JP6300223B2 - Linear double-stranded DNA for RNA expression - Google Patents
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Description
本発明は、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、該ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーに関する。 The present invention provides a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence and a promoter sequence in sequence, and a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising the terminator sequence and a promoter sequence in sequence. It relates to the forward primer.
様々なタンパク質を細胞内に発現させる技術は、細胞内におけるタンパク質の機能解析、工業・医療・農業分野で商業的に利用されるタンパク質の生産等に広く用いられており、今日では欠かせない技術である。細胞内で特定のタンパク質を発現させるためには、細胞内へタンパク質をコードする遺伝子を導入する方法が有用であり、導入する遺伝子等のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の運搬体としてプラスミドベクターを使用した方法が広く利用されている。 The technology to express various proteins in cells is widely used for functional analysis of proteins in cells and production of proteins used commercially in industrial, medical and agricultural fields. It is. In order to express a specific protein in a cell, a method of introducing a gene encoding the protein into the cell is useful, and a method using a plasmid vector as a carrier for a DNA sequence for RNA expression such as a gene to be introduced Is widely used.
一方、これまでに正確性の高いＤＮＡポリメラーゼが開発されたことから、ＰＣＲ法によりタンパク質をコードする遺伝子を数時間で合成することが可能になった。そこで、タンパク質をコードする遺伝子を含む線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入する方法も検討されている。この方法により、タンパク質の機能解析、タンパク質の生産、創薬のためのスクリーニング等の目的に応じて、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡが十分に発現すれば、従来の手間と時間のかかるプラスミド構築を、簡便で迅速なＰＣＲ法による線状二本鎖ＤＮＡの作製に替えることが可能となり、大幅な時間の短縮、ハイスループット化が期待できる。 On the other hand, since a highly accurate DNA polymerase has been developed so far, it has become possible to synthesize a gene encoding a protein by PCR in a few hours. Therefore, a method for introducing a linear double-stranded DNA containing a gene encoding a protein into a cell has been studied. With this method, if RNA derived from DNA sequences for RNA expression is sufficiently expressed in cells depending on the purpose of protein functional analysis, protein production, screening for drug discovery, etc., conventional labor and time can be reduced. Such plasmid construction can be replaced with production of linear double-stranded DNA by a simple and rapid PCR method, and a great reduction in time and high throughput can be expected.
線状二本鎖ＤＮＡをそのまま細胞内に導入し、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる場合に用いる線状二本鎖ＤＮＡとしては、プロモータ配列、タンパク質をコードする遺伝子配列等のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列、ターミネータ配列を順次備える線状二本鎖ＤＮＡが用いられているが、細胞内でのＲＮＡの発現は簡便かつ十分なものではなかった。また、プロモータ配列、タンパク質をコードする遺伝子配列、発現マーカーをコードするＤＮＡ配列、ターミネータ配列、ポリアデニレーションシグナル配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法により調製する方法が提案されているが（特許文献１参照）、各配列の両端に制限酵素サイト又はアニーリング配列をそれぞれ組み込み、ＰＣＲ法により該ＤＮＡ断片を構築し、次いでその５’末端にリン酸を付加するか制限酵素により突出末端を作製してセルフライゲーションにより環状化を行う必要がある等、作業が煩雑でかつ時間がかかるという問題があり、さらに、作製したＤＮＡ断片も、線状二本鎖ＤＮＡとしてではなく、環状化して動物細胞に導入するものであった。 Linear double-stranded DNA used when linear double-stranded DNA is directly introduced into a cell and RNA derived from a DNA sequence for RNA expression is expressed in the cell includes a promoter sequence, a gene sequence encoding a protein, etc. Although a linear double-stranded DNA sequentially comprising a DNA sequence for RNA expression and a terminator sequence is used, the expression of RNA in cells is not simple and sufficient. Further, a method has been proposed in which a DNA fragment containing a promoter sequence, a gene sequence encoding a protein, a DNA sequence encoding an expression marker, a terminator sequence, and a polyadenylation signal sequence is prepared by PCR (see Patent Document 1). ), Incorporating restriction enzyme sites or annealing sequences at both ends of each sequence, constructing the DNA fragment by PCR method, and then adding phosphoric acid to its 5 ′ end or creating a protruding end by restriction enzyme and self-ligating There is a problem that the work is cumbersome and time consuming, such as the need to circulate by, and the prepared DNA fragments are not circularly double-stranded DNA, but are circularized and introduced into animal cells. Met.
本発明者らは、ターミネータ配列を含むＤＮＡ配列の相補配列からなり、線状二本鎖ＤＮＡによる細胞におけるＲＮＡ発現用のリバースプライマーであって、前記ターミネータ配列が、３０〜２００塩基からなり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むリバースプライマーや、このプライマーを用いて、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と前記連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ法により作製し、これを細胞内に導入してＲＮＡを発現させることを提案した（特許文献２参照）。 The present inventors comprise a reverse sequence for RNA expression in a cell using linear double-stranded DNA consisting of a complementary sequence of a DNA sequence containing a terminator sequence, wherein the terminator sequence consists of 30 to 200 bases ( A / T / G), (A / T / G), T, A, A, A, (A / T / G / C), (A / T / G / C), (A / G / C) A reverse primer containing a continuous 9-base sequence, and a linear double-stranded DNA comprising a promoter sequence, an RNA expression DNA sequence, and a terminator sequence containing the continuous 9-base sequence in sequence using this primer Was prepared by the PCR method, and this was introduced into cells to propose RNA expression (see Patent Document 2).
