JP6371765B2 - 糖尿病治療用医薬組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年7月31日に出願された米国仮出願第61/678,077号の利益を主張する非仮出願であり、その内容全体は引用により本明細書に組み込まれる。
米国特許規則1.821−1.825に要求される配列表を、本出願と共に電子的に提出する。この配列表は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明者らは、「細胞ネットワーク統合及び処理(CNIP)を利用し、成体対象内においてインビボで膵臓ベータ細胞形成が増大し得ることを証明した。CNIPアプローチに従って、本発明者らは、細胞処理における3つの主要な段階で、すなわち(1)第一に、細胞内における炭水化物代謝段階で、(2)第二に、膜受容体機能の段階で、(3)第三に、遺伝子発現段階で、介入する。3つの全ての段階を標的とすることにより、ベータ細胞形成を誘導する相乗的相互作用を起こすことができる。本発明者らは、この方法の一例を、Synerがギリシャ名synergosからの接頭辞であり、IIIはローマ数字の3であることから、「Syner−III」と呼ぶ。
グルコース代謝は、成熟膵臓、又は他の器官若しくは組織におけるベータ細胞形成を誘導するためのCNIPアプローチにおける第一の局面である。グルコースは哺乳類細胞によって利用される主要なエネルギー源であり、グルコースの代謝により、細胞機能及び増殖のためのエネルギーが供給される(Bohnsack及びHirschi,Annu Rev Nutr.24:433−453,2004)。解糖の阻害により細胞周期進行が停止し、増殖を誘導するにはグルコースが必要であることが立証された(Newcombら, Eukaryot.Cell.2:143−149,2003)。インビボにおける膵臓ベータ細胞形成を誘導する要因には、グルコース代謝の増加が含まれる(Bernardら, FASEB J.13:1195−1205,1999;Alonsoら,Diabetes 56:1792−1801,2007)。成体ラットに24時間グルコースを点滴するだけで、ベータ細胞数が約50%増加した(Bernardら,FASEB J.13:1195−1205,1999)。更に、グルコースは、インビトロにおける構成的アポトーシスプログラムを制御することにより、ベータ細胞の生存を促進する(Hoorensら,J.Clin.Invest.98:1568−1574,1996)。グルコース代謝は、膵臓ベータ細胞形成の誘導のための膵臓を準備する。
膜受容体チロシンキナーゼ及び/又はチロシンキナーゼ関連受容体は、成体対象において膵臓ベータ細胞形成を誘導するCNIPアプローチの第二の構成要素である。生理的刺激に続く膵臓ベータ細胞の産生における第二の局面は、膜受容体を通してメッセージを受け取るための細胞に関するものである。膵臓ベータ細胞群の刺激に関与している膜受容体は、受容体のチロシンキナーゼファミリー及び受容体のチロシンキナーゼ関連ファミリー由来のものである。妊娠中は、インスリ抵抗性の発生、及び胎児/胎盤エネルギー需要の上昇に反応して膵臓ベータ細胞の質量が増大し、この効果は、プロラクチン、エストロゲン、及び胎盤性ラクトゲンの分泌の上昇を齎す(Heitら,Annu.Rev Cell Dev.Biol.22:311−338,2006)。ベータ細胞のインスリン分泌の増大による補填が失敗すると、妊娠性糖尿病が引き起こされる。膵島の増大及び細胞過形成が、解剖された妊娠したヒトで観察されている(Van Asscheら、Br.J.Obstet Gynaecol 85:818−820,1978)。膵臓ベータ細胞の質量を増大させる、妊娠中のホルモン刺激(プロラクチン、エストロゲン、及び胎盤ラクトゲン)は、チロシンキナーゼ関連受容体を通して作用する(Nielsenら、Diabetes 50(Suppl.1):S25−S29,2001)。ベータ細胞の質量を増加させる他のホルモンは、受容体のチロシンキナーゼファミリーを通して作用し、肝細胞増殖因子、血小板由来成長因子, 成長ホルモン、インスリン、IGF−1、EGFを含む(Nielsen et al., Diabetes 50(Suppl. 1): S25−S29, 2001)。注目すべきことに、ベータ細胞質量についてのこれらのホルモンの効果も、グルコース代謝に依存している。グルコースの非存在下で、膵臓ベータ細胞の質量を増大させるという、チロシンキナーゼファミリーを介したホルモンの作用は消失している(Cousinら、Biochem.J.344:649−658,1999)。すなわち、CNIPアプローチは、成熟した膵臓におけるベータ細胞形成を誘導するための、グルコース代謝、膜チロシンキナーゼ、及び/又はチロシンキナーゼ関連受容体の効果を兼ね備えている。
