JP6345423B2 - 1色覚および他の疾患の治療のためのプロモーター、発現カセット、ベクター、キット、ならびに方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国仮出願第61/430,710号(2011年1月7日出願)の出願日の利益を主張するものであり、その全記載内容は参照により本明細書中に組み込まれるものとする。
1色覚(achromatopsia)は色覚障害であり、典型的には先天性常染色体劣性障害である。この障害は部分的なもの、または完全なものでありうる。Pang, J.-J.ら(2010). Achromatopsia as a Potential Candidate for Gene Therapy. In Advances in Experimental Medicine and Biology, Volume 664, Part 6, 639-646 (2010)(以下、Pangら)(非特許文献1)を参照されたい。1色覚の症状としては、視力低下、色識別障害(achromatopia)(色知覚の欠如)、昼盲(明るい光の嫌悪または回避を意味する羞明(photoaversion)を伴う、明所での視覚能力低下)、眼球振盪(制御できない眼の振動運動)、虹彩機能異常、および立体視障害(ある場面の三次元的側面を知覚できないこと)が挙げられる。
ある態様では、本発明は、約1.8 kbのCNGB3遺伝子の5’-NTRを含む単離されたプロモーターを提供する。例示的な実施形態では、該プロモーターは配列番号1として記載された配列を含む。
I. 概要および定義
他に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に普通に理解される意味を有するものとする。次の文献は、本発明中で使用する用語のうちの多くの一般的な定義を当業者に提供するものである:Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988);The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Riegerら(eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書中で使用する場合、以下の用語は、他に明記しない限りは後述の意味を有するものとする。
本発明は、網膜の錐体細胞に影響を及ぼす遺伝病の治療に使用しうるプロモーター、発現カセット、ベクター、キット、および方法を提供する。網膜の錐体細胞に影響を及ぼす遺伝病としては、1色覚;レーバー先天性黒内障;錐体-杆体ジストロフィー;X連鎖性網膜色素変性症を含む網膜色素変性症;黄斑症;および加齢黄斑変性が挙げられる。好適な実施形態では、該疾患は1色覚である。
hnson S,ら Achromatopsia caused by novel mutations in both CNGA3 and CNGB3. J. Med. Genet. 41 (2):e20. (2004)., Peng C,ら Achromatopsia-associated mutation in the human cone photoreceptor cyclic nucleotide-gated channel CNGB3 subunit alters the ligand sensitivity and pore properties of heteromeric channels. J. Biol. Chem. 278 (36):34533-40 (2003)., Bright SR,ら Disease-associated mutations in CNGB3 produce gain of function alterations in cone cyclic nucleotide-gated channels. Mol. Vis. 11:1141-50 (2005)., Kohl S,ら CNGB3 mutations account for 50% of all cases with autosomal recessive achromatopsia. Eur. J. Hum. Genet. 13 (3):302-8 (2005)., Rojas CV,ら A frameshift insertion in the cone cyclic nucleotide gated cation channel causes complete achromatopsia in a consanguineous family from a rural isolate. Eur. J. Hum. Genet. 10 (10):638-42 (2002)., Kohl S,ら Mutations in the CNGB3 gene encoding the beta-subunit of the cone photoreceptor cGMP-gated channel are responsible for achromatopsia(ACHM3) linked to chromosome 8q21. Hum. Mol. Genet. 9 (14):2107-16 (2000)., Sundin OH,ら Genetic basis of total colourblindness among the Pingelapese islanders. Nat. Genet. 25 (3):289-93 (2000)に報告されている。GNAT2として知られる錐体細胞トランスデューシンの遺伝子における配列変化もまた1色覚を引き起こす場合がある。Kohl S,ら、Mutations in the cone photoreceptor G-protein alpha-subunit gene GNAT2 in patients with achromatopsia. Kokl S,ら Mutations in the cone photoreceptor G-protein alpha-subunit gene GNAT2 in patients with achromatopsia. Am J Hum Genet 71 (2):422-425 (2002) (以下、Kohlら)を参照されたい。これらのタンパク質における突然変異の程度は1色覚表現型の重症度と相関している。http://en.wikipedia.org/wiki/Achromatopsia。CNGB3における突然変異は1色覚の症例の約50%を占める。Kohlら。CNGA3における突然変異は症例の約23%を占め、またGNAT2における突然変異は症例の約2%を占める。
