性能を
有することが見出された。したがって、これらの試薬を、標準的なTMT試薬で用いられ
る標識プロトコールを維持し、ウシ血清アルブミン(BSA)のトリプシン分解物を標識
するために用いた。これらのサンプルを精製し、LC−MS/MS分析に供した。
追加のβAla基によってTMTアレイタグの質量が増加しているにも関わらず、新規
TMT試薬で標識された場合も個々のペプチドの溶出は標準的なTMTと比べてそれほど
大きくは変化しないことが見出され、観察されたシフトは1分間未満であった。また、M
S/MS挙動は、標準的な試薬と非常に類似していることが見出された。図15Aは、そ
れぞれDMP−βALA−OSu又はDMP−(βAla)3−OSuのいずれかで標識
されたBSAトリプシン分解物についての合計イオンカウントクロマトグラムを示す。選
択されたペプチドについてのそれぞれのイオン及びそれに対応するMS/MSプロファイ
ルを図15Bに示す。フラグメントイオンは、タグによって誘導される質量シフトを除い
て本質的に同一であり、SEQUESTにおける同定の信頼度は、追加のタグに関連する
フラグメントによる影響を受けないことが分かる。
影響を与える可能性について、更に調べるために、BSAのトリプシン分解物から得られ
た全てのMS/MSスペクトルを詳細に分析した。各追加のアミド結合において更なるフ
ラグメント化が明らかに見られたが、これは、ペプチドの同定スコアには影響を与えると
は思われず、全体的に予測の範囲内であった。必要に応じて、タグに由来するフラグメン
トピークをデータベースサーチから除くことができた。図16は、標準的なTMT試薬及
び2×ベータアラニンで伸長されたTMT試薬の両方についての質量標識体フラグメント
のMS/MSスペクトルを示す。
アミノヘキサン酸残基によって伸長されているTMT試薬で標識したことを除いて同一
のウシ血清アルブミンのトリプシン分解物を用いて同様の実験を実施した。この場合、標
準的なTMT試薬と比べて有意なシフトが観察され、保持時間は最高5分間長かった。他
の調べられた特徴(一般的なMS及びMS/MS挙動、サーチアルゴリズムの有効性、追
加のフラグメント)は、DMPip−(βAla)3−OSu試薬と非常に類似しており
、予測された挙動に従っていた。
<スルホ−テトラフルオロフェニル反応性基を有する質量標識体の合成>
標識の合成は、出発点が対応する酸である1段階反応である。
Claims (24)
- 2以上の反応性質量標識体のセットであって、前記セットにおける各標識体が、以下の構造を含む、質量分析によって検出するために生体分子を標識するための反応性質量標識体であり:
X−L−M−Re
(式中、Xは、以下の基を含む質量マーカー部分であり;
R1は、
R2は、X-L-Mを含み;
R3は、存在せず;
Zは、Oであり;かつ
Bは、-NH2又は-(CH2)n-ONH2であり、nは、1〜6である。)、
各質量正規化部分によって前記質量標識体が所望の総質量を確実に有し、前記セットが以下の群:
−共通の質量の質量マーカー部分を有する標識体の群であって、前記群における各標識体が固有の総質量を有する前記群;又は
−質量マーカー部分を有する標識体の群であって、各質量マーカー部分がその群における他の全ての質量マーカー部分とは異なる質量を有し、前記群における各標識体が共通の総質量を有する前記群;
のいずれかを含み、前記セットにおける全ての質量標識体が、質量分析によって互いに識別可能である、前記セット。 - 以下の構造を含む、質量分析によって検出するために生体分子を標識するための請求項1記載の反応性質量標識体のセット:
X−L−M−S−Re
(式中、Sは、以下の基を含む質量系列修飾基であり:
- Lが、アミド結合である、請求項1又は2記載の反応性質量標識体のセット。
- 前記質量マーカー部分Xが、以下の基:
- 前記質量マーカー部分が、以下の基:
- 以下の構造のうちの1つを有する、請求項1〜5のいずれかに記載の反応性質量標識体のセット:
J及びKが両方ともCH2であり、且つnは1であり;且つ
mは、0を含む任意の正の整数である。)。 - mが、0である、請求項6記載の反応性質量標識体のセット。
- 質量分析による分析方法における、請求項1〜7のいずれかに記載の反応性質量標識体のセットの使用。
- 生体分子に関連付け可能な質量標識体を質量分析によって同定することにより前記生体分子を検出することを含む分析方法であって、前記質量標識体が、請求項1〜7のいずれかに記載の質量標識体である、前記分析方法。
- 1. 請求項1〜7のいずれかに記載の反応性質量標識体と前記生体分子とを反応させる工程と、
2. 標識された前記生体分子を分離する工程と、
