JP6360345B2 - Xanthene compounds and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は、キサンテン化合物及びその用途に関する。 The present invention relates to xanthene compounds and uses thereof.
チトクロームP-450（Cytochrome P-450；以下、ＣＹＰと記すこともある。）は、ステロイドや脂肪酸等の内因性物質のみならず、医薬、農薬、食品添加物又は環境汚染物質等の化学物質の酸化的代謝において中心的役割を担う酵素である。ＣＹＰは、これら化学物質の活性、或いは、毒性や発がん性の発現にも関与している。ＣＹＰは多くの哺乳動物の各組織に広く分布しており、化学物質の投与によりその発現量が変動することもある。ＣＹＰには、構造や基質特異性或いは誘導剤に対する感受性の異なる多種類の分子種が存在することが明らかにされている。各種化学物質の活性や毒性を評価する上で、ＣＹＰ分子種の関与を把握する必要があることから、ＣＹＰ分子種特異的な活性測定法の開発が求められている。 Cytochrome P-450 (hereinafter sometimes referred to as CYP) is not limited to endogenous substances such as steroids and fatty acids, but also to chemicals such as pharmaceuticals, agricultural chemicals, food additives or environmental pollutants. It is an enzyme that plays a central role in oxidative metabolism. CYP is also involved in the activity of these chemical substances or the expression of toxicity and carcinogenicity. CYP is widely distributed in each tissue of many mammals, and its expression level may vary depending on the administration of a chemical substance. It has been clarified that CYP has many kinds of molecular species having different structures, substrate specificities, and sensitivity to inducers. In order to evaluate the activity and toxicity of various chemical substances, it is necessary to grasp the involvement of CYP molecular species, and therefore development of an activity measuring method specific to CYP molecular species is required.
チトクロームP-450の分子種3A（以下、CYP3Aと記すこともある。）は、多様な化学物質の代謝に係わる主要な分子種である。
CYP3A活性の測定方法としては、例えば、CYP3Aによるテストステロン6β-水酸化やミダゾラム1-水酸化の産物をLC-MS/MSを用いて定量する方法が用いられているが、これらの方法はMS測定前のサンプル精製やMS測定に手間と時間を要する。
ＣＹＰ分子種特異的に代謝される蛍光プローブを用いる酵素活性測定法は、当該蛍光プローブがＣＹＰにより代謝されて生ずる蛍光分子の蛍光強度を計測する方法であり、マルチウエルプレート上で多数サンプルを同時に測定可能な手法である。CYP3A活性測定用の蛍光プローブとして、7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin（ＢＦＣ）が市販されているが、ＢＦＣは、CYP3Aの他にCYP1A及びCYP2Bの基質としても代謝を受けることが知られている。ＢＦＣの類縁体である2,5-bis(trifluoro-methyl)-7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin（ＢＦＢＦＣ)が、CYP3A特異的な蛍光プローブとして、非特許文献１に記載されている。
Cytochrome P-450 molecular species 3A (hereinafter sometimes referred to as CYP3A) is a major molecular species involved in the metabolism of various chemical substances.
As a method for measuring CYP3A activity, for example, a method of quantifying the product of testosterone 6β-hydroxylation or midazolam 1-hydroxylation by CYP3A using LC-MS / MS is used. Time and time are required for previous sample purification and MS measurement.
The enzyme activity measurement method using a fluorescent probe that is metabolized specifically by the CYP molecular species is a method for measuring the fluorescence intensity of a fluorescent molecule that is generated by the metabolism of the fluorescent probe by CYP. A large number of samples can be simultaneously measured on a multi-well plate. It is a measurable method. 7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin (BFC) is commercially available as a fluorescent probe for measuring CYP3A activity, and BFC is known to undergo metabolism as a substrate for CYP1A and CYP2B in addition to CYP3A. Non-patent document 1 describes 2,5-bis (trifluoro-methyl) -7-benzyloxy-4-trifluoromethylcoumarin (BFBFC), which is an analog of BFC, as a CYP3A-specific fluorescent probe.
キサンテン系蛍光分子は、クマリン系蛍光分子より優れた強度の蛍光量子収率を有する。キサンテン系蛍光分子においてキサンテン環部の6位水酸基にβ-ガラクトピラノシル基を導入した化合物が、β-ガラクトシダーゼ活性測定用の蛍光プローブとして使用できることが、特許文献１に記載されている。 Xanthene-based fluorescent molecules have a fluorescent quantum yield that is superior to coumarin-based fluorescent molecules. Patent Document 1 describes that a compound in which a β-galactopyranosyl group is introduced into the 6-position hydroxyl group of a xanthene ring portion in a xanthene-based fluorescent molecule can be used as a fluorescent probe for measuring β-galactosidase activity.
CYP3Aに特異的な基質として優れたＣＹＰ分子種選択性を有し、検出感度にも優れた、CYP3A活性測定用の蛍光プローブの開発が望まれている。 Development of a fluorescent probe for measuring CYP3A activity having excellent CYP molecular species selectivity as a substrate specific to CYP3A and excellent detection sensitivity is desired.
本発明は、キサンテン系蛍光分子である6-hydroxy-9-aryl-xanthenoneにおいて、キサンテン環部の6位水酸基に置換されていてもよいベンジル基が導入された化合物、及びそのCYP3A活性測定用蛍光プローブとしての用途等を提供する。 The present invention relates to a compound in which a 6-hydroxy-9-aryl-xanthenone xanthene-based fluorescent molecule is introduced with a benzyl group which may be substituted at the 6-position hydroxyl group of the xanthene ring portion, and fluorescence for measuring CYP3A activity thereof Use as a probe is provided.