CNIPアプローチにおける第三の局面は遺伝子発現段階に向けられており、転写活性化剤又は転写因子(これらは、グルコキナーゼにより生ずるグルコース代謝効果、代謝/分子効果を収束・集中させる誘因物質(誘因体)として利用される)、並びに成熟膵臓内でベータ細胞を産生するためのチロシンキナーゼ受容体及びチロシンキナーゼ関連受容体が含まれる。「転写」という用語は、遺伝子のDNA配列をRNA産物に複写する工程を意味し、通常、鋳型としてDNAを用い、DNA依存性RNAポリメラーゼにより実施される。全てのシステムは、物理学のようにモジュラー誘因体を有している。カオス系においては、ネットワーク終点は誘因体の影響力に従う。単純な観察から、ある発射体の衝突目標は、推進力の初期力に空気抵抗及び発射体に対する重力の影響を組み合わせたものに依存する。初期影響力、空気抵抗及び重力は、発射体の最終的な目標を決定するための誘引体として相乗的に作用する。生存生物は、「カオス」状態に存在する非線形動的システムであるといえる。転写段階において、とある一組の遺伝子の発現量は一定のままであり、これらの遺伝子は「ハウスキーピング」遺伝子と呼ばれる。これらは、細胞の普遍的な機能を実行するが、他のクラスの遺伝子は、環境刺激に反応して発現する。生理的ストレスに対する膵臓ベータ細胞の適応において、遺伝子発現の上方制御は、膵臓ベータ細胞形成を誘導するために不可欠である(Bouwens及びRooman,Physiol Rev 85:1255−1270,2005)。遺伝子発現段階での、この生理的ストレスに対する適応反応の重要なメディエータは、転写因子の形態におけるモジュラー誘因物質の活性化を必要とする(Albert及びBarabasi,Rev Mod Physics 74:47−97,2002;Albert及びOthmer,J Theor Biol 223,1−18,2003)。したがって、CNIPアプローチには、生理的ストレスへ反応して成熟膵臓でベータ細胞を形成することに関与する(モジュラー誘因物質としての)転写因子が含まれることになる。
特定の態様においては、本明細書に開示された1、2、3種又はそれ以上の治療成分を、1つのあるいは複数の組成物内で混合させることができ、又は併用投与することもできる。一態様においては、1種以上の治療成分は、1、2、3種又はそれ以上の核酸送達ベクター、及び/又は治療剤、の混合物として提供される。このような混合物は、本明細書に開示されるように、経口投与、局所投与又は全身投与することができる。
「核酸ベクター」という用語は、核酸配列を複製、転写及び/又は翻訳(すなわち発現)し得る細胞内に導入するために、核酸配列を挿入することのできる、キャリア核酸分子を意味するために使用される。核酸配列は「外因性」(これはベクターが導入される細胞に対して異物であるか、配列自体は細胞に対して「内因性」であるが、配列の位置が宿主細胞内のの通常ではありえない場所にあること意味する)であっても良い。特定の態様においては、外因性ベクターは、外因性核酸をコードしていても良い。核酸ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスゲノム、及び他の発現ベクター(バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス)、人工染色体(例えば、YACs)等が挙げられる。最近の開示を考慮すると、当業者であれば、標準的組み換え技術により、ベクターの構築設備は十分であろう(例えば、両者とも参照により本明細書に組み込まれる、Maniatisら、Molecular Cloning:A laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,New York.,1989;Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,New York City,NY,John Wiley & Sons,Inc.,1994を参照されたい)。
