JP6345596B2 - Method for detecting primary aldosteronism and monoclonal antibody - Google Patents

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Description

本発明は、原発性アルドステロン症の検出方法及びモノクローナル抗体に関する。 The present invention relates to a method for detecting primary aldosteronism and a monoclonal antibody.

原発性アルドステロン症とは副腎から自律的にアルドステロンとよばれるステロイドが過剰に分泌される疾患であり、食塩感受性高血圧の原因となる。原発性アルドステロン症には大きく分けて腫瘍性と非腫瘍性（特発性）の2つの相異なる病態が存在する。形態的には、前者が片側性の腺腫（aldosterone producing adenoma, 以下APA）であるのに対し、後者は両側性の副腎過形成（idiopathic hyperaldosteronism, 以下IHA）である。APAとIHAではその治療方針が全く異なるため（前者が副腎摘除術、後者が薬物治療）、その鑑別診断は非常に重要となる。しかしながら、APAとIHAを区別できるような病態識別マーカーはこれまでに見つかっておらず、そのため最終的に病理標本を用いて確定診断が行われる際には上述のAPAとIHAの形態的な特徴の差のみが判定材料に用いられていた。 Primary aldosteronism is a disease in which steroids called aldosterone are secreted excessively from the adrenal glands and cause salt-sensitive hypertension. There are two distinct types of primary aldosteronism: neoplastic and non-neoplastic (idiopathic). Morphologically, the former is unilateral adenoma (hereinafter referred to as APA), while the latter is bilateral adrenal hyperaldosteronism (hereinafter referred to as IHA). Since APA and IHA have completely different treatment strategies (the former is adrenalectomy and the latter is pharmacotherapy), the differential diagnosis is very important. However, no pathological markers that can distinguish between APA and IHA have been found so far. Therefore, when a definitive diagnosis is finally made using a pathological specimen, the morphological characteristics of APA and IHA described above Only the difference was used as a judgment material.

3β水酸化ステロイド脱水素酵素（3β-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase, 以下略して3β-HSD）は、副腎や精巣、胎盤組織等で発現し、ステロイド合成の必須ステップを触媒する酵素である。ヒトの3β-HSDにはHSD3B1とHSD3B2とよばれる2種のサブタイプが存在する。しかしながら、これら2種類のサブタイプは構造的に類似しており、アミノ酸配列で比較すると両者は92% も一致するため（非特許文献1）、この酵素のサブタイプの違いを抗体によって識別することは困難だとされてきた。   3β-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase (3β-HSD for short) is an enzyme that is expressed in the adrenal gland, testis, placental tissue, etc., and catalyzes an essential step of steroid synthesis. There are two subtypes of human 3β-HSD called HSD3B1 and HSD3B2. However, these two subtypes are structurally similar, and they are 92% identical when compared by amino acid sequence (Non-patent Document 1). Has been considered difficult.

従来、原発性アルドステロン症の病理診断を行う際には、病変部のステロイド合成能を判定する目的でPan-HSD3B抗体（サブタイプ非特異性抗体）を用いた免疫組織染色により診断が広く行われてきた（非特許文献2および3）。しかしながら、このPan抗体ではサブタイプの区別がつかないため、APAやIHAの病巣部において発現する酵素がどちらのサブタイプであるかということは全くわからぬまま、APAとIHAの病変部にみられる形態的特徴の差のみを指標にAPAとIHAの病態鑑別が行われてきた。   Conventionally, when performing pathological diagnosis of primary aldosteronism, diagnosis is widely performed by immunohistochemical staining using Pan-HSD3B antibody (subtype non-specific antibody) for the purpose of determining the ability of steroid synthesis at the lesion. (Non-Patent Documents 2 and 3). However, since this Pan antibody cannot distinguish between subtypes, it does not know which subtype the enzyme is expressed in the lesion of APA or IHA, and it can be seen in lesions of APA and IHA. Differentiation of APA and IHA has been performed using only the difference in morphological characteristics as an index.

Doi M et al., Nature Medicine, 16, 67-74, 2010Doi M et al., Nature Medicine, 16, 67-74, 2010 Nakamura Y et al., Clin Endocrinol Metab. 96, E1272-8, 2011Nakamura Y et al., Clin Endocrinol Metab. 96, E1272-8, 2011 Sasano H 2000 The adrenal cortex. In: Stefaneanu L, Sasano H, Kovacs K (eds) Molecular and Cellular Endocrine Pathology. London: Arnold; pp221-pp252.Sasano H 2000 The adrenal cortex.In: Stefaneanu L, Sasano H, Kovacs K (eds) Molecular and Cellular Endocrine Pathology.London: Arnold; pp221-pp252.

APAとIHAの病態鑑別は、病変部にみられる形態的特徴の差のみを指標に行われてきたため、病態鑑別を間違えるケースがあった。   The pathologic differentiation between APA and IHA has been carried out using only the difference in morphological features seen in the lesion as an index.

本発明は、APAとIHAの病態鑑別を、副腎静脈血サンプルを用いて事前に間違いなく行う方法を提供するのみならず、摘出副腎を用いた病理検査で確実に行うことを目的とする。   The object of the present invention is not only to provide a method for definitely performing a pathological differentiation between APA and IHA using an adrenal venous blood sample in advance, but also to reliably perform pathological examination using an isolated adrenal gland.

