JP6368502B2 - 糖ペプチドの質量分析法 - Google Patents
糖ペプチドの質量分析法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6368502B2 JP6368502B2 JP2014038782A JP2014038782A JP6368502B2 JP 6368502 B2 JP6368502 B2 JP 6368502B2 JP 2014038782 A JP2014038782 A JP 2014038782A JP 2014038782 A JP2014038782 A JP 2014038782A JP 6368502 B2 JP6368502 B2 JP 6368502B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycopeptide
- acid
- hexnac
- labeled
- hex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Description
従って、本発明の目的は、糖ペプチドの質量分析法において糖ペプチドの検出感度を増加させる方法を提供することである。
[1] 電荷的に中性な芳香環もしくは複素環の単環を持ち、且つアミノ基と反応しうる官能基を持つ標識化合物を用いて、糖ペプチドのペプチド鎖のN末端のアミノ基に、又はN末端及び側鎖のアミノ基に標識して質量分析することを特徴とする糖ペプチドの質量分析法。
[2] 前記糖ペプチドが酸性糖鎖を有する糖ペプチドである[1]に記載の糖ペプチドの質量分析法。
[3] 前記糖ペプチドが硫酸化糖鎖を有する糖ペプチドである[1]に記載の糖ペプチドの質量分析法。
[4] 前記硫酸化糖鎖を有する糖ペプチドが下記式(4)で表される糖ペプチドである[3]に記載の糖ペプチドの質量分析法。
[5] 下記式(4)で表される糖ペプチド、又は、下記式(4)で表される糖ペプチド構造を含む前立腺特異抗原(PSA)の糖タンパク質。
1.生体試料からの糖ペプチドの検出。
2.糖鎖を有するタンパク質の同定。
3.糖ペプチドの糖鎖構造の同定。
そして、これらはいずれも疾患関連マーカーの探索に新たな手法を提供するものである。
「質量分析法」とは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)法、レーザー脱離(LD)法、高速電子衝撃(FAB)法、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法、大気圧化学(APCI)法などのイオン化方法によって分子を含む試料をイオン化し、次いで、飛行時間法(タイムオブフライト法、TOF法)、二重収束法、四重極集束法等を用いて、イオン化した分子を質量/電荷比(m/z)に従って分離し検出する方法である。
本発明においてイオン化法は限定されないが、好ましくは、MALDI法である。
本発明の質量分析法は、以上に記載されたMSn(n>1)解析を含む。
本発明で用いる標識化合物は、中性の水溶液又は有機溶媒、もしくはその水溶液と有機溶媒の混合液中で塩素、臭素、ヨウ素、ナトリウム、カリウム、カルシウム等のイオンと結合していない状態で正電荷を帯びている第4級リン、第1級、第2級、第3級、第4級アミン等や負電荷を帯びているカルボン酸、硫酸等の官能基は含まない、もしくは電荷的に中性になる様に正電荷と負電荷の官能基がイオンペアになっている化合物であり、疎水性を示す芳香環を構成する原子に関しては、炭素原子のみ、或いは、炭素原子と炭素原子以外の原子、例えば窒素原子、硫黄原子等を上げる事ができ、炭素原子のみ(炭素環)で又は炭素とそれ以外の原子(複素環)とで、当該環を形成している芳香環もしくは複素環の単環を持つ化合物であり、また、アミノ基を標識する反応性官能基として上記の中性である官能基以外としてカルバメート誘導体、カルボン酸無水物、カルボン酸等を含んでいる化合物である。この反応性官能基は、ペプチド鎖のN末端のアミノ基以外にLys,His,Trp等の側鎖のアミノ基と反応する。従来、糖ペプチドC末端の標識には、疎水性が高いナフチル基、ピレン基などが好まれるが、糖ペプチドN末端に関しては本発明により単環化合物であるベンゾイル基の方が親イオンを多く生成し十分な感度を得る事が見出された。具体的には、無水安息香酸(benzoic anhydride)、安息香酸(benzoic acid)、3,4,5−トリメトキシ安息香酸無水物(3,4,5−trimethoxybenzoic anhydride)、4−トリフルオロメチル安息香酸無水物(4−trifluoromethylbenzoic anhydride)、3,5−ビストリフルオロメチル安息香酸(3,5−Bis(trifluoromethyl)benzoic acid)、2−メトキシ安息香酸(2−methoxybenzoic acid)、3−メトキシ安息香酸(3−methoxybenzoic acid)、4−メトキシ安息香酸(4−methoxybenzoic acid)、2,4−ジメトキシ安息香酸(2,4−dimethoxybenzoic acid)、2,5−ジメトキシ安息香酸(2,5−dimethoxybenzoic acid)、2,6−ジメトキシ安息香酸(2,6−dimethoxybenzoic acid)、3,4−ジメトキシ安息香酸(3,4−dimethoxybenzoic acid)、3,5−ジメトキシ安息香酸(3,5−dimethoxybenzoic acid)、4−メトキシ−3,5−ジメチル安息香酸(4−methoxy−3,5−dithylbenzoic