JP6348193B1 - アミノ酸の由来判別方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の試料は、アミノ酸を含む食品(うまみ調味料、試薬等含む)である。試料に含まれるタンパク質がアミノ酸に分解されていない場合には、予めタンパク質を加水分解する前処理が必要である。タンパク質を加水分解する方法には特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、例えば、試料に適量の塩酸を加えて加熱し、タンパク質をアミノ酸に分解する方法などを用いることができる。
試料中の安定同位体比は下記式1に示した国際標準物質の安定同位体比に対する千分率偏差(δ値、単位:‰(パーミル))で定義される。
式1: δ値=[(R試料/R国際標準化物質)−1]×1000(‰)
標準物質としては、炭素では白亜紀Peedee層ペルムナイト炭酸塩、窒素では大気中の窒素ガスを用い、δ値はそれぞれδ13C、δ15Nと表記する。
前述した通り、アミノ酸のδ15Nはガスクロマトグラフ−安定同位体比質量分析計(GC-IRMS)により測定することができる(非特許文献1、非特許文献2参照)。GC-IRMSによる測定は、複数のアミノ酸の安定同位体比を一度に測定することができ、且つその確度が高いため非常に有用な方法である。
前述の通り、アミノ酸のδ15NはGC-IRMSにより測定することができる。しかし、GC-IRMSを用いてアミノ酸の安定同位体比を測定するには、アミノ酸の誘導体化が必要であり、誘導体化試薬に由来する炭素(ピバロイル基等)を導入する必要がある。このため、δ13Cについては、誘導体化試薬に由来する炭素の影響で測定結果の確度が低下する。確度の低下は分子量の大きな誘導体化試薬を用いるほど顕著であり、言い換えると、アミノ酸誘導体を熱的に安定化させようとすればするほど確度が低下する。このため、GC-IRMSではδ13Cの正確な測定を行うことができない。
前記の通りGC-IRMSを用いてアミノ酸の安定同位体比を測定するには、アミノ酸を誘導体化する必要があり、アミノ酸に誘導化試薬に由来する炭素原子(ピバロイル基等)が導入される。このため、GC-IRMSによってアミノ酸のδ13Cを測定する場合には、補正計算が必要であり、正確性が低下してしまう。また、誘導体化やGCカラムにおける分離の際にδ13Cの同位体分別が起こる可能性がある。
前処理工程で得られたアミノ酸結晶のカルボキシル基に、移動相として使用された炭酸水素アンモニウムに由来するアンモニアが付加して塩となり窒素原子が導入される。このため、補正計算が必要となり正確性が低下してしまう。また、前処理工程の逆相クロマトグラフィーによる精製やHILICを用いた分離工程において、δ15Nの同位体分別が起こる可能性がある。
アミノ酸の由来を判別する手順を、グルタミン酸を例に説明する。グルタミン酸の由来は、(1)由来の明確なグルタミン酸の安定同位体比(δ13Cおよびδ15N)を測定し、次いで(2)由来の不明確な試料に含まれるグルタミン酸の安定同位体比を測定し、最後に(3)両試料の安定同位体比を比較することにより判別することができる。産地や原料によって同位体比は変わるため、由来の明確なグルタミン酸のデータをできるかぎり蓄積することが好ましい。
(1)試料の加水分解
試料に蒸留水と12M塩酸を添加し、110℃で12〜24時間処理することで、試料に含まれるタンパク質をアミノ酸へ分解した。続いて、試料を遠心分離し、上澄みを分取した。なお、試料、蒸留水および塩酸の量は、試料から分離精製できるグルタミン酸の量に合わせて適宜変更した。
グルタミン酸の窒素安定同位体比(δ15N)を測定する工程は以下の通りである。
試料に蒸留水と1M塩酸を加え、10分間撹拌後、遠心分離して沈殿した不溶成分を除去した。
不溶成分を除去した水溶液にジクロロロメタン/n-ヘキサン混合溶媒加えて、液−液抽出を行った。このとき、アミノ酸は水層、油脂は有機層に選択的に溶けるため、水層のみを回収して油脂を除去した。
以下の条件でアミノ酸を抽出した。
試料のカチオン化剤:塩酸
固定相:バイオラッド社製「AG50W-X8 200-400 mesh Resin」
移動相:不純物を除去する際には蒸留水、アミノ酸を回収する際には10%アンモニア水
試料に2−プロパノール/塩化チオニル(4:1)を加え、110℃で2時間加熱することでアミノ酸のカルボニル基をエステル化した。次いで、塩化ピバロイル/ジクロロメタン(1:4)を加えて、110℃で2時間加熱することでアミノ基をピバロイル化し、アミノ酸誘導体を得た。
アミノ酸誘導体にGC-IRMSに導入し、δ15Nを測定した。なおGC-IRMS(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)の仕様及び測定条件は表1の通りである。
以下の手順で試料に含まれるグルタミン酸の炭素安定同位体比(δ13C)を測定した。
試料に蒸留水と1M塩酸を加え、10分間撹拌後、遠心分離して沈殿した不溶成分を除去した。
不溶成分を除去した水溶液にジクロロロメタン/n-ヘキサン混合溶媒加えて、液−液抽出を行った。このとき、アミノ酸は水層、油脂は有機層に選択的に溶けるため、水層のみを回収して油脂を除去した。
