JP6319515B2 - タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてBXL1遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養することを含む、トリコデルマ属真菌によるタンパク質の製造方法。
(2)前記誘導剤を5重量%(wt/wt)以上培地に添加して培養する、(1)に記載の方法。
(3)前記誘導剤に含まれるキシランの含有量が15〜40重量%である(1)または(2)に記載の方法。
(4)前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、(1)から(3)のいずれかに記載の方法。
(5)前記トリコデルマ・リーセイがカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、(4)に記載の方法。
(6)前記タンパク質がセルラーゼ組成物である(1)から(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼ比活性がp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質1mg当たり0.006U/mg protein以下、セロビオヒドロラーゼ比活性がp−ニトロフェニル−β−D−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質1mg当たり0.1U/mg protein以上、β-グルコシダーゼ比活性がp−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質1mg当たり0.25U/mg protein以上である(6)に記載の方法。
(8)前記β−キシロシダーゼ比活性が0.002U/mg protein以下、前記β-グルコシダーゼ比活性が0.3U/mg protein以上である(7)記載の方法。
(9)(6)〜(8)のいずれか1項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖の製造方法。
(10)(6)〜(8)のいずれか1項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖とグルコースの製造方法。
(11)セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてトリコデルマ属真菌を培養する際の溶存酸素飽和度の減少を抑制する方法であって、前記トリコデルマ属真菌として、BXL1遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いる、溶存酸素飽和度の減少抑制方法。
DO値の測定には市販のDO計を使用することができる。使用するDO計には特に制限はなく、DO値を正確に測定できるものであれば良い。例として、密閉型DO電極(エイブル株式会社)や溶存酸素センサ(メトラー・トレド株式会社)などが挙げられる。DO計は予め0点校正とスパン校正を行っておく。0点校正は亜硫酸ソーダ2%溶液を使用して行う。スパン校正は実際に培養する条件において菌体が存在しない状態で通気、攪拌を行い、溶存酸素が飽和になるまで待ち、その後計器の指示値が安定していることを確認し、その温度での飽和溶存酸素に合わせて校正を行う。また、培養槽を加圧してDO測定を行う際は、圧補正を行う必要がある。さらに、培養槽が大きい場合は静水圧補正を行う必要がある。補正を行う際の計算式は以下である。
D=DO(1+α+β)・・・(式2)
D:補正した飽和溶存酸素
DO:1気圧、純水中での飽和溶存酸素
α:ゲージ圧(kg/cm2)
β:静水圧(DO計取り付け位置の液深(m)/10)
溶存酸素飽和度(%)=(培養中の溶存酸素)/(培養開始前の飽和溶存酸素)×100・・・(式3)。
市販のタンパク質濃度測定試薬(Quick Start Bradfordプロテインアッセイ、Bio−Rad製)を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬250μLに希釈した糸状菌由来セルラーゼ溶液を5μL添加し、室温で5分間静置後の595nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてBSAを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。
1mMp-ニトロフェニル-β-キシロピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは 1mMp-ニトロフェニル-β-キシロピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。この際に405nmの吸光度が1を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はp−ニトロフェノール溶液を濃度0.1mM、0.2mM、1mM、2mMになるように調製し、酵素希釈液の代わりに10μLを入れ、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。
1mMp-ニトロフェニル-β-グルコピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加して30℃で10分間反応させた。その後2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは 1mMp-ニトロフェニル-β-グルコピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。この際に405nmの吸光度が1を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はp−ニトロフェノール溶液を濃度0.1mM、0.2mM、1mM、2mMになるように調製し、酵素希釈液の代わりに10μLを入れ、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。
1mMp-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加し30℃で60分間反応させた。その後、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは 1mMp-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。この際に405nmの吸光度が1を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はp−ニトロフェノール溶液を濃度0.1mM、0.2mM、1mM、2mMになるように調製し、酵素希釈液の代わりに10μLを入れ、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。