本発明は、以下の原発性アルドステロン症の検出方法、検出するための使用、モノクローナル抗体及びキットを提供するものである。
項１． 以下の工程（１）及び工程（２）を含む、アルドステロン産生腺腫（APA）及び／又は副腎過形成（IHA）の検出方法：
工程（１）：アルドステロン(A)及びコルチゾール(F)を産生するための必須酵素である3βHSD（3β-hydroxy-Δ5-steroid dehydrogenase）の副腎サンプル中の活性を評価する工程
（ここで、前記3βHSDは、Aを産生するためのプレグネノロン（P5）からプロゲステロン（P4）を経由するA-経路と、Fを産生するための17ヒドロキシプレグネノロン（17OH-P5）から17ヒドロキシプロゲステロン（17OH-P4）を経由するF-経路に作用し、F-経路と比較したA-経路の相対頻度を示すA-経路／F-経路比（AFR、A-経路をF-経路で割算したもの）を算出することで3βHSD活性を評価する）、
工程（２）：工程（１）で算出したA-経路／F-経路比（AFR）に基づいてAPA及び／又はIHAを検出する工程。
項２． ヒトHSD3B1及び／又はヒトHSD3B2の発現量もしくは発現パターンのAFR及び／又はIHAの検出のための使用。
項３． ヒトHSD3B2を特異的に認識し、ヒトHSD3B1を認識しない、ヒトHSD3B2に対するモノクローナル抗体。
項４． 配列番号２に示されるHSD3B2ポリペプチドの40番目のArg(R)を認識し、配列番号１に示されるHSD3B1ポリペプチドの40番目のGly(G)を認識しない、項３に記載のモノクローナル抗体。
項５． ヒトの組織標本を用いた免疫組織化学的解析においてサブタイプ特異性を保持する項３又は４に記載のモノクローナル抗体。
項６． 変性したHSD3B2ポリペプチドと未変性のHSD3B2ポリペプチドの両方を認識することができる、項３〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
項７． 項３〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗体を副腎サンプルに適用して、副腎におけるヒトHSD3B2ポリペプチドの発現量を測定する工程を含む、項１に記載のAPA及び／又はIHAの検出方法。
項８． 副腎サンプルが副腎静脈血または摘出した副腎である、項５に記載のAPA及び／又はIHAの検出方法。
項９． 項３〜６のいずれかに記載のヒトHSD3B2を特異的に認識するモノクローナル抗体を含む、APA及び／又はIHAを検出するためのキット。
項１０． さらにヒトHSD3B1を特異的に認識する抗体を含む、項９に記載のキット。
項１１． ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サンドイッチ測定法、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析法または免疫組織化学染色方法で測定することを特徴とする項９又は１０に記載のキット。The present invention provides the following methods for detecting primary aldosteronism, uses for detection, monoclonal antibodies and kits.
Item 1. A method for detecting aldosterone-producing adenoma (APA) and / or adrenal hyperplasia (IHA), comprising the following steps (1) and (2):
Step (1): A step of evaluating the activity of 3βHSD (3β-hydroxy-Δ5-steroid dehydrogenase), which is an essential enzyme for producing aldosterone (A) and cortisol (F), in an adrenal sample (wherein the 3βHSD) A-pathway from pregnenolone (P5) to produce A through progesterone (P4) and 17-hydroxypregnenolone (17OH-P5) to produce F via 17-hydroxyprogesterone (17OH-P4) Calculate the A-path / F-path ratio (AFR, A-path divided by F-path), which indicates the relative frequency of the A-path compared to the F-path. To evaluate 3βHSD activity),
Step (2): A step of detecting APA and / or IHA based on the A-path / F-path ratio (AFR) calculated in step (1).
Item 2. Use of the expression level or expression pattern of human HSD3B1 and / or human HSD3B2 for detection of AFR and / or IHA.
Item 3. Monoclonal antibody against human HSD3B2 that specifically recognizes human HSD3B2 but does not recognize human HSD3B1.
Item 4. Item 4. The monoclonal antibody according to Item 3, which recognizes the 40th Arg (R) of the HSD3B2 polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 and does not recognize the 40th Gly (G) of the HSD3B1 polypeptide represented by SEQ ID NO: 1.
Item 5. Item 5. The monoclonal antibody according to Item 3 or 4, which retains subtype specificity in an immunohistochemical analysis using a human tissue specimen.
Item 6. Item 6. The monoclonal antibody according to any one of Items 3 to 5, which is capable of recognizing both a denatured HSD3B2 polypeptide and a native HSD3B2 polypeptide.
Item 7. Item 7. The method for detecting APA and / or IHA according to Item 1, comprising a step of measuring the expression level of human HSD3B2 polypeptide in the adrenal gland by applying the monoclonal antibody according to any one of Items 3 to 6 to the adrenal sample.
Item 8. Item 6. The method for detecting APA and / or IHA according to Item 5, wherein the adrenal sample is adrenal venous blood or a removed adrenal gland.
Item 9. A kit for detecting APA and / or IHA, which comprises a monoclonal antibody that specifically recognizes human HSD3B2 according to any one of Items 3 to 6.
Item 10. Item 10. The kit according to Item 9, further comprising an antibody that specifically recognizes human HSD3B1.
Item 11. Item 11. The kit according to Item 9 or 10, wherein the kit is measured by ELISA, RIA, sandwich assay, Western blot on polyacrylamide gel, immunoblot analysis or immunohistochemical staining.

ヒトのHSD3B1とHSD3B2には極度の構造的類似性（92% identity）があり、両者を抗体によって識別することは困難とされてきたが、我々はGANPマウスを利用した高親和性抗体作製法を用いることによってHSD3B2に特異的なモノクローナル抗体を樹立することに成功した。HSD3B2に特異的な抗体は世界で初めてである。 Human HSD3B1 and HSD3B2 have extremely high structural similarity (92% identity), and it has been difficult to distinguish them by antibodies. However, we have developed a high-affinity antibody production method using GANP mice. By using it, we succeeded in establishing a monoclonal antibody specific for HSD3B2. This is the first antibody specific to HSD3B2.

一方で、市販のHSD3B抗体に対してサブタイプ特異性を調べたところ、我々はHSD3B2に特異的な抗体は販売されていないが、Abnova社から販売されているHSD3B1抗体がHSD3B1に特異的でありHSD3B2には反応しないこと、さらに、我々が樹立したHSD3B2抗体とAbnova社のHSD3B1抗体は、それぞれHSD3B1とHSD3B2のアミノ末端領域にみられる１アミノ酸残基の違いをともに識別することによってサブタイプ特異性を獲得していることを見出した。   On the other hand, when we investigated the subtype specificity for the commercially available HSD3B antibody, we did not sell antibodies specific for HSD3B2, but the HSD3B1 antibody sold by Abnova is specific for HSD3B1. The HSD3B2 antibody we established and Abnova's HSD3B1 antibody do not react with HSD3B2, and the subtype specificity is identified by distinguishing the difference of one amino acid residue in the amino terminal region of HSD3B1 and HSD3B2, respectively. Found that you have won.

重要なことに、上記2種類の抗体はヒトの組織標本を用いた免疫組織化学的解析においてもサブタイプ特異性を保持する。実際にヒトの正常副腎切片を用いて抗体染色を行ったところ、免疫陽性反応はHSD3B2抗体では副腎皮質のうち、アルドステロンを産生する球状層とコルチゾールを産生する束状層の両層に認められるのに対し、HSD3B1抗体では球状層に特異的であることを確認した。このようなHSD3B1とHSD3B2の発現分布の違いは、以前我々が行ったHSD3B1とHSD3B2のmRNAレベルにおける発現解析から得られた結果（非特許文献1）と完全に一致する。つまり、これら2種の抗体を併用することにより、ヒトのHSD3Bに対するサブタイプ別の鑑別診断が行えることを明らかにした。   Importantly, these two antibodies retain subtype specificity in immunohistochemical analysis using human tissue specimens. When antibody staining was performed using human normal adrenal slices, immunopositive reactions were observed in both the aldosterone-producing globular layer and cortisol-producing bundled layer in the adrenal cortex in the HSD3B2 antibody. In contrast, the HSD3B1 antibody was confirmed to be specific to the spherical layer. The difference in the expression distribution of HSD3B1 and HSD3B2 is completely consistent with the results obtained from the expression analysis at the mRNA level of HSD3B1 and HSD3B2 that we previously performed (Non-patent Document 1). In other words, it was clarified that the combined diagnosis of human HSD3B by subtype can be performed by using these two antibodies together.