本発明のプロモーター、CNGB3核酸、調節エレメント、および発現カセット、およびベクターは、当分野で公知の方法を利用して生産できる。以下に記載した方法は、かかる方法の非限定的な例として提供したものである。
本発明は単離されたプロモーターを提供する。幾つかの態様では、これらのプロモーターはCNGB3遺伝子の5’-NTRのセグメントを含む。関連する態様では、これらのプロモーターはCNGB3遺伝子の5’-NTRのセグメントを他の遺伝子に由来する1つ以上のエンハンサー配列と共に含む。
別の態様では、本発明は、(a)本発明のプロモーター;(b)CNGB3核酸、CNGA3核酸、およびGNAT2核酸からなる群より選択される核酸;ならびに(c)最小調節エレメント、を含む導入遺伝子発現カセットを提供する。本発明のプロモーターとしては、上記で検討したプロモーターが挙げられる。
本発明は、前節で検討した発現カセットのうちのいずれか1つを含むベクターもまた提供する。幾つかの実施形態では、該ベクターは前記発現カセットの配列を含むオリゴヌクレオチドである。具体的な実施形態では、該オリゴヌクレオチドの送達を、in vivoエレクトロポレーション(例えば、Chalberg, TW,ら phiC31 integrase confers genomic integration and long-term transgene expression in rat retina. Investigative Ophthalmology &Visual Science, 46, 2140-2146 (2005)(以下、Chalbergら、2005)を参照されたい)または電子雪崩法によるトランスフェクション(例えば、Chalberg, TW,ら Gene transfer to rabbit retina with electron avalanche transfection. Investigative Ophthalmology &Visual Science, 47, 4083-4090 (2006)(以下、Chalbergら、2006)を参照されたい)により達成してもよい。さらなる実施形態では、前記ベクターは、DNA凝集ペプチド(DNA-compacting peptide)(例えば、Farjo, R,ら Efficient non-viral ocular gene transfer with compacted DNA nanoparticles. PLoS ONE, 1, e38 (2006)(以下、Farjoら、2006)(この文献中では、ポリエチレングリコールに結合するシステイン残基とそれに続く30個のリジンを含有するペプチドであるCK30を、光受容器への遺伝子導入のために使用している)を参照されたい)、細胞透過特性を持つペプチド(Johnson, LN,ら、Cell-penetrating peptide for enhanced delivery of nucleic acids and drugs to ocular tissues including retina and cornea. Molecular Therapy, 16(1), 107-114 (2007)(以下、Johnsonら、2007)、Barnett, EM,ら Selective cell uptake of modified Tat peptide-fluorophore conjugates in rat retina in ex vivo and in vivo models. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 47, 2589-2595 (2006)(以下、Barnettら、2006)、Cashman, SM,ら Evidence of protein transduction but not intercellular transport by protein fused to HIV tat in retina cell culture and in vivo. Molecular Therapy, 8, 130-142 (2003)(以下、Cashmanら、2003)、Schorderet, DF,ら D-TAT transporter as an ocular peptide delivery system. Clinical and Experimental Ophthalmology, 33, 628-635 (2005)(以下、Schorderetら、2005)、眼の細胞へのペプチド送達の具体例についてはKretz, A,ら HSV-1 VP22 augments adenoviral gene transfer to CNS neurons in the retina and striatum in vivo. Molecular Therapy, 7, 659-669 (2003)(以下、Kretzら 2003)を参照されたい)、またはDNAを封入したリポプレックス、ポリプレックス、リポソーム、もしくはイムノリポソーム(例えば、Zhang, Y,ら Organ-specific gene expression in the rhesus monkey eye following intravenous nonviral gene transfer. Molecular Vision, 9, 465-472 (2003)(以下、Zhangら 2003)、Zhu, C,ら Widespread expression of an exogenous gene in the eye after intravenous administration. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 43, 3075-3080 (2002)(以下、Zhuら 2002)、Zhu, C.,ら Organ-specific expression of the lacZ gene controlled by the opsin promoter after intravenous gene administration in adult mice. Journal of Gene Medicine, 6, 906-912. (2004)(以下、Zhuら 2004)を参照されたい)である。
本発明の核酸分子(例えば、プロモーター、CNGB3核酸、CNGA3核酸、GNAT2核酸、または調節エレメントを含む)は、標準的な分子生物学的技術を利用して単離することができる。目的とする核酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用すれば、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術(例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F.,およびManiatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd,ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載されている技術)を利用して核酸分子を単離することができる。
治療の方法
本発明は、網膜錐体細胞に影響を及ぼす遺伝子の突然変異、置換、または欠失に関連する疾患を治療するための方法を提供し、ここで該方法は、かかる治療を必要とする対象に本発明のプロモーターのうちの1つを含むベクターを投与し、それによって該対象を治療することを含むものとする。ある実施形態では、該疾患は網膜色素上皮(PRE)に影響を及ぼす。具体的な実施形態では、該疾患は1色覚である。網膜錐体細胞に影響を及ぼす遺伝子の突然変異、置換、または欠失に関連する他の疾患としては、1色覚、レーバー先天性黒内障、錐体-杆体ジストロフィー、黄斑症、加齢黄斑変性、およびX連鎖性網膜色素変性症を含む網膜色素変性症が挙げられる。
本発明はキットも提供する。ある態様では、本発明のキットは、(a)本発明のプロモーターのうちのいずれか1つを含むベクターおよび(b)その使用のための説明書を含む。別の態様では、本発明のキットは、(a)本発明のベクターのうちのいずれか1つ、および(b)その使用のための説明書を含む。本発明のプロモーターおよびベクターについては上に記載した。幾つかの実施形態では、本発明のベクターは、上に記載したような非ウイルスベクターまたはウイルスベクターを含む、当分野で公知のあらゆるタイプのベクターであってもよい。好適な実施形態では、該ベクターはウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニア/ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV))に由来するベクターである。最も好適な実施形態では、該ベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを作製する方法であって、アデノ随伴ウイルスベクターに、本発明のプロモーター(上に記載したもの)のうちのいずれか1つならびにCNGB3核酸、CNGA3核酸、およびGNAT2核酸からなる群より選択される核酸(同じく上に記載したもの)を挿入することを含む上記方法もまた提供する。幾つかの実施形態では、該核酸はヒト核酸、すなわち、ヒトCNGB3、CNGAもしくはGNAT遺伝子に由来する核酸、またはその機能的変異体である。代替的実施形態では、該核酸は非ヒト遺伝子由来の核酸である。
AAVベクターは、初めはアデノウイルス調製物の混入物質とみなされていたためにその名を持つアデノ随伴ウイルスに由来する。AAVベクターは他のタイプのベクターに比べて数多くの周知の利点を提示する:野生型株は疾患の所見または副作用を呈することなくヒトおよび非ヒト霊長類動物に感染する;AAVカプシドは、ウイルスの精製および濃縮の厳密な方法を可能にする高い化学的および物理的安定性と併せて非常に低い免疫原性を示す;AAVベクターによる形質導入は有糸***後の非***細胞における持続的な導入遺伝子発現を導き、かつ長期に渡る機能獲得を実現する;またAAVのサブタイプおよび変異株の多様性は、選択した組織および細胞型を標的化する可能性を提示する。Heilbronn R & Weger S, Viral Vectors for Gene Transfer:Current Status of Gene Therapeutics, in M. Schafer-Korting (ed.), Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology, 197:143-170 (2010) (以下、Heilbronn)。AAVベクターの主要な制限は、AAVが一本鎖DNAを含有する従来のベクターに限られた導入遺伝子容量(<4.9 kb)しか与えないということである。