0.5mMp-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシド(社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μLに酵素希釈液10μLを添加し50℃で30分間反応させた。その後、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp-ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは 1mMp-ニトロフェニル-β-キシロビオシドを含有する50mM酢酸バッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。この際に405nmの吸光度が1を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はp−ニトロフェノール溶液を濃度0.1mM、0.2mM、1mM、2mMになるように調製し、酵素希釈液の代わりに10μLを入れ、2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。
キシロオリゴ糖、グルコース、キシロースは、日立高速液体クロマトグラフ LaChrom Eite(HITACHI)を用いて、以下の条件で定量分析した。
カラム:KS802、KS803(Shodex)
移動相:水
検出方法:RI
流速:0.5mL/min
温度:75℃
PC−3−7株のBXL1遺伝子のORF領域を、アセトアミドダーゼ(AmdS)遺伝子で置換することによって、PC−3−7/△BXL1株を作製し、BXL1遺伝子が破壊された株として以下の実験に用いた。すなわち、AmdS遺伝子を含むDNA配列の上流及び下流に、BXL1遺伝子座の導入目的箇所に相同的な部分を付加するように破壊用プラスミドを作製し、デザインしたプライマー(配列番号1、配列番号2)を用いて相同領域を含んだAmdS遺伝子をPCRで増幅させ、得られたPCR断片をPC−3−7株に形質転換した。形質転換は、標準的な方法であるプロトプラスト-PEG法で行った。より具体的には、相同組み換え及び形質転換はGene,61,165−176(1987)に記載されたようにして行った。
前培養
トリコデルマ・リーセイ PC−3−7株の胞子を1.0×107/mLになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液2.5mLを1Lバッフル付フラスコに入れた表1に記した組成で構成される前培養液250mLへ接種させた。接種させた前培養液を28℃、160rpmの培養条件にて3日間培養を行った。この際の培養液当たりの乾燥菌体量を測定したところ、11mg/mLであった。
**マンデルスは、7g/L (NH4)2SO4、10g/L KH2PO4、3g/L CaCl2、3g/L MgSO4・7H2Oを含む。
トリコデルマ・リーセイ PC−3−7株の前培養液10mLをそれぞれ200mL容ミニジャーに入れた表2に示した本培養液100mL(バイオマス10gをさらに含む)へ接種させ、28℃、700rpm、1vvm、pH5の培養条件にて5日間培養を行った。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、8重量%(wt/wt)であった。中和は3.3%アンモニアと0.2N硫酸を使用した。使用したバイオマスは、セルロースとキシランを含むArbocel(登録商標)(J.Rettenmaier&Sohne)を使用した。DO計は密閉型溶存酸素電極SDOC−12F−L120(エイブル株式会社)を使用した。また、培養槽の加圧は行わなかった。
**マンデルスは、7g/L (NH4)2SO4、10g/L KH2PO4、3g/L CaCl2、3g/L MgSO4・7H2Oを含む。
***バイオマスは他成分を混合し、メスアップした後に添加する。
培養開始より1日おきに500μLずつ培養液を採取した。そして、15,000×g、4℃の条件下で10分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を0.22μmのフィルターでろ過し、そのろ液を培養上清液とし、タンパク質濃度を測定した。酵素活性測定には培養5日目の培養上清液を使用した(表3)。
培養開始24時間後に酸素供給を停止し、培養液の溶存酸素量の値(DO値)の経時変化を10秒ごとに測定し、プロットした。プロットした曲線の中で対数的に減少している3点以上のプロットの傾きを求め、その傾きから酸素利用速度を求めた(表4)。
使用株を実施例1で作製したトリコデルマ・リーセイ PC−3−7/△BXL1株にする以外は比較例1と同様にして、酵素活性(表3)、酸素利用速度(表4)を求めた。また、その際の前培養液当たりの乾燥菌体量を測定した結果、11mg/mLであり、親株(PC−3−7株)と同じであった。活性測定の結果、親株(PC−3−7株)と比較してβ-キシロシダーゼ活性が100分の1以下に低下し、β-グルコシダーゼ活性が増加していることが判明した。さらに、酸素利用速度は比較例1の親株の結果と比較して実施例2のPC−3−7/△BXL1株では半分以下の36%に低下していることが判明した。なお、誘導剤として用いたバイオマスは、Arbocel(商品名)であり、セルロース含有量が約80重量%、キシラン含有量が約20重量%である。
誘導剤として、beech wood xylan(シグマアルドリッチ社製)を使用し、使用株をトリコデルマ・リーセイ PC−3−7/△BXL1株にする以外は比較例1と同様にして、酸素利用速度(表4)を求めた。その結果、キシランを誘導剤として使用した場合には、親株(PC−3−7株)の培養結果(比較例2)と比較すると、比較例3の酸素利用速度は、親株の296%に増加した。
誘導剤として、微結晶セルロースであるCellulose microcrystalline(Merck社製)を使用すること以外は比較例1と同様にして、酸素利用速度を算出した(表4)。
誘導剤として、Cellulose microcrystalline(Merck社製)を使用し、使用株をトリコデルマ・リーセイ PC−3−7/△BXL1株にする以外は比較例1と同様にして、酸素利用速度(表4)を求めた。その結果、セルロースを誘導剤として使用した場合には、親株(PC−3−7株)の培養結果(比較例4)と比較すると、比較例5の酸素利用速度は、親株の73%に低下した。