この特許文献２の手法により、複雑な操作を必要とせず、簡便かつ迅速にＲＮＡ発現用の線状二本鎖ＤＮＡを作製することができ、該線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入することにより、タンパク質の機能解析、タンパク質の生産、創薬のためのスクリーニング等の目的に応じて、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを簡便かつ十分に発現させることが可能となった。しかしながら、あくまでプロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えたものであるため、タンパク質にシグナルペプチド又はタグペプチドを付与する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とプロモータ配列又はターミネータ配列との間にシグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入する必要があり、作業が煩雑になるという問題が残っていた。さらに、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に対して変異を導入する場合にも、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流にプロモータ配列、下流にターミネータ配列を備えていることから、変異を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入する作業が煩雑になるという問題も残っていた。 According to the method of Patent Document 2, a linear double-stranded DNA for RNA expression can be prepared easily and quickly without requiring a complicated operation, and the linear double-stranded DNA is introduced into a cell. Thus, RNA derived from a DNA sequence for RNA expression can be expressed easily and sufficiently in cells depending on purposes such as protein function analysis, protein production, and screening for drug discovery. However, since the promoter sequence, the DNA sequence for RNA expression, and the terminator sequence are sequentially provided, when the signal peptide or tag peptide is added to the protein, the DNA sequence for RNA expression and the promoter sequence or terminator sequence It was necessary to insert a DNA sequence encoding a signal peptide or tag peptide between them, and the problem remained that the work was complicated. Furthermore, when a mutation is introduced into an RNA expression DNA sequence, a promoter sequence is provided upstream of the RNA expression DNA sequence, and a terminator sequence is provided downstream. There also remains a problem that the work of introducing a mutation into a DNA sequence for RNA expression becomes complicated.
上述のように、ＲＮＡ発現用の線状二本鎖ＤＮＡを細胞に導入することにより細胞内でＲＮＡを簡便かつ目的に応じて十分に発現させることができるようになったものの、細胞内におけるタンパク質の機能解析、工業・医療・農業分野で商業的に利用されるタンパク質の生産等において、発現するタンパク質にシグナルペプチド、タグペプチド等のペプチドを付与する場合や、変異を導入する場合は、該線状二本鎖ＤＮＡの作製について改良すべき点が残されていた。 As described above, RNA can be expressed easily and adequately in a cell according to the purpose by introducing linear double-stranded DNA for RNA expression into the cell. In the case of functional analysis of proteins, production of proteins commercially used in the fields of industry, medicine, agriculture, etc., when adding a peptide such as a signal peptide or tag peptide to the expressed protein, or when introducing a mutation, this line The point which should be improved about preparation of a double stranded DNA was left.
本発明の課題は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流又は下流にシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を簡易に付与することや、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を簡易に導入することができる、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを提供することにある。 An object of the present invention is to easily give a DNA sequence encoding a signal peptide, a tag peptide, or the like upstream or downstream of an RNA expression DNA sequence, or to easily introduce a mutation into an RNA expression DNA sequence. An object of the present invention is to provide a linear double-stranded DNA for RNA expression.
本発明者らは、タンパク質をコードする遺伝子配列の下流にターミネータ配列が結合されていない線状二本鎖ＤＮＡと、ターミネータ配列を有する線状二本鎖ＤＮＡとを用いて、細胞内でＲＮＡを発現させることを鋭意検討したなかで、プロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ、及び、タンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを複数作製した。その過程で、ターミネータ配列とプロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡをそのまま細胞に導入したところ、驚くことに細胞内で遺伝子が発現することを見いだした。 The present inventors have used a double-stranded DNA in which a terminator sequence is not bound downstream of a gene sequence encoding a protein, and a linear double-stranded DNA having a terminator sequence to convert RNA in a cell. In the intensive study of expression, linear double-stranded DNA sequentially comprising a promoter sequence and a gene sequence encoding a protein, and linear double-stranded DNA sequentially comprising a gene sequence encoding a protein and a terminator sequence A plurality of DNAs were prepared. In the process, when a linear double-stranded DNA having a terminator sequence, a promoter sequence, and a gene sequence encoding a protein was introduced into the cell as it was, it was surprisingly found that the gene was expressed in the cell.
これまでの技術常識では、細胞内で遺伝子を発現させるには、プロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備える二本鎖ＤＮＡを細胞に導入する必要があったが、前記結果から、細胞に導入する線状二本鎖ＤＮＡとしては、必ずしもプロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えることが必須ではないと考え、プロモータ配列、タンパク質をコードする遺伝子配列、ターミネータ配列の配置を様々に組み合わせて実験を行ったところ、ターミネータ配列とプロモータ配列とタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡや、タンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入した場合に細胞内で遺伝子が発現することを見いだし、加えて、かかる線状二本鎖ＤＮＡは、シグナルペプチドやタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を簡易に付与できること、シグナルペプチドやタグペプチドを付与しても細胞内で遺伝子が発現すると共にシグナルペプチドやタグペプチドが有効に機能すること、ＲＮＡ発現用ＤＮＡに変異を簡易に導入できること等、非常に有用であることを見いだし、本発明を完成した。 According to the common general knowledge so far, in order to express a gene in a cell, it has been necessary to introduce a double-stranded DNA sequentially comprising a promoter sequence, a gene sequence encoding a protein, and a terminator sequence into the cell. Therefore, as a linear double-stranded DNA to be introduced into a cell, it is not necessarily essential to sequentially comprise a promoter sequence, a gene sequence encoding a protein, and a terminator sequence, a promoter sequence, a gene sequence encoding a protein, When experiments were conducted with various combinations of terminator sequences, linear double-stranded DNA sequentially comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and a gene sequence encoding a protein, a gene sequence encoding a protein, and a terminator sequence A linear double-stranded DNA sequentially having a promoter sequence is transferred to a cell. In addition, it was found that the gene is expressed in cells when introduced as it is, and in addition, such a linear double-stranded DNA can easily give a DNA sequence encoding a signal peptide or tag peptide, a signal peptide or tag peptide The present invention was found to be very useful, such as gene expression in cells and effective functioning of signal peptides and tag peptides, and introduction of mutations into RNA expression DNA. did.