「プロモータ」とは、転写開始及び転写速度を制御する核酸配列の領域である制御配列である。プロモータには、核酸配列の特定の転写を開始するための、RNAポリメラーゼ及び他の転写因子のような調節タンパク質及び分子が結合することができる遺伝的エレメントを含んでも良い。「制御下」及び「転写制御下」に「動作可能に位置する」、「動作可能に連結する」という語句は、プロモータが、転写開始及び/又は該配列の発現を制御するための核酸配列に関し、正確な機能的位置及び/又は方向にあることを意味する。
コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要な場合がある。これらのシグナルには、ATG開始コドン又は隣接配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性翻訳調節シグナルの提供が必要になる場合ある。当業者は、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができる。開始コドンが、全体の挿入物の翻訳を確実にするための所望のコード配列のリーディングフレームを有する「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然のものであっても、合成の物であってもいずれでもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含ませることによって高めることができる。
ベクターには、多重制限酵素部位を含む核酸領域である多重クローニング部位(MCS)が含まれ、これらのいずれかは、ベクターを消化するための標準的組み換え技術と合わせて使用することができる。「制限酵素消化」は、核酸分子の特定の位置でのみ機能する酵素を用いた、核酸分子の触媒的開裂を意味する。これらの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者に広く理解されている。しばしば、ベクターは制限酵素を用いて線形化又は断片化され、MCS内で外因性の配列をベクターに連結することができる。「連結」は、互いに隣接していてもいなくてもよい2個の核酸断片間にホスホジエステル結合を形成する工程の意味である。制限酵素及び連結反応を含む技術は、組み換え技術の分野の当業者に周知である。
本発明のベクター又は構築物は、通常、少なくとも1個の終結シグナルを含んでいる。「終結シグナル」あるいは「ターミネータ」とは、RNAポリメラーゼによるRNA転写の特定の終結に関与するDNA配列を含む。したがって、特定の実施態様においては、RNA転写物の産生を終了させる終結シグナルを意図する。ターミネータは、所望のメッセージレベルを達成するためにインビボにおいて必要とされる場合がある。
転写後調節は、RNA段階、すなわち、遺伝子の転写と翻訳の間での、遺伝子発現の調節である。特定の態様においては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)が使用される。WPREは、核転写のレベルを上昇させ、RNA核外遊出を促進する。WPREは、効率的に発現するように核内で正常に分解されるRNAを導くRNAプロセシングにおける他の工程を促進することができる。WPREは、新たに合成された転写物を、核内の分解から保護するRNA−タンパク質複合体の生成を促進するように機能することもできる(参照により本明細書に組み込まれる、Zuffereyら,Journal of Virology,73:2886−2892,1999、及び米国特許第6284469号)。
発現、特に真核生物の発現においては、通常、転写物の適切なポリアデニル化を達成するためのポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功には重要でないと考えられ、任意のこのような配列を使用することができる。好ましい実施態様としては、種々の標的細胞において都合がよく、十分に機能することが知られている、SV40ポリアデニル化シグナル、又はウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが挙げられる。ポリアデニル化は、転写物の安定性を増大し、細胞質輸送を促進することができる。
宿主細胞内でベクターを増殖させるために、ベクターは、複製が開始する特定の核酸配列である、複製起点部位(しばしば、「ori」と呼ぶ)を1個以上含んでいてもよい。その他、宿主細胞が酵母である場合には、自己複製配列(ARS)を使用することができる。