これまでは、原発性アルドステロン症の2大病変であるAPAとIHAにおいてその病巣部に発現する3βHSDのサブタイプは全く不明であった。上記2種類のサブタイプ特異的抗体を用いて腫瘍であるAPAと過形成に過ぎないIHAを比較したところ、APAの病巣部ではHSD3B2が強く発現し、HSD3B1の発現は低いこと、一方で、IHAの病巣部ではどちらのサブタイプも発現するが、特にHSD3B1の発現レベルが正常の副腎に比べて異常に亢進していることが分かった。これらの結果は、APAとIHAがHSD3B1とHSD3B2に対する抗体の染色性によって区別できることを示している。つまり、HSD3B1とHSD3B2を新たな病態識別マーカーとして使用することにより、これまでの形態のみを主体としたAPAとIHAの診断法に対して、分子メカニズムに基づく裏付けを与えることができる。   So far, the subtype of 3βHSD expressed in the lesions of APA and IHA, which are the two major lesions of primary aldosteronism, has been completely unknown. Comparison of tumor APA and IHA, which is only hyperplasia using the above two types of subtype-specific antibodies, shows that HSD3B2 is strongly expressed in the lesion area of APA, and HSD3B1 expression is low, while IHA Although both subtypes were expressed in the lesion area, HSD3B1 expression levels were found to be abnormally elevated compared to normal adrenal glands. These results indicate that APA and IHA can be distinguished by the staining properties of antibodies against HSD3B1 and HSD3B2. In other words, by using HSD3B1 and HSD3B2 as new disease state identification markers, support based on the molecular mechanism can be given to the diagnostic methods for APA and IHA mainly based on the conventional forms.

特に、腫瘍にのみ染まるHSD3B2はきわめて重要である。なぜなら、過形成ならば薬剤投与で治療を進めることが可能であるが、腫瘍であれば手術適応であるからである。このため病理診断は極めて重要である。現在まで20例以上のAPAを染色したが、全例陽性で有り、極めて感度の高いすばらしいモノクローナル抗体である。   In particular, HSD3B2, which only stains tumors, is extremely important. This is because it is possible to proceed with treatment by administration of a drug if it is hyperplasia, but it is an indication for surgery if it is a tumor. For this reason, pathological diagnosis is extremely important. To date, more than 20 cases of APA have been stained, but all cases are positive and are excellent monoclonal antibodies with extremely high sensitivity.

HSD3B1とHSD3B2の蛋白質配列。両者とも共通の保存されている領域を黄色で示す。黒の下線は抗体作成に用いた抗原の部位を示す。星印はHSD3B2抗体が識別認識するアミノ酸部位を示す。Protein sequence of HSD3B1 and HSD3B2. Both are shown in yellow in the common stored area. The black underline indicates the site of the antigen used for antibody production. The asterisk indicates the amino acid site recognized and recognized by the HSD3B2 antibody. Westernブロットによる、HSD3B1とHSD3B2の抗体の特異性の検討。Examination of antibody specificity of HSD3B1 and HSD3B2 by Western blot. Westernブロットによる、HA（ヘマグルチニン）標識したHSD3B1、HSD3B2や一アミノ酸変異させた各種ミュータントの抗体の特異性の検討。Examination of antibody specificity of HA (hemagglutinin) -labeled HSD3B1, HSD3B2 and various mutants mutated by one amino acid by Western blot. 二重免疫細胞化学による抗体の検定。Antibody assay by double immunocytochemistry. HSD3B1抗体、HSD3B2抗体、CYP17A1抗体による、正常副腎（normal adrenal; NA）、および特発性アルドステロン症（Ideopathic hyperaldosternism）の副腎の免疫組織化学。Bar=1mm。Immunohistochemistry of adrenal glands of normal adrenal (NA) and idiopathic aldosteronism with HSD3B1, HSD3B2 and CYP17A1 antibodies. Bar = 1mm. HSD3B1抗体、HSD3B2抗体による、副腎腺腫（aldosterone producing adenoma; APA）、および、腫瘍周辺の健常副腎の免疫組織化学。Bar=1mm。Immunohistochemistry of adrenal adenoma (aldosterone producing adenoma; APA) and healthy adrenal glands around the tumor by HSD3B1 and HSD3B2 antibodies. Bar = 1mm. 副腎静脈サンプル（IVS）を用いた、各種副腎におけるA-経路／F-経路比（AFR、A-経路をF-経路で割算したもの）。A-path / F-path ratio in various adrenals using adrenal vein sample (IVS) (AFR, A-path divided by F-path). IHA及びAPAにおけるHSD3Bに関係するステロイド代謝を示す。Figure 2 shows steroid metabolism related to HSD3B in IHA and APA.

本発明は、原発性アルドステロン症の検出方法、検出するための使用、HSD3B2ポリペプチドを特異的に検出するモノクローナル抗体及びキットに関する。   The present invention relates to methods for detecting primary aldosteronism, uses for detection, monoclonal antibodies and kits that specifically detect HSD3B2 polypeptides.

（１）HSD3B2を特異的に検出するモノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は、配列番号２に示されるHSD3B2ポリペプチドを特異的に検出することができ、配列番号１に示されるHSD3B1ポリペプチドを認識しない。(1) Monoclonal antibody specifically detecting HSD3B2 The monoclonal antibody of the present invention can specifically detect the HSD3B2 polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 and does not recognize the HSD3B1 polypeptide represented by SEQ ID NO: 1. .

本発明のモノクローナル抗体が認識するアミノ酸を調べたところ、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号２に示されるHSD3B2ポリペプチドの39番目のArg(R)を認識し、配列番号１に示されるHSD3B1ポリペプチドの40番目のGly(G)を認識しないことが明らかになった。   When the amino acids recognized by the monoclonal antibody of the present invention were examined, the monoclonal antibody of the present invention recognized the 39th Arg (R) of the HSD3B2 polypeptide represented by SEQ ID NO: 2, and the HSD3B1 polypeptide represented by SEQ ID NO: 1. It was revealed that the 40th Gly (G) of the peptide was not recognized.