すなわち、本発明は、［１］（ａ）ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ、又は（ｂ）ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ、に示されるターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［２］ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列が、タンパク質をコードする遺伝子配列であることを特徴とする上記［１］記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［３］ターミネータ配列が、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とする上記［１］又は［２］記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［４］プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモータ配列又はヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ配列であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［５］プラスミドの複製開始点、又は薬剤耐性遺伝子を含まないことを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［６］（ａ）におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流、又は、（ｂ）におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流に、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を備えたことを特徴とする上記［１］〜［５］のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや、
［７］ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さが２００〜５０００塩基であることを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれか記載のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡに関する。
That is, the present invention provides [1] (a) a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and a DNA sequence for RNA expression, or (b) a DNA sequence for RNA expression. A linear double-stranded DNA for RNA expression sequentially comprising a terminator sequence and a promoter sequence as shown in FIG. 2, a linear double-stranded DNA for RNA expression sequentially comprising a terminator sequence and a promoter sequence,
[2] The RNA expression linear double-stranded DNA according to [1], wherein the RNA expression DNA sequence is a gene sequence encoding a protein;
[3] Terminator sequence is (A / T / G), (A / T / G), T, A, A, A, (A / T / G / C), (A / T / G / C) , (A / G / C) comprising a continuous 9-base sequence, the RNA expression linear double-stranded DNA according to [1] or [2],
[4] The RNA expression according to any one of [1] to [3] above, wherein the promoter sequence is a human cytomegalovirus (CMV) promoter sequence or a human elongation factor 1α (EF1α) promoter sequence. Linear double-stranded DNA,
[5] A linear double-stranded DNA for RNA expression according to any one of [1] to [4] above, which does not contain a plasmid replication origin or a drug resistance gene;
[6] The DNA sequence encoding a signal peptide or a tag peptide is provided downstream of the RNA expression DNA sequence in (a) or upstream of the RNA expression DNA sequence in (b), [6] 1] to [5], a linear double-stranded DNA for RNA expression according to any one of
[7] The linear double-stranded DNA for RNA expression according to any one of [1] to [6] above, wherein the length of the linear double-stranded DNA for RNA expression is 200 to 5000 bases .
また、本発明は、［８］ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーであって、ターミネータ配列のセンス鎖配列と、プロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えたことを特徴とするフォワードプライマーや、
［９］ターミネータ配列のセンス鎖配列が、長さ３０〜２５０塩基であり、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むことを特徴とする上記［８］記載のフォワードプライマーや、
［１０］ターミネータ配列のセンス鎖配列が、配列番号３又は４で示される配列であることを特徴とする上記［８］又は［９］記載のフォワードプライマーに関する。
The present invention also provides [8] a forward primer for preparing a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence and a promoter sequence in sequence, comprising a sense strand sequence of the terminator sequence and a promoter sequence. A forward primer characterized by sequentially comprising a DNA sequence to be annealed;
[9] The sense strand sequence of the terminator sequence is 30 to 250 bases in length, and (A / T / G), (A / T / G), T, A, A, A, (A / T / G / C), (A / T / G / C), (A / G / C) containing a continuous 9-base sequence, the forward primer according to the above [8],
[10] The forward primer according to [8] or [9] above, wherein the sense strand of the terminator sequence is the sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡによれば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流又は下流にシグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を付与することや、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入することが簡易となる。即ち、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に付与する場合は、前述の（ａ）の態様によれば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列の間に挿入する必要はなくＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流にこれを連結するのみでよく、また、前述の（ｂ）の態様によれば、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の間に挿入する必要はなくＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流にこれを連結するのみでよく、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に簡易に付与することができる。この効果は、特にＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を変えてその発現をそれぞれ検討する場合や目的に応じて上記ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を変える場合により大きいものとなる。さらに、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入する場合は、前述の（ａ）の態様によれば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列のアンチセンス鎖配列に変異を有する配列を含むリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけでよく、前述の（ｂ）の態様によれば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列のセンス鎖配列に変異を有する配列を含むフォワードプライマー用いてＰＣＲを行うだけでよい。 According to the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention, a DNA sequence encoding a signal peptide or a tag peptide is added upstream or downstream of the DNA sequence for RNA expression, or the DNA sequence for RNA expression is mutated. It becomes easy to introduce. That is, when a DNA sequence encoding a signal peptide or a tag peptide is added to an RNA expression DNA sequence, it is necessary to insert between the RNA expression DNA sequence and the terminator sequence according to the above-described embodiment (a). It is only necessary to link this downstream of the RNA expression DNA sequence, and according to the above-mentioned embodiment (b), it is not necessary to insert between the promoter sequence and the RNA expression DNA sequence. It is only necessary to link this upstream of the sequence, and a DNA sequence encoding a signal peptide or tag peptide can be easily added to the DNA sequence for RNA expression. This effect is particularly great when the DNA sequence for RNA expression is changed to examine its expression, or when the DNA sequence encoding the peptide sequence is changed according to the purpose. Furthermore, when a mutation is introduced into an RNA expression DNA sequence, according to the above-described embodiment (a), PCR is performed using a reverse primer including a sequence having a mutation in the antisense strand sequence of the RNA expression DNA sequence. According to the above-described embodiment (b), it is only necessary to perform PCR using a forward primer containing a sequence having a mutation in the sense strand sequence of the RNA expression DNA sequence.
