JP6367952B2 - エリスロポエチンおよび分枝ポリマー構造を含む複合体 - Google Patents

Description

本発明は、バイオテクノロジー、ライフサイエンスおよび製薬産業の分野に関し、特に、その薬物動態を改善し、血中のその半減期およびその生物学的活性を増加させる、分子修飾に関する。

発明の背景
ヒトにおける治療のための生体分子の使用は、近年、増加しており、主に（１）新しいタンパク質およびペプチド分子の発見、（２）インビボでの作用機序のより良い理解、（３）タンパク質およびペプチド合成の発現系での改善、および（４）薬力学的もしくは薬物動態学的特性を高める製剤、または分子修飾技術における改善による。

修飾される薬物送達の分野における技術開発は、治療薬の薬力学的および薬物動態学的特性を改善する目的で、注射可能な薬剤の放出を変化させる多数のシステムの導入を可能にしてきた。新たな薬物送達システムは、製剤（例えば、連続的な製品放出またはリポソーム）での変化によって、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つ以上の分子に薬剤が共有結合のみするＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）のような、薬物分子への添加によって、生成することができる。

放出の新しい形態は、半減期を増加させ、有害作用を低減させ、薬効を増加させ、患者の生活の質を向上させることになる。連続放出システムは、制御された所定の方法で薬剤を放出し、血漿濃度での大きな変動を回避することが重要である薬剤に特に適している。

生物分解性ミクロスフェアを用いる分子の全身性放出は、分解されやすい、および放出の延長や変化を受けやすいタンパク質の保護によって広く研究されている（Ｓｉｎｈａ，Ｖ．ＲおよびＴｒｅｈａｎ，Ａ．（２００３年）、Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ（タンパク質送達としての生物分解可能なミクロスフェア）、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，９０（３）：２６１−２８０）。

ＰＥＧ化は、生体分子の薬理学的制限の多くを最小化する治療用タンパク質の修飾方法を提供する。例えば、血中での半減期は、次のものを含むいくつかの理由で増加する：ポリマー残基は、プロテアーゼアタックおよび免疫系による薬物の認識を避けることがあり、また、複合体の天然タンパク質に対して有意に高い流体力学的容積は、腎臓によるろ過を有意に減少させる。多くの場合、タンパク質のインビトロでの生物学的活性は、ＰＥＧ化によって影響を受けるが、血液寿命の大幅な増加は、その治療作用をより効果的にする（Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ．およびＣｈｅｓｓ Ｒ．Ｂ．（２００３年）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（医薬品に対するＰＥＧ化の影響）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２：２１４−２２１）。

疎水性相互作用によって誘導される分解経路を立体的にブロックし、タンパク質の熱的不安定に関与する分子間相互作用を減少させる非特異的な立体障害を発生させるので、ＰＥＧ化の別の利益は、増加する物理的安定性によって与えられる。増加する物理的安定性は、より安定な製剤を可能にする（Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ．およびＣｈｅｓｓ Ｒ．Ｂ．（２００３年）Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（医薬品に対するＰＥＧ化の影響）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２：２１４−２２１）。

活性化ＰＥＧの第二世代の出現により、より選択的なＰＥＧ化を可能にする基（例えば：タンパク質のＮ末端に優先的に結合するアルデヒド基）および分枝構造（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｍ．Ｊ．，Ｂｅｎｔｌｅｙ Ｍ．Ｄ．，Ｈａｒｒｉｓ Ｊ．Ｍ．（２００２年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ（ペプチドおよびタンパク質のＰＥＧ化のための化学）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖｉｅｗｓ．５４：４５９−４７６）が利用可能になる。開発される分枝ＰＥＧは、２つの分枝の単官能性（米国特許第５９３２４６２号）、４つの分枝の四官能性、および８つの分枝の八官能性を含む。治療用タンパク質の結合については、単官能性活性化ＰＥＧは、タンパク質とＰＥＧポリマーの間の架橋を避けるので、それらはより有用である。分枝ＰＥＧはまた、タンパク質表面のより良好な保護を可能にする傘型効果（ｕｍｂｒｅｌｌａ ｔｙｐｅ ｅｆｆｅｃｔ）を有する。

２つの分枝単官能性ＰＥＧは、天然タンパク質より良い臨床結果を示す共役アルファ−２ａ−インターフェロンを得ることを可能にした（Ｒａｊｅｎｄｅｒ Ｒｅｄｄｙ Ｋ．，Ｍｏｄｉ Ｍ．Ｗ．，Ｐｅｄｄｅｒ Ｓ．（２００２年）．Ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｆａ−２ａ（４０ＫＤ）（Ｐｅｇａｓｙｓ） ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．（Ｃ型肝炎治療のためのＰＥＧインターフェロンアルファ−２ａ（４０ＫＤ）（Ｐｅｇａｓｙｓ）の使用）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖｉｅｗｓ．５４：５７１−５８６）。

組換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）（ｒｈＥＰＯ）を含む、異なる修飾放出技術が適用されているタンパク質の多数の報告がある。ＥＰＯは、１６５個のアミノ酸を有する糖タンパク質である。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（略して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、その推定分子量は、グリコシル化のその程度に応じて、２７と３９ｋＤａの間である（Ｍｉｋａｙｅ，Ｔ．ら、（１９７７年）．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ヒトエリスロポエチンの精製）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５２：５５５８−５５６４）。