本培養液100mLに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるCellulose microcrystalline(Merck社製)を8.5g、beech wood xylan(シグマアルドリッチ社製)を1.5g使用すること以外は比較例1と同様にして、酸素利用速度を算出した(表5)。その結果、キシラン含有量が15重量%の誘導剤を使用した場合には、キシラン単独(比較例2)、またはセルロース単独(比較例4)の誘導剤を使用した場合と比較して、酸素利用速度は大幅に増加していることがわかった。
本培養液100mLに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるCellulose microcrystalline(Merck社製)を8.5g、beech wood xylan(シグマアルドリッチ社製)を1.5g使用すること以外は比較例1と同様にして、酸素利用速度を算出した(表5)。その結果、キシラン含有量が15重量%の誘導剤を使用した場合には、親株(PC−3−7株)の培養結果(比較例6)と比較すると、実施例3の酸素利用速度は、親株の56%に低下した。
本培養液100mLに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるCellulose microcrystalline(Merck社製)を7g、beech wood xylan(シグマアルドリッチ社製)を3g使用すること以外は比較例1と同様にして、酸素利用速度を算出した(表5)。その結果、キシラン含有量が30重量%の誘導剤を使用した場合には、キシラン単独(比較例2)、またはセルロース単独(比較例4)の誘導剤を使用した場合と比較して、酸素利用速度は大幅に増加していることがわかった。
本培養液100mLに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるCellulose microcrystalline(Merck社製)を7g、beech wood xylan(シグマアルドリッチ社製)を3g使用すること以外は比較例1と同様にして、酸素利用速度を算出した(表5)。その結果、キシラン含有量が30重量%の誘導剤を使用した場合には、親株(PC−3−7株)の培養結果(比較例7)と比較すると、実施例4の酸素利用速度は、親株の55%に低下した。
本培養液100mLに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるCellulose microcrystalline(Merck社製)を6g、beech wood xylan(シグマアルドリッチ社製)を4g使用すること以外は比較例1と同様にして、酸素利用速度を算出した(表6)。その結果、キシラン含有量が30重量%の誘導剤を使用した場合には、キシラン単独(比較例2)、またはセルロース単独(比較例4)の誘導剤を使用した場合と比較して、酸素利用速度は大幅に増加していることがわかった。
本培養液100mLに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるCellulose microcrystalline(Merck社製)を6g、beech wood xylan(シグマアルドリッチ社製)を4g使用すること以外は比較例1と同様にして、酸素利用速度を算出した(表6)。その結果、キシラン含有量が40重量%の誘導剤を使用した場合には、親株(PC−3−7株)の培養結果(比較例8)と比較すると、実施例5の酸素利用速度は、親株の85%に低下した。
200mL容のジャーで酸素利用速度が減少するという効果が確認されたため、より大きい5Lスケールで培養し、全培養期間でのDO値推移を測定することにした。前培養は比較例1と同様にして行った。本培養はトリコデルマ・リーセイ PC−3−7株の前培養液250mLをそれぞれ5L容ミニジャーに入れた表2に示した本培養液2.5Lへ接種させ、28℃、700rpm、1vvm、pH5の培養条件にて5日間培養を行った。中和は10%アンモニアと1N硫酸を使用した。誘導剤であるセルロースとキシランを含むバイオマスとして、Arbocel(登録商標)(J.Rettenmaier&Sohne)を使用した。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、8重量%(wt/wt)であった。培養開始後、溶存酸素飽和度の推移を培養終了後まで測定し(図1)、最低飽和度を算出した(表6)。また、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表6)。DO計は密閉型溶存酸素電極SDOC−12F−L260(エイブル株式会社)を使用した。また、培養槽の加圧は行わなかった。
使用株をトリコデルマ・リーセイ PC−3−7/△BXL1株にする以外は比較例9と同様にして、全培養期間の溶存酸素飽和度推移を測定し(図2)、最低飽和度を算出し(表6)、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表6)。その際、前培養の菌体量は比較例9と同じであった。その結果、比較例9の親株(PC−3−7)の培養結果と比較して実施例6のBXL1遺伝子破壊株では酸素要求性が低下して、最低飽和度が顕著に増加した。また、タンパク質濃度に関しても比較例9よりも12%増加していた。
本培養培地を表7の組成にすること以外は比較例9と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表6)。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、2重量%(wt/wt)であった。
**マンデルスは、7g/L (NH4)2SO4、10g/L KH2PO4、3g/L CaCl2、3g/L MgSO4・7H2Oを含む。
***バイオマスは他成分を混合し、メスアップした後に添加する。
使用株をトリコデルマ・リーセイ PC−3−7/△BXL1株にする以外は比較例10と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表6)。比較例10の結果と比較すると、誘導剤2%の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも1%増加することが判明した。