本発明の抗体は、HSD3B2ポリペプチド（配列番号２）または40番目のArg(R)を有するそのペプチド断片（例えば、図1ａの下線で示されるペプチド断片）を用いて得られるモノクローナル抗体であり、ヒトHSD3B2を特異的に認識し、ヒトHSD3B1を認識しない抗体産生細胞(ハイブリドーマ)を選別することにより得ることができる。   The antibody of the present invention is a monoclonal antibody obtained using the HSD3B2 polypeptide (SEQ ID NO: 2) or a peptide fragment thereof having the 40th Arg (R) (for example, the peptide fragment indicated by the underline in FIG. 1a), It can be obtained by selecting an antibody-producing cell (hybridoma) that specifically recognizes human HSD3B2 and does not recognize human HSD3B1.

本発明のモノクローナル抗体は、例えばHSD3B2蛋白質（配列番号２）のアミノ末端領域の39番目のArg(R)を有するポリペプチド（図1a下線部）とグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）の融合蛋白質を免疫原とし、免疫高感受性GANPマウス(Sakaguchi, N., et al. Generation of high-affinity antibody against T cell-dependent antigen in the Ganp gene-transgenic mouse. J Immunol 174, 4485-4494 (2005))を利用してハイブリドーマを作製した後、HSD3B2に反応するがHSD3B1に反応しない抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これが産生するモノクローナル抗体を精製することで得られる。免疫の惹起は、通常1ng〜10mgの量の免疫原を10〜14日の日数を開けて1〜5回に分けた操作で行うことができる。十分な免疫後、抗体産生能を有する器官（脾臓やリンパ節）を動物から無菌的に摘出し、細胞融合時の親株とする。なお、摘出する器官としては、脾臓が最も好ましい。細胞融合のパートナーとしては、ミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞には、マウス由来、ラット由来、ヒト由来等があるが、マウス由来が好ましい。細胞融合には、ポリエチレングリコールを用いる方法、細胞電気融合法等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを用いる方法が簡便で好ましい。細胞融合しなかった脾臓細胞やミエローマ細胞とハイブリドーマとの選択は、例えばHATサプリメント（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）を添加した血清培地で培養することで行うことができる。   The monoclonal antibody of the present invention comprises, for example, a fusion protein of a polypeptide having 39th Arg (R) in the amino terminal region of HSD3B2 protein (SEQ ID NO: 2) (underlined in FIG. 1a) and glutathione-S-transferase (GST). Immunogen-sensitive GANP mice (Sakaguchi, N., et al. Generation of high-affinity antibody against T cell-dependent antigen in the Ganp gene-transgenic mouse.J Immunol 174, 4485-4494 (2005)) It is obtained by preparing a hybridoma using the hybridoma, selecting a hybridoma that produces an antibody that reacts with HSD3B2 but does not react with HSD3B1, and purifies the monoclonal antibody produced by the hybridoma. Induction of immunity can usually be performed by an operation in which an immunogen in an amount of 1 ng to 10 mg is divided into 1 to 5 times with 10 to 14 days. After sufficient immunization, organs capable of producing antibodies (spleen and lymph nodes) are aseptically removed from the animals and used as parent strains for cell fusion. The spleen is most preferable as an organ to be removed. Myeloma cells are used as cell fusion partners. Myeloma cells include mouse origin, rat origin, human origin, etc., but mouse origin is preferred. Examples of cell fusion include methods using polyethylene glycol, cell electrofusion, and the like, but methods using polyethylene glycol are simple and preferred. Selection of spleen cells or myeloma cells that have not undergone cell fusion and hybridomas can be performed, for example, by culturing in a serum medium supplemented with HAT supplements (hypoxanthine-aminopterin-thymidine).

本発明の抗体を産生するハイブリドーマの選択は、前述の培養上清を採取し、HSD3B2の39番目のArg(R)を有するポリペプチドのGST融合蛋白質を固相化したEIAプレートでのELISAを行う。この際、陰性対象としてHSD3B1の40番目のGly(G)を有するポリペプチドのGST融合蛋白質を用いたELISAを行うことが好ましい。ELISAの結果、HSD3B2に反応するがHSD3B1には反応しないウェルを選択し、そのウェルの細胞をクローニングに供する。その強く発色した培養上清に対応するハイブリドーマを、HSD3B2ポリペプチドに反応する抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。さらに、抗体産生ハイブリドーマを選別し単一化する作業（クローニング）が必要であり、限界希釈法、フィブリンゲル法、セルソーターを用いる方法等があるが限界希釈法が簡便で好ましい。これにより、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを獲得することができる。   Selection of the hybridoma producing the antibody of the present invention is performed by collecting the above-mentioned culture supernatant and conducting ELISA on an EIA plate on which a GST fusion protein of a polypeptide having 39th Arg (R) of HSD3B2 is immobilized. . At this time, it is preferable to carry out ELISA using a GST fusion protein of a polypeptide having 40th Gly (G) of HSD3B1 as a negative target. As a result of ELISA, a well that reacts with HSD3B2 but does not react with HSD3B1 is selected, and the cells in the well are subjected to cloning. The hybridoma corresponding to the strongly colored culture supernatant is selected as a hybridoma producing an antibody that reacts with the HSD3B2 polypeptide. Furthermore, an operation (cloning) for selecting and unifying antibody-producing hybridomas is necessary, and there are a limiting dilution method, a fibrin gel method, a method using a cell sorter, etc., but the limiting dilution method is simple and preferable. Thereby, the hybridoma which produces the target monoclonal antibody is acquirable.

上記方法により得られたハイブリドーマを培養することで、培養上清中にモノクローナル抗体を得ることができる。さらに、大量のモノクローナル抗体を得るには、in vivoおよびin vitroによる方法があるが、in vivoによる方法、特にマウス腹水で得る方法が好ましい。培養上清やマウス腹水からのモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム塩折法、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー等により行われるが、精製純度や簡便性を考慮するとアフィニティークロマトグラフィーが最も好ましい。さらに高純度のモノクローナル抗体を得る必要がある場合には、アフィニティークロマトグラフィーの後に最終精製としてゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー等を行うのが好ましい。
本発明の抗体を用いることで、１ng/ml以上の濃度のHSD3B2ポリペプチドを検出することが可能である。特に、１〜２００ng/ml、好ましくは１〜１００ng/mlの濃度のHSD3B2ポリペプチドを検出することが可能である。By culturing the hybridoma obtained by the above method, a monoclonal antibody can be obtained in the culture supernatant. Furthermore, in order to obtain a large amount of monoclonal antibody, there are in vivo and in vitro methods, but an in vivo method, particularly a method using mouse ascites is preferred. Monoclonal antibodies are purified from the culture supernatant or mouse ascites by ammonium sulfate salt folding, affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydroxyapatite column chromatography, etc., but affinity chromatography is used in consideration of purification purity and simplicity. Is most preferred. When it is necessary to obtain a highly pure monoclonal antibody, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography or the like is preferably performed as a final purification after affinity chromatography.
By using the antibody of the present invention, it is possible to detect HSD3B2 polypeptide at a concentration of 1 ng / ml or more. In particular, it is possible to detect HSD3B2 polypeptide at a concentration of 1 to 200 ng / ml, preferably 1 to 100 ng / ml.