acid)、3−メトキシ−2−メチル安息香酸(3−methoxy−2−methylbenzoic acid)、3−メトキシ−4−メチル安息香酸(3−methoxy−4−methylbenzoic acid)、2,3,4−トリメトキシ安息香酸(2,3,4−trimethoxybenzoic acid)、2,3,6−トリメトキシ安息香酸(2,3,6−trimethoxybenzoic acid)、2,4,5−トリメトキシ安息香酸(2,4,5−trimethoxybenzoic acid)、2,4,6−トリメトキシ安息香酸(2,4,6−trimethoxybenzoic acid)、3,4,5−トリメトキシ安息香酸(3,4,5−trimethoxybenzoic acid)、4−メチル安息香酸(4−methylbenzoic acid)、2−メチル安息香酸(2−methylbenzoic acid)、3−メチル安息香酸(3−methylbenzoic acid)、2−トリフルオロメチル安息香酸(2−(trifluoromethyl)benzoic acid)、3−トリフルオロメチル安息香酸(3−(trifluoromethyl)benzoic acid)、4−トリフルオロメチル安息香酸(4−(trifluoromethyl)benzoic acid)、フタル酸ベンジルアミド(phthalic acid benzylamide)、2,3−ピリジンジカルボン酸無水物(2,3−pyridinedicarboxylic anhydride)、2,3−ピリジンジカルボン酸(2,3−pyridinedicarboxylic acid)、2,4−ピリジンジカルボン酸(2,4−pyridinedicarboxylic acid)、2,5−ピリジンジカルボン酸(2,5−pyridinedicarboxylic acid)、2,6−ピリジンジカルボン酸 (2,6−pyridinedicarboxylic acid)、3,4−ピリジンジカルボン酸(3,4−pyridinedicarboxylic acid)、3,5−ピリジンジカルボン酸(3,5−pyridinedicarboxylic acid)などが挙げられる。
糖ペプチドとは、ペプチドに糖鎖が結合している物である。本発明では、糖アミノ酸も糖ペプチドに含まれるものとする。通常、糖ペプチドの糖鎖には、N結合型糖鎖とO結合型糖鎖があり、前者はアスパラギン(Asn)の側鎖に結合した糖鎖であり、後者はセリン、スレオニンの側鎖に結合した糖鎖であるがその他の結合様式も存在する。生物に通常、存在している糖鎖の組成には、グルコース(Glc)、マンノース(Man)、ガラクトース(Gal)と言われるヘキソース(Hex)とN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)と言われるN−アセチルヘキソサミン(HexNAc)、フコース(Fuc)と言われるデオキシヘキソース(dHex)があり、これらの糖は中性を示し、これらだけで構成された糖鎖は中性糖鎖と呼ばれる。また、N−アセチルノイラミン酸(NeuAc)、N−グリコリルノイラミン酸(NeuGc)と言われるシアル酸やグルクロン酸(GlcA)、イズロン酸(Ido)等と言ったカルボン酸を有する糖も存在し、これらは酸性を示し、これを含む糖鎖は酸性糖鎖と呼ばれる。さらに、生体中の糖には、糖の水酸基にアセチル基、メチル基、リン酸基、硫酸基等が修飾されて存在している物もあり、この中でリン酸基、硫酸基で修飾された糖は酸性を示し、これを含む糖鎖も酸性糖鎖と呼ばれる。
式(4)で表される糖ペプチド構造は、本発明において初めて同定されたPSAの新規糖鎖構造である。これにより、このPSA上の硫酸化糖ペプチドを質量分析計及びELISA測定等の標準物質としてバイオマーカーの指標にする事ができる。また、この糖ペプチド構造もしくは、これを含むPSA糖タンパク質を抗原として抗体を作成する事により、生体試料中に存在する式(4)で表される糖ペプチド構造を含む前立腺特異抗原(PSA)の糖タンパク質を検出して、定量が行えるので、疾患等の臨床診断に役立つ。
<実施例1>
糖ペプチドのペプチド鎖のN末端アミノ基のベンゾイル(Bz)化
最初に、卵黄由来糖ペプチド(Lys−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4Neu5Ac2)−Lys−Thr)のリジン(Lys)の側鎖アミノ基をBeardsley R.L.らの手法(非特許文献8)によって、グアニジド化し、その後、酸加水分解によって、脱シアリル化を行い、ペプチドのN末端に1個アミノ基を有する糖ペプチド(H−Homoarg−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4)−Homoarg−Thr−OH)を調製した。この糖ペプチドを用いて、標識による効果を調べた。
糖ペプチドのペプチド鎖のN末端アミノ基のアセチル(Ac)化
同様に、H−Homoarg−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4)−Homoarg−Thr−OHに対して、無水酢酸(Ac2O)を用いて糖ペプチドのN末端のアミノ基の標識化を行い、質量分析計で測定した。図2で示されるようにAc基による標識ではpositive mode,negative mode共に標識前と比べて感度(ピーク強度、SN比)が悪くなっている。
糖ペプチドのペプチド鎖のN末端アミノ基への標識試薬の比較
