JP6314872B2 - 含有蛍光成分数決定方法及びその含有蛍光成分数決定方法を用いた分光蛍光光度計 - Google Patents
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Description
そこで、分子が発する蛍光を検出することによって、その試料に含まれる蛍光成分の定性や定量分析を行うために、設定励起波長λEXの光を試料に照射し、そのときに試料から放出される蛍光を測定する分光蛍光光度計が開発されている(例えば、特許文献1参照)。
試料室20には、分析対象となる試料Sが収納された10mmキュベットセル等が配置されるようになっている。
凹面回折格子12aはコンピュータ150の制御によって回転し、任意の設定励起波長λEXの光を試料Sに対して照射することができるようになっている。
凹面回折格子31aはコンピュータ150の制御によって回転し、任意の目的波長範囲λEM1〜λEM2の光を光検出器32に対して出射することができるようになっている。
I(t)=I0×exp(−t/r) ・・・(1)
これにより、分析部151cは、蛍光寿命rと初期蛍光強度I0とから、その試料Sに含まれる蛍光成分の定性や定量分析を行っている。
I(t)=I01×exp(−t/r1)+I02×exp(−t/r2)+・・・+I0n×exp(−t/rn) ・・・(2)
また、異なる蛍光成分が含まれると判定したときには、最も蛍光寿命r2’が長い蛍光成分2に対応する理論減衰曲線を図6(a)の減衰曲線から除去することで、新たな減衰曲線(第2減衰曲線)を作成して、第2減衰曲線に対して上述したことを繰り返すことにより、第2減衰曲線において蛍光成分数nが1種類であるか否かを判定することにした。これにより、上述した手順を繰り返していくことで、試料Sに含まれている「蛍光成分数n」を決定することを見出した。
また、「所定時間間隔」とは、ユーザー等によって測定前に予め決められた任意の時間間隔であり、例えば、1μ秒間等となる。
また、「測定終了時間」とは、ユーザー等によって測定後等に決められる任意の時間であり、例えば、蛍光の光強度が0となる時間等となる。
さらに、「理論減衰曲線」とは、ある蛍光寿命rを有する蛍光成分が示すであろうと文献等に記載されたり算出されたりした減衰曲線のことをいう。
また、本発明の分光蛍光光度計は、設定励起波長の光を試料に対して照射する照射部と、前記試料が配置される試料室と、前記試料から放出される蛍光の光強度を検出する検出部と、前記検出部で検出された光強度の時間変化である第N減衰曲線に基づいて蛍光寿命rを算出する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、前記制御部は、請求項1に記載の含有蛍光成分数決定方法に基づいて、蛍光成分数を算出するようにしてもよい。
分光蛍光光度計1は、設定励起波長λEXの光を出射する照射部100と、試料Sが配置される試料室20と、蛍光を測定する検出部30と、分光蛍光光度計1全体を制御するコンピュータ50とを備える。
分光蛍光光度計1の使用方法は、第1減衰曲線を取得する減衰曲線取得ステップAと、第X時間区間の第N減衰曲線に基づいて蛍光寿命rXを算出する第X蛍光寿命算出ステップBと、X値を減少させながら蛍光寿命r(X−1)、r(X−2)、・・・、r1を算出していく蛍光寿命変化算出ステップCと、試料Sに含まれる蛍光成分数をN種類とする判定ステップDと、第(N+1)減衰曲線を作成する作成ステップEと、N値を増加させる多成分算出ステップFとを含む。
まず、ステップS101の処理において、ユーザーは、試料Sが収納された10mmキュベットセルを試料室20に配置する。
次に、ステップS102の処理において、ユーザーは、入力装置52を用いて光源部制御部51aと光検出器制御部51bとを制御することにより、設定励起波長λEX(例えば、350nm)の光を試料Sに対して所定時間(例えば10μ秒間)照射する。そして、試料Sから放出される目的波長範囲λEM1〜λEM2(例えば350nm〜450nm)の蛍光を光検出器32に導き、光検出器32から光強度信号(蛍光強度)I(t)を所定時間間隔(例えば1μ秒間)で得ることにより減衰曲線を取得する。
次に、ステップS103の処理において、蛍光成分数を示すパラメータN=1とする。つまり、試料Sに含まれる蛍光成分数を1種類と仮定する。
次に、ステップS104の処理において、測定開始時間t0〜測定終了時間teの第N減衰曲線を所定時間間隔ΔtでX個に分割し、その時間区間の位置を示すパラメータX=X(最終の時間区間)とする。