また、本発明によれば、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することも簡易にできるようになる。即ち、前述の（ａ）の態様では、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流にターミネータ配列を連結する必要がなく、（ｂ）の態様では、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流にプロモータ配列を連結する必要がないため、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製しておくことで、特にＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を変えてその発現をそれぞれ検討する場合は、対応するＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを簡易に作製することができる。 Moreover, according to the present invention, it becomes possible to easily prepare a linear double-stranded DNA for RNA expression. That is, in the above-described embodiment (a), it is not necessary to connect a terminator sequence downstream of the DNA sequence for RNA expression, and in the embodiment (b), it is necessary to connect a promoter sequence upstream of the DNA sequence for RNA expression. Therefore, by preparing a linear double-stranded DNA with a terminator sequence and a promoter sequence in sequence, especially when examining the expression by changing the DNA sequence for RNA expression, A linear double-stranded DNA can be easily prepared.
さらに、ターミネータ配列のセンス鎖配列とプロモータ配列にアニールする配列を順次備えた本発明のフォワードプライマーにより、複雑な操作を必要とせず、簡易かつ迅速に、ターミネータ配列の下流にプロモータ配列を順次備えた配列を含むＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することが可能となり、シグナルペプチド、タグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を付与することやＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入することが簡易にできるようになる。 Furthermore, the forward primer of the present invention, which is sequentially provided with a sense strand sequence of a terminator sequence and a sequence that anneals to the promoter sequence, is provided with a promoter sequence sequentially downstream of the terminator sequence in a simple and rapid manner without requiring complicated operations. It becomes possible to produce RNA expression linear double-stranded DNA containing sequences, and it is easy to add DNA sequences encoding signal peptides, tag peptides, etc., and to introduce mutations into RNA expression DNA sequences become able to.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡとしては、（ａ）ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（以下、「本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１」ということがある）や、（ｂ）ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（以下、「本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２」ということがある）であれば特に制限されず、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをそのまま細胞に導入するだけで、細胞内でＲＮＡを発現させることが可能であるものであればよい。本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１としては、ターミネータ配列の下流（３’末端側）にプロモータ配列が動作可能に連結され、さらに前記プロモータ配列の下流にＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列が動作可能に連結されているものであればよく、また、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２としては、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流にターミネータ配列が動作可能に連結され、前記ターミネータ配列の下流にプロモータ配列が動作可能に連結されているものであればよい。 The linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention includes (a) a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and a DNA sequence for RNA expression (hereinafter referred to as “this case”). RNA expression linear double-stranded DNA 1 ”) and (b) RNA expression linear double-stranded DNA (hereinafter, referred to as RNA expression DNA sequence, terminator sequence and promoter sequence) There is no particular limitation as long as it is sometimes referred to as “the present RNA expression linear double-stranded DNA 2”, and the RNA expression linear double-stranded DNA of the present invention is simply introduced into the cell as it is, and RNA is expressed in the cell. What is necessary is just to be able to express. In the present RNA expression linear double-stranded DNA 1, a promoter sequence is operably linked downstream (3 ′ end side) of the terminator sequence, and an RNA expression DNA sequence is operably linked downstream of the promoter sequence. In addition, as the linear double-stranded DNA 2 for RNA expression of the present invention, a terminator sequence is operably linked downstream of the DNA sequence for RNA expression, and a promoter sequence is downstream of the terminator sequence. Any device that is operably connected may be used.
また、本発明のフォワードプライマーとしては、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのフォワードプライマーであって、ターミネータ配列のセンス鎖配列と、プロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えたことを特徴とするフォワードプライマーであれば特に制限されず、ここで、ターミネータ配列のセンス鎖配列と、プロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えたものとしては、ターミネータ配列のセンス鎖配列の下流にプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列が連結されているものであればよい。 Further, the forward primer of the present invention is a forward primer for producing the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention, comprising a sense strand sequence of a terminator sequence and a DNA sequence that anneals to a promoter sequence. It is not particularly limited as long as it is a forward primer characterized in that it is sequentially provided. Here, the sense strand of the terminator sequence is assumed to have the sense strand sequence of the terminator sequence and the DNA sequence that anneals to the promoter sequence. Any DNA sequence that anneals to the promoter sequence downstream from the sequence may be used.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや本発明のフォワードプライマーにおけるターミネータ配列としては、ＲＮＡの発現を行う目的、ＲＮＡ発現を行う細胞の種類、プロモータの種類、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の種類等によって適宜選択することができ、天然に存在するターミネータ配列であっても、データベース上の配列に基づいて人工的に合成したターミネータ配列であってもよいが、複雑な操作を必要とせずに簡易かつ迅速に本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製するには、人工的に合成したターミネータ配列を選択することが好ましい。人工的に合成したターミネータ配列は、変異ＲＮＡ発現の誘導に機能しうる限りは、天然に存在するターミネータ配列の部分配列であっても、そのＤＮＡ配列に置換、欠損、挿入を有するものであってもよい。 The terminator sequence in the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention and the forward primer of the present invention includes the purpose of expressing RNA, the type of cells that perform RNA expression, the type of promoter, the type of DNA sequence for RNA expression The terminator sequence may be a naturally-occurring terminator sequence or an artificially synthesized terminator sequence based on the sequence on the database, but it is simple without requiring complicated operations. In order to quickly and rapidly prepare the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention, it is preferable to select an artificially synthesized terminator sequence. An artificially synthesized terminator sequence has a substitution, deletion, or insertion in its DNA sequence even if it is a partial sequence of a naturally occurring terminator sequence as long as it can function to induce the expression of mutant RNA. Also good.