本発明のrAAVベクターの生産、精製、および特徴付けは、当分野で公知の多くの方法のいずれかを利用して実施することができる。実験室規模の生産方法の概観については、例えば、Clark RK, Recent advances in recombinant adeno-associated virus vector production. Kidney Int. 61s:9-15 (2002);Choi VWら、Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Current Protocols in Molecular Biology 16.25.1-16.25.24 (2007)(以下、Choiら);Grieger JC & Samulski RJ, Adeno-associated virus as a gene therapy vector:Vector development, production, and clinical applications. Adv Biochem Engin/Biotechnol 99:119-145 (2005)(以下、Grieger & Samulski);Heilbronn R & Weger S, Viral Vectors for Gene Transfer:Current Status of Gene Therapeutics, in M. Schafer-Korting (ed.), Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology, 197:143-170 (2010)(以下、Heilbronn);Howarth JLら、Using viral vectors as gene transfer tools. Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010)(以下、Howarth)を参照されたい。以下に記載した生産方法は、非限定的な例を意図したものである。
以前の研究者達は、青錐体1色型色覚者において見出される6つの異なる欠失の位置に基づいて末端切断型ヒト赤/緑錐体オプシンプロモーターを作出した(0.6〜55 kb)。Wang, Y.,ら A locus control region adjacent to the human red and green pigment genes. Neuron 9:429-440 (1992);Nathans, J., ら Molecular genetics of human blue cone monochromacy. Science 245:831-838 (1989);Shaaban, S.ら Functional analysis of the promoters of the human red and green visual pigment genes;Integrative Opthalmology & Visual Science:39(6):885-896 (1998)。この末端切断型赤/緑オプシンプロモーターを図1に示す。
前記PR2.1プロモーターを、PR2.1の5’末端からの末端切断を行うことにより短縮した。PR2.1の500 bpのコアプロモーターおよび600 bpの遺伝子座調節領域(LCR)は無傷のまま残した。該PR2.1プロモーターの3つの短縮バージョン:PR1.7、PR1.5、およびPR1.1を作出した。これらはそれぞれ、PR2.1をその5’末端で約300 bp、500 bp、および1,100 bp切断することにより作出した。CMVエンハンサーを該PR1.1の5’末端に付加することによりハイブリッドプロモーターを作出した。これらのプロモーターの各々を含有するプロウイルスプラスミドを、図3に示す通りに作出した。これらのプロウイルスプラスミド(p)は、AAV末端反復配列(TR)、合成プロモーター(PR2.1-syn)またはその末端切断物、場合によってはCMVエンハンサー(CMVenh)、および緑色蛍光タンパク質(GFP)導入遺伝子を含有していた。次の4つのプロウイルスプラスミド:
(1) pTR-PR2.1syn-GFP
(2) pTR-PR1.8-GFP
(3) pTR-PR1.6-GFP
(4) pTR-CMVenh-PR1.1-GFP
を構築し、その配列を決定した。
1) PR right-Hind:
5’-GATTTAAGCTTGCGGCCGCGGGTACAATTCCGCAGCTTTTAGAG-3’;
2) PR1.1 Left-Hind:5’-CTGCAAGCTTGTGGGACCACAAATCAG-3’;
3) PR1.5 Left-Acc65I:5’- TAGCGGTACCAGCCATCGGCTGTTAG-3’;および
4) PR1.7 left-Acc65I:5’-GTGGGTACCGGAGGCTGAGGGGTG-3’
を設計した。プライマーPR right-Hindを他の3つのプライマーと組み合わせることにより、PR1.1、PR1.5、およびPR1.7をそれぞれPCR増幅した。Pfu Ultra HSポリメラーゼミックスを使用し、熱サイクルは、95℃で5分、その後は94℃で1分、58℃で45秒、および72℃で2分を35サイクルとした。
全4種のプラスミドのDNA配列決定および制限酵素マッピングにより、これらのプロウイルスプラスミドの配列およびTRが正確であることを確認した。
これらの実験では、全3種類の錐体光受容器におけるhCNGB3発現を可能にすることを目標として、新規の天然およびハイブリッドhCNGB3プロモーターを作出した。1対のオリゴヌクレオチドプライマーを、参照hCNGB3遺伝子配列(GenBankアクセッション番号NG_016980)を基に、hCNGB3オープンリーディングフレーム(ORF)の開始コドン(ATG)のすぐ5’側にある1913 bpのDNA断片のPCR増幅のために設計した。CNGB3遺伝子の5’非翻訳領域(NTR)は天然のCNGB3プロモーターを含有していた。使用したプライマー配列は:pCNGB3-NTR F:5’-CAGACTAGCCAGAATCACAGATC-3’およびpCNGB3-NTR R:5’-TCTCCTATAGGCTTCACCTTGTTG-3’であった。0.25μgまたは0.5μgのヒトゲノムDNA(Promega、カタログ番号G1471、ロット番号305017)をDNA鋳型として使用し、2X Pfu Ultra HS Mix(Agilent Technologies、カタログ番号600850)を使用してPCR増幅を実施した。