即ち、本発明は、
［１］
式（Ｉ）：
式中、Ｒ１は一価の基を表し、Ｒ２は水素原子又は一価の基を表し、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基又はアルコキシ基を表し、Ｒ５は式（Ｉ）で表される化合物の6位O-ベンジル部のエーテル結合がチトクロームP-450の分子種3Aにより酸化的に開裂可能となるように選ばれる一価の基を表し、ｎは１から５の整数を表し、ｎが２以上の場合、複数存在するＲ５の全部又は一部は同じであっても異なっていてもよい；
で表される化合物、又はその溶媒和物；
［２］
Ｒ１及びＲ２がそれぞれ独立に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基、アルコキシカルボニル基、アルカノイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アロイルアミノ基又はヘテロアロイルアミノ基であり、該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アルカノイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アロイルアミノ基又はヘテロアロイルアミノ基に含まれる水素原子は置換されていてもよい［１］記載の化合物；
［３］
Ｒ１が炭素数１から６のアルキル基であり、該アルキル基に含まれる水素原子はハロゲン原子で置換されていてもよく、Ｒ２が炭素数１から６のアルコキシ基であり、該アルコキシ基に含まれる水素原子はハロゲン原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基で置換されていてもよい［１］又は［２］記載の化合物；
［４］
Ｒ５が水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ニトロ基又はシアノ基である［１］から［３］のいずれか一項に記載の化合物；
［５］
Ｒ５が炭素数１から６のアルキル基又は炭素数１から６のハロアルキル基である［１］から［４］のいずれか一項に記載の化合物；
［６］
ｎが１又は２である［１］から［５］のいずれか一項に記載の化合物；
［７］
Ｒ３及びＲ４が水素原子である［１］から［６］のいずれか一項に記載の化合物；
［８］
9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-6-ビス(2,5-トリフルオロメチル)ベンジルオキシ-3H-キサンテン-3-オン；
［９］
CYP3A活性測定用蛍光プローブとしての［１］から［８］のいずれか一項に記載の化合物の使用；
［１０］
チトクロームP-450の分子種3Aの活性測定方法であって、
（１）［１］から［８］のいずれか一項に記載の化合物をチトクロームP-450の分子種3Aと反応させる工程；及び
（２）上記工程（１）により得られる反応産物の蛍光強度を計測する工程；
を含む方法；
［１１］
工程（２）における反応産物の蛍光強度の計測が、工程（１）の反応後の反応液の蛍光強度を計測することにより行われ、工程（２）で得られた計測値と対照の反応液の蛍光強度とを比較する工程を更に含む、［１０］に記載の方法；及び
［１２］
対照の反応液が、工程（１）の反応前の反応液、または、［１］から［８］のいずれか一項に記載の化合物もしくはチトクロームP-450の分子種3Aを含まないこと以外は工程（１）で用いられる反応液と同じ組成を有する反応液である、［１１］に記載の方法；
等を提供する。
That is, the present invention
[1]
Formula (I):
In the formula, R 1 represents a monovalent group, R 2 represents a hydrogen atom or a monovalent group, R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group or an alkoxy group, R 5 represents a monovalent group selected so that the ether bond at the 6-position O-benzyl part of the compound represented by formula (I) can be oxidatively cleaved by the molecular species 3A of cytochrome P-450, n Represents an integer of 1 to 5, and when n is 2 or more, all or a part of a plurality of R 5 may be the same or different;
Or a solvate thereof;
[2]
R 1 and R 2 are each independently an alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, alkoxy group, nitro group, amino group, cyano group, alkoxycarbonyl group, alkanoylamino group, aryl group, heteroaryl group, aroylamino group or hetero An aroylamino group, wherein a hydrogen atom contained in the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, alkoxy group, alkoxycarbonyl group, alkanoylamino group, aryl group, heteroaryl group, aroylamino group or heteroaroylamino group is substituted The compound according to [1], which may be
[3]
R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a hydrogen atom contained in the alkyl group may be substituted with a halogen atom, R 2 is an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and the alkoxy group The hydrogen atom contained in is a compound according to [1] or [2], which may be substituted with a halogen atom, a carboxyl group or an alkoxycarbonyl group;
[4]
The compound according to any one of [1] to [3], wherein R 5 is a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, a haloalkyl group, a nitro group, or a cyano group;
[5]
The compound according to any one of [1] to [4], wherein R 5 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a haloalkyl group having 1 to 6 carbon atoms;
[6]
The compound according to any one of [1] to [5], wherein n is 1 or 2;
[7]
The compound according to any one of [1] to [6], wherein R 3 and R 4 are hydrogen atoms;
[8]
9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -6-bis (2,5-trifluoromethyl) benzyloxy-3H-xanthen-3-one;
[9]
Use of the compound according to any one of [1] to [8] as a fluorescent probe for measuring CYP3A activity;
[10]
A method for measuring the activity of molecular species 3A of cytochrome P-450,
(1) a step of reacting the compound according to any one of [1] to [8] with a molecular species 3A of cytochrome P-450; and (2) fluorescence intensity of a reaction product obtained by the above step (1) Measuring step;
A method comprising:
[11]
The fluorescence intensity of the reaction product in step (2) is measured by measuring the fluorescence intensity of the reaction solution after the reaction in step (1), and the measured value obtained in step (2) and the control reaction solution The method according to [10], further comprising a step of comparing the fluorescence intensity of
The control reaction solution does not contain the reaction solution before the reaction in step (1) or the compound according to any one of [1] to [8] or the molecular species 3A of cytochrome P-450. The method according to [11], which is a reaction solution having the same composition as the reaction solution used in step (1);
Etc.
本発明により、優れたＣＹＰ分子種選択性を有し検出感度にも優れた、CYP3A活性測定用の蛍光プローブ、当該プローブを用いるCYP3A活性測定法等が提供可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a fluorescent probe for measuring CYP3A activity, having excellent CYP molecular species selectivity and excellent detection sensitivity, a CYP3A activity measuring method using the probe, and the like.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本明細書中で用いられる「アルキル」とは、特定数の炭素原子を含有する直鎖状又は分枝鎖状の飽和炭化水素を意味し、これらに含まれる１以上の水素原子は、それぞれ独立に、ハロゲン原子又は本発明に含まれる置換基で置換されていてもよい。かかる「アルキル」の例として、炭素数１から６のアルキルが挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、n-ブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル、n-ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。 As used herein, “alkyl” means a linear or branched saturated hydrocarbon containing a specific number of carbon atoms, and one or more hydrogen atoms contained therein are each independently May be substituted with a halogen atom or a substituent included in the present invention. Examples of such “alkyl” include alkyl having 1 to 6 carbon atoms, specifically, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, n-butyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, n- Examples include pentyl and hexyl.