人工的に合成したターミネータ配列を用いる場合、本発明のターミネータ配列としては、十分なＲＮＡ発現量を目的に応じて得る観点から、１番目の塩基がＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、又はＧ（グアニン）であり、２番目の塩基がＡ、Ｔ、又はＧであり、３番目の塩基がＴであり、４番目の塩基がＡであり、５番目の塩基がＡであり、６番目の塩基がＡであり、７番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ（シトシン）であり、８番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣであり、９番目の塩基がＡ、Ｇ、又はＣである、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列を好適に例示することができ、この９塩基として、Ａ，（Ａ／Ｔ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むものをより好適に例示することができ、かかる連続した９塩基は１又は２以上含まれていてもよい。また、人工的に合成したターミネータ配列の長さとしては、上記観点に沿う限り特に制限されないが、本発明のフォワードプライマーにおいては、好ましくは３０〜２５０塩基、より好ましくは４０〜２００塩基、さらに好ましくは６０〜１２０塩基からなるのがよい。 When an artificially synthesized terminator sequence is used, as the terminator sequence of the present invention, the first base is A (adenine), T (thymine), or G from the viewpoint of obtaining a sufficient RNA expression level depending on the purpose. (Guanine), the second base is A, T, or G, the third base is T, the fourth base is A, the fifth base is A, the sixth The base is A, the seventh base is A, T, G, or C (cytosine), the eighth base is A, T, G, or C, and the ninth base is A, G, Or C, (A / T / G), (A / T / G), T, A, A, A, (A / T / G / C), (A / T / G / C), ( A terminator sequence including a sequence of 9 bases of (A / G / C) can be preferably exemplified. As these 9 bases, A, (A / T), T A sequence including 9 consecutive nucleotide sequences of A, A, A, (A / T / G), (A / G / C), and (A / C) can be illustrated more preferably. Nine bases may contain 1 or 2 or more. Further, the length of the artificially synthesized terminator sequence is not particularly limited as long as the above viewpoint is met, but in the forward primer of the present invention, it is preferably 30 to 250 bases, more preferably 40 to 200 bases, still more preferably. Preferably consists of 60 to 120 bases.
このようなターミネータ配列としては、公知の文献（国際公開第２０１２／１４７３７０号パンフレット）等に記載の配列を利用することができ、例えば、ラビットβ−グロビン（Ｒａｂｂｉｔ β−ｇｌｏｂｉｎ）ターミネータ配列（配列番号１）又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列（配列番号２）の一部であって上記の長さ及び配列を有するものを好ましく挙げることができ、この中から、タンパク質の機能解析、タンパク質の生産、創薬のためのスクリーニング等の目的に応じて十分なＲＮＡ発現量が得られるものを適宜選択することが好ましい。例えば、ラビットβ−グロビンターミネータ配列の塩基配列における塩基番号１２１〜１９０番目の塩基配列（配列番号３）や、ラビットβ−グロビンターミネータ配列の塩基配列における塩基番号１２１〜１８０番目、１２１〜２００番目、１２１〜２２０番目、１３０〜１９０番目の塩基配列、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基配列における塩基番号１３０〜２０８番目の塩基配列（配列番号４）や、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基配列における塩基番号１２１〜２２０番目、１３０〜２２０番目の塩基配列等をより好ましく挙げることができる。 As such a terminator sequence, a sequence described in a known document (WO 2012/147370 pamphlet) or the like can be used. For example, a rabbit β-globin (Rabbit β-globin) terminator sequence (SEQ ID NO: 1) or a part of the simian virus 40 (SV40) terminator sequence (SEQ ID NO: 2) having the above-mentioned length and sequence can be preferably mentioned. Among these, protein functional analysis, protein production In addition, it is preferable to appropriately select one that can provide a sufficient RNA expression level in accordance with the purpose such as screening for drug discovery. For example, base sequences 121 to 190 in the base sequence of the rabbit β-globin terminator sequence (SEQ ID NO: 3), base numbers 121 to 180 in the base sequence of the rabbit β-globin terminator sequence, 121 to 200, 121-220th base, 130-190th base sequence, base sequence 130-208 in the base sequence of SV40 terminator sequence (SEQ ID NO: 4), base number 121-220th in base sequence of SV40 terminator sequence, The 130-220th base sequence etc. can be mentioned more preferably.