本培養培地に添加するバイオマスを培地1Lに対して46gに変更し、その他成分は表7の組成にし、比較例9と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表8)。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、4重量%(wt/wt)であった。
使用株をトリコデルマ・リーセイ PC−3−7/△BXL1株にする以外は比較例11と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表8)。さらに、活性を測定した(表10)。比較例11の結果と比較すると、誘導剤4%の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも1%増加することが判明した。
本培養培地に添加するバイオマスを培地1Lに対して58gに変更し、その他成分は表7の組成にし、比較例9と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表8)。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、5重量%(wt/wt)であった。
使用株をトリコデルマ・リーセイ PC−3−7/△BXL1株にする以外は比較例12と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表8)。さらに、活性を測定した(表10)。比較例12の結果と比較すると、誘導剤5%の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも8%増加することが判明した。
本培養培地に添加するバイオマスを培地1Lに対して70gに変更し、その他成分は表7の組成にし、比較例9と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表9)。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、6重量%(wt/wt)であった。
使用株をトリコデルマ・リーセイ PC−3−7/△BXL1株にする以外は比較例13と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表9)。さらに、活性を測定した(表10)。比較例13の結果と比較すると、誘導剤6%の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも10%増加することが判明した。
本培養培地に添加するバイオマスを培地1Lに対して83gに変更し、その他成分は表7の組成にし、比較例9と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表9)。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、7重量%(wt/wt)であった。
使用株をトリコデルマ・リーセイ PC−3−7/△BXL1株にする以外は比較例14と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始4日後のタンパク質濃度を測定した(表9)。さらに、活性を測定した(表10)。比較例14の結果と比較すると、誘導剤7%の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも11%増加することが判明した。
比較例9で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は糖化反応に使用した。糖化反応に使用したバガスはアルカリ処理(前処理)を行ったバガスを使用した。糖化反応は以下のようにして行った。2mLチューブの中にアルカリ処理をしたバガスを乾燥重量50mg分入れ、バガスの固形分濃度が反応開始時に5重量%となるように純水を加えつつ、希塩酸を用いてpH5.0に調整した。pHを調製した前処理物に8mg/g−バイオマスになるようにセルラーゼ組成物(タンパク質)を添加して、ヒートブロックローテーターを用いてpH5.0、50℃の反応条件で反応を開始した。反応中は適宜pH5になるように調整を行った。8時間後に99度の湯浴に5分間浸けて反応を停止した。反応液は8,000×gの条件下で5分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を0.22μmのフィルターでろ過し、そのろ液を参考例5に従いキシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した。キシロオリゴ糖の結果を表11に、グルコースの結果を表12に示す。
実施例6で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例15と同様にして行い、キシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した(表11、表12)。その結果、親株(PC−3−7)と比較してBXL1破壊株ではキシロオリゴ糖の収量が顕著に増加していることが判明した。さらに、グルコースの収量も親株と比較して増加していることが判明した。
比較例6で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例15と同様にして行い、グルコースの分析に供した(表13)。
実施例3で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例15と同様にして行い、グルコースの分析に供した(表13)。
比較例7で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例15と同様にして行い、グルコースの分析に供した(表13)。
実施例4で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例15と同様にして行い、グルコースの分析に供した(表13)。
比較例8で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例15と同様にして行い、グルコースの分析に供した(表14)。
実施例5で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例15と同様にして行い、グルコースの分析に供した(表14)。