次に、電荷的に中性かつ芳香環又は複素環を持つ表1の(2)、(5)、(8)のカルボン酸無水物、カルボン酸を用いてH−Homoarg−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4)−Homoarg−Thr−OHのN末端のアミノ基に標識し、試料を混合して質量分析計で測定する事により、ピーク強度比を計算し、それぞれのイオン感度を評価した。
表1の(3)、(4)、(6)、(7)は、芳香環又は複素環の単環を持つ標識化合物ではないが、参考例として行い、評価している。
芳香環が1、2、4個あるベンゾイル(1)、ナフトイル(3)、ピレノイル(4)基を比較した結果、芳香環が1個のベンゾイルが一番、感度が良かった。また、芳香環が1つでもメトキシが結合している物(2)は、感度が悪かった。しかしながら、カルボン酸と3級アミンが混在して電荷的に中性な化合物(5)は、感度が良かった。また、2つの芳香環又は複素環を持つ(3)、(7)と(8)を比較した結果、ほぼ同程度の感度である事が分かった。
H−Ile−Arg−Asn(Hex5HexNAc4)−Lys−Ser−OH、H−Lys−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4)−Lys−Thr−OHのN末端アミノ基のみ標識した場合と、リシン側鎖アミノ基をも標識した場合の比較
H−Ile−Arg−Asn(Hex5HexNAc4)−Lys−Ser−OH、H−Lys−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4)−Lys−Thr−OHを用いてペプチドのN末端に1個だけ標識した糖ペプチドBz−Ile−Arg−Asn(Hex5HexNAc4)−Homoarg−Ser−OH、Bz−Homoarg−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4)−Homoarg−Thr−OHとLysの側鎖のアミノ基と合わせて2箇所に標識されたBz−Ile−Arg−Asn(Hex5HexNAc4)−Lys(Bz)−Ser−OH、3箇所に標識化されたBz−Lys(Bz)−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4)−Lys(Bz)−Thr−OHを作成し、それぞれ等量混ぜて質量分析計で測定し、positive mode,negative modeの両方で標識化の個数によるイオン化の比較を行った。
ウシリボヌクレアーゼB由来糖ペプチド、ヒト免疫グロブリン由来糖ペプチドのN末端アミノ基のベンゾイル化
同じペプチド鎖に複数の異性体の糖鎖が結合しているウシリボヌクレアーゼB由来糖ペプチド、ヒト免疫グロブリン由来糖ペプチドを用いて同様にペプチド鎖のN末端のアミノ基にBz標識を行い、標識前の糖ペプチドと等量混ぜて質量分析計で測定し、positive mode,negative modeの両方で標識化によるイオン検出の比較を行った。
ウシサイログロブリン糖ペプチドPhe−Asn(Hex5HexNAc4dHex1SO3)のN末端アミノ基のベンゾイル化
ウシサイログロブリン(500μg)を100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(50μL)に溶かし、1.0%(w/v)RapiGest水溶液(5μL)、200mMジチオトレイトール水溶液(5μL)を加え、56℃で30分間加熱し、500mMヨードアセトアミド水溶液(5μL)を加え、室温で遮光条件下30分間静置する。この溶液にTPCK処理トリプシン(10mg/ml,2μL)を加え、37℃で2時間反応させる。反応溶液を85℃30分間、加熱する事により酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm,3mL)で過剰な試薬を除去し、濃縮する。次に、100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(50μL)を加え、サーモリシン(1000U/μL,4μL)を加え、56℃で10時間反応させる。反応溶液を減圧濃縮し、100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)(50μL)に溶かし、シアリダーゼ(10U/mL,2μL)を加え、37℃で2時間反応させる。反応溶液を85℃15分間、加熱する事により酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm,3mL)で脱塩し、濃縮する。この試料に水(20μL)、DEAE−Sepharose(wet100μL)、エタノール(100μL)、n−ブタノール(400μL)の順番で加え、室温で1時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してn−ブタノール:エタノール:水=4:1:1(v/v/v)(2mL)、エタノール:水=1:1(v/v)(2mL)で洗浄し、200mM炭酸水素アンモニウム水溶液(2mL)で硫酸化糖ペプチド画分を回収し、減圧濃縮した。これにDMF(5μL)を加え、60℃5分間、加熱し、200mM無水安息香酸−メタノール溶液(100μL)を加え、超音波洗浄機を用いて15分間室温で超音波しながら反応を行い、試薬を不活性化させ、エステル化反応を止める為、1M水酸化ナトリウム水溶液(5μL)、7Mアンモニウム水溶液(10μL)を加え、減圧濃縮を行った。この反応物を水(1mL)に溶かし、C18 Spinカラム(10mg)にロードし、水(2mL)で十分洗浄した後に、50%アセトニトリル水溶液(650μL)、80%アセトニトリル水溶液(650μL)で回収し、減圧濃縮を行った。