本発明のモノクローナル抗体は、ヒトの組織標本を用いた免疫組織化学的解析においてもサブタイプ特異性を保持する。ヒトの組織標本としては、ホルマリンあるいはパラフィンで固定された標本が挙げられる。本発明のモノクローナル抗体は、固定され変性したHSD3B2ポリペプチドと細胞内の未変性のHSD3B2ポリペプチドの両方を認識することができるため、好ましい。   The monoclonal antibody of the present invention retains subtype specificity even in immunohistochemical analysis using human tissue specimens. Examples of human tissue specimens include specimens fixed with formalin or paraffin. The monoclonal antibody of the present invention is preferable because it can recognize both the immobilized and modified HSD3B2 polypeptide and the intracellular native HSD3B2 polypeptide.

本発明の抗体を備えた、HSD3B2ポリペプチドを検出するためのキットも、本発明の範囲に含まれる。当該キットは、本発明のモノクローナル抗体を備え、好ましくは使用される免疫染色もしくは免疫測定に必要な試薬が必要量備えられたものである。   A kit for detecting HSD3B2 polypeptide comprising the antibody of the present invention is also included in the scope of the present invention. The kit includes the monoclonal antibody of the present invention, and preferably includes a necessary amount of reagents necessary for immunostaining or immunoassay to be used.

（２）抗体を用いる原発性アルドステロン症の検出方法もしくは診断方法及びその使用
本発明の方法は、本発明のモノクローナル抗体を使用した免疫染色により、副腎組織中のHSD3B2を検出する方法に係るものである。免疫染色において、抗原抗体反応の可視化は、常法により行うことができ、例えば、オートラジオグラフィー、金コロイド法、蛍光抗体法、酵素抗体法などが挙げられる。(2) Primary aldosteronism detection method or diagnostic method using antibody and use thereof The method of the present invention relates to a method of detecting HSD3B2 in adrenal tissue by immunostaining using the monoclonal antibody of the present invention. is there. In immunostaining, visualization of an antigen-antibody reaction can be performed by a conventional method, and examples thereof include autoradiography, a gold colloid method, a fluorescent antibody method, and an enzyme antibody method.

本発明の抗体は、副腎の静脈血中のHSD3B2を免疫学的測定方法により検出することで、原発性アルドステロン症の検出もしくは診断を行うことができる。免疫学的測定方法としては、ウエスタンブロット法（ＷＢ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等、検出系に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素、ヨウ素125 等の放射性同位元素（ＲＩ）、アクリジニウム化合物等の発光物質あるいはフルオレセインイソチオシアネート等の蛍光物質などを標識した抗体または抗原を用いる測定法等があるが、これらに限定されるものではない。本発明の方法では、特に酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の一種である酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）が好ましく用いられ、特にＥＬＩＳＡがより好適である。また、簡便性に優れるイムノクロマト法も好適である。   The antibody of the present invention can detect or diagnose primary aldosteronism by detecting HSD3B2 in venous blood of the adrenal gland by an immunological measurement method. Immunological measurement methods include Western blotting (WB), enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), chemiluminescence immunoassay (CLIA), fluorescence immunoassay (FIA), etc. Antibodies or antigens labeled with enzymes such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (ALP), radioactive isotopes (RI) such as iodine 125, luminescent substances such as acridinium compounds or fluorescent substances such as fluorescein isothiocyanate However, it is not limited to these. In the method of the present invention, an enzyme immunoassay (ELISA) which is a kind of enzyme immunoassay (EIA) is particularly preferably used, and ELISA is more preferable. Further, an immunochromatography method that is excellent in convenience is also suitable.

HSD3B2ポリペプチドは、APA組織に豊富に含まれるが、IHA組織にはあまり含まれない。従って、本発明の抗体により副腎組織中のHSD3B2ポリペプチドを検出する方法によれば、APAとIHAの鑑別診断を確実に行うことができる。例えば、APAもしくはIHAの診断が正しいかどうかを術後に行うことができ、死因の検証にも使用することができる。IHA組織はHSD3B1ポリペプチドが多く発現され、APA組織はHSD3B2ポリペプチドが多く発現されるので、HSD3B1ポリペプチドを特異的に検出可能なモノクローナル抗体を本発明の抗体と組み合わせて使用することで、APAとIHAの鑑別診断をさらに確実に行うことができる。   HSD3B2 polypeptides are abundant in APA tissues but less in IHA tissues. Therefore, according to the method for detecting HSD3B2 polypeptide in adrenal tissue using the antibody of the present invention, differential diagnosis between APA and IHA can be reliably performed. For example, whether the diagnosis of APA or IHA is correct can be performed postoperatively and can be used to verify the cause of death. Since IHA tissue expresses a lot of HSD3B1 polypeptide and APA tissue expresses a lot of HSD3B2 polypeptide, using a monoclonal antibody capable of specifically detecting HSD3B1 polypeptide in combination with the antibody of the present invention, APA And IHA differential diagnosis can be performed more reliably.

IHAにおいては、HSD3B1ポリペプチドが副腎皮質の最外層に多く存在し、APAにおいては、HSD3B1ポリペプチドの副腎皮質最外層における存在量が少なくなり、その内側におけるHSD3B2ポリペプチドの発現量が非常に多くなるために、APAとIHAの診断は、容易に行うことができる。   In IHA, HSD3B1 polypeptide is abundant in the outermost layer of the adrenal cortex, and in APA, the abundance of HSD3B1 polypeptide in the outermost layer of the adrenal cortex is low, and the expression level of HSD3B2 polypeptide is very high inside it. Therefore, the diagnosis of APA and IHA can be easily performed.