また、天然に存在するターミネータ配列を用いる場合、本発明のターミネータ配列としては、ウィルスのターミネータ配列であっても、大腸菌、枯草菌等の原核生物のターミネータ配列であっても、酵母、マウス、ヒト、ラビット等の真核生物のターミネータ配列であってもよく、具体的には、ラビットβ−グロビン（Ｒａｂｂｉｔ β−ｇｌｏｂｉｎ）ターミネータ配列、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネータ配列、ＨＳＶ・ＴＫターミネータ配列、ＣＹＣ１ターミネータ配列、ＡＤＨターミネータ配列、ＳＰＡターミネータ配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネータ配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネータ配列、トウモロコシ由来のＺｅｉｎ遺伝子ターミネータ配列、ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）遺伝子ターミネータ配列、サブクローバー・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子ターミネータ配列、ＬａｃＺアルファターミネータ配列、ｐｏｌｙＴターミネータ配列等を挙げることができ、十分なＲＮＡ発現量を目的に応じて得る観点からは、好ましくはラビットβ−グロビンターミネータ配列（配列番号１）やＳＶ４０ターミネータ配列（配列番号２）を挙げることができる。 When a naturally occurring terminator sequence is used, the terminator sequence of the present invention may be a viral terminator sequence, a prokaryotic terminator sequence such as Escherichia coli or Bacillus subtilis, yeast, mouse, human. Eukaryotic terminator sequences such as Rabbit and the like, specifically, Rabbit β-globin terminator sequence, simian virus 40 (SV40) terminator sequence, bovine growth hormone (BGH) terminator sequence Sequence, HSV / TK terminator sequence, CYC1 terminator sequence, ADH terminator sequence, SPA terminator sequence, Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase (NOS) gene terminator sequence, cauliflower mosaic virus (CaMV) List 5S gene terminator sequence, corn-derived Zein gene terminator sequence, Rubisco small subunit (SSU) gene terminator sequence, subclover stunt virus (SCSV) gene terminator sequence, LacZ alpha terminator sequence, polyT terminator sequence, etc. From the viewpoint of obtaining a sufficient RNA expression level depending on the purpose, a rabbit β-globin terminator sequence (SEQ ID NO: 1) and an SV40 terminator sequence (SEQ ID NO: 2) are preferable.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡや本発明のフォワードプライマーにおけるプロモータ配列としては、十分なＲＮＡの発現を得る目的、ＲＮＡを発現させる哺乳動物等の細胞の種類やＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列、ターミネータ配列等により適宜選択することができ、具体的には、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ配列、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモータ配列、アデノウィルス後期（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｍａｊｏｒ Ｌａｔｅ、ＡＭＬ）のＡＭＬプロモータ配列、ＳＶ４０及びＨＴＬＶ−１ ＬＴＲの融合プロモータであるＳＲαプロモータ配列、ヒトユビキチンＣプロモータ配列、α−アクチンプロモータ配列、β−アクチンプロモータ配列、Ｕ６プロモータ配列、Ｈ１プロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が抑制されるＴｅｔ−Ｏｆｆプロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が誘導されるＴｅｔ−Ｏｎプロモータ配列、亜鉛等の金属や種々の刺激により誘導されるメタロチオネインプロモータ配列、活性酸素により誘導されるＡＲＥプロモータ配列を挙げることができ、ＲＮＡの発現量を高める観点からは、好ましくはＣＭＶプロモータ配列、ヒト伸長因子ＥＦ１αプロモータ配列、より好ましくはＣＭＶプロモータ配列を好適に挙げることができ、ＲＮＡ発現の誘導に機能しうる限りは、その部分配列であっても、ＤＮＡ配列の置換、欠失、挿入を含んでいてもよい。 The promoter sequence in the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention and the forward primer of the present invention includes the purpose of obtaining sufficient RNA expression, the type of cells such as mammals expressing RNA, and the DNA sequence for RNA expression. The human cytomegalovirus (CMV) promoter sequence, the human elongation factor 1α (EF1α) promoter sequence, the simian virus (SV40) promoter sequence, the adenovirus major (Adenovirus Major), and the like. Late, AML) AML promoter sequence, SV40 and HTLV-1 LTR fusion promoter SRα promoter sequence, human ubiquitin C promoter sequence, α-actin promoter sequence, β-actin promoter sequence, U6 promoter sequence, H1 promoter sequence, Tet-Off promoter sequence in which RNA expression is suppressed by tetracycline, Tet-On promoter sequence in which RNA expression is induced by tetracycline, metallothionein promoter sequence induced by metals such as zinc and various stimuli, active oxygen From the viewpoint of increasing the expression level of RNA, preferably a CMV promoter sequence, a human elongation factor EF1α promoter sequence, more preferably a CMV promoter sequence can be preferably mentioned. As long as it can function for induction of RNA expression, it may be a partial sequence or may include substitution, deletion, or insertion of a DNA sequence.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、ＲＮＡを発現しうる線状二本鎖ＤＮＡ配列であればよく、タンパク質をコードする遺伝子配列の他、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）発現配列、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）発現配列、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）、核酸アプタマー発現配列、デゴイ発現配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現配列、リボザイム発現配列等の機能性核酸を発現するＤＮＡ配列を挙げることができる。 The DNA sequence for RNA expression in the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention may be a linear double-stranded DNA sequence capable of expressing RNA. In addition to a gene sequence encoding a protein, shRNA (small DNA expressing functional nucleic acids such as hairpin RNA) expression sequences, siRNA (short interfering RNA) expression sequences, miRNA (micro-RNA), nucleic acid aptamer expression sequences, degoy expression sequences, antisense oligonucleotide expression sequences, ribozyme expression sequences Sequences can be mentioned.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いてタンパク質を発現する場合、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、タンパク質をコードする遺伝子配列を選択することができ、タンパク質をコードする遺伝子配列としては、用途に合わせて全長の遺伝子配列でも、その一部でもよく、変異が導入されていてもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製した人工的な遺伝子でもよく、遺伝子における５’末端の開始コドン及び３’末端に停止コドンは適宜含んでいても含んでいなくてもよい。 When a protein is expressed using the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention, a gene sequence encoding the protein can be selected as the DNA sequence for RNA expression. As a gene sequence encoding the protein, Depending on the application, the full-length gene sequence or a part thereof may be used, or a mutation may be introduced. Moreover, the origin may be a gene isolated from any organism or an artificial gene prepared by genetic engineering, including the 5 ′ terminal start codon and 3 ′ terminal stop codon as appropriate. It does not have to be.