DEAE−Sepharoseで分画した硫酸糖ペプチドを標識せずに質量分析計を用いて測定したが、硫酸化糖ペプチドは観測されなかった(図9)。
ヒト黄体形成ホルモン(LH)糖ペプチドVal−Glu−Asn(Hex4HexNAc5SO3)−His−ThrのN末端アミノ基のベンゾイル化
ヒト黄体形成ホルモン(LH)(15μg)を100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、1.0%(w/v)RapiGest水溶液(3μL)、200mMジチオトレイトール水溶液(3μL)を加え、56℃で30分間加熱し、500mMヨードアセトアミド水溶液 (3μL)を加え、室温で遮光条件下30分間静置する。この溶液にTPCK処理トリプシン(10mg/ml,1μL)を加え、37℃で2時間反応させる。反応溶液を85℃30分間、加熱する事により酵素を失活させ、減圧濃縮する。次に、100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)(50μL)に溶かし、シアリダーゼ(10U/mL,2μL)を加え、37℃で2時間反応させる。反応溶液を85℃15分間、加熱する事により酵素を失活させ、G−25スピンカラム(600μL)で脱塩し、減圧濃縮する。次に、100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(50μL)を加え、サーモリシン(1000U/μL,4μL)を加え、56℃で10時間反応させ、0.8%トリフルオロ酢酸水溶液(50μL)を加え、反応を停止させ、減圧濃縮した。これにDMF(5μL)を加え、60℃5分間、加熱し、200mM無水安息香酸−メタノール溶液(100μL)を加え、超音波洗浄機を用いて15分間室温で超音波しながら反応を行い、1M水酸化ナトリウム水溶液(5 μL)、7Mアンモニウム水溶液(10μL)を加え、減圧濃縮を行った。この試料を水(1000μL)に溶かし、活性炭カラム(50mg)にロードし、水(2mL)、0.1%トリフルオロ酢酸水溶液(2mL)、水(2mL)の順番で十分洗浄した後に、50%アセトニトリル水溶液(650μL)、80%アセトニトリル水溶液(650μL)で溶出し、減圧濃縮を行った。この試料に水(20μL)、DEAE−Sepharose(wet100μL)、エタノール(100μL)、n−ブタノール(400μL)の順番で加え、室温で1時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してn−ブタノール:エタノール:水=4:1:1(v/v/v)(2mL)、エタノール:水=1:1(v/v)(2mL)で洗浄し、200mM炭酸水素アンモニウム水溶液(2mL)で硫酸化糖ペプチド画分を回収し、減圧濃縮した。
MS測定では、Bz−Val−Glu−Asn(Hex4HexNAc5SO3)−His−Thrのm/z=2444.8の[M−H]−イオンが検出できた。
ヒト前立腺特異抗原(PSA)糖ペプチドのN末端アミノ基のベンゾイル化
ヒト前立腺特異抗原(PSA)(1.3μg)を100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(30μL)に溶かし、1.0%(w/v)RapiGest水溶液(3μL)を加え、56℃で30分間加熱する。この溶液にサーモリシン(1000U/μL,1μL)を加え、56℃で10時間反応させた。次に、14Mアンモニウム水溶液(22μL)を加え、O−メチルイソウレア塩酸塩水溶液(1mg/μL,12μL)を加え、65℃で30分間反応した。この反応液に10%トリフルオロ酢酸水溶液(120μL)を加え、減圧濃縮した。そして、0.8%トリフルオロ酢酸水溶液(100μL)を加え、90℃で30分間加熱する事により、脱シアリル化を行い、減圧濃縮した。これにDMF(5μL)を加え、60℃5分間、加熱し、200mM無水安息香酸−メタノール溶液(100μL)を加え、超音波洗浄機を用いて15分間室温で超音波しながら反応を行い、1M水酸化ナトリウム水溶液(5μL)、7Mアンモニウム水溶液(10μL)を加え、減圧濃縮を行った。この試料を水(1000μL)に溶かし、活性炭カラム(50mg)にロードし、水(2mL)、0.1%トリフルオロ酢酸水溶液(2mL)、水(2mL)の順番で十分洗浄した後に、50%アセトニトリル水溶液(650μL)、80%アセトニトリル水溶液(650μL)で溶出し、減圧濃縮を行った。この試料に水(20μL)、Sepharose(wet50μL)、エタノール(100μL)、n−ブタノール(400μL)の順番で加え、室温で1時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してn−ブタノール:エタノール:水=4:1:1(v/v/v)(2mL)で洗浄し、エタノール:水=1:1(v/v)(2mL)で糖ペプチド画分を回収し、減圧濃縮した。
MS測定では、Bz−Ile−Arg−Asn(Hex4HexNAc5dHex1SO3)−Lys−Serのm/z=2651.1の[M−H]−イオンとm/z=2652.8の[M+H]+イオンが検出できた。
ヒト前立腺特異抗原(PSA)糖ペプチドBz−Ile−Arg−Asn(Hex4HexNAc5dHex1SO3)−Lys−SerのMSn解析
島津製作所製MALDI−QIT−TOF MS装置(AXIMA−Resonance)を用いてpositive,negative modeでMSn測定を行った。