増幅パラメータは、95℃で5分、その後は94℃で1分、55℃で45秒、および72℃で2分を35サイクルとした。増幅した1913 bpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動により精製した後、hCNGB3遺伝子の短縮5’-NTR配列を作成するためにPCR増幅用の鋳型DNAとして使用した。2セットのオリゴヌクレオチドプライマーを、それぞれ1800 bpおよび1600 bpの5’-NTR配列を増幅するために設計した。1,800 bpの5’-NTRを増幅するために使用したプライマーセットの配列は、pCNGB3-NTF F238 Acc65I:5’-GTTGGGTACCAGCCGCCATCAGGAATAAAC-3’、およびpCNGB-NTR R SacII:5’-TCTCCGCGGTGGTTCTGAAAACCCTC-3’であった。1,600 bpの5’-NTRを増幅するために使用したプライマーセットの配列は、pCNGB3-NTR F431 Acc65I:5’-CATCTTGGTACCACATTCTCTTACAGAGC-3’、およびpCNGB3-NTR R XhoI:5’-ATCTTCTCGAGGGTGGTTCTGAAAACCCTC-3’であった。短縮5’-NTR配列は2X Pfu Ultra HS Mix(Agilent Technologies、カタログ番号600850)を使用してPCRにより増幅し、PCR増幅パラメータは、95℃で5分、その後は94℃で1分、54℃で45秒、および72℃で2分を35サイクルとした。
以下の実験により、天然のCNGB3非翻訳領域から得た錐体特異的プロモーターの、マウスの網膜細胞におけるGFP発現の駆動に対するin vivo有効性を実証した。
当業者であれば、通常の実験程度の実験を利用して、本明細書中に記載した本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる等価物は添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。
Claims (22)
- 配列番号1の配列からなる、単離されたプロモーター。
- 配列番号2の配列からなる、単離されたプロモーター。
- 400 bpのサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー、および
1.4 kbのCNGB3遺伝子の5’-NTR
からなる単離されたプロモーターであって、サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーが配列番号3の配列からなり、CNGB3遺伝子の5’-NTRが配列番号4の配列からなる、上記プロモーター。 - 前記CNGB3遺伝子がヒトCNGB3遺伝子である、請求項1〜3のいずれか1項記載のプロモーター。
- (a) 請求項1〜3のいずれか1項記載のプロモーター;
(b) CNGB3核酸、CNGA3核酸、およびGNAT2核酸からなる群より選択される核酸;ならびに
(c) 最小調節エレメント
を含む導入遺伝子発現カセット。 - (a) 請求項1または2記載のプロモーター、
(b) CNGB3核酸、および
(c) 最小調節エレメント
を含む導入遺伝子発現カセット。 - 前記核酸がヒト核酸である、請求項5または6記載の発現カセット。
- 請求項5〜7のいずれか1項記載の発現カセットを含む核酸ベクター。
- 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項8記載のベクター。
- 前記AAVベクターのカプシド配列の血清型およびITRの血清型が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびAAV12からなる群より独立して選択される、請求項9記載のベクター。
- 前記カプシド配列が変異カプシド配列である、請求項10記載のベクター。
- 網膜錐体細胞に影響を及ぼす遺伝子の突然変異、置換、または欠失に関連する疾患を治療するための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか1項記載のプロモーターを含むベクターの使用であって、上記治療が、かかる治療を必要とする対象に上記医薬を投与することを含む、上記使用。
- 前記疾患が1色覚である。請求項12記載の使用。
- 1色覚を治療するための医薬の製造における、請求項8〜11のいずれか1項記載のベクターの使用であって、上記治療が、かかる治療を必要とする対象に上記医薬を投与することを含む、上記使用。
- 前記ベクターを網膜下に投与する、請求項12〜14のいずれか1項記載の使用。
- 前記疾患が網膜色素上皮(RPE)に影響を及ぼすものである、請求項12記載の使用。
- (a) 請求項1〜3のいずれか1項記載のプロモーターを含むベクター、および
(b) その使用のための説明書
を含むキット。 - (a) 請求項8〜11のいずれか1項記載の核酸ベクター、および
(b) その使用のための説明書
を含むキット。 - 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを作製する方法であって、アデノ随伴ウイルスベクターに、請求項1〜4のいずれか1項記載のプロモーターならびにCNGB3核酸、CNGA3核酸、およびGNAT2核酸からなる群より選択される核酸を挿入することを含む、上記方法。
- 前記核酸がヒト核酸である、請求項19記載の方法。
- 前記AAVベクターのカプシド配列の血清型およびITRの血清型が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびAAV12からなる群より独立して選択される、請求項19または請求項20記載の方法。
- 前記カプシド配列が変異カプシド配列である、請求項21記載の方法。
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