本発明においては、精製工程を簡略化するため、(B3−1)逆相クロマトグラフィー工程と、(B3−2)脱色工程をまとめて実施した。具体的には、ポリプロピレン製のクロマトカラムに、オクタデシルシリル基で表面修飾された多孔性球状シリカゲルを投入して、シリカゲル界面が水平になるまで慣らす。次いで、カラム用の活性炭を投入して精製用のカラムを準備した。
このカラムに、試料を加え、更に移動相として水を加えることで、脂質や色素を除去した。
以下の条件でアミノ酸を抽出した。
試料のカチオン化剤:塩酸
固定相:ダウ・ケミカル社製「アンバーライトIR120BH」、
移動相:不純物を除去する際には蒸留水、アミノ酸を回収する際には10%アンモニア水
得られた抽出物は減圧濃縮(60℃)し、更に蒸留水/メタノール混合溶液に溶解させたうえで、遠心分離と親水性PTEEフィルター(ミリポア社製「Millex-LH」)により清澄化した。
親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)により、グルタミン酸アンモニウムのみを分離精製した。HILICの条件は以下の通りである。
装置:島津製作所製「LC20AP」
固定相:昭和電工製「AsahipakNH2P」
移動相:炭酸水素アンモニウム水溶液/メタノール
グルタミン酸アンモニウムを錫箔に0.5mg取り分け、EA-IRMSによりδ13Cを測定した。EA-IRMS(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)の仕様及び測定条件は表2の通りである。
表3、4、5に示す条件に従って試料1〜34に含まれるグルタミン酸のδ13Cおよびδ15Nを測定した。
原料の由来が不明確な試料101〜113について、グルタミン酸のδ13Cおよびδ15Nを測定した。なお、分析例1〜34の場合と異なり、試料101〜113に含まれる不純物(脂質、グルタミン酸以外のアミノ酸等)は明らかではないため、全て精製工程を実施した。
(B1)〜(B5)の精製工程におけるδ13Cの同位体分別を以下の通り確認した。
表7は、試薬としてL(+)−グルタミン酸ナトリウム−水和物(和光純薬工業社製、98-102%)を用い、精製しない場合、(B1)抽出工程のみを実施した場合、(B2)脱脂工程のみを実施した場合、(B3)カラムによる精製工程のみを実施した場合、(B4)陽イオン交換工程のみを実施した場合、(B5)分離工程のみを実施した場合、および全精製工程を実施した場合に、EA-IRMSによってδ13Cを測定した結果である。
Claims (10)
- 試料に含まれるグルタミン酸の炭素安定同位体比(δ13C)を元素分析−安定同位体比質量分析計(EA-IRMS)により測定し、且つ窒素安定同位体比(δ15N)をガスクロマトグラフ−安定同位体比質量分析計(GC-IRMS)により測定することを特徴とするグルタミン酸安定同位体比の測定方法。
- δ13Cを測定する前処理として、親水性相互作用クロマトグラフィーによりグルタミン酸を分離精製する工程を含むことを特徴とする請求項1記載のグルタミン酸安定同位体比の測定方法。
- δ13Cを測定する前処理として、逆相クロマトグラフィーにより油脂成分を除去する工程を含むことを特徴とする請求項1又は2記載のグルタミン酸安定同位体比の測定方法。
- δ13Cを測定する前の処理として、活性炭カラムを使用して色素成分を除去する工程を含むことを特徴とする請求項1〜3いずれか記載のグルタミン酸安定同位体比の測定方法。
- 由来が明確な試料に含まれるグルタミン酸の炭素安定同位体比(δ13C)および窒素安定同位体比(δ15N)と、由来が不明確な試料に含まれるグルタミン酸の炭素安定同位体比(δ13C)および窒素安定同位体比(δ15N)とを比較することで、由来が不明確なグルタミン酸の由来を判別する方法。
ただし、由来が不明確な試料に含まれるグルタミン酸の炭素安定同位体比(δ13C)および窒素安定同位体比(δ15N)は、請求項1〜4いずれか記載の方法により測定されることを特徴とする。 - 試料に含まれるアミノ酸の炭素安定同位体比(δ13C)を元素分析−安定同位体比質量分析計(EA-IRMS)により測定し、且つ窒素安定同位体比(δ15N)をガスクロマトグラフ−安定同位体比質量分析計(GC-IRMS)により測定することを特徴とするアミノ酸安定同位体比の測定方法。
- δ13Cを測定する前処理として、親水性相互作用クロマトグラフィーによりアミノ酸を分離精製する工程を含むことを特徴とする請求項6記載のアミノ酸安定同位体比の測定方法。
- δ13Cを測定する前処理として、逆相クロマトグラフィーにより油脂成分を除去する工程を含むことを特徴とする請求項6又は7記載のアミノ酸安定同位体比の測定方法。
- δ13Cを測定する前の処理として、活性炭カラムを使用して色素成分を除去する工程を含むことを特徴とする請求項6〜8いずれか記載のアミノ酸安定同位体比の測定方法。
- 由来が明確な試料に含まれるアミノ酸の炭素安定同位体比(δ13C)および窒素安定同位体比(δ15N)と、由来が不明確な試料に含まれるアミノ酸の炭素安定同位体比(δ13C)および窒素安定同位体比(δ15N)とを比較することで、由来が不明確なアミノ酸の由来を判別する方法。
ただし、由来が不明確な試料に含まれるアミノ酸の炭素安定同位体比(δ13C)および窒素安定同位体比(δ15N)は、請求項6〜9いずれか記載の方法により測定されることを特徴とする。
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