（３）A-経路／F-経路比(AFR)を用いた原発性アルドステロン症の検出方法もしくは診断方法及びその使用
図２に正常副腎、IHA及びAPAにおける3βHSDに関係するステロイド代謝を示す。3βHSDステップは、高活性(低Km)型(HSD3B1)と低活性(高Km)型(HSD3B2)により行われている。3βHSD変換は、異なる最終産物を生じる2つの経路からなり、一経路はアルドステロン(A)を生じる経路（A-経路）であり、他方はコルチゾール(F)を生じる経路（F-経路）である。A-経路では、アルドステロン(A)はプログネノロン(P5)からプロゲステロン(P4)に変換され、F-経路では、コルチゾールは17-ヒドロキシプログネノロン(17OH-P5)から17-オキシプロゲステロン(17OH-P4)に変換される。副腎皮質束状帯（ZF）においてはF-経路が働いており、P5はCYP17A1により17OH-P5に変換され、そこに存在するHSD3B2は17OH-P5を17OH-P4に変換し、最終的にFが生じる。一方、副腎皮質球状帯(ZG)においてはA-経路が働いており、HSD3B1とHSD3B2によりP5は直接P4に変換され、最終的にAが生じる。このA-経路は、IHA及びAPAにおいて大きく変化する。A-経路／F-経路比（AFR、A-経路をF-経路で割算したもの）はF-経路と比較したA-経路の相対頻度を示す。非病的（健常）副腎(APAの非腫瘍側の副腎)において、AFRは0.18-0.29である。IHAにおいて、HSD3B1を発現する細胞は過形成を示し、多量のアルドステロンを産生する。IHAのAFRは2つの群に分けられる。一方の群はAFRが非常に高い群(AFR=0.66-3.8)であり、他方の群はAFRの正常群(AFR=0.13-0.29)である。AFRスコアの差異は、IHAがAFRの明らかに異なる2種以上の患者群から構成され、高AFRのIHA患者群は3βHSDステップの高酵素活性型の増加による高アルドステロン血症を示す。APAにおいて、AFRは中程度であるが着実に増加する(AFR=0.31-0.47)。(3) Detection method or diagnosis method of primary aldosteronism using A-pathway / F-pathway ratio (AFR) and its use FIG. 2 shows steroid metabolism related to 3βHSD in normal adrenal gland, IHA and APA. The 3βHSD step is performed by a high activity (low Km) type (HSD3B1) and a low activity (high Km) type (HSD3B2). 3βHSD conversion consists of two pathways that produce different end products, one pathway is the pathway that produces aldosterone (A) (A-pathway) and the other is the pathway that produces cortisol (F) (F-pathway). In the A-route, aldosterone (A) is converted from prognenolone (P5) to progesterone (P4), and in the F-route, cortisol is converted from 17-hydroxyprognenolone (17OH-P5) to 17-oxyprogesterone (17OH-P4). ). In the adrenocortical bundle zone (ZF), the F-pathway works, P5 is converted to 17OH-P5 by CYP17A1, HSD3B2 present there converts 17OH-P5 to 17OH-P4, and finally F Occurs. On the other hand, the A-pathway works in the adrenal cortex globular zone (ZG). P5 is directly converted to P4 by HSD3B1 and HSD3B2, and finally A is generated. This A-pathway varies greatly in IHA and APA. The A-path / F-path ratio (AFR, A-path divided by F-path) indicates the relative frequency of the A-path compared to the F-path. In non-pathological (healthy) adrenal glands (adrenal on the non-tumor side of APA), the AFR is 0.18-0.29. In IHA, cells that express HSD3B1 show hyperplasia and produce large amounts of aldosterone. IHA AFRs are divided into two groups. One group is a group with very high AFR (AFR = 0.66-3.8), and the other group is a normal group with AFR (AFR = 0.13-0.29). Differences in AFR scores consist of two or more patient groups with distinctly different IFR in AFR, and high AFR IHA patient groups exhibit hyperaldosteronemia due to increased high enzyme activity of the 3βHSD step. In APA, AFR is moderate but increases steadily (AFR = 0.31-0.47).

腫瘍細胞の大部分は低酵素活性型のHSD3B2を高発現する。腫瘍細胞はCYP17A1を欠くためにF-経路を欠き、A-経路のみが働き、低酵素活性型であっても、腫瘍細胞数は正常副腎の数十倍から数百倍の数に達するため、多量のアルドステロンを産生する。腫瘍細胞における大量のアルドステロン産生のために、HSD3B1とHSD3B2は腫瘍周囲の非腫瘍副腎の皮質球状帯(ZG)においてアルドステロンの産生は抑制される。   Most of the tumor cells highly express low-activity HSD3B2. Since tumor cells lack CYP17A1, they lack the F-pathway, only the A-pathway works, and even if they are of low enzyme activity type, the number of tumor cells reaches tens to hundreds of times that of normal adrenal glands. Produces large amounts of aldosterone. Due to the large amount of aldosterone production in tumor cells, HSD3B1 and HSD3B2 suppress aldosterone production in the cortical globular zone (ZG) of the non-tumor adrenal glands surrounding the tumor.

本発明者は、APAにおいてHSD3B2が過剰発現し、IHAにおいてHSD3B1が過剰発現することを初めて見出し、それにより「AFR」がAPAとIHAの診断に役立つとの仮説を立てて健常者もしくはAPAの非腫瘍副腎、IHA患者、APA患者のA-経路(アルドステロン産生のための3βHSD活性)とF-経路（コルチゾールの産生のための3βHSD活性）を測定し、AFRによりIHAとAPAの診断が可能であることを明らかにした。   The inventor found for the first time that HSD3B2 is overexpressed in APA and HSD3B1 is overexpressed in IHA, thereby hypothesizing that `` AFR '' is useful for the diagnosis of APA and IHA. Measure A-pathway (3βHSD activity for aldosterone production) and F-pathway (3βHSD activity for cortisol production) in tumor adrenal gland, IHA patients, and APA patients, and IFR and APA can be diagnosed by AFR It revealed that.

以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
（１）HSD3B1とHSD3B2の蛋白質配列のアラインメント（図1ａ）。
両者とも共通の保存されている領域を黄色で示す。黒の下線は抗体作成に用いた抗原の部位を示す。星印はHSD3B2抗体が識別認識するアミノ酸部位を示す。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
(1) Alignment of protein sequences of HSD3B1 and HSD3B2 (FIG. 1a).
Both are shown in yellow in the common stored area. The black underline indicates the site of the antigen used for antibody production. The asterisk indicates the amino acid site recognized and recognized by the HSD3B2 antibody.

（２）Westernブロットによる、HSD3B1とHSD3B2の抗体の特異性の検討（図１ｂ）。
COS-1細胞にHAタグで標識したHSD3B1やHSD3B2を発現させ、電気泳動後HSD3B1抗体、HSD3B2抗体を用いてWesternブロットを行った。HA抗体、pan-HSD3B抗体は、非特異的反応のコントロールとして用いている。pEZはHA標識したHSD3B1やHSD3B2を発現させるのに用いたプラスミドベクターである。Pan-HSD抗体は、HA抗体と同じ大きさの部位に、HSD3B1でもHSD3B2を発現させても検出される。これに対して、HSD3B1抗体はHSD3B1を発現させたときだけ認識し、HSD3B2を発現させても認識されない。また我々のHSD3B2抗体はHSD3B2を発現させたときだけ認識し、HSD3B1を発現させても認識されない。(2) Examination of antibody specificity of HSD3B1 and HSD3B2 by Western blot (FIG. 1b).
HSD3B1 and HSD3B2 labeled with an HA tag were expressed in COS-1 cells. After electrophoresis, Western blotting was performed using HSD3B1 antibody and HSD3B2 antibody. HA antibody and pan-HSD3B antibody are used as controls for non-specific reactions. pEZ is a plasmid vector used to express HA-labeled HSD3B1 and HSD3B2. Pan-HSD antibody can be detected regardless of whether HSD3B1 or HSD3B2 is expressed at the same size as HA antibody. In contrast, the HSD3B1 antibody is recognized only when HSD3B1 is expressed, and is not recognized when HSD3B2 is expressed. In addition, our HSD3B2 antibody is recognized only when HSD3B2 is expressed, but not when HSD3B1 is expressed.