また、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いてタンパク質の発現をノックダウンする場合、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制できるｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、ｓｉＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、アンチセンスオリゴヌクレオチドを選択することができる。また、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いてタンパク質の活性化作用を阻害又は抑制する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、タンパク質の活性化作用を阻害又は抑制できる核酸アプタマー発現配列や、リボザイム発現配列を選択することができ、特定の遺伝子の転写を抑制する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としてデゴイ発現配列を設定することができ、上記配列は、それぞれ標的ＲＮＡの配列、及び、その転写因子が結合し得る配列の情報に基づいて人工合成することができる。また、疾患の治療効果を有するタンパク質を発現する配列や、疾患の原因又は進行に関わるタンパク質の発現抑制機能を有する配列をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とすることにより、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡをＤＮＡワクチンとして応用することができる。 In addition, when the expression of a protein is knocked down using the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention, the DNA sequence for RNA expression is an shRNA expression DNA that can suppress the expression of mRNA of a gene encoding the protein. A sequence, a DNA sequence for expressing siRNA, or an antisense oligonucleotide can be selected. In addition, when the protein activation action is inhibited or suppressed using the RNA expression linear double-stranded DNA of the present invention, the RNA expression DNA sequence may be a nucleic acid aptamer that can inhibit or suppress the protein activation action. An expression sequence or a ribozyme expression sequence can be selected. When transcription of a specific gene is to be suppressed, a dego expression sequence can be set as a DNA sequence for RNA expression. And can be synthesized artificially based on sequence information to which the transcription factor can bind. In addition, the RNA expression linear sequence of the present invention can be obtained by using a sequence for expressing a protein having a therapeutic effect for a disease or a sequence having a function of suppressing the expression of a protein involved in the cause or progression of a disease as a DNA sequence for RNA expression. The double-stranded DNA can be applied as a DNA vaccine.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡとしては、プラスミドの複製開始点、又は薬剤耐性遺伝子を含まないものが好ましく、プラスミドの複製開始点としては、ＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子等の複製開始点を挙げることができ、薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等を挙げることができる。 The linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention is preferably a plasmid replication origin or one that does not contain a drug resistance gene, and the plasmid replication origin is replication of ColE1, R factor, F factor, etc. Starting points can be mentioned, and examples of drug resistance genes include ampicillin resistance genes, tetracycline resistance genes, chloramphenicol resistance genes, kanamycin resistance genes, and the like.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡは、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流、又は、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２におけるＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流にシグナルペプチド又はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を備えることができる。シグナルペプチドとしては、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチド等を好適に挙げることができ、タグペプチドとしては、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグ等を好適に挙げることができる。 The linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention is a DNA for RNA expression in the linear double-stranded DNA 2 for RNA expression or downstream of the DNA sequence for RNA expression in the linear double-stranded DNA 1 for RNA expression of the present invention. A DNA sequence encoding a signal peptide or tag peptide can be provided upstream of the sequence. Signal peptides include Golgi translocation signal peptide, cell membrane translocation signal peptide, mitochondrial translocation signal peptide, nuclear translocation signal peptide, synaptic translocation signal peptide, nucleolar translocation signal peptide, nuclear transmembrane signal peptide, peroxisome translocation signal peptide, etc. As tag peptides, FLAG tag peptide, HA tag peptide, MYC tag peptide, GFP tag peptide, MBP tag peptide, GST tag peptide, HIS tag, SNAP tag, ACP tag, CLIP tag, TAP tag , V5 tag and the like can be preferably mentioned.
また、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡにおいては、ターミネータ配列とプロモータ配列の間、又はＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列の少なくとも一方にはリンカー配列を備えることもできる。リンカー配列は、ターミネータ配列とプロモータ配列、又はＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列を連結する配列であり、長さとしては、十分なＲＮＡの発現量を得る観点からは、好ましくは１０００塩基以内、より好ましくは３００塩基以内、さらに好ましくは１００塩基以内、中でも３０塩基以内を挙げることができ、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の任意の塩基から構成される。 Moreover, in the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention, a linker sequence may be provided between the terminator sequence and the promoter sequence, or at least one of the DNA sequence for RNA expression and the terminator sequence. The linker sequence is a sequence that links a terminator sequence and a promoter sequence, or a DNA sequence for RNA expression and a terminator sequence, and the length is preferably within 1000 bases from the viewpoint of obtaining a sufficient RNA expression level. Preferably, it is within 300 bases, more preferably within 100 bases, and especially within 30 bases, and it is composed of any base of adenine (A), thymine (T), cytosine (C), guanine (G). .
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さ（塩基）としては、ＲＮＡの発現量を高める観点からは、好ましくは２００〜５０００塩基、より好ましくは２００〜３０００塩基、さらに好ましくは２００〜１７００塩基を挙げることができる。 The length (base) of the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention is preferably 200 to 5000 bases, more preferably 200 to 3000 bases, and even more preferably 200 from the viewpoint of increasing the expression level of RNA. -1700 bases can be mentioned.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを製造する方法としては特に制限されず、フュージョンＰＣＲ法（特開２００９−２６８３６０）等のＰＣＲ法や制限酵素処理とＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション法により、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を順次有するように連結させる方法や、又はＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列を順次有するように連結させる方法を例示することができるが、ＰＣＲ法を用いた方法を好適に例示することができる。 The method for producing the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention is not particularly limited, and may be a PCR method such as a fusion PCR method (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-268360) or a ligation method using a restriction enzyme treatment and DNA ligase. Exemplifying a method of ligating a terminator sequence, a promoter sequence, and a DNA sequence for RNA expression so as to sequentially have a DNA sequence, a method of linking a DNA sequence for RNA expression, a terminator sequence, and a promoter sequence in order. However, a method using the PCR method can be preferably exemplified.
