JP6367952B2 - エリスロポエチンおよび分枝ポリマー構造を含む複合体 - Google Patents
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Description
ヒトにおける治療のための生体分子の使用は、近年、増加しており、主に(1)新しいタンパク質およびペプチド分子の発見、(2)インビボでの作用機序のより良い理解、(3)タンパク質およびペプチド合成の発現系での改善、および(4)薬力学的もしくは薬物動態学的特性を高める製剤、または分子修飾技術における改善による。
本発明は、EPOと、モノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)の2つの分枝を含む非対称分枝ポリマー構造とを含む複合体であって、これらのmPEGの分枝の1つの分子量が10kDaと14kDaの間であり、mPEGの他の分枝の分子量が17kDaと23kDaの間である、上記複合体を提供することにより、上記の問題を解決する。
mPEG20K−OHの活性化反応
活性化なしの20kDaの分子量の50gのmPEG(mPEG20K−OH)を3時間、450mLのトルエン中で、共沸乾燥した。この時間の後、200mLの溶媒を除去し、溶液を室温に冷却した。続いて、60mLの乾燥ジクロロメタン(DCM)を共溶媒として添加した。ジスクシンイミジルカーボナート(4.9g)を秤量し、40mLのジメチルホルムアミドに溶解した。上記溶液をmPEF20K−OHを含むフラスコに加えた。ジメチルアミノピリジン(2.5g)を秤量し、20mLのDCMに溶解した。上記溶液をmPEF20K−OHを含むフラスコに加え、撹拌を開始した。それを一晩、室温で反応させた。
mPEG20K−OHの活性化反応のために使用されたのと同じ手順に従ったが、この場合には、分子量12kDaの非活性化mPEG(mPEG12K−OH)が出発原料として使用された。
L−リジン(9.1g)を秤量し、30mLの0.1Mホウ酸;pH8.0に溶解させた。20gのPEG20K−SCをホウ酸中の15mLのL−リジン溶液に添加した。その溶液を12時間、撹拌し続けた。
PEG2,32K−COOHの精製を40mL/分の体積流量を使用して、80cmの高さのDEAE−セファロース(DEAE−Sepharose)カラムで実施した。ゲルを0.2M水酸化ナトリウムの4.5Lの溶液で予め消毒した。カラムを50mMホウ酸の溶液、pH9.0で平衡化した。続いて、カラムを5Lの蒸留水で洗浄した。水に溶解したPEG2,32K−COOHサンプルは、水の伝導率よりも40mS/cm大きい伝導率に適用(apply)された。サンプルを適用した後、カラムを3Lの精製水で洗浄した。サンプルの溶出を10mM塩化ナトリウムの5Lの溶液を用いて実施した。500mLの画分を収集した。続いて、カラムを1M塩化ナトリウムの3Lの溶液を用いて再生した。プロセスから回収された全収率は、90%より高く、95%より高い純度であった。
1gのPEG2,32K−COOHをDCMに溶解した;0.01gのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)と0.02gのジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。その反応混合物を12時間、撹拌した。続いて、それを5mLのDCMで希釈し、ガラス繊維膜を通してろ過した。ろ液をロータリーエバポレーター上で濃縮し、400mLのジエチルエーテルを加えて生成物を沈殿させた。その混合物を真空ろ過し、固形生成物(PEG2,32K−NHS)を収集し、ロータリーエバポレーター中で真空下、1時間乾燥した。95%より高い活性化度および90%を超える最初のポリマー塊の回収が達成された。
結合反応(Conjugation reaction)
6gのPEG2,32K−NHSを50mMホウ酸溶液、pH8.0において、5mg/mLの初期濃度で、1gのrhEPOを含む溶液に添加した。反応をゆっくり撹拌しながら4℃で2時間保持した。反応を50mMホウ酸、pH8.0を用いて0.9mg/mLの最終タンパク質濃度に希釈することによって停止させた。図1に示すように、反応収率をSDS―PAGEゲルの濃度測定によって決定した。総回収率は、40%より大きく、ポリPEG化生成物は3%未満であった。
PEGとrhEPOの結合反応の生成物、すなわち、遊離EPOおよび二PEG化EPOからのモノPEG化EPOを分離するために、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製プランがデザインされた。分離プロセスを12cmの高さのQ−セファロースを用いて充填されたカラムを使用して実施した。ゲルを0.2M水酸化ナトリウムの22mLであらかじめ消毒した。次に、33mLの精製水を通し、その後、33mLの50mMホウ酸、pH8.0の平衡溶液を通した。0.9mg/mLの濃度にまで平衡溶液で希釈された結合反応液からのサンプルを適用した。PEG2,32K−NHSとのEPO複合体(PEG2,32K−EPO)を含むサンプルの溶出を、0.175M〜0.5Mの塩化ナトリウムの濃度を増加させながら同じ平衡緩衝液を使用して、順次実施する。体積流量は1.2mL/分であり、装入量は0.58mgタンパク質/1mLゲルであった。プロセスの回収率は40%であり、純度は97%であった。