本明細書中で用いられる「アルケニル」とは、２以上の炭素原子を有し、１以上の炭素−炭素二重結合を含有する直鎖状又は分枝鎖状の脂肪族炭化水素を意味し、これらに含まれる１以上の水素原子は、それぞれ独立に、ハロゲン原子又は本発明に含まれる置換基で置換されていてもよい。かかる「アルケニル」の例として、炭素数２から６アルケニルが挙げられ、具体的には、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等が挙げられる。 As used herein, “alkenyl” means a linear or branched aliphatic hydrocarbon having two or more carbon atoms and containing one or more carbon-carbon double bonds. One or more hydrogen atoms contained therein may be independently substituted with a halogen atom or a substituent contained in the present invention. Examples of such “alkenyl” include alkenyl having 2 to 6 carbon atoms, and specific examples include ethenyl, propenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl and the like.
本明細書中で用いられる「アルキニル」とは、２以上の炭素原子を有し、１以上の炭素−炭素三重結合を含有する直鎖状又は分枝鎖状の脂肪族炭化水素を意味し、これらに含まれる１以上の水素原子は、それぞれ独立に、ハロゲン原子又は本発明に含まれる置換基で置換されていてもよい。かかる「アルキニル」の例として、炭素数２から６のアルキニルが挙げられ、具体的には、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等が挙げられる。 As used herein, “alkynyl” refers to a linear or branched aliphatic hydrocarbon having two or more carbon atoms and containing one or more carbon-carbon triple bonds, One or more hydrogen atoms contained therein may be each independently substituted with a halogen atom or a substituent contained in the present invention. Examples of such “alkynyl” include alkynyl having 2 to 6 carbon atoms, and specific examples include ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl, hexynyl and the like.
本明細書中で用いられる「アルコキシ」とは、−ＯＲａで表される基を意味し、ここでＲａは上記で定義されているアルキルを表す。かかる「アルコキシ」の例として、メトキシが挙げられる。 As used herein, “alkoxy” refers to a group represented by —ORa, where Ra represents alkyl as defined above. An example of such “alkoxy” is methoxy.
本明細書中で用いられる「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。 As used herein, “halogen” means fluorine, chlorine, bromine or iodine.
本明細書に用いられる「アリール」とは、炭素原子と水素原子とからなる芳香族基、又は、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群から選ばれる少なくとも１つを含有する単環又は多環の芳香族基を意味し、これらに含まれる１以上の水素原子は、それぞれ独立に、ハロゲン原子又は本発明に含まれる置換基で置換されていてもよい。かかる「アリール」の例として、炭素数６から１０のアリールが挙げられ、具体的には、フェニル基、ビフェニル基、ナフチル基等、チエニル基、フリル基、ピロリル基、ピラゾリル基、イソチアゾリル基、イソオキサゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等が挙げられる。アリール又はヘテロアリールを有する基（アロイル基及びヘテロアロイル基など）のアリール又はヘテロアリールについても同様である。 As used herein, “aryl” refers to an aromatic group consisting of a carbon atom and a hydrogen atom, or a monocyclic or polycyclic group containing at least one selected from the group consisting of a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom. This means an aromatic group of a ring, and one or more hydrogen atoms contained therein may be each independently substituted with a halogen atom or a substituent contained in the present invention. Examples of such “aryl” include aryl having 6 to 10 carbon atoms, specifically, phenyl group, biphenyl group, naphthyl group, thienyl group, furyl group, pyrrolyl group, pyrazolyl group, isothiazolyl group, isoxazolyl group. Group, pyridyl group, pyrazinyl group, pyrimidinyl group, pyridazinyl group and the like. The same applies to aryl or heteroaryl of a group having an aryl or heteroaryl (such as an aroyl group and a heteroaroyl group).
本明細書中で用いられる「ハロアルキル」とは、該基に含まれる少なくとも１つの水素原子がハロゲン原子で置換された、本明細書中で定義されているアルキル基を意味する。本発明において有用な分枝状又は直鎖状の「ハロアルキル」の具体例には、該基に含まれる１以上の水素原子がそれぞれ独立にハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子）で置換された、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル及びt-ブチルが含まれる。「ハロアルキル」のより具体的な例として、-ＣＦ３、-ＣＨ２-ＣＨ２-Ｆが挙げられる。 As used herein, “haloalkyl” means an alkyl group as defined herein, wherein at least one hydrogen atom contained in the group is replaced with a halogen atom. Specific examples of the branched or straight chain “haloalkyl” useful in the present invention include one or more hydrogen atoms contained in the group independently of halogen atoms (for example, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom or Methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl and t-butyl substituted with iodine atoms). More specific examples of “haloalkyl” include —CF 3 , —CH 2 —CH 2 —F.
「置換されていてもよい」とは、対象となる基に含まれる水素原子のうち少なくとも１つが、上記いずれかのハロゲン原子又は置換基で置換されていてもよいことを表す。 “Optionally substituted” means that at least one of the hydrogen atoms contained in the target group may be substituted with any of the above halogen atoms or substituents.
本明細書に用いられる「溶媒和物」とは、溶質（本発明の場合には、式（Ｉ）の化合物）と溶媒との種々の化学量論の複合体を意味する。そのような溶媒は、本発明の目的においては、溶質の有益な機能を妨げるものであるべきではない。適当な溶媒の具体例には、水、メタノール及びエタノールが含まれる。 As used herein, “solvate” means various stoichiometric complexes of a solute (in the present invention, a compound of formula (I)) and a solvent. Such a solvent should not interfere with the beneficial function of the solute for the purposes of the present invention. Examples of suitable solvents include water, methanol and ethanol.
式（Ｉ）において、Ｒ１は一価の基を表す。
この一価の基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基、アルコキシカルボニル基、アルカノイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アロイルアミノ基、又はヘテロアロイルアミノ基が挙げられ、該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アルカノイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アロイルアミノ基又はヘテロアロイルアミノ基に含まれる水素原子は置換されていてもよい。
Ｒ１としては炭素数１から６のアルキル基が好ましく、該アルキル基に含まれる１以上の水素原子はそれぞれ独立にハロゲン原子で置換されていてもよい。
In the formula (I), R 1 represents a monovalent group.
Examples of the monovalent group include an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a cyano group, an alkoxycarbonyl group, an alkanoylamino group, an aryl group, a heteroaryl group, an aroylamino group, or A heteroaroylamino group, a hydrogen atom contained in the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, alkoxy group, alkoxycarbonyl group, alkanoylamino group, aryl group, heteroaryl group, aroylamino group or heteroaroylamino group May be substituted.
R 1 is preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and one or more hydrogen atoms contained in the alkyl group may be each independently substituted with a halogen atom.
式（Ｉ）において、Ｒ２は水素原子又は一価の基を表す。
この一価の基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基、アルコキシカルボニル基、アルカノイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アロイルアミノ基、又はヘテロアロイルアミノ基が挙げられ、該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アルカノイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アロイルアミノ基又はヘテロアロイルアミノ基に含まれる水素原子は置換されていてもよい。
Ｒ２としては炭素数１から６のアルコキシ基が好ましく、該アルコキシ基に含まれる１以上の水素原子はハロゲン原子、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基で置換されていてもよい。Ｒ２が示す置換アルコキシ基としては、例えば、カルボキシル置換Ｃ１−６アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換Ｃ１−６アルコキシ基等が挙げられる。
In the formula (I), R 2 represents a hydrogen atom or a monovalent group.
Examples of the monovalent group include an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alkoxy group, a nitro group, an amino group, a cyano group, an alkoxycarbonyl group, an alkanoylamino group, an aryl group, a heteroaryl group, an aroylamino group, or A heteroaroylamino group, a hydrogen atom contained in the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, alkoxy group, alkoxycarbonyl group, alkanoylamino group, aryl group, heteroaryl group, aroylamino group or heteroaroylamino group May be substituted.
R 2 is preferably an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, and one or more hydrogen atoms contained in the alkoxy group may be substituted with a halogen atom, a carboxyl group or an alkoxycarbonyl group. Examples of the substituted alkoxy group represented by R 2 include a carboxyl-substituted C 1-6 alkoxy group and an alkoxycarbonyl-substituted C 1-6 alkoxy group.
式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基又はアルコキシ基を表す。
Ｒ３及びＲ４としては、水素原子が好ましい。
In the formula (I), R 3 and R 4 each independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group or an alkoxy group.
R 3 and R 4 are preferably a hydrogen atom.
式（Ｉ）において、Ｒ５はそれぞれ独立に、式（Ｉ）で表される化合物の6位O-ベンジル部のエーテル結合がチトクロームP-450の分子種3Aにより酸化的に開裂可能となるように選ばれる一価の基を表す。ｎが２以上の場合、複数存在するＲ５の全部又は一部は同じであっても異なっていてもよい。
かかる一価の基としては、例えば、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ニトロ基又はシアノ基を挙げることができる。
Ｒ５としては、炭素数１から６のアルキル基又は炭素数１から６のハロアルキル基が好ましい。
In formula (I), each R 5 is independently such that the ether bond at the 6-position O-benzyl moiety of the compound represented by formula (I) can be oxidatively cleaved by molecular species 3A of cytochrome P-450. Represents a monovalent group selected. When n is 2 or more, all or a part of a plurality of R 5 may be the same or different.
Examples of the monovalent group include a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, a haloalkyl group, a nitro group, and a cyano group.
R 5 is preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a haloalkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
式（Ｉ）で表される化合物の例として：
Ｒ１が炭素数１から６のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数１から６のアルコキシ基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であり、Ｒ５が炭素数１から６のハロアルキル基であり、ｎが２である化合物；及び
Ｒ１がメチル基であり、Ｒ２がメトキシ基であり、Ｒ３及びＲ４が水素原子であり、Ｒ５がトリフルオロメチル基であり、ｎが２である化合物；
を挙げることができる。
式（Ｉ）で表される化合物のより具体的な例として、9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-6-ビス(2,5-トリフルオロメチル)ベンジルオキシ-3H-キサンテン-3-オンを挙げることができる。
Examples of compounds of formula (I):
R 1 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 2 is an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, R 3 and R 4 are hydrogen atoms, and R 5 is a haloalkyl group having 1 to 6 carbon atoms. A compound in which n is 2, and R 1 is a methyl group, R 2 is a methoxy group, R 3 and R 4 are hydrogen atoms, R 5 is a trifluoromethyl group, and n is 2 is a compound;
Can be mentioned.
As a more specific example of the compound represented by the formula (I), 9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -6-bis (2,5-trifluoromethyl) benzyloxy-3H-xanthene-3 -I can mention it.
本明細書に記載の特定の化合物は、１以上のキラル中心を含有し、複数の立体異性体として存在しうる。立体異性体の混合物及び精製されたエナンチオマー又はエナンチオ的／ジアステレオ的に富化された混合物も本発明に包含される。式（Ｉ）の化合物の個々の異性体及びそれらの任意の完全に又は部分的に平衡化した混合物も本発明に包含される。１以上のキラル中心が反転した対応異性体との混合物としての、式（Ｉ）の化合物の個々の異性体も本発明に包含される。特定の光学異性体は、キラル固定相でのクロマトグラフィー又はキラル塩形成及びその後の選択的結晶化による分離のような当該分野での公知の技術により分離及び回収が可能である。出発物質として特定の光学異性体を使用することにより、最終生成物として対応する異性体を取得することも可能である。
式（Ｉ）の化合物は結晶であっても良く、結晶形が単一であっても結晶形混合物であっても式（Ｉ）の化合物に包含される。結晶は、自体公知の結晶化法を適用して、化合物を結晶化することによって製造することができる。同位元素（例えば、3Ｈ、14Ｃ、18Ｆ、35Ｓ、125Ｉなど）等で標識された化合物も、式（Ｉ）の化合物に包含される。
Certain compounds described herein contain one or more chiral centers and can exist as multiple stereoisomers. Stereoisomeric mixtures and purified enantiomers or enantiomerically / diastereomerically enriched mixtures are also encompassed by the present invention. The individual isomers of the compounds of formula (I) and any wholly or partially equilibrated mixtures thereof are also encompassed by the present invention. Also included in the present invention are the individual isomers of the compounds of formula (I) as a mixture with the corresponding isomer with one or more chiral centers inverted. Certain optical isomers can be separated and recovered by techniques known in the art such as chromatography on chiral stationary phases or separation by chiral salt formation followed by selective crystallization. By using a specific optical isomer as a starting material, it is also possible to obtain the corresponding isomer as the final product.
The compound of formula (I) may be in the form of a crystal, and a single crystal form or a mixture of crystal forms is encompassed by the compound of formula (I). Crystals can be produced by crystallizing a compound by applying a crystallization method known per se. Compounds labeled with isotopes (eg, 3 H, 14 C, 18 F, 35 S, 125 I, etc.) are also encompassed in the compounds of formula (I).
式（Ｉ）の化合物は、多形として公知の特徴である２以上の形態として結晶化することが可能であり、そのような多形形態（多形体）は式（Ｉ）の化合物に包含される。多形は、一般には、温度、圧力又はそれらの両方の変化に対する反応として生じうる。多形は結晶化過程における変動からも生じうる。多形は、Ｘ線回折パターン、溶解度及び融点のような当該技術分野で公知の種々の物理的特徴により識別されうる。 Compounds of formula (I) can be crystallized as two or more forms, which are characteristics known as polymorphs, and such polymorphic forms (polymorphs) are encompassed by compounds of formula (I) The Polymorphism generally can occur as a response to changes in temperature, pressure, or both. Polymorphs can also arise from variations in the crystallization process. Polymorphs can be distinguished by various physical characteristics known in the art such as X-ray diffraction patterns, solubility and melting point.
式（Ｉ）で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）と記すこともある。）又はその溶媒和物の製造方法について、以下に説明する。 A method for producing a compound represented by formula (I) (hereinafter sometimes referred to as compound (I)) or a solvate thereof will be described below.
化合物（Ｉ）又はその溶媒和物は、例えば、下記スキームに記載の反応により製造することができる。かかる反応は、例えば、エーテルを合成する一般的な合成反応の１つであるWilliamson反応である。キサンテン系蛍光分子（Ａ）のフェノール性水酸基とベンジルハライド（Ｘはハロゲン原子を表す）を塩基存在下で反応させることにより、化合物（Ｉ）を合成することができる。ハロゲン（Ｘ）としては、臭素又は塩素が好ましい。塩基としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水素化ナトリウム、炭酸銀(I)、酸化銀(I)などが挙げられる。反応溶媒は、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトニトリルなどの非プロトン性極性溶媒が好ましい。
式（Ｉ）で表される化合物、又はその溶媒和物（以下、一括して本発明化合物と記すこともある。）は、CYP3A活性測定用の蛍光プローブとして使用することができる。本発明化合物は、CYP3Aに特異的な基質であり、該酵素の共存下で酸化的代謝を受けると強蛍光性のキサンテン系蛍光分子を生成する。例えば、6-ヒドロキシ-9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-3H-キサンテン-3-オンの水酸基に2,5-bis(trifluoromethyl)benzyl基が導入された本発明化合物（9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-6-ビス(2,5-トリフルオロメチル)ベンジルオキシ-3H-キサンテン-3-オン）は、波長482nmの励起光の照射に対して微弱の蛍光を発するのみであるが、当該化合物とCYP3Aとの反応により得られる反応産物においては、代謝により生じた6-ヒドロキシ-9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-3H-キサンテン-3-オンによる極めて強い蛍光（波長520nm）を観測することができる。従って、本発明化合物を基質としてCYP3Aと反応させ、本発明化合物が代謝されて生じる強蛍光分子を蛍光測定することにより、CYP3A酵素活性を定量することが可能である。本発明化合物を蛍光プローブとして用いることにより、多数サンプルのCYP3A酵素活性をマルチウエルプレート上で同時に測定することも可能である。 The compound represented by the formula (I) or a solvate thereof (hereinafter sometimes collectively referred to as the compound of the present invention) can be used as a fluorescent probe for measuring CYP3A activity. The compound of the present invention is a substrate specific for CYP3A, and generates strong fluorescent xanthene-based fluorescent molecules when subjected to oxidative metabolism in the presence of the enzyme. For example, the compound of the present invention in which a 2,5-bis (trifluoromethyl) benzyl group is introduced into the hydroxyl group of 6-hydroxy-9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -3H-xanthen-3-one (9- ( 4-methoxy-2-methylphenyl) -6-bis (2,5-trifluoromethyl) benzyloxy-3H-xanthen-3-one) emits weak fluorescence when irradiated with excitation light having a wavelength of 482 nm However, in the reaction product obtained by the reaction of the compound with CYP3A, it is extremely difficult to react with 6-hydroxy-9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -3H-xanthen-3-one produced by metabolism. Strong fluorescence (wavelength 520 nm) can be observed. Therefore, the CYP3A enzyme activity can be quantified by reacting the compound of the present invention with CYP3A as a substrate and measuring the fluorescence of a strong fluorescent molecule produced by metabolism of the compound of the present invention. By using the compound of the present invention as a fluorescent probe, the CYP3A enzyme activity of a large number of samples can be simultaneously measured on a multiwell plate.
本発明のCYP3A活性測定方法は、以下の工程：
（１）本発明化合物をCYP3Aと反応させる工程；及び
（２）上記工程（１）により得られる反応産物の蛍光強度を測定する工程；
を含む。
本発明化合物を基質としてCYP3Aと反応させ、本発明化合物が酸化的代謝を受けて生成する蛍光分子から発する蛍光の強度を測定することにより、生成した蛍光分子を定量し、CYP3A活性を測定する。必要に応じて、本発明化合物とCYP3Aとの反応の前後に反応液の蛍光強度を測定して両者を比較してもよく、CYP3Aとの反応後の蛍光強度を本発明化合物と対照物質との間で比較してもよい。例えば、工程（２）における反応産物の蛍光強度の計測を、工程（１）の反応後の反応液の蛍光強度を計測することにより行い、工程（２）で得られた計測値と対照の反応液の蛍光強度とを比較する。かかる対照の反応液としては、工程（１）の反応前の反応液、または、本発明化合物もしくはCYP3Aを含まないこと以外は工程（１）で用いられる反応液と同じ組成を有する反応液を挙げることができる。
本発明化合物とCYP3Aとの反応は、NADPH-P450還元酵素とその補酵素NADPHの共存下に、化合物のCYPによる代謝速度の測定に通常用いられる反応液組成及び反応条件で行うことができる。反応液における本発明化合物の濃度としては、約0.1μMから約100μMを挙げることができる。反応液へのCYP3Aの添加量としては、約0.1pmolから約100pmolを挙げることができる。反応温度は、通常約20℃から約37℃の範囲である。
本発明の方法によるCYP3A酵素活性の測定は中性条件下に行うことができ、例えば、pH約5からpH約9の範囲、好ましくはpH約6からpH約8の範囲、より好ましくはpH6.8からpH7.6の範囲で行うことができる。
The method for measuring CYP3A activity of the present invention comprises the following steps:
(1) a step of reacting the compound of the present invention with CYP3A; and (2) a step of measuring the fluorescence intensity of the reaction product obtained by the above step (1);
including.
By reacting the compound of the present invention with CYP3A as a substrate and measuring the intensity of fluorescence emitted from the fluorescent molecule produced by the compound of the present invention upon oxidative metabolism, the produced fluorescent molecule is quantified and the CYP3A activity is measured. If necessary, the fluorescence intensity of the reaction solution may be measured before and after the reaction between the compound of the present invention and CYP3A to compare the two, and the fluorescence intensity after the reaction with CYP3A can be compared between the compound of the present invention and the control substance. You may compare between. For example, the fluorescence intensity of the reaction product in the step (2) is measured by measuring the fluorescence intensity of the reaction solution after the reaction in the step (1), and the measured value obtained in the step (2) and the control reaction The fluorescence intensity of the liquid is compared. Examples of such a control reaction solution include the reaction solution before the reaction in step (1), or a reaction solution having the same composition as the reaction solution used in step (1) except that the compound of the present invention or CYP3A is not included. be able to.
The reaction of the compound of the present invention with CYP3A can be carried out in the presence of NADPH-P450 reductase and its coenzyme NADPH in the reaction solution composition and reaction conditions usually used for measurement of metabolic rate of the compound by CYP. The concentration of the compound of the present invention in the reaction solution can be about 0.1 μM to about 100 μM. Examples of the amount of CYP3A added to the reaction solution include about 0.1 pmol to about 100 pmol. The reaction temperature is usually in the range of about 20 ° C to about 37 ° C.
Measurement of CYP3A enzyme activity by the method of the present invention can be performed under neutral conditions, for example, in the range of about pH 5 to about pH 9, preferably in the range of about pH 6 to about 8, more preferably about pH 6. It can be carried out in the range of 8 to pH 7.6.
CYP3A活性測定用蛍光プローブとしては、本発明化合物をそのまま用いても良いが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いても良い。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等帳化剤などを本発明化合物に配合して用いることができる。これら添加剤の配合量は当業者により適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され得る。 As the fluorescent probe for measuring CYP3A activity, the compound of the present invention may be used as it is, but if necessary, an additive usually used for preparing a reagent may be blended and used as a composition. For example, as an additive for using the reagent in a physiological environment, a solubilizing agent, a pH adjusting agent, a buffering agent, an equalizing agent and the like can be blended with the compound of the present invention. The amount of these additives can be appropriately selected by those skilled in the art. These compositions can be provided as a composition in an appropriate form such as a powder-form mixture, a lyophilized product, a granule, a tablet, or a liquid.
以下に実施例及び試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例においては以下の略語が用いられうる：
NMR（核磁気共鳴）；g（グラム）；mg（ミリグラム）；mL（ミリリットル）；μL（マイクロリットル）；mmol（ミリモル）；pmol（ピコモル）；mM（ミリモル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；N（規定濃度）；nm（ナノメーター）；Hz（ヘルツ）；eq（モル等量）；THF（テトラヒドロフラン）；DMF（N,N-ジメチルホルムアミド）；DMSD（ジメチルスルホキシド）；CDCl3（重水素化クロロホルム）；DMSD-d6（重水素化ジメチルスルホキシド）； Mg（マグネシウム）；NaHCO3（炭酸水素ナトリウム）；MgSO4（硫酸マグネシウム）；TBDMSCl（t-ブチルジメチルシリルクロリド）；TBDMSO{[t-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}；NADPH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸／還元型）。
The following abbreviations may be used in the examples:
NMR (nuclear magnetic resonance); g (gram); mg (milligram); mL (milliliter); μL (microliter); mmol (mmol); pmol (picomolar); mM (molar concentration); N (specified concentration); nm (nanometer); Hz (hertz); eq (molar equivalent); THF (tetrahydrofuran); DMF (N, N-dimethylformamide); DMSD (dimethyl sulfoxide); CDCl 3 (heavy) DMSD-d 6 (deuterated dimethyl sulfoxide); Mg (magnesium); NaHCO 3 (sodium hydrogen carbonate); MgSO 4 (magnesium sulfate); TBDMSCl (t-butyldimethylsilyl chloride); TBDMSO {[ t-butyl (dimethyl) silyl] oxy}; NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate / reduced form).
以下の分析機器を使用して、各種データを計測した。
1H-NMR：AV300M, AV600（BRUKER）
Quantum Efficiency（QE）：QE-1100（大塚電子）
Microplate reader：Safire2（TECAN）
Various data were measured using the following analytical instruments.
1 H-NMR: AV300M, AV600 (BRUKER)
Quantum Efficiency (QE): QE-1100 (Otsuka Electronics)
Microplate reader: Safire2 (TECAN)
1H-NMRスペクトルについては、化学シフトをピーピーエム（ppm，δ値）で、結合定数はヘルツ（Hz， J値）単位で示した。分離パラメーターは見掛け多重度を示し、s（一重項）、d（二重項）、t（三重項）、q（四重項）、m（多重項）又は br（ブロード）として表記した。 For 1 H-NMR spectra, chemical shifts were expressed in parts per million (ppm, δ values), and binding constants were expressed in units of hertz (Hz, J values). The separation parameter indicates apparent multiplicity and is expressed as s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quartet), m (multiplet) or br (broad).
実施例１−１：3,6-ジヒドロキシ-9H-キサンテン-9-オンの製造
2,2’,4,4’-テトラヒドロキシベンゾフェノン 6.00g(24.4mmol)と蒸留水40mLを反応器(Storage bottle, ACE GLASS)に仕込み、195℃乃至200℃で4時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却した後、析出した粗製生成物を濾取し、次いで、蒸留水50mLを加えて、還流条件下で再結晶することにより、3,6-ジヒドロキシ-9H-キサンテン-9-オン 5.18g(収率93%)を淡黄色結晶として得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6):δ6.82-6.89(m,4H), 8.26(d, J=8.7Hz, 2H), 10.83(brs, 2H).
Example 1-1: Preparation of 3,6-dihydroxy-9H-xanthen-9-one
2,2 ′, 4,4′-tetrahydroxybenzophenone (6.00 g, 24.4 mmol) and distilled water (40 mL) were charged into a reactor (Storage bottle, ACE GLASS) and heated at 195 ° C. to 200 ° C. for 4 hours. After cooling the reaction mixture to room temperature, the precipitated crude product was collected by filtration, and then added with 50 mL of distilled water and recrystallized under reflux conditions to give 3,6-dihydroxy-9H-xanthene-9- On 5.18 g (93% yield) was obtained as pale yellow crystals.
1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ): δ 6.82-6.89 (m, 4H), 8.26 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 10.83 (brs, 2H).
実施例１−２：3,6-ビス{[t-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}-9H-キサンテン-9-オンの製造
実施例１−１に従って得た3,6-ジヒドロキシ-9H-キサンテン-9-オン 4.95g(21.7mmol)及びイミダゾール 7.39g(5.0eq)をDMF 25mLに溶解し、氷冷却でt-ブチルジメチルシリルクロリド 8.18g(2.5eq)を添加して、窒素雰囲気下、室温で５時間攪拌した。反応混合物を水に注いで、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、MgSO4で乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝3/1）により精製し、3,6-ビス{[t-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}-9H-キサンテン-9-オン 9.07g（収率95%）を白色結晶として得た。
1H-NMR(300MHz, CDCl3): δ0.34(s, 12H), 1.08(s, 18H), 6.74-6.79(m, 4H), 8.10(dd, J=1.5, 7.5 Hz, 2H).
Example 1-2: Preparation of 3,6-bis {[t-butyl (dimethyl) silyl] oxy} -9H-xanthen-9-one 3,6-dihydroxy-9H-xanthene obtained according to Example 1-1 -9-one 4.95 g (21.7 mmol) and imidazole 7.39 g (5.0 eq) were dissolved in 25 mL of DMF, and 8.18 g (2.5 eq) of t-butyldimethylsilyl chloride was added with ice cooling. For 5 hours. The reaction mixture was poured into water and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dried over MgSO 4 . The residue obtained by distilling off the solvent under reduced pressure was purified by silica gel column chromatography (eluent: hexane / ethyl acetate = 3/1) to give 3,6-bis {[t-butyl (dimethyl) silyl] oxy} 9.07 g (yield 95%) of -9H-xanthen-9-one was obtained as white crystals.
1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ): δ0.34 (s, 12H), 1.08 (s, 18H), 6.74-6.79 (m, 4H), 8.10 (dd, J = 1.5, 7.5 Hz, 2H).
実施例１−３：6-ヒドロキシ-9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-3H-キサンテン-3-オン（以下、化合物（１）と記すこともある。）の製造
Mg 165mg（2.0eq）及びTHF 10mLを反応器に仕込み、窒素雰囲気下、2-ブロモ-5-メトキシトルエン 1.37g（2.0eq）を加えて60℃で5時間攪拌した。反応混合物を氷浴で冷却した後、実施例１−２に従って得た3,6-ビス{[t-ブチル(ジメチル)シリル]オキシ}-9H-キサンテン-9-オン 1.50g（3.40mmol）のTHF溶液10mLを滴下し、室温に戻して30分間攪拌した。次いで、2N塩酸水溶液20mLを氷冷下で反応混合物へ徐々に加え、室温で15時間攪拌した後、クロロホルムを加えて、有機層を分液し、飽和NaHCO3水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。MgSO4で乾燥後、溶媒を減圧留去して得られた結晶性残渣をジエチルエーテルで洗浄することにより、6-ヒドロキシ-9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-3H-キサンテン-3-オン 0.77g（収率68%）を橙色結晶として得た。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6): δ1.98(s, 3H), 3.86(s, 3H), 6.96(d, J=9.2 Hz, 2H), 7.03(m, 3H),7.10(s, 1H), 7.23(d, J=8.2 Hz, 1H), 7.28(d, J=9.2 Hz, 2H).
Example 1-3: Production of 6-hydroxy-9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -3H-xanthen-3-one (hereinafter sometimes referred to as compound (1))
165 mg (2.0 eq) of Mg and 10 mL of THF were charged into the reactor, and 1.37 g (2.0 eq) of 2-bromo-5-methoxytoluene was added under a nitrogen atmosphere, followed by stirring at 60 ° C. for 5 hours. After cooling the reaction mixture in an ice bath, 1.50 g (3.40 mmol) of 3,6-bis {[t-butyl (dimethyl) silyl] oxy} -9H-xanthen-9-one obtained according to Example 1-2. 10 mL of THF solution was added dropwise, and the mixture was returned to room temperature and stirred for 30 minutes. Next, 20 mL of 2N hydrochloric acid aqueous solution was gradually added to the reaction mixture under ice-cooling, and after stirring at room temperature for 15 hours, chloroform was added and the organic layer was separated and washed successively with saturated aqueous NaHCO 3 solution and saturated brine. . After drying with MgSO 4 , the solvent was distilled off under reduced pressure, and the resulting crystalline residue was washed with diethyl ether to give 6-hydroxy-9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -3H-xanthene-3. -0.77 g (68% yield) of ON was obtained as orange crystals.
1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ): δ1.98 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 6.96 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.03 (m, 3H), 7.10 ( s, 1H), 7.23 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 9.2 Hz, 2H).
化合物（１）の合成スキームを以下に示す。
実施例２： 9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-6-ビス(2,5-トリフルオロメチル)ベンジルオキシ-3H-キサンテン-3-オン(以下、化合物（２）と記すこともある。)の製造
実施例１−３に従って得た6-ヒドロキシ-9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-3H-キサンテン-3-オン 200mg（0.60mmol）をDMF 5mLに溶解して、氷冷下で水素化ナトリウム／油性26mg（1.1eq）を添加し、室温で30分間攪拌した。この反応混合物に氷冷下で2,5-ビス(トリフルオロメチル)ベンジルブロミドを加え、同温度にて30分間攪拌した後、反応温度を室温まで戻して、更に1時間攪拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液に注いで、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、MgSO4で乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝3/1）により精製し、9-(4-メトキシ-2-メチルフェニル)-6-ビス(2,5-トリフルオロメチル)ベンジルオキシ-3H-キサンテン-3-オン 296mg（収率88%）を橙色結晶として得た。
1H-NMR(400MHz, CDCl3): δ2.06(s, 3H), 3.90(s, 3H), 5.39(s, 2H), 6.45(d, J=2.0 Hz, 1H), 6.58(dd, J=2.0, 10.0 Hz, 1H), 6.86-6.99(m, 3H), 7.01-7.04(m, 2H), 7.07-7.10(m, 2H), 7.76(d, J=8.0 Hz, 1H), 7.89(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.02(s, 1H).
Example 2: 9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -6-bis (2,5-trifluoromethyl) benzyloxy-3H-xanthen-3-one (hereinafter also referred to as compound (2)) 200 mg (0.60 mmol) of 6-hydroxy-9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -3H-xanthen-3-one obtained according to Example 1-3 was dissolved in 5 mL of DMF, Under ice cooling, 26 mg (1.1 eq) of sodium hydride / oil was added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. 2,5-bis (trifluoromethyl) benzyl bromide was added to the reaction mixture under ice-cooling, and the mixture was stirred at the same temperature for 30 minutes. The reaction temperature was then returned to room temperature, and the mixture was further stirred for 1 hour. The reaction mixture was poured into saturated aqueous ammonium chloride solution and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with saturated brine and dried over MgSO 4 . The residue obtained by distilling off the solvent under reduced pressure was purified by silica gel column chromatography (eluent: hexane / ethyl acetate = 3/1) to give 9- (4-methoxy-2-methylphenyl) -6-bis ( 296 mg (yield 88%) of 2,5-trifluoromethyl) benzyloxy-3H-xanthen-3-one was obtained as orange crystals.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ2.06 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 5.39 (s, 2H), 6.45 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.58 (dd, J = 2.0, 10.0 Hz, 1H), 6.86-6.99 (m, 3H), 7.01-7.04 (m, 2H), 7.07-7.10 (m, 2H), 7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.02 (s, 1H).
化合物（２）の合成スキームを以下に示す。
化合物（１）、化合物（２）及びtrifluoromethyl-7-hydroxycoumarin（ＦＨＣ）の分光学的特性を表１に示す。 Table 1 shows the spectroscopic characteristics of the compound (1), the compound (2) and trifluoromethyl-7-hydroxycoumarin (FHC).
試験例１：ヒト及びラットＣＹＰ分子種による本発明化合物の代謝試験（分子種選択性評価）
実施例２に従って合成した化合物（２）3μM、NADPH（和光純薬）1mM及び0.1% DMSOを含む100 mMリン酸バッファー溶液（pH 7.4）を調製した。96ウエルプレートの各ウエルにCYPの各種分子種を発現する組換昆虫細胞のミクロゾーム（CYP 2pmol, BD SupersomesTM、日本BD）を2μL入れ、上記リン酸バッファー溶液198μLを加えて反応を開始し、37℃で20分間インキュベートした。アセトニトリル（ナカライテスク）100μLを添加して反応を停止させ、得られた反応液の蛍光強度を、励起波長482nm、蛍光波長520nmにて測定した。化合物（１）の0、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.50μM及び1μM 溶液（100mM リン酸バッファー／アセトニトリル=2/１）を用いて検量線を作成した。化合物（２）とヒトCYPの各種分子種を反応させることにより生じた化合物（１）の量を表２に示し、化合物（２）とラットCYPの各種分子種を反応させることにより生じた化合物（１）の量を表３に示す。化合物（２）は、ヒト及びラットのCYP3Aに対する特異的な基質であること、及び、化合物（２）とCYP3Aとの反応により得られる産物の蛍光強度を測定することによりCYP3A酵素活性が測定可能であることが判った。
Test Example 1: Metabolic test of the compound of the present invention with human and rat CYP molecular species (molecular species selectivity evaluation)
A 100 mM phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 3 μM of the compound (2) synthesized according to Example 2, 1 mM NADPH (Wako Pure Chemical Industries) and 0.1% DMSO was prepared. Put 2μL of recombinant insect cell microsomes (CYP 2pmol, BD Supersomes TM , Japan BD) expressing various molecular species of CYP in each well of 96 well plate, start reaction by adding 198μL of the above phosphate buffer solution, Incubated at 37 ° C for 20 minutes. The reaction was stopped by adding 100 μL of acetonitrile (Nacalai Tesque), and the fluorescence intensity of the obtained reaction solution was measured at an excitation wavelength of 482 nm and a fluorescence wavelength of 520 nm. A calibration curve was prepared using 0, 0.01 μM, 0.05 μM, 0.1 μM, 0.50 μM and 1 μM solutions of compound (1) (100 mM phosphate buffer / acetonitrile = 2/1). The amount of the compound (1) produced by reacting the compound (2) with various molecular species of human CYP is shown in Table 2, and the compound (2) produced by reacting the compound (2) with various molecular species of rat CYP ( The amount of 1) is shown in Table 3. Compound (2) is a specific substrate for human and rat CYP3A, and CYP3A enzyme activity can be measured by measuring the fluorescence intensity of the product obtained by the reaction of compound (2) with CYP3A. It turns out that there is.
本発明により、優れたＣＹＰ分子種選択性を有し検出感度にも優れた、CYP3A活性測定用の蛍光プローブ、当該プローブを用いるCYP3A活性測定法等が提供可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a fluorescent probe for measuring CYP3A activity, having excellent CYP molecular species selectivity and excellent detection sensitivity, a CYP3A activity measuring method using the probe, and the like.
Claims (8)
Ｒ２は水素原子又はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、ニトロ基、アミノ基、シアノ基、アルコキシカルボニル基、アルカノイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アロイルアミノ基又はヘテロアロイルアミノ基（該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アルカノイルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、アロイルアミノ基又はヘテロアロイルアミノ基に含まれる水素原子は置換されていてもよい）を表し、
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基又はアルコキシ基を表す、
で表される化合物、又はその溶媒和物。 Formula (I):
R2 is a hydrogen atom or alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, alkoxy group, nitro group, amino group, cyano group, alkoxycarbonyl group, alkanoylamino group, aryl group, heteroaryl group, aroylamino group or heteroaroylamino group ( A hydrogen atom contained in the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, alkoxy group, alkoxycarbonyl group, alkanoylamino group, aryl group, heteroaryl group, aroylamino group or heteroaroylamino group may be substituted) . Represent,
R3 and R4 each independently represent a hydrogen atom, be a halogen atom, an alkyl group or an alkoxy group table,
Or a solvate thereof.
（１）請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物をチトクロームP-450の分子種3Aと反応させる工程；及び
（２）上記工程（１）により得られる反応産物の蛍光強度を計測する工程；
を含む方法。 A method for measuring the activity of molecular species 3A of cytochrome P-450,
(1) a step of reacting the compound according to any one of claims 1 to 4 with cytochrome P-450 molecular species 3A; and (2) measuring the fluorescence intensity of the reaction product obtained by the above step (1). The step of:
Including methods.
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