実験において、低酸素刺激を除去することによって；ＥＰＯのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が血液中で急速に減少し、３時間で検出不能となり得ることが実証されているが、これはその半減期が短いことを示す（Ｌａｃｏｍｂｅ，Ｃ．ら（１９８８年）Ｐｅｒｉｔｕｂｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｈｙｐｏｘｉｃ ｋｉｄｎｅｙ（管周辺細胞は、マウス低酸素腎臓におけるエリスロポエチン合成の部位である）Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ８１：６２０−６２３；Ｋｏｕｒｙ，Ｓ．Ｔら（１９８９年）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｋｉｄｎｅｙｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄａｔｉｏｎ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ， ｒｅｎａｌ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるマウスの腎臓におけるエリスロポエチン生成細胞の定量：ヘマトクリット、腎エリスロポエチンのｍＲＮＡおよび血清エリスロポエチン濃度との相関）Ｂｌｏｏｄ ７４：６４５−６５１）。血漿中のＥＰＯの半減期は、４と１３時間の間の範囲であることが推定された；治療上使用される他の分子と比較する場合、この時間は、非常に短い。これは、定期的にホルモンの使用を必要とする患者が、頻繁に、正常に近い赤血球レベルを維持するために注入されなければならない原因になる（Ｓｐｉｖａｋ，Ｊ．Ｌ．１９９２年 Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．（エリスロポエチンの作用機序：赤血球細胞応答）Ｊ．Ｗ．Ｆｉｓｈｅｒ（Ｅｄ．）におけるＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ−Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｏｒｇａｎｓ（血液の生化学的薬理学および血液形成器官）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １０１：４９−１１４；Ｊｅｌｋｍａｎｎ，Ｗ．（１９８６年）Ｒｅｎａｌ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（腎エリスロポエチン：特性と生産）Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １０４：１３９−２０５）。

ｒｈＥＰＯの半減期を増加させる目的で、変異が分子上で行われ、Ｎ−グリコシル化の部位を増加させ（Ｂｕｒｋｅ，Ｐａｕｌ（２００３年）Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ．（凝集安定化された生物学的活性化剤の持続放出のための装置）、米国特許出願第２００３０１３３９７９号）、それは、マイクロスフェア中でカプセル化され（Ｍｏｒｌｏｃｋ Ｍら（１９９８年）Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｌｏａｄｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ＬＰＬＧ−ＰＥＯ−ＬＰＬＧ ｔｒｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ： ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｒｅｌｅａｓｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．（生物分解性ＬＰＬＧ−ＰＥＯ−ＬＰＬＧトリブロックコポリマーから調製されるエリスロポエチン充填ミクロスフェア：タンパク質の安定化およびインビトロ放出特性）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，５６（１−３）：１０５−１１５）また、リポソーム中でカプセル化されており（Ｍｏｒｉｙａ Ｈら（１９９７年）、Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｎｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒａｔｓ．（ラットにおける静脈内および皮下投与後の遊離およびリポソーム組換えヒトエリスロポエチンの薬物動態学的および薬理学的プロファイル）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １４（１１）：１６２１−１６２８）、得られるｒｈＥＰＯ二量体は、その生物学的活性を増大させることが報告されている（Ｂｒｕｎｏ Ｄ．ら（２００１年）．Ｄｉｍｅｒｉｃ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．（インビトロおよびインビボでの増強される赤血球生成活性を有する二量体エリスロポエチン融合タンパク質）Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，３７７６−３７８２）。

診療所の中で最も多くの結果を有する修飾の１つは、ポリマーとのｒｈＥＰＯの化学的結合である（Ｊｏｌｌｉｎｇ Ｋ．ら（２００５年）、Ｍｉｘｅｄ−Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｓｃａｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．（ＰＥＧ化ヒトエリスロポエチンの種間の薬物動態学的スケーリングの混合効果モデリング）Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ；２４：４６５−４７５）。このｒｈＰＥＧ化ＥＰＯの開発で見られる難しさは、モノＰＥＧ化および二ＰＥＧ化種の形成による、結合プロセスの低収率であり、後者は、プロセスの汚染（コンタミネーション）物質を構成する。

上記の全てについて、未修飾分子を超える治療上の利点を提供する、ＥＰＯおよびポリマーの新たな複合体を得ることは依然として関心事である。

本発明の説明
本発明は、ＥＰＯと、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）の２つの分枝を含む非対称分枝ポリマー構造とを含む複合体であって、これらのｍＰＥＧの分枝の１つの分子量が１０ｋＤａと１４ｋＤａの間であり、ｍＰＥＧの他の分枝の分子量が１７ｋＤａと２３ｋＤａの間である、上記複合体を提供することにより、上記の問題を解決する。

ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}とＥＰＯの結合反応の生成物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの二重染色（クマシーブリリアントブルーおよびヨウ素）の結果。サンプル１は、ＥＰＯ陽性対照に相当し、サンプル２は、ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}とＥＰＯの結合反応の生成物に相当する。

ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}とＥＰＯの結合反応の生成物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの二重染色（クマシーブリリアントブルーおよびヨウ素）の結果。サンプル１は、ＥＰＯ陽性対照に相当し、サンプル２は、ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}とＥＰＯの結合反応の生成物に相当する。

異なるＰＥＧ−ＥＰＯ複合体を評価するためのゲルろ過クロマトグラフィーにより得られたクロマトグラム。

正球性マウスの方法によって決定される天然型ＥＰＯおよびモノＰＥＧ化ＥＰＯのインビボでの生物学的活性。

ＰＥＧ_{２，３２Ｋ} −ＥＰＯ、ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＥＰＯおよび未修飾ＥＰＯの複合体のトリプシン分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｉｏｏｎ）アッセイにより得られた結果。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに従う分解速度が表される。