酸性糖鎖を持つシアロ糖ペプチドのペプチド鎖の無水安息香酸によるN末端標識
卵黄由来糖ペプチド(Lys−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4Neu5Ac2)−Lys−Thr)のリジン(Lys)の側鎖アミノ基をBeardsley R. L.らの手法(非特許文献8)を改良した(反応停止を氷零下で酢酸を用いて行う)グアニジド化を行い、シアル酸の脱離を起こさずにペプチドのN末端に1個アミノ基を有する糖ペプチド(H−Homoarg−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4Neu5Ac2)−Homoarg−Thr−OH)を調製した。この糖ペプチドに無水安息香酸(Bz2O)を用いて糖ペプチドのN末端のアミノ基のBz標識化を行い、質量分析計で測定した。図20で示されるように、酸性糖鎖を持つ糖ペプチドにおいてもBz標識を行う事によってpositive mode,negative mode共に検出感度(ピーク強度、SN比)が向上している。
卵黄由来糖ペプチドBz−Homoarg−Val−Ala−Asn(Hex5HexNAc4Neu5Ac2)−Homoarg−ThrのMSn解析
島津製作所製MALDI−QIT−TOF MS装置(AXIMA−Resonance)を用いてnegative modeでMSn測定を行った。
安定同位体標識された安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(d5−BzOSu)の合成
重水素で標識された安息香酸(127mg,1.00mmol)とN−ヒドロキシコハク酸イミド(230mg,2.00mmol)、トリエチルアミン(167μl,1.20mmol)をジメチルアミドホルム(1mL)に溶かし、ジシクロヘキシルカルボジイミド(206mg,1.20mmol)を加え、室温で180分間反応させた。反応溶液をフィルター濾過した後に、濾液を減圧濃縮する。この残渣にイソプロパノール(5mL)を加え、加熱しながら溶かした後に冷やす事によって、目的物となる下記式(5)で表される安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(d5−BzOSu,以下d−BzOSuと記す)(184mg,82%)を得た。(TLC)Rf0.42[トルエン−酢酸エチル(10:1)]
1H−NMR(600MHz,CDCl3):δ2.91(s,4H)
13C−NMR(125MHz,CDCl3):δ25.63,124.88,128.31,130.13,134.38,161.82,169.24
ヒトミエローマプラズマより産生されたヒトIgG1kappa,ヒトIgG1lambda,IgG2kappa,ヒトIgG2lambda(100μg)をそれぞれ100mM炭酸水素アンモニウム水溶液(200μL)に溶かし、1.0%(w/v)RapiGest水溶液(20μL)を加え、90℃で15分間加熱し、室温で30分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン(10μg)を加え、37℃で15時間反応させる。反応溶液を90℃30分間、加熱する事により酵素を失活させ、G−25カラム(0.8×6cm,3mL)で脱塩し、濃縮する。これに水(20μL)とピリジン(10μL)を加え、200mM安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(d0−BzOSu,h−BzOSu)、ジメチルホルムアミド溶液もしくは200mM重水素標識安息香酸−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(d−BzOSu)、ジメチルホルムアミド溶液(20μL)を加え、57℃で12時間反応を行い、0.5M水酸化ナトリウム水溶液(60μL)を加え、室温にて30分間撹拌した。その後、水(200μL)を加え、EtOAc(400μL)にて3回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をG−25カラム(0.8×6cm,3mL)で脱塩し、C18 Spinカラム(10mg)にロードし、水(2mL)で十分洗浄した後に、25%アセトニトリル水溶液(650μL)、50%アセトニトリル水溶液 (650μL)で回収し、減圧濃縮を行った。この試料に水(20μL)、Sepharose4B(wet50μL)、エタノール(100μL)、n−ブタノール(400μL)の順番で加え、室温で1時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してn−ブタノール:エタノール:水=8:2:1(v/v/v)(2mL)で洗浄し、エタノール:水=1:2(v/v)(2mL)で糖ペプチドを回収し、減圧濃縮した。
Claims (4)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014038782A JP6368502B2 (ja) | 2013-09-10 | 2014-02-28 | 糖ペプチドの質量分析法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013187765 | 2013-09-10 | ||
JP2013187765 | 2013-09-10 | ||