比較例3で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。培養開始4日後の培養液は遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は活性、タンパク質濃度を測定し(表16)、糖化反応に使用した。糖化反応はセルラーゼ組成物(タンパク質)の添加量を2mg/g−バイオマスにすることと、反応時間を24時間にすること以外は比較例15と同様にして行い、キシロオリゴ糖の分析に供した(表15)。
比較例5で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は糖化反応に使用した。糖化反応は比較例19と同様にして行い、キシロオリゴ糖の分析に供した(表15)。
実施例2で得られた培養開始4日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は活性、タンパク質濃度を測定し(表16)、その後糖化反応に使用した。糖化反応は比較例19と同様にして行い、キシロオリゴ糖の分析に供した(表15)。その結果、セルロースとキシランを誘導剤として添加した培養液が最もキシロオリゴ糖の収率が高くなった。二番目に収率が高かったのは、キシランを誘導剤とした場合であった。しかし、キシロース/(キシロース+キシロオリゴ糖)の割合がセルロースとキシランを誘導剤にした場合の方が低く、キシロオリゴ糖とキシロースの膜分離がより容易になることが判明した。さらにキシランを誘導剤として添加した培養では、セルロースとキシランを誘導剤とした場合の培養と比較して、タンパク質(セルラーゼ組成物)が10分の1程度しか生産されないため、糖化反応時により多くの培養液が必要になる。
使用した株をPC−3−7/△BXL1株にし、本培養の組成を表7に示した組成にし、バイオマスにbeech wood xylan(シグマアルドリッチ社製)を使用する以外は比較例1と同様の条件にて培養を行った。培養開始4日後の培養液は遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は活性、タンパク質濃度を測定し(表16)、糖化反応に使用した。糖化反応は比較例19と同様にして行い、キシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した(表17、表18)。
使用した株をPC−3−7/△BXL1株にし、本培養の組成を表7に示した組成にする以外は比較例1と同様の条件にて培養を行った。培養開始4日後の培養液は遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は活性を測定した(表16)。その結果、誘導剤を8%添加した場合では、誘導剤を2%添加した場合と比較してβ-キシロシダーゼの活性が低下し、β-グルコシダーゼの活性、p−ニトロフェニル-β-D-キシロビオシドの分解活性が増加していた。その後、得られたろ過液は糖化反応に使用した。糖化反応は比較例19と同様にして行い、キシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した(表17、表18)。その結果、誘導剤添加の割合が同じ場合では、キシランよりもセルロースとキシランを誘導剤としたほうが、キシロオリゴ糖収量、グルコース収量が増加していた。さらに、キシロース/(キシロース+キシロオリゴ糖)の割合がセルロースとキシランを誘導剤にした場合の方がキシランを誘導剤にした場合より低かった。また、セルロースとキシランを誘導剤とした場合では、誘導剤を2%よりも8%添加して培養して得られたセルラーゼ組成物を使用したほうが、キシロオリゴ糖、グルコースの収量が増加し、キシロース/(キシロース+キシロオリゴ糖)割合も低下していた。これらの結果から、セルロースとキシランを誘導剤として8%添加し培養して得られたセルラーゼ組成物が、最もキシロオリゴ糖とグルコースの生産に適していることがわかった。
Claims (11)
- セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてBXL1遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養することを含む、トリコデルマ属真菌によるタンパク質の製造方法。
- 前記誘導剤を5重量%(wt/wt)以上培地に添加して培養する、請求項1に記載の方法。
- 前記誘導剤に含まれるキシランの含有量が15〜40重量%である請求項1または2に記載の方法。
- 前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 前記トリコデルマ・リーセイがカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、請求項4に記載の方法。
- 前記タンパク質がセルラーゼ組成物である請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼ比活性がp−ニトロフェニル−β−D−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質1mg当たり0.006U/mg protein以下、セロビオヒドロラーゼ比活性がp−ニトロフェニル−β−D−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質1mg当たり0.1U/mg protein以上、β-グルコシダーゼ比活性がp−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質1mg当たり0.25U/mg protein以上である請求項6に記載の方法。
- 前記β−キシロシダーゼ比活性が0.002U/mg protein以下、前記β-グルコシダーゼ比活性が0.3U/mg protein以上である請求項7記載の方法。
- 請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖の製造方法。
- 請求項6〜8のいずれか1項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖とグルコースの製造方法。
- セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてトリコデルマ属真菌を培養する際の溶存酸素飽和度の減少を抑制する方法であって、前記トリコデルマ属真菌として、BXL1遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いる、溶存酸素飽和度の減少抑制方法。
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