本発明の特定の実施態様においては、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含ませることにより、インビトロ又はインビボで識別することができる。このようなマーカーは、識別可能な改変を細胞に付与し、発現ベクターを含む細胞の容易な識別を可能にする。一般に、選択マーカーは、選別を可能にする性質を付与するものである。陽性の選択マーカーは、マーカーの存在によって選抜されることを可能にするものであるが、陰性の選択可能マーカーは、存在することによって選抜から排除されるものである。陽性の選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
ポリペプチドのアミノ酸組成への修飾及び/又は改変が可能であり、その結果、本発明はポリペプチド、及びポリペプチドをコードする核酸の配列中の多様性を意図し、ここで、それでもなお、それらは本発明の治療、予防及び治癒的態様に関するかなりの活性を保持できる。
特定の態様においては、コンポーネントは、このようなコンポーネントをコードする又は発現する核酸を用いることにより、膵臓、又は他の器官若しくは組織に提供される。ウイルス性及び非ウイルス性送達ベクターを、本明細書に開示される方法において使用することができる(例えば、Syner−III)。「核酸」、「核酸分子」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」及び「ヌクレオチド分子」という用語は、別段の規定がない限り、本明細書において置き換え可能に用いられ、cDNA、DNA、PNA、又はリボ核酸(RNA)の重合体を含む、デオキシ核酸の重合体を意味する。核酸は、細胞抽出物、ゲノム又はゲノム外DNA、ウイルス核酸、又は人工的/化学的に合成した分子から得ることができる。この用語には、二重鎖又は一本鎖デオキシリボ核酸又はリボ核酸が含まれる。
受容体介在性エンドサイトーシスを介して細胞に感染あるいは侵入し、ウイルスがコードする遺伝子を発現するという能力を有する特定のウイルスは、細胞(例えば哺乳類細胞)への外来核酸の導入のための魅力的な候補となる。したがって、グルコース代謝活性を増進するための薬剤をコードし、発現し、チロシンキナーゼ受容体活性を増大し、ベータ細胞に関連する遺伝子の転写を増大するウイルスを利用することができる。核酸を送達するために使用することのできるウイルスベクターの非限定的例を以下に説明する。
更なる実施態様においては、核酸は例えばリポソームのような脂質に取り込まれる。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内側の水性媒体を特徴とする小胞状構造物である。多重膜リポソームは、水性媒体により分離された複数の脂質層を有している。リン脂質が過剰の水溶液内に懸濁された場合にリポソームが自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造が形成され、水が取り込まれ、脂質二重層間に溶質が溶解する前に自己再配列を受ける(Ghosh及びBachhawat,In:Liver Diseases,Targeted Diagnosis and Therapy Using Specific Receptors and Ligands,Wuら.(編集),Marcel Dekker,NY,87−104,1991)。リポフェクタミン(Gibco BRL)又はスーパーフェクト(Qiagen)と複合体を形成した核酸も考えられる。
更に、核酸は、受容体介在性送達媒体によって標的細胞に送達され得る。これらは、標的細胞内で起こる受容体介在性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。種々の受容体の細胞型特異的な分布の観点から、この送達方法は、本発明に更なる別の特異性を加える。
微粒子銃技術は、核酸を、少なくとも1つの細胞小器官、細胞、組織又は生物に導入するために使用することができる(参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,550,318号;第5,538,880号;第5,610,042号;及びPCT出願公開第WO 94/09699号)。この方法は、該DNA被覆微粒子が細胞膜を貫通するように、DNA被覆微粒子を加速して高速にし、細胞を死滅させずに細胞に侵入させる能力に依存する(Kleinら,Nature 327,70−73,1987)。当該技術分野において公知の多種多様の微粒子銃技術があり、これらの多くは本発明に適用可能である。