PEG2,40K−NHSを得るために、例1で記載される手順に従ったが、リジンとの反応の第二ステップにおいて、PEG20K−SCを使用した。90%より高い活性を伴って50%より大きい全収率が達成された。
結合反応
6gのPEG2,40K−NHSを50mMホウ酸緩衝液、pH8.0中で5mg/mLの初期濃度で、1gのrhEPOを含む溶液に添加した。反応をゆっくり撹拌しながら4℃で2時間、保持した。反応を50mMホウ酸、pH8.0を用いて、0.9mg/mLの最終タンパク質濃度に希釈することによって停止させた。図2に示すように、反応収率をSDS−PAGEゲルの濃度測定によって決定した。総回収率は40%より高く、PEG化生成物は1%未満であった。
PEGとEPOの結合反応の生成物、すなわち、遊離EPOおよび二PEG化EPOからのモノPEG化EPOを分離するために、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製プランがデザインされた。分離プロセスを12cmの高さのQ−セファロースを用いて充填されたカラムを使用して実施した。ゲルを22mLの0.2M水酸化ナトリウムであらかじめ消毒した;次に、33mLの蒸留水を通し、その後、33mLの50mMホウ酸、pH8.0の平衡溶液を通した。0.9mg/mLの濃度に平衡溶液で希釈された結合反応からのサンプルを適用した。PEG2,40K−NHSと結合されるEPO(PEG2,40K−EPO)を含むサンプルの溶出を、0.175M〜0.5Mの塩化ナトリウムの濃度を増加させながら同じ平衡緩衝液を使用して、順次実施した。体積流量は1.2mL/分であり、装入量は0.58mgタンパク質/1mLゲルであった。プロセスの回収率は40%であり、純度は97%であった。
複合体濃度の決定
複合体濃度を、分光光度計で280nmでの吸光度を測定することによって決定した。タンパク質濃度の計算を、EPOについて0.743のモル吸光係数を用いて実施した。
クロマトグラフィー分離を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)ポンプおよび226nmのフィルターを有するUV検出器を用いて実施した。適用質量は、100μgのタンパク質であった。クロマトグラフィーをスーパーデックス−200(Superdex−200)マトリックスを用いて実施した。PEG化EPO(PEG2,32K-EPOおよびPEG2,40K−EPO)の2つの変異体および未修飾EPOを分析した。
PEG化EPOの効力(potency)の決定が正球性マウスの方法によってされた。B6D2F1系(16〜18g)、メス、処女のマウスが、グループごとに3匹の動物の割合で、PEG2,40K−EPO、PEG2,32K−EPO、基準物質(陽性対照として)および陰性対照(希釈剤のみ)のサンプルの0.2mLの異なる希釈(300、450および600IU/mL、3、4.5および6μg/マウスに相当)を皮下接種された。2匹の動物をさらに使用し、50mMホウ酸緩衝液、pH8.0の溶液を接種し、その毒性を評価した。接種の72時間後、血液サンプルを各動物から眼窩穿刺により採取し、4μLのヘパリンナトリウム(5000IU)を含むバイアルに堆積させた。末梢血から、40μLを回収し、0.3mMメチレンブルー溶液、1.29mMクエン酸ナトリウム、5mLの生理食塩水、および10mLの蒸留水によって形成される120μLの溶液で混合した。それらを、37℃の水浴中で1時間、インキュベートした。その後、選択的溶血を0.08mMのEDTAテトラナトリウム;0.15mM塩化アンモニウム;および9.98mMの重炭酸ナトリウムからなる溶解液を用いて処理することによって、6分間実施した。赤血球溶解は、生理食塩水で過剰希釈することにより停止され、網状赤血球は、ノイバウアーチャンバー(Neubauer chamber)の中で視覚的にカウントされた。データ処理および効力の計算は、α=0.05の有意なレベルで直線性および平行性の有効性を検出するために、平行線および未知のパターンのランダムなデザインを使用して行った。得られた値は、欧州薬局方の規定に適合している必要があり、それには、パーセンテージで表して、仮定に基づいて計算された効力(potency)の比の値が80%以上125%以下であるべきであり、計算された効力の信頼限界は、64%と156%の間の範囲にあるものとすると記述されている。