JP2014038782A JP6368502B2 (ja) | 2013-09-10 | 2014-02-28 | 糖ペプチドの質量分析法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015078972A JP2015078972A (ja) | 2015-04-23 |
JP6368502B2 true JP6368502B2 (ja) | 2018-08-01 |
Family
ID=53010487
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014038782A Expired - Fee Related JP6368502B2 (ja) | 2013-09-10 | 2014-02-28 | 糖ペプチドの質量分析法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6368502B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023243136A1 (ja) * | 2022-06-14 | 2023-12-21 | 株式会社島津製作所 | 分析用試料の調製方法および分析方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020013097A1 (ja) * | 2018-07-11 | 2020-01-16 | 公益財団法人がん研究会 | 前立腺がんに特異的な糖鎖、及びこれを用いた検査方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004066808A2 (en) * | 2002-12-20 | 2004-08-12 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Glycan markers for diagnosing and monitoring disease |
JP2005049164A (ja) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Shimadzu Corp | ペプチドの高感度測定又は定量のためのラベル化試薬及び方法 |
JP4907334B2 (ja) * | 2006-03-15 | 2012-03-28 | 公益財団法人野口研究所 | 微量質量分析法 |
JP5082559B2 (ja) * | 2007-04-13 | 2012-11-28 | 株式会社島津製作所 | Maldi質量分析用液体マトリックス |
EP2354790B1 (en) * | 2008-12-03 | 2013-07-17 | The Noguchi Institute | Method for determining prostate cancer |
JP5673367B2 (ja) * | 2011-06-03 | 2015-02-18 | 株式会社島津製作所 | 糖ペプチド又は糖タンパク質の質量分析用液体マトリックス |
-
2014
- 2014-02-28 JP JP2014038782A patent/JP6368502B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023243136A1 (ja) * | 2022-06-14 | 2023-12-21 | 株式会社島津製作所 | 分析用試料の調製方法および分析方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2015078972A (ja) | 2015-04-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dong et al. | Advances in mass spectrometry‐based glycomics | |
Yu et al. | Advances in mass spectrometry‐based glycoproteomics | |
Garcia | What does the future hold for top down mass spectrometry? | |
Karlsson et al. | Negative ion graphitised carbon nano‐liquid chromatography/mass spectrometry increases sensitivity for glycoprotein oligosaccharide analysis | |
ES2396163T3 (es) | Cuantifiación mediante espectrometría de masas | |
Budnik et al. | Global methods for protein glycosylation analysis by mass spectrometry | |
Bereman et al. | Development of a nanoLC LTQ orbitrap mass spectrometric method for profiling glycans derived from plasma from healthy, benign tumor control, and epithelial ovarian cancer patients | |
Soares et al. | Mass spectrometry and animal science: protein identification strategies and particularities of farm animal species | |