正球性マウスの方法によって決定される異なるＰＥＧ−ＥＰＯ複合体および未修飾ＥＰＯの生物学的活性。

このように、本発明は、Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ（米国特許第７２０２２０８号）により使用されるものと類似する分子サイズを有する単官能性分枝ＰＥＧ構造を含む複合体を提供するが、それは、異なる分子量の２つのＰＥＧストランド（らせん）の構造を採用する。この代替手段は、予期せず、薬物に新たな利点を与える。本発明の複合体において、２つの分枝ＰＥＧポリマー構造の総分子量は、２７と３７ｋＤａの間である。本発明の１つの態様において、ｍＰＥＧ１の分子量は１２ｋＤａであり、ｍＰＥＧ２の分子量は２０ｋＤａである。

直鎖のＰＥＧ鎖の替わりに、所定の分子量を有する非対称分枝ＰＥＧ鎖を使用することにより、二ＰＥＧ化された汚染物質の形成を低減することが可能になり、その分子の半減期およびその物理化学的安定性が予想外に有意に増加した。

別の予想外の結果は、非対称分枝単官能性ＰＥＧを有するＰＥＧ化分子の生物学的活性が失われていないままであることである。ＰＥＧ化により引き起こされる生体分子の生物学的活性の損失は、文献で広く報告されている（Ｈａｒｒｉｓ ＪＭおよびＣｈｅｓｓ ＲＢ （２００３年） Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（医薬品に対するＰＥＧ化の影響）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２：２１４−２２１）。

２つの非対称分枝を有する単官能性ＰＥＧは、異なる分子サイズを有する２つの直鎖状のＰＥＧ鎖をコアに結合させることによって得られる。同様のプロセスが、良好な結果を示す他の著者によって使用されてきた（米国特許第５９３２４６２号）。コアに２つの直鎖状のＰＥＧ鎖を結合するために、それらが活性基を有することが必要とされた。この基は、当該分野で公知の様々な基から選択されることができる。例えば、この活性基は、とりわけ、スクシンイミジルスクシナート、スクシンイミジルカルボナート、ｐ−ニトロフェニルカルボナート、スクシンイミジルプロパノアート、スクシンイミジルブタノアートであることができる。本発明の好ましい直鎖状ＰＥＧは、スクシンイミジルカーボナートで活性化される。これは、次の２つの主な理由による：ａ）それとそのアミノ基の間の反応の良好な収率、およびｂ）この官能化ＰＥＧを得るためのプロセスの容易さ。この官能化ＰＥＧを得るためのプロセスは、この技術分野に携わる人々に知られている（Ｍｉｒｏｎ Ｔ，Ｗｉｌｃｈｅｋ Ｍ．（１９９３年）．Ａ Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ｆｏｒ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（タンパク質に結合するためのスクシンイミジルカルボナートポリエチレングリコールの調製のための簡便法）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：５６８−５６９）。直鎖状ＰＥＧが活性化されると、続いてそれは、選択されたコア分子と反応することができる。

本発明の好ましい態様において、コアは、後に活性化されるように使用することができる２つの遊離アミノ基とカルボキシル基を有する生体適合性分子であるので、それは、Ｌ−リジンである。したがって、本発明の１つの態様において、ＥＰＯは、以下のように表される非対称分枝ポリマー構造に結合される：

特定の態様において、複合体の部分を形成する前記ポリマー構造において、ｍＰＥＧ１の分子量が１２ｋＤａであり、ｍＰＥＧ２の分子量が２０ｋＤａであり、またはｍＰＥＧ１の分子量が２０ｋＤａであり、ｍＰＥＧ２の分子量が１２ｋＤａである。

２つの非対称分枝の誘導体は、クロマトグラフィー法を用いて精製されてよく、続いて生体分子に結合するための異なる反応基を用いて活性化されてよい。他のＰＥＧ構造の活性化のために使用される官能基のいずれかは、本発明で記載される非対称分枝ＰＥＧのために使用されてよい。これらの官能基の例は、次の通りである：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジルカーボナート、様々なタイプのアルデヒド、とりわけマレイミド。タンパク質にこの構造を結合することを可能にする官能基の別のタイプは、ニトリロトリアセタートのようなキレート基であり、それは、遷移金属を用いて、ペプチド骨格中に存在するヒスチジンに結合されてよい。使用される反応基の選択は、ＰＥＧが結合されるタンパク質の残基に依存する。

Ｈｕａｎｇによって出願された特許出願（ＥＰ１４７９７１１Ａ１）の諸例において、ＰＥＧ分枝構造は、分枝のそれぞれにおいて異なる分子量で示される；しかし、分枝の分子サイズは、本発明のそれよりも小さい。特許出願第ＥＰ１４７９７１１Ａ１において、発明者らは、複合体の生物学的活性が、未修飾の薬剤の生物学的活性に関して減少することを示唆する。しかしながら、本発明において、予想外に、総分子量が２７と３７ｋＤａの間の２つの非対称分枝を有するモノ官能性ＰＥＧに結合されるＥＰＯの生物学的活性は、未修飾のＥＰＯのそれと同様であった。一方、本発明において、より低い分子量を有する、２つの分枝を有するＰＥＧ構造の半減期は、Ｈｕａｎｇによって出願された特許出願に従えば、本発明の、それぞれ、１２ｋＤａと２０ｋＤａの２つの分枝のＰＥＧを有するＥＰＯ複合体の半減期よりも短いことが示された。

本発明で得られたこの結果は、予想外であった。非対称のポリマー構造を含む複合体（ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}）で、生物学的活性を制限せず、ポリＰＥＧ化生成物の形成を減少させる結合反応を改善し、薬物動態パラメータを有意に改善する分子の空間分布が達成される。これは、それを必要とする人々のための治療用量の低減を可能にする。

本発明において、非対称の２つの分枝ＰＥＧ構造を得るための基本的な原料は、１２ｋＤａのｍＰＥＧ（１２Ｋ ＰＥＧ）と２０ｋＤａのｍＰＥＧ（２０Ｋ ＰＥＧ）である。ＰＥＧは多分散ポリマーであるので、これらのｍＰＥＧの分子量は、製造業者によって確立される範囲を有する。例えば、製造業者の１つによって特定されているように、多分散性は、１．１％より低いはずである。その場合、１２Ｋ ＰＥＧについて製造業者により報告される分子量の範囲は、１２．０±１．２ｋＤａであろう；ＰＥＧ ２０Ｋは、２０．０±２．０ｋＤａであろう。

ＰＥＧの初期材料の各バッチ間の分子量のこの違いが薬物動態の結果に影響を与えるかどうかを決定するために、仕様の極端な値に相当する分子量を有するＰＥＧのバッチを用いる実験（例１１）が実施された。１１ｋＤａの分子量を有する１２Ｋ ＰＥＧと１８ｋＤａの分子量を有する２０Ｋ ＰＥＧは、２９ｋＤａの総分子量の２つの分枝ＰＥＧ構造を有するＥＰＯ複合体（ＰＥＧ_{２，２９Ｋ}−ＥＰＯ）を形成するために使用された。１３ｋＤａの分子量を有する１２Ｋ ＰＥＧおよび２２ｋＤａの分子量を有する２０Ｋ ＰＥＧはまた、３５ｋＤａの総分子量の２つの分枝ＰＥＧ構造を有するＥＰＯ複合体（ＰＥＧ_{２，３５Ｋ}−ＥＰＯ）を形成するために使用された。結果は、１２Ｋ ＰＥＧと２０Ｋ ＰＥＧの異なる最初のバッチが使用される場合、薬物動態パラメータは類似することを示した。したがって、ＰＥＧ_{２，２９Ｋ}−ＥＰＯおよびＰＥＧ_{２，３５Ｋ}−ＥＰＯ構造によって形成される複合体は、製造業者によって示される理論重量を有する構造によって形成されるものと本質的に同じと考えられ、これは、ＥＰＯおよび２つの分枝ＰＥＧ、１つは１２ｋＤａ、もう１つは２０ｋＤａの複合体（ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ）である。

活性化ＰＥＧを有するタンパク質の結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、適切な緩衝液内で行われる。緩衝液の特性は、他の要因群の中で、ポリマーの官能基および結合の対象に依存する。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような官能化ＰＥＧとの遊離アミノ基による結合が望まれる場合、結合部位は、結合反応のｐＨに依存して、ある程度まで予測することができる。８．０と９．０の間のｐＨは、リジンのε−アミノ基による結合を促進する。

複合体を得た後、それは様々な技術を使用して特徴付けられる。複合体の化学的、物理的および生物学的特性は、精製される複合体の可能な限りの特徴付けを達成するために分析される。例えば、ＰＥＧ残基は、実際にタンパク質のモル吸光係数に影響を与えないので、複合体の濃度は、通常、紫外線分光法（２８０ｎｍの吸光度）により決定され得る。ゲルろ過クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法によっては、対象の複合体および汚染物質に相当する信号を識別することが難しいので、精製される生成物の純度は、好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される。他の物理化学的特性は、当業者に公知の通常の方法により調査することができる。

本発明に関して、用語エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、その生物学的活性を維持するＥＰＯ分子の任意の変異体、例えば、切断された分子を意味する。ＥＰＯは、この技術分野の当業者によって公知の発現および精製系を使用して、組換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）技術によって得ることができる。したがって、本発明の態様において、複合体は、ｒｈＥＰＯを含む。本発明の複合体はまた、アミノ酸置換のような先行技術の任意の方法によって修飾された後、上記の方法により得られるＥＰＯの任意の変異体を含む。

本明細書中に開示されるＰＥＧ−ＥＰＯ複合体のいずれかを含む医薬組成物および薬学的に許容可能な賦形剤はまた、本発明の対象である。

本発明の別の側面は、ＰＥＧ化ＥＰＯを得る方法であり、この方法で、前記タンパク質は、２つのｍＰＥＧ分枝を含む非対称分枝ポリマー構造に結合され、ｍＰＥＧ分枝の１つの分子量は、１０ｋＤａと１４ｋＤａの間であり、ｍＰＥＧの他方の分枝の分子量は、１７ｋＤａと２３ｋＤａの間である。本発明の方法により、タンパク質が投与される哺乳動物の血液中のＥＰＯの半減期が、未結合ＥＰＯの半減期と比較して増加する。したがって、本発明は、それを必要とする対象に投与される用量を減らす目的で、タンパク質の薬物動態を改善する方法を提供する。本発明に関して、ＥＰＯの薬物動態パラメータの改善は、前記タンパク質の半減期および／または平均滞留時間の上昇として理解されるべきである。したがって、本発明は、ＥＰＯ分子の半減期の上昇のために、該ＥＰＯ分子の化学修飾の方法を開示し、前記タンパク質が、２つのｍＰＥＧ分枝を含む非対称分枝ポリマー構造に結合され、これらのｍＰＥＧ分枝の１つの分子量は、１０ｋＤａと１４ｋＤａの間であり、他方のｍＰＥＧ分枝の分子量は、１７ｋＤａと２３ｋＤａの間である。

本発明の１つの態様において、非対称分枝ポリマー構造のｍＰＥＧ分枝の１つの分子量は、１２ｋＤａであり、他のｍＰＥＧ分枝の分子量は、２０ｋＤａである。本発明の１つの態様において、ＥＰＯと結合される非対称分枝ポリマー構造は、本発明の方法において、以下のように表される。

本発明の方法の好ましい態様において、ＥＰＯに結合される非対称分枝ポリマー構造において、ｍＰＥＧ１の分子量は、１２ｋＤａであり、ｍＰＥＧ２の分子量は、２０ｋＤａであり、またはｍＰＥＧ１の分子量は、２０ｋＤａであり、ｍＰＥＧ２の分子量は、１２ｋＤａである。より好ましい態様において、本発明の方法において、ＥＰＯは、ｒｈＥＰＯである。

例１ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとしての活性化ＰＥＧの調製
ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ＯＨの活性化反応
活性化なしの２０ｋＤａの分子量の５０ｇのｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ＯＨ）を３時間、４５０ｍＬのトルエン中で、共沸乾燥した。この時間の後、２００ｍＬの溶媒を除去し、溶液を室温に冷却した。続いて、６０ｍＬの乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）を共溶媒として添加した。ジスクシンイミジルカーボナート（４．９ｇ）を秤量し、４０ｍＬのジメチルホルムアミドに溶解した。上記溶液をｍＰＥＦ_２０Ｋ−ＯＨを含むフラスコに加えた。ジメチルアミノピリジン（２．５ｇ）を秤量し、２０ｍＬのＤＣＭに溶解した。上記溶液をｍＰＥＦ_２０Ｋ−ＯＨを含むフラスコに加え、撹拌を開始した。それを一晩、室温で反応させた。

反応混合物をガラス繊維膜を使用して、ろ過して固体生成物を除去した。ろ液を１．５Ｌの乾燥ジエチルエーテルで沈殿させ、真空下でろ過した。沈殿物を真空により回収し、４時間、高真空下で乾燥させ、−２０℃で保存した。ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ＯＨの初期質量の９６％を９６．０±０．８％の活性化の程度を有するＰＥＧスクシンイミジルカーボナート（ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ＳＣ）として回収した。

ｍＰＥＧ_１２Ｋ−ＯＨの活性化反応
ｍＰＥＧ_２０Ｋ−ＯＨの活性化反応のために使用されたのと同じ手順に従ったが、この場合には、分子量１２ｋＤａの非活性化ｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ_１２Ｋ−ＯＨ）が出発原料として使用された。

ＰＥＧ_２０Ｋ−ＳＣおよびＰＥＧ_１２Ｋ−ＳＣとＬ−リジンの反応
Ｌ−リジン（９．１ｇ）を秤量し、３０ｍＬの０．１Ｍホウ酸；ｐＨ８．０に溶解させた。２０ｇのＰＥＧ_２０Ｋ−ＳＣをホウ酸中の１５ｍＬのＬ−リジン溶液に添加した。その溶液を１２時間、撹拌し続けた。

続いて、反応混合物を３００ｍＬの蒸留水で希釈し、塩酸溶液の混合物でｐＨ３．５に調整した。その混合物を分液漏斗に移し、１００ｍＬのＤＣＭを加えた。それを手動で撹拌し、下相（有機相）を除去した。合計５回の抽出を実施した。２０ｇの硫酸ナトリウムを有機相を含む瓶に添加し、相が完全に透明になるまで、手動で撹拌した。それをガラス繊維膜を使用して、真空ろ過した。ろ液をロータリーエバポレーター上で最大限まで濃縮した。次いで、５００ｍＬのジエチルエーテルを加え、手動で撹拌し、生成物を沈殿させた。それを真空ろ過し、生成物（２０ＫのモノＰＥＧ化Ｌ−リジン）をロータリーエバポレーター中で真空下で１時間乾燥した。

第２の反応ステップにおいて、９ｇのＰＥＧ_１２Ｋ−ＳＣを１５ｇの２０ＫのモノＰＥＧ化Ｌ−リジンに加えた。反応物を２１５ｍＬのＤＣＭに溶解し、０．１４ｍＬのトリエチルアミンを添加した。反応混合物をガラス繊維膜を使用して真空ろ過した。ろ液をロータリーエバポオレーター上で最大に濃縮した。次に３００ｍＬのジエチルエーテルを加え、２分間手動で撹拌して生成物を沈殿させた。それを真空下でろ過し、得られた生成物（２つの非対称分枝を有するＰＥＧ、１つは１２ｋＤａおよびもう１つは２０ｋＤａ（ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＣＯＯＨ））をロータリーエバポレーター中で、真空下で１時間、乾燥した。プロセスの全収率は、７０％より高かった。

ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＣＯＯＨの精製
ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＣＯＯＨの精製を４０ｍＬ／分の体積流量を使用して、８０ｃｍの高さのＤＥＡＥ−セファロース（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムで実施した。ゲルを０．２Ｍ水酸化ナトリウムの４．５Ｌの溶液で予め消毒した。カラムを５０ｍＭホウ酸の溶液、ｐＨ９．０で平衡化した。続いて、カラムを５Ｌの蒸留水で洗浄した。水に溶解したＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＣＯＯＨサンプルは、水の伝導率よりも４０ｍＳ／ｃｍ大きい伝導率に適用（ａｐｐｌｙ）された。サンプルを適用した後、カラムを３Ｌの精製水で洗浄した。サンプルの溶出を１０ｍＭ塩化ナトリウムの５Ｌの溶液を用いて実施した。５００ｍＬの画分を収集した。続いて、カラムを１Ｍ塩化ナトリウムの３Ｌの溶液を用いて再生した。プロセスから回収された全収率は、９０％より高く、９５％より高い純度であった。

Ｎ−ヒドロキシスクシンインミドのエステルとしての分枝活性化ＰＥＧ（ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＮＨＳ）の調製
１ｇのＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＣＯＯＨをＤＣＭに溶解した；０．０１ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と０．０２ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。その反応混合物を１２時間、撹拌した。続いて、それを５ｍＬのＤＣＭで希釈し、ガラス繊維膜を通してろ過した。ろ液をロータリーエバポレーター上で濃縮し、４００ｍＬのジエチルエーテルを加えて生成物を沈殿させた。その混合物を真空ろ過し、固形生成物（ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＮＨＳ）を収集し、ロータリーエバポレーター中で真空下、１時間乾燥した。９５％より高い活性化度および９０％を超える最初のポリマー塊の回収が達成された。

例２ ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＮＨＳと結合されるＥＰＯの調製
結合反応（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
６ｇのＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＮＨＳを５０ｍＭホウ酸溶液、ｐＨ８．０において、５ｍｇ／ｍＬの初期濃度で、１ｇのｒｈＥＰＯを含む溶液に添加した。反応をゆっくり撹拌しながら４℃で２時間保持した。反応を５０ｍＭホウ酸、ｐＨ８．０を用いて０．９ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に希釈することによって停止させた。図１に示すように、反応収率をＳＤＳ―ＰＡＧＥゲルの濃度測定によって決定した。総回収率は、４０％より大きく、ポリＰＥＧ化生成物は３％未満であった。

モノＰＥＧ化ＥＰＯの精製
ＰＥＧとｒｈＥＰＯの結合反応の生成物、すなわち、遊離ＥＰＯおよび二ＰＥＧ化ＥＰＯからのモノＰＥＧ化ＥＰＯを分離するために、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製プランがデザインされた。分離プロセスを１２ｃｍの高さのＱ−セファロースを用いて充填されたカラムを使用して実施した。ゲルを０．２Ｍ水酸化ナトリウムの２２ｍＬであらかじめ消毒した。次に、３３ｍＬの精製水を通し、その後、３３ｍＬの５０ｍＭホウ酸、ｐＨ８．０の平衡溶液を通した。０．９ｍｇ／ｍＬの濃度にまで平衡溶液で希釈された結合反応液からのサンプルを適用した。ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＮＨＳとのＥＰＯ複合体（ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ）を含むサンプルの溶出を、０．１７５Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度を増加させながら同じ平衡緩衝液を使用して、順次実施する。体積流量は１．２ｍＬ／分であり、装入量は０．５８ｍｇタンパク質／１ｍＬゲルであった。プロセスの回収率は４０％であり、純度は９７％であった。

例３ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとしての分枝活性化ＰＥＧ（ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＮＨＳ）の調製
ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＮＨＳを得るために、例１で記載される手順に従ったが、リジンとの反応の第二ステップにおいて、ＰＥＧ_２０Ｋ−ＳＣを使用した。９０％より高い活性を伴って５０％より大きい全収率が達成された。

例４ ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＮＨＳと結合されるＥＰＯの調製
結合反応
６ｇのＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＮＨＳを５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０中で５ｍｇ／ｍＬの初期濃度で、１ｇのｒｈＥＰＯを含む溶液に添加した。反応をゆっくり撹拌しながら４℃で２時間、保持した。反応を５０ｍＭホウ酸、ｐＨ８．０を用いて、０．９ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度に希釈することによって停止させた。図２に示すように、反応収率をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定によって決定した。総回収率は４０％より高く、ＰＥＧ化生成物は１％未満であった。

モノＰＥＧ化ＥＰＯの精製
ＰＥＧとＥＰＯの結合反応の生成物、すなわち、遊離ＥＰＯおよび二ＰＥＧ化ＥＰＯからのモノＰＥＧ化ＥＰＯを分離するために、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製プランがデザインされた。分離プロセスを１２ｃｍの高さのＱ−セファロースを用いて充填されたカラムを使用して実施した。ゲルを２２ｍＬの０．２Ｍ水酸化ナトリウムであらかじめ消毒した；次に、３３ｍＬの蒸留水を通し、その後、３３ｍＬの５０ｍＭホウ酸、ｐＨ８．０の平衡溶液を通した。０．９ｍｇ／ｍＬの濃度に平衡溶液で希釈された結合反応からのサンプルを適用した。ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＮＨＳと結合されるＥＰＯ（ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＥＰＯ）を含むサンプルの溶出を、０．１７５Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの濃度を増加させながら同じ平衡緩衝液を使用して、順次実施した。体積流量は１．２ｍＬ／分であり、装入量は０．５８ｍｇタンパク質／１ｍＬゲルであった。プロセスの回収率は４０％であり、純度は９７％であった。

例５ ＰＥＧ化ＥＰＯの物理化学的特性評価
複合体濃度の決定
複合体濃度を、分光光度計で２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。タンパク質濃度の計算を、ＥＰＯについて０．７４３のモル吸光係数を用いて実施した。

ゲルろ過クロマトグラフィーによる特性評価
クロマトグラフィー分離を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ポンプおよび２２６ｎｍのフィルターを有するＵＶ検出器を用いて実施した。適用質量は、１００μｇのタンパク質であった。クロマトグラフィーをスーパーデックス−２００（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００）マトリックスを用いて実施した。ＰＥＧ化ＥＰＯ（ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}-ＥＰＯおよびＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＥＰＯ）の２つの変異体および未修飾ＥＰＯを分析した。

図３は、各変異体に対する推定分子量と得られる保持時間の対応関係を示す。それはより大きな分子サイズを有しているので、より短い保持時間で、ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＥＰＯ複合体を溶出し、次にＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ複合体を溶出し、最終的に未修飾ＥＰＯを溶出した。

例６ ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ複合体の生物学的特性評価
ＰＥＧ化ＥＰＯの効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）の決定が正球性マウスの方法によってされた。Ｂ６Ｄ２Ｆ１系（１６〜１８ｇ）、メス、処女のマウスが、グループごとに３匹の動物の割合で、ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＥＰＯ、ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ、基準物質（陽性対照として）および陰性対照（希釈剤のみ）のサンプルの０．２ｍＬの異なる希釈（３００、４５０および６００ＩＵ／ｍＬ、３、４．５および６μｇ／マウスに相当）を皮下接種された。２匹の動物をさらに使用し、５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０の溶液を接種し、その毒性を評価した。接種の７２時間後、血液サンプルを各動物から眼窩穿刺により採取し、４μＬのヘパリンナトリウム（５０００ＩＵ）を含むバイアルに堆積させた。末梢血から、４０μＬを回収し、０．３ｍＭメチレンブルー溶液、１．２９ｍＭクエン酸ナトリウム、５ｍＬの生理食塩水、および１０ｍＬの蒸留水によって形成される１２０μＬの溶液で混合した。それらを、３７℃の水浴中で１時間、インキュベートした。その後、選択的溶血を０．０８ｍＭのＥＤＴＡテトラナトリウム；０．１５ｍＭ塩化アンモニウム；および９．９８ｍＭの重炭酸ナトリウムからなる溶解液を用いて処理することによって、６分間実施した。赤血球溶解は、生理食塩水で過剰希釈することにより停止され、網状赤血球は、ノイバウアーチャンバー（Ｎｅｕｂａｕｅｒ ｃｈａｍｂｅｒ）の中で視覚的にカウントされた。データ処理および効力の計算は、α＝０．０５の有意なレベルで直線性および平行性の有効性を検出するために、平行線および未知のパターンのランダムなデザインを使用して行った。得られた値は、欧州薬局方の規定に適合している必要があり、それには、パーセンテージで表して、仮定に基づいて計算された効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）の比の値が８０％以上１２５％以下であるべきであり、計算された効力の信頼限界は、６４％と１５６％の間の範囲にあるものとすると記述されている。

図４において、グラフは、ＥＰＯの量の増加が適用され、効力のＩＵで測定される網状赤血球カウント実験から直接得られたデータを観察することができる。手段の比較のための統計的チューキー・クレーマー検定が、インビボでの活性値を分析する目的で、適用された。データの統計分析は、Ｐ＜０．０５についての諸値の間に有意差を示さなかった。ＰＥＧ化ＥＰＯと陽性対照として使用される未修飾ＥＰＯとの間の生物学的活性の差異は、アッセイ（±５０％）の変動範囲内であった。

重要であることには、アッセイを行うために使用される用量は、効力の３００、４５０および６００ＩＵを有していたことが強調される。これらは、天然型ＥＰＯの生物学的活性を検出するために設定された用量である一方で、分子量３０ｋＤａの直線ポリマー構造と結合するＥＰＯ（ＰＥＧ_{１，３０Ｋ}-ＥＰＯ）であるＡｍｇｅｎ ＣｏｍｐａｎｙのＭｉｒｃｅｒａ（登録商標）の製品を使用して実施されるアッセイは、効力の６０００ＩＵの最小用量を必要とする。しかしながら、本発明に従って実施された試験において、２０倍低い用量で、ＰＥＧ化ＥＰＯのインビボ生物学的活性が検出された。

例７ プロテアーゼ分解に対する抵抗性
異なるＰＥＧ−ＥＰＯ分子のプロテアーゼによる分解に対する抵抗性を証明するために、インビボの実験が実施され、ＰＥＧ化ＥＰＯと天然タンパク質（対照として）がトリプシンで消化された。両方のＰＥＧ化ＥＰＯ変異体は、天然ＥＰＯよりもプロテアーゼ分解に対してより高い抵抗性を示した。図５において、対照として使用されるＥＰＯの分解速度の結果が示され、また、２つのＰＥＧ化変異体ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯおよびＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＥＰＯについても示されている。２つのＰＥＧ化ＥＰＯ変異体は、天然ＥＰＯよりもプロテアーゼによる分解に対してより高い耐性を示すことがわかる。

例８ ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ複合体の薬物動態
薬物動態の研究を未修飾ＥＰＯ、ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ複合体、ＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＥＰＯ複合体およびＰＥＧ_{１，３０Ｋ}−ＥＰＯ複合体を比較することによって行った。２ｋｇの質量を有するニュージーランド種のウサギを使用した。半減期（ｔ_１／２）、曲線下面積（略してＡＵＣ）および平均保持時間（略してＭＲＴ）の結果を表１に示す。

全てのＰＥＧ化ＥＰＯは、未修飾ＥＰＯよりも長い半減期を有することが観察できる。ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ複合体の半減期は、ＰＥＧ_{１，３０Ｋ}−ＥＰＯについて得られたそれよりも非常に長かった（２．４倍）。この結果は、両方の複合体が非常に類似する分子サイズを示すことを考慮すると、予想外である。更に、この非対称分枝分子は、より高い分子量を有する分枝されたＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＥＰＯ複合体よりも長い半減期を示すが、このこともまた予測されなかった。

例９ 異なるＥＰＯ複合体の薬物動態結果の比較
この薬物動態学的研究は、分子量１２ｋＤａの分枝と２０ｋＤａの別の分枝を有するＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ複合体；分子量５ｋＤａの分枝と７ｋＤａの別の分枝を有する非対称ＰＥＧ構造に結合されるＥＰＯ（ＰＥＧ_{２，１２Ｋ}−ＥＰＯ）；それぞれ７ｋＤａの２つの分枝の対称構造を有するＥＰＯ複合体；および１２ｋＤａの分子量の直鎖状ＰＥＧに結合するＥＰＯ（ＰＥＧ_{１，１２Ｋ}−ＥＰＯ）を比較して行った。この研究のために、ＰＥＧ_{２，１２Ｋ}−ＥＰＯ複合体をＰＥＧ_{２．３２Ｋ}−ＥＰＯ複合体と同様の方法で得たが、低分子量のｍＰＥＧを使用した。ＰＥＧ_{２，１４Ｋ}−ＥＰＯ複合体をＰＥＧ_{２，４０Ｋ}−ＥＰＯ複合体と同様に得たが、低分子量のｍＰＥＧを使用した。ＰＥＧ_{１，１２Ｋ}−ＥＰＯ複合体は、例１の開始時に記載されるような１２ｋＤａの分子量のｍＰＥＧを活性化することによって得られ、ｒｈＥＰＯとの結合は、例２で記載されるように、後で行われた。２ｋｇの質量を有するニュージーランド種のウサギが比較のために使用された。その結果を表２に示す。本発明の複合体（ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ）は、分析された複合体の他のものよりも長い半減期を示した。

例１０ 種々のＥＰＯ複合体群の生物学的活性の比較
複合体群の生物学的活性が、例６に記載のそれと同様の方法で測定された。複合体：（１）ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ；（２）ＰＥＧ_{２，１２Ｋ}−ＥＰＯ；（３）ＰＥＧ_{２，１４Ｋ}−ＥＰＯ；および（４）ＰＥＧ_{１，１２Ｋ}−ＥＰＯについて得られた結果が比較された。未修飾ｒｈＥＰＯは、対照として使用された。図６において、本発明の複合体（ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ）は、未修飾タンパク質の生物学的活性を維持したが、それと異なり、分析された複合体群の残りのものについての生物学的活性は、ＰＥＧ化の際に減少することがわかる。

例１１ ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ複合体の２つの非対称分枝を形成するｍＰＥＧの分子量の極限限界を使用する薬物動態試験
ＰＥＧは多分散であり、非対称ＰＥＧの構造を形成するために使用される出発原料であるＰＥＧ_{２，３２Ｋ}は、分子量の１２ｋＤａおよび２０ｋＤａの理論値からの変動を有し得るため、２９ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ非対称構造を有するＥＰＯ複合体（ＰＥＧ_{２，２９Ｋ}−ＥＰＯ）と３５ｋＤａの分子量を有するＰＥＧ非対称構造を有するＥＰＯ複合体（ＰＥＧ_{２，３５Ｋ}−ＥＰＯ）の薬物動態研究が実施された。これらは、本発明のＥＰＯ複合体のＰＥＧ形成部分の総分子量の限界である。ＰＥＧ_{２，２９Ｋ}−ＥＰＯおよびＰＥＧ_{２，３５Ｋ}−ＥＰＯ複合体が、ＰＥＧ_{２，３２Ｋ}−ＥＰＯ複合体と同様の方法で得られた。２ｋｇの質量を有するニュージーランド株のウサギが使用された。その結果を表３に示す。観察されるとおり、研究された複合変異体の薬物動態パラメータに差異はない。

Claims (7)

1. エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）の２つの分枝を含む非対称分枝ポリマー構造を含む複合体であって、ｍＰＥＧの分枝の１つの分子量が１２ｋＤａであり、他方のｍＰＥＧの分枝の分子量が２０ｋＤａであって、該分枝ポリマー非対称構造が以下のように示される、上記複合体。
   
2. ｍＰＥＧ１の分子量が１２ｋＤａであり、ｍＰＥＧ２の分子量が２０ｋＤａであり、またはｍＰＥＧ１の分子量が２０ｋＤａであり、ｍＰＥＧ２の分子量が１２ｋＤａである、請求項１に記載の複合体。
3. ＥＰＯが組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）である、請求項１〜２のいずれか一項に記載の複合体。
4. 請求項１〜３のいずれか一項の複合体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
5. ＰＥＧ化エリスロポエチン（ＥＰＯ）を得るための方法であって、
   前記タンパク質が２つの分枝を含む非対称分枝ポリマー構造に結合され、ｍＰＥＧの分枝の１つの分子量が１２ｋＤａであり、他方のｍＰＥＧの分枝の分子量が２０ｋＤａであって、
   非対称分枝ポリマー構造が以下のように示される、上記方法。
   
6. ｍＰＥＧ１の分子量が１２ｋＤａであり、ｍＰＥＧ２の分子量が２０ｋＤａであり、またはｍＰＥＧ１の分子量が２０ｋＤａであり、ｍＰＥＧ２の分子量が１２ｋＤａである、請求項５に記載の方法。
7. ＥＰＯが組換えヒトＥＰＯ（ｒｈＥＰＯ）である、請求項５〜６のいずれか一項に記載の方法。