異なるPEG−EPO分子のプロテアーゼによる分解に対する抵抗性を証明するために、インビボの実験が実施され、PEG化EPOと天然タンパク質(対照として)がトリプシンで消化された。両方のPEG化EPO変異体は、天然EPOよりもプロテアーゼ分解に対してより高い抵抗性を示した。図5において、対照として使用されるEPOの分解速度の結果が示され、また、2つのPEG化変異体PEG2,32K−EPOおよびPEG2,40K−EPOについても示されている。2つのPEG化EPO変異体は、天然EPOよりもプロテアーゼによる分解に対してより高い耐性を示すことがわかる。
薬物動態の研究を未修飾EPO、PEG2,32K−EPO複合体、PEG2,40K−EPO複合体およびPEG1,30K−EPO複合体を比較することによって行った。2kgの質量を有するニュージーランド種のウサギを使用した。半減期(t1/2)、曲線下面積(略してAUC)および平均保持時間(略してMRT)の結果を表1に示す。
この薬物動態学的研究は、分子量12kDaの分枝と20kDaの別の分枝を有するPEG2,32K−EPO複合体;分子量5kDaの分枝と7kDaの別の分枝を有する非対称PEG構造に結合されるEPO(PEG2,12K−EPO);それぞれ7kDaの2つの分枝の対称構造を有するEPO複合体;および12kDaの分子量の直鎖状PEGに結合するEPO(PEG1,12K−EPO)を比較して行った。この研究のために、PEG2,12K−EPO複合体をPEG2.32K−EPO複合体と同様の方法で得たが、低分子量のmPEGを使用した。PEG2,14K−EPO複合体をPEG2,40K−EPO複合体と同様に得たが、低分子量のmPEGを使用した。PEG1,12K−EPO複合体は、例1の開始時に記載されるような12kDaの分子量のmPEGを活性化することによって得られ、rhEPOとの結合は、例2で記載されるように、後で行われた。2kgの質量を有するニュージーランド種のウサギが比較のために使用された。その結果を表2に示す。本発明の複合体(PEG2,32K−EPO)は、分析された複合体の他のものよりも長い半減期を示した。
複合体群の生物学的活性が、例6に記載のそれと同様の方法で測定された。複合体:(1)PEG2,32K−EPO;(2)PEG2,12K−EPO;(3)PEG2,14K−EPO;および(4)PEG1,12K−EPOについて得られた結果が比較された。未修飾rhEPOは、対照として使用された。図6において、本発明の複合体(PEG2,32K−EPO)は、未修飾タンパク質の生物学的活性を維持したが、それと異なり、分析された複合体群の残りのものについての生物学的活性は、PEG化の際に減少することがわかる。
PEGは多分散であり、非対称PEGの構造を形成するために使用される出発原料であるPEG2,32Kは、分子量の12kDaおよび20kDaの理論値からの変動を有し得るため、29kDaの分子量を有するPEG非対称構造を有するEPO複合体(PEG2,29K−EPO)と35kDaの分子量を有するPEG非対称構造を有するEPO複合体(PEG2,35K−EPO)の薬物動態研究が実施された。これらは、本発明のEPO複合体のPEG形成部分の総分子量の限界である。PEG2,29K−EPOおよびPEG2,35K−EPO複合体が、PEG2,32K−EPO複合体と同様の方法で得られた。2kgの質量を有するニュージーランド株のウサギが使用された。その結果を表3に示す。観察されるとおり、研究された複合変異体の薬物動態パラメータに差異はない。
Claims (7)
- エリスロポエチン(EPO)およびモノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)の2つの分枝を含む非対称分枝ポリマー構造を含む複合体であって、mPEGの分枝の1つの分子量が12kDaであり、他方のmPEGの分枝の分子量が20kDaであって、該分枝ポリマー非対称構造が以下のように示される、上記複合体。
- mPEG1の分子量が12kDaであり、mPEG2の分子量が20kDaであり、またはmPEG1の分子量が20kDaであり、mPEG2の分子量が12kDaである、請求項1に記載の複合体。
- EPOが組換えヒトEPO(rhEPO)である、請求項1〜2のいずれか一項に記載の複合体。
- 請求項1〜3のいずれか一項の複合体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
- PEG化エリスロポエチン(EPO)を得るための方法であって、
前記タンパク質が2つの分枝を含む非対称分枝ポリマー構造に結合され、mPEGの分枝の1つの分子量が12kDaであり、他方のmPEGの分枝の分子量が20kDaであって、
非対称分枝ポリマー構造が以下のように示される、上記方法。
- mPEG1の分子量が12kDaであり、mPEG2の分子量が20kDaであり、またはmPEG1の分子量が20kDaであり、mPEG2の分子量が12kDaである、請求項5に記載の方法。
- EPOが組換えヒトEPO(rhEPO)である、請求項5〜6のいずれか一項に記載の方法。
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