Palmisano et al. | Structural analysis of glycoprotein sialylation–part II: LC-MS based detection | |
Windwarder et al. | Site-specific analysis of the O-glycosylation of bovine fetuin by electron-transfer dissociation mass spectrometry | |
Walker et al. | Interplay of permanent charge and hydrophobicity in the electrospray ionization of glycans | |
Nie et al. | Recent advances in sialic acid-focused glycomics | |
Nishikaze et al. | In-depth structural characterization of N-linked glycopeptides using complete derivatization for carboxyl groups followed by positive-and negative-ion tandem mass spectrometry | |
Lattová et al. | The usefulness of hydrazine derivatives for mass spectrometric analysis of carbohydrates | |
Nishimura | Toward automated glycan analysis | |
Lazar et al. | Recent advances in the MS analysis of glycoproteins: Theoretical considerations | |
Nishikaze et al. | Structural analysis of N-glycans by the glycan-labeling method using 3-aminoquinoline-based liquid matrix in negative-ion MALDI-MS | |
Zhang et al. | Mass spectrometry for protein sialoglycosylation | |
JP2005536759A (ja) | Maldi−マトリックス | |
Donohoo et al. | Advances in mass spectrometry‐based glycomics—An update covering the period 2017–2021 | |
Gutierrez‐Reyes et al. | Advances in mass spectrometry‐based glycoproteomics: An update covering the period 2017–2021 | |
Jiang et al. | Rapid and sensitive MALDI MS analysis of oligosaccharides by using 2-hydrazinopyrimidine as a derivative reagent and co-matrix | |
Wang et al. | Liquid chromatography electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometric characterization of N-linked glycans and glycopeptides | |
Smith et al. | Quantitative glycomics using liquid phase separations coupled to mass spectrometry | |
Hsiao et al. | Pseudo‐neutral‐loss scan for selective detection of phosphopeptides and N‐glycopeptides using liquid chromatography coupled with a hybrid linear ion‐trap/orbitrap mass spectrometer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170227 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20171110 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171121 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180119 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180703 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180709 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6368502 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |