JP6357317B2

JP6357317B2 - Microscope illumination device, microscope illumination method, and microscope

Info

Publication number: JP6357317B2
Application number: JP2014015827A
Authority: JP
Inventors: 将人土肥
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2014-01-30
Filing date: 2014-01-30
Publication date: 2018-07-11
Anticipated expiration: 2034-01-30
Also published as: JP2015141395A

Description

本発明は、顕微鏡照明装置、顕微鏡照明方法および顕微鏡に関するものである。 The present invention relates to a microscope illumination device, a microscope illumination method, and a microscope.

従来、カバーガラスの表面直近の極薄い範囲の標本を観察する技術としてエバネッセント照明を利用した顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
エバネッセント照明は、液浸対物レンズの後ろ側焦点位置においてレンズ辺縁部に集光したレーザ光を液浸対物レンズに入射させ、液浸対物レンズによって略平行光となったレーザ光をカバーガラスと液体との界面において全反射させることにより、カバーガラス側にエバネッセント光を染み出させる照明方法である。カバーガラスの表面直近の極薄い範囲の標本を高コントラストで観察できる一般的な顕鏡手法であるが、１方向から照明する全反射照明では偏った蛍光情報しか得られないという問題がある。 2. Description of the Related Art Conventionally, a microscope using evanescent illumination is known as a technique for observing a specimen in an extremely thin range near the surface of a cover glass (see, for example, Patent Document 1).
The evanescent illumination causes the laser light collected on the lens edge at the back focal position of the immersion objective lens to enter the immersion objective lens, and the laser light that has become substantially parallel light by the immersion objective lens and the cover glass. In this illumination method, evanescent light is oozed out to the cover glass side by total reflection at the interface with the liquid. Although this is a general microscope technique that enables observation of a very thin specimen in the vicinity of the surface of the cover glass with high contrast, there is a problem that only partial fluorescence information can be obtained with total reflection illumination that illuminates from one direction.

そこで、カバーガラスへのレーザ光の入射方向を液浸対物レンズの軸線回りに回転させ、時間平均化された画像を取得することにより、偏射照明による画像中の陰影の形成やスペックルノイズを抑制する手法が示されている（例えば、特許文献２参照。）。 Therefore, by rotating the incident direction of the laser light on the cover glass around the axis of the immersion objective lens and acquiring a time-averaged image, it is possible to reduce shadow formation and speckle noise in the image by oblique illumination. A technique for suppressing the above is shown (for example, see Patent Document 2).

特開２００１−２７２６０６号公報JP 2001-272606 A 特開２００３−１３１１４１号公報JP 2003-131141 A

しかしながら、視野範囲を広げるために液浸対物レンズの後ろ側焦点位置に入射するレーザ光のＮＡを増大させる場合には、当該後ろ側焦点位置におけるレーザ光のエネルギ密度が極めて高くなり、液浸対物レンズが熱によって損傷するという不都合がある。すなわち、レーザ光のＮＡを増大させて照野を広げると、後ろ側焦点位置に形成されるレーザ光のスポット径が小さくなるうえに、広がった照野の明るさを広がる前と同等にするためには、その分、高いエネルギのレーザ光を入射させる必要があり、後ろ側焦点位置におけるレーザ光のエネルギ密度は相乗的に増加してしまうという不都合がある。さらに、時間平均化が必要なため、高速で撮影することができず、ガルバノミラーやモーターなどの振動により、被写体ズレが生じてしまう欠点がある。 However, when the NA of the laser light incident on the back focal position of the immersion objective lens is increased in order to widen the field of view, the energy density of the laser light at the back focal position becomes extremely high, and the immersion objective is There is a disadvantage that the lens is damaged by heat. That is, if the NA of the laser beam is increased to widen the illumination field, the spot diameter of the laser beam formed at the back focal position becomes small and the brightness of the wide illumination field is made equal to that before spreading. Therefore, it is necessary to make high-energy laser light incident to that extent, and there is a disadvantage that the energy density of the laser light at the back focal position increases synergistically. Furthermore, since time averaging is required, it is impossible to photograph at high speed, and there is a disadvantage that subject displacement occurs due to vibration of a galvanometer mirror, a motor, or the like.

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、レーザ光を集光させてケーラー照明を行うレンズの熱による損傷を防止しつつ視野範囲を拡大することができる顕微鏡照明装置、顕微鏡照明方法および顕微鏡を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of the above-described circumstances, and is a microscope illumination apparatus and microscope that can expand a visual field range while preventing damage caused by heat of a lens that condenses laser light and performs Kohler illumination. An object is to provide an illumination method and a microscope.

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源から発せられたレーザ光を入射させ、その入射光軸に対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有しかつ前記入射光軸を進んできた光を含むレーザ光に変換して出射させる光変換部と、該光変換部から出射されたレーザ光を前記入射光軸に平行な方向に偏向する、パワーを有しない光学素子とを備え、該光学素子から出射されたレーザ光を、標本を照明するための集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させる顕微鏡照明装置を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
One aspect of the present invention, is incident laser light emitted from the light source, organic vital to and NA has a main optical axis distributed on a conical surface extending at an angle to the incident optical axis A light conversion unit that converts and emits laser light including light that has traveled along the incident optical axis, and a power that deflects the laser light emitted from the light conversion unit in a direction parallel to the incident optical axis. And a microscope illumination device that condenses laser light emitted from the optical element at a pupil position of a condenser lens for illuminating a specimen or a conjugate position thereof.

本態様によれば、光源から発せられたレーザ光が光変換部に入射されると、レーザ光は光変換部において円錐面上に分布する主光軸を有しかつ該主光軸に沿って集光するＮＡを有するレーザ光に変換される。光変換部から出射されたレーザ光は光学素子を通過することにより偏向されて入射光軸に平行な円筒面上に主光軸を分布させたＮＡを有するレーザ光となる。 According to this aspect, when the laser light emitted from the light source is incident on the light conversion unit, the laser light has the main optical axis distributed on the conical surface in the light conversion unit and is along the main optical axis. It is converted into laser light having NA to be condensed. The laser beam emitted from the light conversion unit is deflected by passing through the optical element, and becomes a laser beam having an NA in which the main optical axis is distributed on a cylindrical surface parallel to the incident optical axis.

そして、このようなレーザ光が集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光されることにより、集光レンズによって集光されたレーザ光はケーラー照明として標本を照明する。この場合において、集光レンズに入射するレーザ光は集光レンズの光軸を中心として周方向に主光軸を分布させているので、周方向の複数方向から同時に標本に射入射されて標本を照明する。 Then, by condensing such laser light at the pupil position of the condenser lens or its conjugate position, the laser light condensed by the condenser lens illuminates the sample as Koehler illumination. In this case, since the main optical axis is distributed in the circumferential direction around the optical axis of the condenser lens, the laser light incident on the condenser lens is incident on the specimen simultaneously from a plurality of circumferential directions. Illuminate.

したがって、偏射照明による問題は解消されるとともに、集光レンズの瞳位置におけるレーザ光の集光位置が分散されているので、レーザ光のＮＡを大きくしかつ大きなエネルギのレーザ光を導入しても、集光位置におけるエネルギ密度が過大とはならず、集光レンズを健全な状態に維持することができる。さらに、時間平均化を必要としないため、高速での撮像が可能かつ、振動原を有しないので被写体ブレも生じない。 Therefore, the problem due to the oblique illumination is solved, and the condensing position of the laser light at the pupil position of the condensing lens is dispersed. Therefore, the NA of the laser light is increased and a laser beam having a large energy is introduced. However, the energy density at the condensing position does not become excessive, and the condensing lens can be maintained in a healthy state. Furthermore, since time averaging is not required, high-speed imaging is possible, and no vibration is generated, so that subject blurring does not occur.

また、光学素子はパワーを有しないので、光学素子の通過前後においてレーザ光のＮＡは変化無く保存される。すなわち、入射光軸に対して所定の角度をなして広がる途中の光軸上のどの位置に光学素子を配置するかによって、光学素子から出射されるレーザ光の主光軸が配置される円筒面の径寸法が変化し、集光レンズによって標本に入射されるケーラー照明の角度を連続的に変化させることができ、対物レンズや標本、観察条件に最適な照明状態を提供できる。そして、この場合においてもレーザ光のＮＡが変化しないので、ケーラー照明の光束径を一定に維持し、照野における明るさを一定に維持することができる。 Further, since the optical element has no power, the NA of the laser light is stored without change before and after passing through the optical element. That is, the cylindrical surface on which the main optical axis of the laser beam emitted from the optical element is arranged depending on where the optical element is arranged on the optical axis that is spreading at a predetermined angle with respect to the incident optical axis The angle of the Koehler illumination that is incident on the sample by the condenser lens can be continuously changed, and an optimal illumination state can be provided for the objective lens, the sample, and the observation conditions. In this case as well, since the NA of the laser light does not change, the beam diameter of the Koehler illumination can be kept constant, and the brightness in the illumination field can be kept constant.

上記態様においては、前記光変換部が、レーザ光を偏向しかつＮＡを付与する回折格子であってもよい。
このようにすることで、単一の回折格子により、簡易に集光レンズの瞳位置におけるレーザ光のエネルギ密度を分散させ、ケーラー照明を行う集光レンズの損傷を防止しつつ視野範囲を拡大することができる。 In the above aspect, the light conversion unit may be a diffraction grating that deflects laser light and imparts NA.
By doing so, the energy density of the laser beam at the pupil position of the condenser lens can be easily dispersed by a single diffraction grating, and the visual field range is expanded while preventing damage to the condenser lens that performs Koehler illumination. be able to.

また、上記態様においては、前記光変換部が、レーザ光にＮＡを付与する正のパワーを有するレンズと、レーザ光を偏向する回折格子とを備えていてもよい。
このようにすることで、回折格子の機能を単純化して簡易なものにすることができる。レンズによってＮＡを付与した後のレーザ光を回折格子によって偏向させてもよいし、逆でもよい。 Moreover, in the said aspect, the said light conversion part may be provided with the lens which has a positive power which provides NA to a laser beam, and the diffraction grating which deflects a laser beam.
In this way, the function of the diffraction grating can be simplified and simplified. The laser light after NA is given by the lens may be deflected by the diffraction grating, or vice versa.

また、上記態様においては、前記光変換部が、前記円錐面上に全周にわたって連続的に分布するレーザ光に変換してもよい。
このようにすることで、集光レンズの瞳位置に集光するレーザ光のエネルギ密度を最も低くすることができ、広く明るい視野範囲を確保することができる。 Moreover, in the said aspect, the said light conversion part may convert into the laser beam distributed continuously over the perimeter on the said conical surface.
By doing in this way, the energy density of the laser beam condensed to the pupil position of a condensing lens can be made the lowest, and a wide and bright visual field range can be ensured.

また、上記態様においては、前記光学素子が、前記レーザ光の入射光軸方向に沿って移動可能に設けられていてもよい。
このようにすることで、集光レンズの瞳位置へのレーザ光の径方向の入射位置を変化させ、集光レンズによる標本へのケーラー照明の入射角度を連続的に調節することができる。この場合に、入射角度を変化させても照野の明るさを一定に維持することができる。 Moreover, in the said aspect, the said optical element may be provided so that a movement is possible along the incident optical axis direction of the said laser beam.
By doing in this way, the incident position of the laser beam to the pupil position of the condensing lens in the radial direction can be changed, and the incident angle of the Koehler illumination to the sample by the condensing lens can be continuously adjusted. In this case, the brightness of the illumination field can be maintained constant even when the incident angle is changed.

また、本発明の他の態様は、光源から発せられたレーザ光を、その入射光軸に対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有しかつ前記入射光軸を進んできた光を含むレーザ光に変換する第１のステップと、該第１のステップにおいて変換されたレーザ光を、パワーを有しない光学素子によって前記入射光軸に平行な方向に偏向する第２のステップと、該第２のステップにおいて偏向されたレーザ光を、標本を照明するための集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させる第３のステップと、前記光学素子を前記レーザ光の入射光軸方向に沿って移動させる第４のステップとを含む顕微鏡照明方法を提供する。 Another aspect of the present invention, a laser beam emitted from the light source, have a and NA has a main optical axis distributed on a conical surface extending at an angle to the incident optical axis A first step of converting the laser light including light that has traveled along the incident optical axis; and the laser light converted in the first step is parallel to the incident optical axis by an optical element having no power. A second step of deflecting in the direction; a third step of condensing the laser light deflected in the second step at a pupil position of a condenser lens for illuminating the specimen or a conjugate position thereof; And a fourth step of moving the optical element along an incident optical axis direction of the laser light.

また、本発明の他の態様は、標本を搭載するステージと、該ステージに搭載された標本に対向して配置される集光レンズと、該集光レンズにレーザ光を入射させる請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡照明装置とを備える顕微鏡を提供する。 According to another aspect of the present invention, there is provided a stage on which a sample is mounted, a condensing lens arranged to face the sample mounted on the stage, and laser light incident on the condensing lens. A microscope comprising the microscope illumination device according to claim 5 is provided.

本発明によれば、レーザ光を集光させてケーラー照明を行うレンズの熱による損傷を防止しつつ視野範囲を拡大することができるという効果を奏する。 According to the present invention, it is possible to expand the visual field range while preventing damage caused by heat of a lens that performs Koehler illumination by condensing laser light.

本発明の一実施形態に係る顕微鏡の構成を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the structure of the microscope which concerns on one Embodiment of this invention. 図１の顕微鏡において、矢視Ａ−Ａの（ａ）レーザ光の集光パターンの一例、（ｂ）他の例をそれぞれ示す図である。In the microscope of FIG. 1, it is a figure which shows an example of the condensing pattern of (a) laser beam of arrow AA, and (b) another example, respectively. 図１の顕微鏡においてアキシコンレンズを光軸方向に移動させた場合の光束の形状の変化を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the change of the shape of the light beam when an axicon lens is moved to an optical axis direction in the microscope of FIG. 本発明の一実施形態に係る顕微鏡照明方法を説明するフローチャートである。It is a flowchart explaining the microscope illumination method which concerns on one Embodiment of this invention. 図１の顕微鏡の（ａ）本実施形態に係る顕微鏡照明装置、（ｂ）変形例に係る顕微鏡照明装置をそれぞれ示す模式図である。It is a schematic diagram which respectively shows the microscope illumination apparatus which concerns on (a) this embodiment of the microscope of FIG. 1, and the microscope illumination apparatus which concerns on (b) modification. 図１の顕微鏡の他の変形例に係る顕微鏡照明装置を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the microscope illuminating device which concerns on the other modification of the microscope of FIG.

本発明の一実施形態に係る顕微鏡照明装置４、顕微鏡１および顕微鏡照明方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、標本Ｓを搭載するステージ２と、該ステージ２の下方に近接して上向きに配置された液浸対物レンズ（集光レンズ）３と、該液浸対物レンズ３を介して標本Ｓにレーザ光を照射させる顕微鏡照明装置４とを備えている。 A microscope illumination device 4, a microscope 1, and a microscope illumination method according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
As shown in FIG. 1, a microscope 1 according to this embodiment includes a stage 2 on which a specimen S is mounted, and an immersion objective lens (condensing lens) 3 that is disposed close to the lower side of the stage 2 and facing upward. And a microscope illumination device 4 that irradiates the specimen S with laser light through the immersion objective lens 3.

標本ＳはカバーガラスＧに載せた状態でステージ２に搭載されている。ステージ２には開口部２ａが設けられ、液浸対物レンズ３によって集光されたレーザ光が開口部２ａを介してステージ２上のカバーガラスＧ越しに標本Ｓに下方から照射されるようになっている。 The specimen S is mounted on the stage 2 while being placed on the cover glass G. The stage 2 is provided with an opening 2a, and the laser beam condensed by the immersion objective lens 3 is irradiated from below through the cover glass G on the stage 2 through the opening 2a. ing.

液浸対物レンズ３は、図中、単一のレンズによって表示しているが、実際には多数のレンズを組み合わせて構成されている。液浸対物レンズ３の最先端のレンズの上面３ａとカバーガラスＧとの隙間には、純水等の液体Ｂが注入され、表面張力によって隙間内に保持されるようになっている。 Although the immersion objective lens 3 is represented by a single lens in the drawing, it is actually configured by combining a number of lenses. A liquid B such as pure water is injected into the gap between the upper surface 3a of the most advanced lens of the immersion objective lens 3 and the cover glass G, and is held in the gap by surface tension.

本実施形態に係る顕微鏡照明装置４は、光ファイバ５によって導光されてきた光源からのレーザ光Ｌ１を集光して略平行光からなるレーザ光Ｌ２に変換するコリメートレンズ６と、該コリメートレンズ６によって略平行光に変換されたレーザ光Ｌ２を透過させる際に回折させる回折格子７と、該回折格子７から出射されたレーザ光Ｌ３を偏向する、パワーを有しないアキシコンレンズ８とを備えている。
図中、符号９，１０は、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐをリレーするリレーレンズ、符号１１は絞り、符号１２はミラーである。 The microscope illumination device 4 according to the present embodiment includes a collimating lens 6 that condenses the laser light L1 from the light source guided by the optical fiber 5 and converts it into laser light L2 that is substantially parallel light, and the collimating lens. 6 includes a diffraction grating 7 that diffracts the laser light L2 that has been converted into substantially parallel light by 6 and transmits the laser light L3 emitted from the diffraction grating 7 and that has no power and an axicon lens 8 that has no power. ing.
In the figure, reference numerals 9 and 10 are relay lenses that relay the pupil position P of the immersion objective lens 3, reference numeral 11 is an aperture, and reference numeral 12 is a mirror.

回折格子７は、略平行光からなるレーザ光Ｌ２を入射させ、透過させる際に、図１に示されるように、その入射光軸に対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有するレーザ光Ｌ３に変換して出射させるようになっている。すなわち、回折格子７によって回折されたレーザ光Ｌ３は、図２（ａ）に示されるように、その集光位置において、周方向に連続する円環状のパターンCを有して集光するようになっている。 The diffraction grating 7 is distributed on a conical surface that spreads at a predetermined angle with respect to the incident optical axis, as shown in FIG. 1, when the laser beam L2 composed of substantially parallel light is incident and transmitted. The laser beam L3 having a main optical axis and having an NA is converted and emitted. That is, as shown in FIG. 2A, the laser beam L3 diffracted by the diffraction grating 7 is condensed at the condensing position with an annular pattern C continuous in the circumferential direction. It has become.

なお、本実施形態においては、回折格子７において、図２（ａ）に示されるように、周方向に連続するパターンＣで集光するレーザ光Ｌ３に変換することにしたが、連続していることは必ずしも必要ではなく、図２（ｂ）に示されるように周方向に間隔をあけて多数の位置に集光するパターンＣ′のレーザ光Ｌ３に変換してもよい。スポットの個数は２以上の任意の個数でよく、多ければ多いほど効果的である。 In the present embodiment, in the diffraction grating 7, as shown in FIG. 2A, the laser beam L <b> 3 is collected in a pattern C that is continuous in the circumferential direction, but is continuous. However, it is not always necessary, and as shown in FIG. 2 (b), the laser beam L3 may be converted into a pattern C ′ that is focused at a number of positions at intervals in the circumferential direction. The number of spots may be an arbitrary number of 2 or more, and the larger the number, the more effective.

アキシコンレンズ８は、入射端側にテーパ面８ａを有している。テーパ面８ａの傾斜角度は、回折格子７から出射されたレーザ光Ｌ３の主光軸を回折格子７への入射光軸に平行な方向に偏向する角度に設定されている。アキシコンレンズ８はパワーを有していないので、アキシコンレンズ８を通過する前後においてレーザ光Ｌ３，Ｌ４のＮＡは変化しない。 The axicon lens 8 has a tapered surface 8a on the incident end side. The inclination angle of the taper surface 8 a is set to an angle that deflects the main optical axis of the laser light L 3 emitted from the diffraction grating 7 in a direction parallel to the incident optical axis to the diffraction grating 7. Since the axicon lens 8 has no power, the NA of the laser beams L3 and L4 does not change before and after passing through the axicon lens 8.

回折格子７およびアキシコンレンズ８は、アキシコンレンズ８から出射されたレーザ光Ｌ４の集光位置が、リレーレンズ９，１０を構成する後ろ側のレンズ９の後ろ側焦点位置Ｑに一致するように配置されている。すなわち、アキシコンレンズ８から出射されたレーザ光Ｌ４は液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐと光学的に共役な位置Ｑに集光されるようになっている。 The diffraction grating 7 and the axicon lens 8 are arranged so that the condensing position of the laser light L4 emitted from the axicon lens 8 coincides with the rear focal position Q of the rear lens 9 constituting the relay lenses 9 and 10. Is arranged. In other words, the laser beam L4 emitted from the axicon lens 8 is condensed at a position Q optically conjugate with the pupil position P of the immersion objective lens 3.

また、アキシコンレンズ８は、回折格子７へのレーザ光Ｌ２の入射光軸に沿う方向に移動可能に設けられている。この方向にアキシコンレンズ８を移動させると、図３に示されるように、回折格子７から出射されたレーザ光Ｌ３のアキシコンレンズ８のテーパ面８ａへの入射位置が径方向に変化する結果、レーザ光Ｌ４の集光位置におけるパターンの径寸法が変化するようになっている。図３に示す例では、アキシコンレンズ８を回折格子７に近接する方向に移動させることで、レーザ光Ｌ４の集光位置Ｑにおける円形パターンの径寸法を小さくするようになっている。 Further, the axicon lens 8 is provided so as to be movable in a direction along the optical axis of incidence of the laser light L2 on the diffraction grating 7. When the axicon lens 8 is moved in this direction, as shown in FIG. 3, the incident position of the laser light L3 emitted from the diffraction grating 7 on the tapered surface 8a of the axicon lens 8 changes in the radial direction. The diameter of the pattern at the condensing position of the laser beam L4 changes. In the example shown in FIG. 3, the radial dimension of the circular pattern at the condensing position Q of the laser beam L4 is reduced by moving the axicon lens 8 in a direction close to the diffraction grating 7.

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡照明装置４および顕微鏡１を用いた顕微鏡照明方法について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１を用いて標本Ｓの観察を行うには、カバーガラスＧに載せた標本Ｓをステージ２に搭載し、光源からのレーザ光Ｌ１を光ファイバ５の出射端から出射させる。 A microscope illumination method using the microscope illumination device 4 and the microscope 1 according to the present embodiment configured as described above will be described below.
In order to observe the specimen S using the microscope 1 according to the present embodiment, the specimen S placed on the cover glass G is mounted on the stage 2 and the laser light L1 from the light source is emitted from the exit end of the optical fiber 5. .

本実施形態に係る顕微鏡照明方法は、図４に示されるように、光ファイバ５の出射端か
ら出射されコリメートレンズ６によって略平行光に変換されたレーザ光Ｌ２を、回折格子７によってその入射光軸を中心として広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有するレーザ光Ｌ３に変換する第１のステップＳ１と、該第１のステップＳ１において変換されたレーザ光Ｌ３を、パワーを有しないアキシコンレンズ８によって入射光軸に平行な方向に偏向する第２のステップＳ２と、該第２のステップＳ２において偏向されたレーザ光Ｌ４を、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐと共役な位置Ｑに集光させる第３のステップＳ３と、アキシコンレンズ８を入射光軸方向に沿って移動させる第４のステップＳ４とを含んでいる。 In the microscope illumination method according to the present embodiment, as shown in FIG. 4, laser light L <b> 2 emitted from the emission end of the optical fiber 5 and converted into substantially parallel light by the collimator lens 6 is incident on the incident light by the diffraction grating 7. A first step S1 for converting into a laser beam L3 having a main optical axis distributed on a conical surface extending around the axis and having NA, and the laser beam L3 converted in the first step S1 A second step S2 that deflects in a direction parallel to the incident optical axis by the axicon lens 8 that does not include the laser beam L4 deflected in the second step S2 and the pupil position P of the immersion objective lens 3; A third step S3 for condensing light at the conjugate position Q and a fourth step S4 for moving the axicon lens 8 along the incident optical axis direction are included.

光ファイバ５の出射端から出射されたレーザ光Ｌ１は、コリメートレンズ６によって略平行光からなるレーザ光Ｌ２に変換された後に、第１のステップｓ１において回折格子７に入射させられる。レーザ光Ｌ２は回折格子７において回折されることにより、入射光軸を中心とした円錐面上に延びる主光軸を有する円環状のパターンを有しかつ、所定のＮＡによって集光するレーザ光ｌ３に変換される。レーザ光Ｌ３は、その後、第２のステップＳ２においてアキシコンレンズ８を透過させられることにより、入射光軸に平行な方向に主光軸が偏向されて、入射光軸を中心とした円筒面上に延びる主光軸を有する円環状のパターンを有するレーザ光Ｌ４となって、第３のステップＳ３においてリレーレンズ９の後ろ側焦点位置Ｑに集光される。 The laser light L1 emitted from the emission end of the optical fiber 5 is converted into laser light L2 composed of substantially parallel light by the collimator lens 6 and then incident on the diffraction grating 7 in the first step s1. The laser beam L3 is diffracted by the diffraction grating 7, thereby having an annular pattern having a main optical axis extending on a conical surface with the incident optical axis as the center, and being focused by a predetermined NA. Is converted to Thereafter, the laser light L3 is transmitted through the axicon lens 8 in the second step S2, so that the main optical axis is deflected in a direction parallel to the incident optical axis, and on the cylindrical surface with the incident optical axis as the center. The laser beam L4 having an annular pattern having a main optical axis extending in the direction is condensed at the rear focal position Q of the relay lens 9 in the third step S3.

集光されたレーザ光Ｌ４はリレーレンズ９，１０によってリレーされ、ミラー１２によって９０°偏向されて液浸対物レンズ３の後ろ側焦点位置である瞳位置Ｐに集光される。これにより、液浸対物レンズ３によって集光されたレーザ光Ｌ５は、平行光となって液体Ｂ内を伝播し、液浸対物レンズ３の全周方向からカバーガラスＧの底面に斜入射される。レーザ光Ｌ５の入射角度が臨界角度を超えて浅くなっている場合にはレーザ光Ｌ５はカバーガラスＧと液体Ｂとの界面において全反射し、エバネッセント光がカバーガラスＧを通過してカバーガラスＧの上面に接着している標本Ｓの接着面近傍の極薄い領域を照明する。 The condensed laser light L4 is relayed by the relay lenses 9 and 10, deflected by 90 ° by the mirror 12, and condensed at the pupil position P which is the back focal position of the immersion objective lens 3. As a result, the laser beam L5 collected by the immersion objective lens 3 propagates through the liquid B as parallel light and is obliquely incident on the bottom surface of the cover glass G from the entire circumference direction of the immersion objective lens 3. . When the incident angle of the laser beam L5 is shallower than the critical angle, the laser beam L5 is totally reflected at the interface between the cover glass G and the liquid B, and the evanescent light passes through the cover glass G and passes through the cover glass G. A very thin region in the vicinity of the bonding surface of the specimen S bonded to the upper surface is illuminated.

エバネッセント光が照射された結果、標本Ｓの接着面近傍において発生した蛍光が、液浸対物レンズ３によって集光され、図示しない（例えば、アキシコンレンズ８よりも標本側に配置された）ダイクロイックミラーによってレーザ光Ｌ５から分離されて撮影されることにより、蛍光画像を得ることができる。
この場合において、本実施形態に係る顕微鏡照明装置４によれば、回折格子７によってレーザ光Ｌ４を輪帯状に分散させているので、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐにおけるレーザ光Ｌ４が一点に集中することなく、全周にわたって分散される。 As a result of the irradiation with the evanescent light, the fluorescence generated in the vicinity of the adhesion surface of the specimen S is collected by the immersion objective lens 3 and is not shown (for example, disposed on the specimen side with respect to the axicon lens 8). The fluorescent image can be obtained by separating and photographing from the laser beam L5.
In this case, according to the microscope illuminating device 4 according to the present embodiment, the laser light L4 is dispersed in a ring shape by the diffraction grating 7, so the laser light L4 at the pupil position P of the immersion objective lens 3 is at one point. Dispersed over the entire circumference without concentration.

これにより、視野範囲を増大させるために、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐに入射させるレーザ光Ｌ４のＮＡを増大させることで、瞳位置Ｐにおけるスポット径が縮小されても、さらに、広がった照野の明るさを維持するためにレーザ光Ｌ１のエネルギが増大させられても、瞳位置Ｐにおけるレーザ光Ｌ４のエネルギ密度が過度に高くなることが防止され、液浸対物レンズ３の熱による損傷を防止することができるという利点がある。 Thereby, in order to increase the visual field range, the NA of the laser light L4 incident on the pupil position P of the immersion objective lens 3 is increased, so that the spot diameter at the pupil position P is further expanded even if it is reduced. Even if the energy of the laser beam L1 is increased in order to maintain the brightness of the illumination field, the energy density of the laser beam L4 at the pupil position P is prevented from becoming excessively high, and is caused by the heat of the immersion objective lens 3. There is an advantage that damage can be prevented.

また、本実施形態に係る顕微鏡照明装置４および顕微鏡１によれば、第４のステップＳ４においてアキシコンレンズ８をその光軸方向に連続的に移動させることにより、リレーレンズ９の後ろ側焦点位置Ｑにおいて集光させられるレーザ光Ｌ４のパターンの径を連続的に変化させることができる。その結果、図３に示されるように、液浸対物レンズ３から標本Ｓに向けて出射されるレーザ光Ｌ５の傾斜角度を連続的に変化させることができる。傾斜角度を変化させることで、エバネッセント光の標本Ｓ側への染み出し量を連続的に調節することができる。 Further, according to the microscope illumination device 4 and the microscope 1 according to the present embodiment, the back focal position of the relay lens 9 is obtained by continuously moving the axicon lens 8 in the optical axis direction in the fourth step S4. The pattern diameter of the laser beam L4 collected at Q can be continuously changed. As a result, as shown in FIG. 3, the tilt angle of the laser beam L5 emitted from the immersion objective lens 3 toward the specimen S can be continuously changed. By changing the tilt angle, it is possible to continuously adjust the amount of evanescent light that oozes out to the specimen S side.

この場合において、本実施形態に係る顕微鏡照明装置４によれば、アキシコンレンズ８がパワーを有していないので、光軸方向に移動させても透過するレーザ光Ｌ４の集光位置を光軸方向に変化させずに済み、また、レーザ光Ｌ４のＮＡも変化させずに済むという利点がある。
すなわち、集光位置を変化させないので、エバネッセント光の染み出し量を調節するためにアキシコンレンズ８を光軸方向に移動させても、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐにレーザ光Ｌ４を精度よく集光させ続けて、ケーラー照明を持続することができる。また、ＮＡを変化させないので、エバネッセント光の染み出し量を調節しても照野の広さと明るさを維持することができるという利点がある。 In this case, according to the microscope illumination device 4 according to the present embodiment, since the axicon lens 8 does not have power, the condensing position of the laser beam L4 that is transmitted even if it is moved in the optical axis direction is set to the optical axis. There is an advantage that it is not necessary to change the direction, and the NA of the laser beam L4 is not changed.
In other words, since the condensing position is not changed, the laser beam L4 is accurately applied to the pupil position P of the immersion objective lens 3 even if the axicon lens 8 is moved in the optical axis direction in order to adjust the amount of evanescent light oozing out. The Koehler illumination can be sustained by continuing to concentrate well. Further, since the NA is not changed, there is an advantage that the width and brightness of the illumination field can be maintained even if the amount of evanescent light exuded is adjusted.

なお、本実施形態においては、回折格子７を透過したレーザ光Ｌ３を偏向する光学素子として、図５（ａ）に示されるように、レーザ光Ｌ３を透過させる際に偏向するアキシコンレンズ８を例示したが、これに限定されるものではなく、図５（ｂ）に示されるように、テーパ面状の反射面１３ａとテーパ内面状の反射面１４ａとを組み合わせて反射によりレーザ光を偏向するミラー１３，１４を採用してもよい。 In the present embodiment, as an optical element that deflects the laser beam L3 that has passed through the diffraction grating 7, an axicon lens 8 that deflects when transmitting the laser beam L3 is used, as shown in FIG. 5A. Although illustrated, it is not limited to this, and as shown in FIG. 5 (b), the laser beam is deflected by reflection by combining the reflecting surface 13a having the tapered surface and the reflecting surface 14a having the tapered inner surface. Mirrors 13 and 14 may be employed.

また、本実施形態においては、回折格子７において、レーザ光Ｌ２を漸次広がる円錐面上に主光軸を有し、かつ、ＮＡを有するレーザ光Ｌ３に変換したが、これに代えて、図６に示されるように、コリメートレンズ６によって略平行光に変換されたレーザ光Ｌ２にＮＡを付与する集光レンズ１５を設け、回折格子１６としては、集光レンズ１５から出射されたＮＡを有するレーザ光を円錐面上に沿う主光軸を有する光に変換するためのパワーを有しないものを採用してもよい。このようにすることで、回折格子１６の機能を単純化して簡易に構成することができる。また、回折格子１６に平行光を入射させ、回折格子１６から射出されたレーザ光にＮＡを付与するレンズを回折格子１６の後段に設けることにしてもよい。 Further, in the present embodiment, in the diffraction grating 7, the laser light L2 is converted into the laser light L3 having the main optical axis on the gradually expanding conical surface and having the NA, but instead of this, FIG. As shown in FIG. 4, a condensing lens 15 for providing NA to the laser light L2 converted into substantially parallel light by the collimating lens 6 is provided, and the diffraction grating 16 is a laser having NA emitted from the condensing lens 15. You may employ | adopt what does not have the power for converting light into the light which has the main optical axis along a conical surface. In this way, the function of the diffraction grating 16 can be simplified and configured easily. Further, a lens that allows parallel light to enter the diffraction grating 16 and imparts NA to the laser light emitted from the diffraction grating 16 may be provided in the subsequent stage of the diffraction grating 16.

また、本実施形態においては液体ＢとカバーガラスＧとの界面においてレーザ光Ｌ５を全反射させる全反射照明を行う顕微鏡照明装置４を例示したが、これに代えて、コンデンサレンズによって光軸に対して傾斜した方向から偏射照明したレーザ光Ｌ５を全反射させること無く透過させ、透過光が入射しない光軸上の位置において蛍光を観察するための暗視野照明を行う顕微鏡照明装置に適用することにしてもよい。 In the present embodiment, the microscope illuminating device 4 that performs total reflection illumination that totally reflects the laser light L5 at the interface between the liquid B and the cover glass G is exemplified. The laser light L5 that is obliquely illuminated from the inclined direction is transmitted without being totally reflected, and is applied to a microscope illumination device that performs dark field illumination for observing fluorescence at a position on the optical axis where the transmitted light does not enter. It may be.

また、本実施形態においては、図１のアキシコンレンズ８から出射されたレーザ光Ｌ４の集光位置である、液浸対物レンズ３の瞳位置Ｐと光学的に共役な位置Ｑにレーザスペックルリデューサ（ランダム位相変調素子：図示略）を配置して、標本Ｓに照射されるレーザ光に含まれるスペックルノイズを低減することにしてもよい。 In the present embodiment, the laser speckle is positioned at a position Q optically conjugate with the pupil position P of the immersion objective lens 3, which is the condensing position of the laser light L4 emitted from the axicon lens 8 of FIG. A reducer (random phase modulation element: not shown) may be arranged to reduce speckle noise included in the laser light irradiated on the specimen S.

１顕微鏡
２ステージ
３液浸対物レンズ（集光レンズ）
４顕微鏡照明装置
７，１６回折格子（光変換部）
８アキシコンレンズ（光学素子）
１５集光レンズ（レンズ：光変換部）
Ｐ瞳位置
Ｑ共役な位置
Ｓ標本
Ｓ１第１のステップ
Ｓ２第２のステップ
Ｓ３第３のステップ
Ｓ４第４のステップ 1 Microscope 2 Stage 3 Immersion Objective Lens (Condenser Lens)
4 Microscope illumination device 7,16 Diffraction grating (light conversion part)
8 Axicon lenses (optical elements)
15 condenser lens
P pupil position Q conjugate position S specimen S1 first step S2 second step S3 third step S4 fourth step

Claims

光源から発せられたレーザ光を入射させ、その入射光軸に対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有しかつ前記入射光軸を進んできた光を含むレーザ光に変換して出射させる光変換部と、
該光変換部から出射されたレーザ光を前記入射光軸に平行な方向に偏向する、パワーを有しない光学素子とを備え、
該光学素子から出射されたレーザ光を、標本を照明するための集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させる顕微鏡照明装置。 The laser beam emitted from the light source is incident, has progressed Yu vital the incident optical axis has and NA the main optical axis distributed on a conical surface extending at an angle to the incident optical axis A light conversion unit for converting into laser light including the emitted light and emitting the laser light;
An optical element having no power that deflects laser light emitted from the light conversion unit in a direction parallel to the incident optical axis;
A microscope illuminator that condenses laser light emitted from the optical element at a pupil position of a condenser lens for illuminating a specimen or a conjugate position thereof.

前記光変換部が、レーザ光を偏向しかつＮＡを付与する回折格子である請求項１に記載の顕微鏡照明装置。 The microscope illumination apparatus according to claim 1, wherein the light conversion unit is a diffraction grating that deflects laser light and applies NA.

前記光変換部が、レーザ光にＮＡを付与する正のパワーを有するレンズと、レーザ光を偏向する回折格子とを備える請求項１に記載の顕微鏡照明装置。 The microscope illumination apparatus according to claim 1, wherein the light conversion unit includes a lens having a positive power that gives NA to laser light, and a diffraction grating that deflects the laser light.

前記光変換部が、前記円錐面上に全周にわたって連続的に分布するレーザ光に変換する請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡照明装置。 The microscope illumination apparatus according to any one of claims 1 to 3, wherein the light conversion unit converts the laser light into a laser beam continuously distributed over the entire circumference on the conical surface.

前記光学素子が、前記レーザ光の入射光軸方向に沿って移動可能に設けられている請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡照明装置。 The microscope illumination device according to any one of claims 1 to 4, wherein the optical element is provided so as to be movable along an incident optical axis direction of the laser light.

光源から発せられたレーザ光を、その入射光軸に対して所定の角度をなして広がる円錐面上に分布する主光軸を有しかつＮＡを有しかつ前記入射光軸を進んできた光を含むレーザ光に変換する第１のステップと、
該第１のステップにおいて変換されたレーザ光を、パワーを有しない光学素子によって前記入射光軸に平行な方向に偏向する第２のステップと、
該第２のステップにおいて偏向されたレーザ光を、標本を照明するための集光レンズの瞳位置またはその共役位置に集光させる第３のステップと、
前記光学素子を前記レーザ光の入射光軸方向に沿って移動させる第４のステップとを含む顕微鏡照明方法。 The laser beam emitted from the light source, the light has progressed Yu vital the incident optical axis has and NA the main optical axis distributed on a conical surface extending at an angle to the incident optical axis A first step of converting into a laser beam comprising :
A second step of deflecting the laser beam converted in the first step in a direction parallel to the incident optical axis by an optical element having no power;
A third step of condensing the laser beam deflected in the second step at a pupil position of a condenser lens for illuminating the specimen or a conjugate position thereof;
And a fourth step of moving the optical element along an incident optical axis direction of the laser light.

標本を搭載するステージと、
該ステージに搭載された標本に対向して配置される集光レンズと、
該集光レンズにレーザ光を入射させる請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡照明装置とを備える顕微鏡。 A stage with a specimen,
A condensing lens disposed opposite to the specimen mounted on the stage;
A microscope comprising the microscope illumination device according to any one of claims 1 to 5, wherein laser light is incident on the condenser lens.