3. 前記生体分子に関連付け可能な前記質量標識体を質量分析によって同定する工程とを含む、請求項9記載の方法。 - セットにおける各標識体が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固有の総質量を有する、請求項1〜7のいずれかに記載の反応性質量標識体のセット。
- セットにおける各標識体が、固有の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ共通の総質量を有する、請求項1〜7のいずれかに記載の反応性質量標識体のセット。
- セットにおける各質量標識体が、以下の構造を含む、請求項1〜7、11及び12のいずれかに記載の反応性質量標識体のセット:
M(D)y−L−X(D)z
(式中、Mは、質量正規化部分であり、Xは、質量マーカー部分であり、Dは、質量調整部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、y及びzは、0以上の整数であり、y+zは、1以上の整数である。)。 - 前記質量調整部分が、
(a)前記質量マーカー部分内及び/又は前記質量正規化部分内に位置する同位体置換基、並びに
(b)前記質量マーカー部分に結合している、及び又は前記質量正規化部分に結合している置換原子又は基から選択される、請求項13記載の反応性質量標識体のセット。 - 前記質量調整部分が、ハロゲン原子置換基、メチル基置換基、及び2H、15N、13C又は18O同位体置換基から選択される、請求項13又は14記載の反応性質量標識体のセット。
- セットにおける各質量標識体が、以下の構造を含む、請求項13〜15のいずれかに記載の反応性質量標識体のセット:
X(*)n−L−M(*)m
(式中、Xは、質量マーカー部分であり、Lは、開裂可能リンカーであり、Mは、質量正規化部分であり、*は、同位体質量調整部分であり、n及びmは、0以上の整数であり;
前記セットにおける各標識体が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固有の総質量を有するか;又は
前記セットにおける各標識体が、固有の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ共通の総質量を有する。)。 - 以下の構造を有する2以上の質量標識体を含む、請求項1〜7及び11〜16のいずれかに記載の反応性質量標識体のセット:
前記セットにおける各標識体が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固有の総質量を有するか;又は
前記セットにおける各標識体が、固有の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ共通の総質量を有する。)。 - 以下の構造を有する2以上の質量標識体を含む、請求項1〜7及び11〜16のいずれかに記載の反応性質量標識体のセット:
前記セットにおける各標識体が、共通の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ固有の総質量を有するか;又は
前記セットにおける各標識体が、固有の質量を有する質量マーカー部分を含み、且つ共通の総質量を有する。)。 - 質量調整部分*が、C13又はN15であり、前記セットが、以下の構造を有する6個の反応性質量標識体を含む、請求項17記載の反応性質量標識体のセット:
- 前記質量調整部分*が、C13又はN15であり、前記セットが、以下の構造を有する6個の反応性質量標識体を含む、請求項18記載の反応性質量標識体のセット:
- 請求項1〜7及び11〜20のいずれかに記載の2以上の質量標識体のセットを含む質量標識体のアレイであって、前記アレイにおける任意の1セットの質量標識体の各々の総質量が、前記アレイの他の全てのセットの質量標識体の各々の総質量と異なる、前記質量標識体のアレイ。
- 少なくとも1セットにおける各質量標識体が、共通の質量を有する質量系列修飾基Sを含み、任意の1セットの質量標識体の各々における質量系列修飾基が、アレイにおける他の全てのセットの質量標識体の各々における質量系列修飾基と異なる質量を有する、請求項21記載の質量標識体のアレイ。
- 少なくとも1セットにおける各質量標識体が、請求項2に記載の質量系列修飾基Sを含み、異なる数の同位体質量調整部分*が存在することにより、任意の1セットの質量標識体の各々の質量系列修飾基が、アレイにおける他の全てのセットの質量標識体の各々における質量系列修飾基と異なる質量を有する、請求項22記載の質量標識体のアレイ。
- a)質量標識体の第1のセットであって、前記セットにおける各質量標識体が、以下の構造を有する質量修飾基を含む、前記第1のセットと、
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