次に、ステップS105の処理において、分析部51cは、第X時間区間(時間(te−Δt)〜時間te)の第N減衰曲線を、式(1)に当てはめてフィッティングし、最もよく一致する蛍光寿命rXと初期蛍光強度I0xとを算出する。
次に、ステップS106の処理において、X=X−1とする。つまり、第X時間区間より設定時間前(例えば1μ秒前)となる第(X−1)時間区間とする。
次に、ステップS107の処理において分析部51cは、第(X−1)時間区間の第N減衰曲線を、式(1)に当てはめてフィッティングし、最もよく一致する蛍光寿命r(X−1)と初期蛍光強度I0(X−1)とを算出する。
次に、ステップS108の処理において、分析部51cは、X=1(最初の時間区間)であるか否かを判定する。X=1でないと判定したときには、ステップS106の処理に戻る。つまり、X値を減少させながら蛍光寿命r(X−1)、r(X−2)、・・・、r1を算出していく。一方、X=1であると判定したときには、ステップS109の処理に進む。
次に、ステップS109の処理において、分析部51cは、蛍光寿命r(X−1)、r(X−2)、・・・、r1が変化するか否かを判定する。蛍光寿命rX、r(X−1)、r(X−2)、・・・、r1が変化しないと判定したときには、ステップS112の処理において、分析部51cは、「蛍光成分数」をN種類とする。つまり、ここに至り試料Sには1種類の蛍光成分しか含まれていないものと判定し、「蛍光成分数」を決定して、本フローチャートを終了させる。
一方、蛍光寿命rX、r(X−1)、r(X−2)、・・・、r1が変化すると判定したときには、ステップS110の処理において、蛍光寿命rXの蛍光成分に対応する理論減衰曲線を、第N減衰曲線から除去することにより、第(N+1)減衰曲線を作成する。つまり、最も長い蛍光寿命rXの蛍光成分の影響を除いた減衰曲線を作成する。
次に、ステップS111の処理において、N=N+1として、ステップS104の処理に戻る。つまり、1種類の蛍光成分しか含まれなくなる減衰曲線になるまで、ステップS104の処理〜ステップS111の処理が繰り返されることになる。
20 試料室
30 検出部
51 CPU(制御部)
100 照射部
S 試料
Claims (2)
- 設定励起波長の光を試料に対して照射する照射部と、
前記試料が配置される試料室と、
前記試料から放出される蛍光の光強度を検出する検出部と、
前記検出部で検出された光強度の時間変化であるN=1とした第N減衰曲線を作成して蛍光寿命rを算出する制御部とを備える分光蛍光光度計に用いられる含有蛍光成分数決定方法であって、
測定終了時間より所定時間前となる時点から当該測定終了時間までの所定時間間隔となる第X時間区間の第N減衰曲線に基づいて、前記試料に含まれる蛍光成分数を1種類と仮定して蛍光寿命rXを算出する第X蛍光寿命算出ステップと、
前記第X時間区間より前の所定時間間隔となる第(X−1)時間区間の第N減衰曲線に基づいて、前記試料に含まれる蛍光成分数を1種類と仮定して蛍光寿命r(X−1)を算出するように、当該X値を減少させながら蛍光寿命r(X−1)、r(X−2)・・・を算出していく蛍光寿命変化算出ステップと、
蛍光寿命rX、r(X−1)、r(X−2)・・・が変化しないと判定したときには、前記試料に含まれる蛍光成分数をN種類とする判定ステップと、
前記判定ステップで蛍光寿命rX、r(X−1)、r(X−2)・・・が変化していくと判定したときには、蛍光寿命rXの蛍光成分に対応する理論減衰曲線を、第N減衰曲線から除去することにより、第(N+1)減衰曲線を作成する作成ステップと、
第(N+1)減衰曲線について、第X蛍光寿命算出ステップと蛍光寿命変化算出ステップと判定ステップと作成ステップとを実行するように、前記N値を増加させながら蛍光成分数を算出する多成分算出ステップとを含むことを特徴とする含有蛍光成分数決定方法。 - 設定励起波長の光を試料に対して照射する照射部と、
前記試料が配置される試料室と、
前記試料から放出される蛍光の光強度を検出する検出部と、
前記検出部で検出された光強度の時間変化である第N減衰曲線に基づいて蛍光寿命rを算出する制御部とを備える分光蛍光光度計であって、
前記制御部は、請求項1に記載の含有蛍光成分数決定方法に基づいて、蛍光成分数を算出することを特徴とする分光蛍光光度計。
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