（３）Westernブロットによる、HA標識したHSD3B1、HSD3B2や一アミノ酸変異させた各種ミュータントの抗体の特異性の検討（図１ｃ）。
これらの蛋白質はCOS-1細胞に発現させ、電気泳動後HSD3B1抗体、HSD3B2抗体、およびHA抗体を用いて検出した。重要なことにHSD3B1抗体はG40R変異は認識せず、HSD3B2抗体はG39G変異を認識しない。すなわちHSD3B1抗体はHSD3B1の40Gを認識する抗体で、HSD3B2抗体はHSD3B2の39Rを認識する抗体であると言える。(3) Examination of antibody specificity of HA-labeled HSD3B1, HSD3B2 and various mutants mutated by one amino acid by Western blot (FIG. 1c).
These proteins were expressed in COS-1 cells, and after electrophoresis, detected using HSD3B1, HSD3B2, and HA antibodies. Importantly, the HSD3B1 antibody does not recognize the G40R mutation and the HSD3B2 antibody does not recognize the G39G mutation. That is, it can be said that the HSD3B1 antibody is an antibody that recognizes 40G of HSD3B1, and the HSD3B2 antibody is an antibody that recognizes 39R of HSD3B2.

（４）二重免疫細胞化学による抗体の検定（図１ｄ）。
COS-1細胞にHA標識したHSD3B1やHSD3B2を発現させ、ホルマリン固定した後、HA抗体と共に、HSD3B1抗体やHSD3B2抗体で染色した。HA抗体はAlexa-488で緑に、HSD3B1およびHSD３B2抗体はAlexa594で赤に、核はDAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）で青に対比染色した。一番右には三者のMerge像を示す。(4) Antibody assay by double immunocytochemistry (FIG. 1d).
COS-1 cells were expressed with HA-labeled HSD3B1 and HSD3B2, fixed in formalin, and then stained with HSD3B1 and HSD3B2 antibodies together with HA antibody. The HA antibody was counterstained in green with Alexa-488, the HSD3B1 and HSD3B2 antibodies were counterstained in red with Alexa594, and the nuclei were counterstained in blue with DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole). On the far right is the Merge image of the three parties.

（５）HSD3B1抗体、HSD3B2抗体、CYP17A1抗体による、正常副腎（normal adrenal; NA）、および特発性アルドステロン症（Ideopathic hyperaldosternism）の副腎の免疫組織化学（図１ｅ）。
術後摘出標本をホルマリン固定し、パラフィンに包埋したものをサンプルとして用いた。HSD3B1は副腎球状層にしか存在せず、束状層細胞には存在しないことに注目。IHAではこの球状層細胞の免疫活性が上昇し、数も増える。CYP17A1はPredonisoloneを17-hydroxypredonisoloneに変換する酵素であるが、束状層にしか存在しない。従って、HSD3B1とCYP11B1の二重染色では綺麗に、全ての細胞が染め分けられた。HSD3B2の染色では、NA、IHAとも球状層も束状層の細胞も染色された。(5) Immunohistochemistry of normal adrenal (NA) and idiopathic aldosteronism (Ideopathic hyperaldosternism) by HSD3B1, HSD3B2, and CYP17A1 antibodies (FIG. 1e).
Postoperatively isolated specimens were fixed in formalin and embedded in paraffin as samples. Note that HSD3B1 is only present in the adrenal gland layer and not in bundled layer cells. With IHA, the immune activity of these globular layer cells increases and the number increases. CYP17A1 is an enzyme that converts Predonisolone to 17-hydroxypredonisolone, but it exists only in the bundle layer. Therefore, the double staining of HSD3B1 and CYP11B1 neatly stained all cells. In the HSD3B2 staining, both NA and IHA cells in the spherical layer and the bundle layer were stained.

（６）HSD3B1抗体、HSD3B2抗体による、副腎腺腫（APA）、および、腫瘍周辺の健常副腎の免疫組織化学（図１ｆ）。
術後摘出標本をホルマリン固定し、パラフィンに包埋したものを用いた。腺腫本体にはHSD３B2が極めて多く発現している細胞で満たされていることに注目。また、腫瘍本体のHSD3B1の発現は弱いか、ほとんど無い。腫瘍周囲の副腎組織の球状層ではHSD3B1の発現はほぼ消失し、HSD3B2の発現も減弱している。これに対しHSD3B2の束状層の発現レベルには何の変動も無かった。(6) Immunohistochemistry of adrenal adenoma (APA) and healthy adrenal glands around the tumor by HSD3B1 antibody and HSD3B2 antibody (FIG. 1f).
Postoperatively isolated specimens were fixed in formalin and embedded in paraffin. Note that the adenoma body is filled with cells that express very much HSD3B2. Moreover, the expression of HSD3B1 in the tumor body is weak or almost absent. In the globular layer of adrenal gland surrounding the tumor, the expression of HSD3B1 almost disappeared, and the expression of HSD3B2 was also attenuated. In contrast, there was no change in the expression level of the bundled layer of HSD3B2.

（７）副腎静脈サンプル（IVS）を用いた、各種副腎におけるA-経路／F-経路比（AFR、A-経路をF-経路で割算したもの）（図１ｇ）。
A-経路では、アルドステロン(A)はプログネノロン(P5)からプロゲステロン(P4)に変換され、F-経路では、コルチゾールは17-ヒドロキシプログネノロン(17OH-P5)から17-オキシプロゲステロン(17OH-P4)に変換される（詳細は、図２の説明参照）。図に示したのは、非病的（健常）副腎(APAの非腫瘍側の副腎)6例（水色印）、APAの腫瘍側の副腎6例（桃色印）、IHAの両側（両側で14例：黒色印）の副腎のデータである。APA非病的副腎に対応する腫瘍副腎は同じ形の記号で表わされている。IHAに関しても同一症例は同じ記号で表している。(7) A-path / F-path ratio (AFR, A-path divided by F-path) in various adrenals using adrenal vein sample (IVS) (FIG. 1g).
In the A-route, aldosterone (A) is converted from prognenolone (P5) to progesterone (P4), and in the F-route, cortisol is converted from 17-hydroxyprognenolone (17OH-P5) to 17-oxyprogesterone (17OH-P4). (See the description of FIG. 2 for details). The figure shows 6 non-pathological (healthy) adrenals (adrenal on the non-tumor side of APA) (light blue), 6 adrenals on the tumor side of APA (pink), both sides of IHA (14 on both sides) Example: Black adrenal) adrenal data. Tumor adrenals corresponding to non-APA adrenal glands are represented by the same symbol. For IHA, the same case is represented by the same symbol.

非病的副腎において、AFRは0.18-0.29である。IHAにおいて、HSD3B1を発現する細胞は過形成を示し、多量のアルドステロンを産生する。IHAのAFRは2つの群に分けられる。一方の群はAFRが非常に高い群(AFR=0.66-3.8)であり、他方の群はAFRの正常群(AFR=0.13-0.29)である。AFRスコアの差異は、IHAがAFRの明らかに異なる病因を持つ患者群から構成され、このうち高AFRのIHA患者群は3βHSDステップの高酵素活性型の増加による高アルドステロン血症を示すと考えられる。APAにおいて、AFRは中程度であるが着実に増加する(AFR=0.31-0.47)。腫瘍細胞の大部分は低酵素活性型のHSD3B2を高発現するが、腫瘍細胞はCYP17A1を欠くためにF-経路を欠き、A-経路のみが働き、低酵素活性型であっても、腫瘍細胞数は正常副腎の数十倍から数百倍の数に達するため、多量のアルドステロンを産生する、と考えられる。   In non-pathological adrenal glands, the AFR is 0.18-0.29. In IHA, cells that express HSD3B1 show hyperplasia and produce large amounts of aldosterone. IHA AFRs are divided into two groups. One group is a group with very high AFR (AFR = 0.66-3.8), and the other group is a normal group with AFR (AFR = 0.13-0.29). Differences in AFR scores consisted of patients with IHA having distinctly different etiologies of AFR, of which high AFR IHA patients are likely to show hyperaldosteronism due to increased high enzyme activity at the 3βHSD step . In APA, AFR is moderate but increases steadily (AFR = 0.31-0.47). Most of the tumor cells highly express low enzyme activity type HSD3B2, but tumor cells lack CYP17A1 and thus lack the F-pathway, only the A-pathway works. Since the number reaches several tens to several hundred times that of normal adrenal glands, it is considered that a large amount of aldosterone is produced.

Claims (11)

ヒトHSD3B1及び／又はヒトHSD3B2の発現量もしくは発現パターンのAPAとIHAの鑑別のための使用。 Use of the expression level or expression pattern of human HSD3B1 and / or human HSD3B2 for differentiation between APA and IHA. ヒトHSD3B2を特異的に認識し、ヒトHSD3B1を認識せず、配列番号２に示されるHSD3B2ポリペプチドの39番目のArg(R)を認識し、配列番号１に示されるHSD3B1ポリペプチドの40番目のGly(G)を認識しない、ヒトHSD3B2に対するモノクローナル抗体を副腎サンプルに適用して、副腎におけるヒトHSD3B2ポリペプチドの発現量を測定する工程を含む、APAとIHAの鑑別方法。 Recognizes human HSD3B2 specifically, does not recognize human HSD3B1, recognizes the 39th Arg (R) of the HSD3B2 polypeptide shown in SEQ ID NO: 2, and recognizes the 40th of the HSD3B1 polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 does not recognize Gly (G), a monoclonal antibody against human HSD3B2 applied to adrenal sample, comprising the step of measuring the expression level of human HSD3B2 polypeptide in the adrenal, Kan by how the APA and IHA. 前記モノクローナル抗体が、ヒトの組織標本を用いた免疫組織化学的解析においてサブタイプ特異性を保持する、請求項２に記載のAPAとIHAの鑑別方法。The method for differentiating between APA and IHA according to claim 2, wherein the monoclonal antibody retains subtype specificity in an immunohistochemical analysis using a human tissue specimen. 前記モノクローナル抗体が、変性したHSD3B2ポリペプチドと未変性のHSD3B2ポリペプチドの両方を認識することができる、請求項２に記載のAPAとIHAの鑑別方法。The method for differentiating between APA and IHA according to claim 2, wherein the monoclonal antibody can recognize both a denatured HSD3B2 polypeptide and a native HSD3B2 polypeptide. 副腎サンプルが副腎静脈血または摘出した副腎である、請求項２〜４のいずれか１項に記載のAPAとIHAの鑑別方法。 Adrenal sample is adrenal venous or excised adrenal, Kan by how the APA and IHA according to any one of claims 2-4. ヒトHSD3B2を特異的に認識し、ヒトHSD3B1を認識せず、配列番号２に示されるHSD3B2ポリペプチドの39番目のArg(R)を認識し、配列番号１に示されるHSD3B1ポリペプチドの40番目のGly(G)を認識しない、ヒトHSD3B2に対するモノクローナル抗体を含む、APAとIHAを鑑別診断するためのキット。 Recognizes human HSD3B2 specifically, does not recognize human HSD3B1, recognizes the 39th Arg (R) of the HSD3B2 polypeptide shown in SEQ ID NO: 2, and recognizes the 40th of the HSD3B1 polypeptide shown in SEQ ID NO: 1 A kit for differential diagnosis of APA and IHA, which contains a monoclonal antibody against human HSD3B2 that does not recognize Gly (G) . 前記モノクローナル抗体が、ヒトの組織標本を用いた免疫組織化学的解析においてサブタイプ特異性を保持する、請求項６に記載のキット。The kit according to claim 6, wherein the monoclonal antibody retains subtype specificity in an immunohistochemical analysis using a human tissue specimen. 前記モノクローナル抗体が、変性したHSD3B2ポリペプチドと未変性のHSD3B2ポリペプチドの両方を認識することができる、請求項６に記載のキット。The kit according to claim 6, wherein the monoclonal antibody can recognize both a denatured HSD3B2 polypeptide and a native HSD3B2 polypeptide. さらにヒトHSD3B1を特異的に認識する抗体を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載のキット。 Furthermore, the kit of any one of Claims 6-8 containing the antibody which recognizes human HSD3B1 specifically. ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、サンドイッチ測定法、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット、免疫ブロット分析法または免疫組織化学染色方法で測定することを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 6 to 9, which is measured by ELISA, RIA, sandwich measurement method, Western blot on polyacrylamide gel, immunoblot analysis method or immunohistochemical staining method. ヒトHSD3B1及び／又はヒトHSD3B2の発現量もしくは発現パターンに基づきAFRとIHAを鑑別する方法。 A method for differentiating AFR and IHA based on the expression level or expression pattern of human HSD3B1 and / or human HSD3B2.
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