本発明の核酸は、膵臓又は他の組織を標的とする、ナノ粒子の三次元多成分構造体に組み込んでも良い。使用し得るナノ粒子としては、リポソーム、重合体、タンパク質、ミセル、デンドリマー、量子ドット、ナノシェル、ナノ結晶、金ナノ粒子、常磁性ナノ粒子、及びカーボンナノチューブが挙げられるが、これらに限定されない。
裸のプラスミドDNAは、ハイドロダイナミック遺伝子導入法を使用し、膵管を介して送達させても良い。膵管内ではバルーンカテーテルを配置しても良い。膵管内に配置されたバルーンカテーテルは、閉塞補助点滴のために膨張させる。
特定の態様においては、一対の電極を膵臓又は他の組織の上又は中に配置すると共に、本発明の核酸を当該電極上に配置して、遺伝物質を組織内に導入するようしても良い。
本発明の核酸は、静脈注射される微小気泡内に組み込んでも良い。微小気泡が膵臓又は他の組織に到達すると、それらは超音波の標的となる。微小気泡が膨張して破裂すると、微小気泡は膵臓内に核酸を放出する。局所的な衝撃波は、細胞膜の近くまで核酸を浸透させる。
特定の態様においては、本発明の核酸は、針を用いて、膵臓又は他の組織に直接注入される。
当業者であれば、本明細書を考慮し、適切な治療レジメン(例えば、用量、投与回数、全身投与か局所投与か等)を決定することは十分可能である。投与について、本明細書に開示される成分を、薬学的に許容される媒体と共に単一の製剤(溶液、懸濁液、乳濁液等)に製剤化する。このような媒体は通常は無毒であり、非治療的である。このような媒体の例は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。固定油及びオレイン酸エチル等の非水性媒体も使用することができる。好ましい媒体は、5%(w/w)のヒトアルブミンの生理食塩溶液である。媒体は、少量の添加剤、例えば、等張性及び科学的安定性を向上させる物質、例えば緩衝液及び防腐剤を含んでいてもよい。
以下の実施例、並びに図面は、本発明の特定の実施態様を説明するために包含される。実施例又は図面に開示される技術は、本発明者らにより発見された技術を示し、記載された方法の実施において十分に機能し、その結果、その実施のための形態を構成すると考えられると、当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本明細書の開示を考慮し、開示され、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、同等又は類似の結果が今もなお得られる特定の実施態様において多くの変更をなし得ると認識している。
A.結果
説明の目的のために、治療用成分は、レンチウイルス−CMV−グルコキナーゼ(GK)、レンチウイルス−H1−shRNA PTP1B及びレンチウイルス−CMV−PDX−1を含む。対照組成物は、治療用組成物として同じ濃度で注射されるレンチウイルス−CMV−GFP及びレンチウイルス−H1−shRNAスクランブルを含む。注射の4週間後、インビボにおいて、PDX−1及びGKの過剰発現、及びPTP1B発現の抑制がマウスの膵臓内で検出された。グルコキナーゼの過剰発現は、膵島及び外分泌組織で検出された。膵臓組織は内分泌細胞でのみグルコキナーゼを発現するので、外分泌組織でのグルコキナーゼ発現により、治療用組成物によるグルコキナーゼの過剰発現が確認される。外分泌及び内分泌発現を区別するため、Pdx−1の過剰発現は、Pdx−1のcDNAに組み込まれたc−Mycタグを使用することにより検出される。shRNA PTP1Bと同時発現するGFPも検出された。タンパク質発現はウェスタンブロットにより確認した。
成熟膵臓に対して遺伝子送達を標的とするインビボにおける方法:成体動物におけるベータ細胞形成を調査するため、ウイルスベクターを用いてインビボにおいて成熟膵臓を標的とした。方法論は検証されており(Doironら,Diabetologia 55:719−728,2012)、インビボで膵臓ベータ細胞を産生するためにCNIPアプローチにおいて用いられた。
Claims (3)
- インビボで膵臓に投与されるための、(i)膵臓細胞内で機能的グルコキナーゼタンパク質を発現するように構成されているグルコキナーゼ発現カセット、(ii)チロシンホスファターゼ1B阻害剤、及び(iii)膵臓細胞内で機能的Pdx−1タンパク質を発現するように構成されているPdx−1発現カセットを含む糖尿病治療用医薬組成物。
- 糖尿病が1型糖尿病である、請求項1に記載の糖尿病治療用医薬組成物。
- 糖尿病が2型糖尿病である、請求項1に記載の糖尿病治療用医薬組成物。
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