例えば、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を順次備えた二本鎖ＤＮＡをテンプレートとすれば、本発明のフォワードプライマーと、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の３’末端領域の配列のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１を簡易かつ迅速に作製することが可能となる。テンプレートとして用いるプロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を順次備えた二本鎖ＤＮＡは、線状二本鎖ＤＮＡでも環状ＤＮＡでもよい。 For example, when a double-stranded DNA sequentially comprising a promoter sequence and an RNA expression DNA sequence is used as a template, the forward primer of the present invention and the antisense strand sequence of the sequence of the 3 ′ end region of the RNA expression DNA sequence are comprised. By performing PCR using the reverse primer, the present RNA expression linear double-stranded DNA 1 can be prepared easily and rapidly. The double-stranded DNA sequentially including a promoter sequence and an RNA expression DNA sequence used as a template may be linear double-stranded DNA or circular DNA.
また、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を順次備えた二本鎖ＤＮＡがない場合には、まず、本発明のフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域の配列のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーとを用いてプロモータ配列をテンプレートとしてＰＣＲを行うことでターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡを作製し、次に、作製した前記線状二本鎖ＤＮＡにおけるターミネータ配列の上流、又は作製した前記線状二本鎖ＤＮＡにおけるプロモータ配列の下流にＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を常法により連結させることで本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することができる。 In addition, when there is no double-stranded DNA sequentially comprising a promoter sequence and an RNA expression DNA sequence, first, the reverse primer comprising the forward primer of the present invention and the antisense strand sequence of the sequence of the 3 ′ end region of the promoter sequence. A linear double-stranded DNA containing a sequence comprising a terminator sequence and a promoter sequence in sequence is prepared by performing PCR using a promoter sequence as a template using a primer, and then the prepared linear double-stranded DNA A linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention is prepared by linking an RNA expression DNA sequence upstream of the terminator sequence in FIG. 5 or downstream of the promoter sequence in the prepared linear double-stranded DNA by a conventional method. be able to.
この他、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、長さとしては９〜４５塩基、好ましくは１２〜２４塩基であり、塩基としてはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が５０％以上、好ましくは８０％以上であり、より好ましくはシトシンとグアニンが１００％のＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣ（配列番号５：５ＣＧＣ）からなるアニーリング配列を含むリンカー配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡと、該アニーリング配列を含むリンカー配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製し、得られた２つの線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーでＰＣＲを行う方法や、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と該アニーリング配列を含むリンカー配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡと、該アニーリング配列を含むリンカー配列とターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製し、得られた２つの線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーでＰＣＲを行う方法も挙げることができる。 In addition, the DNA sequence for RNA expression, the terminator sequence, the length is 9 to 45 bases, preferably 12 to 24 bases, and the bases are cytosine (C) and guanine (G) of 50% or more, preferably 80% or more, more preferably linear double-stranded DNA sequentially comprising a linker sequence comprising an annealing sequence consisting of CCCCCGGGGGCCCCCC (SEQ ID NO: 5CGC) with 100% cytosine and guanine, and the annealing sequence, A linear double-stranded DNA comprising a linker sequence and a promoter sequence in sequence is prepared, and the obtained two linear double-stranded DNAs are used as templates from the sense strand sequence of the 5 ′ end region of the RNA expression DNA sequence. A reverse primer comprising a forward primer and an antisense strand sequence in the 3 ′ end region of the promoter sequence PCR method, linear double-stranded DNA sequentially comprising a DNA sequence for RNA expression and a linker sequence including the annealing sequence, a linker sequence including the annealing sequence, a terminator sequence, and a promoter sequence A linear double-stranded DNA was prepared, and using the obtained two linear double-stranded DNAs as a template, a forward primer comprising a sense strand sequence of the 5 ′ end region of the RNA expression DNA sequence, and a 3 ′ end of the promoter sequence A method of performing PCR with a reverse primer comprising the antisense strand sequence of the region can also be mentioned.
ターミネータ配列として１００塩基を超えるように長い配列を用いる場合には、まずはターミネータ配列の下流の配列のセンス鎖配列とプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列を順次備えた本発明のフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いて、プロモータ配列をテンプレートとしてＰＣＲを行い、ターミネータ配列の下流の配列とプロモータ配列を順次備えた配列からなる線状二本鎖ＤＮＡを作製する。また、別途ターミネータ配列の全長を有する線状二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ等により作製する。次に上記で得られたターミネータ配列の下流の配列とプロモータ配列を順次備えた配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ及びターミネータ配列の全長を有する線状二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、ターミネータ配列の５’末端領域の配列のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーとプロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡを作製することもできる。その後、作製した線状二本鎖ＤＮＡにおけるターミネータ配列の上流又は作製した線状二本鎖ＤＮＡにおけるプロモータ配列の下流に、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を常法により連結させることで本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することができる。 When using a long sequence of more than 100 bases as the terminator sequence, first, the forward primer of the present invention comprising the sense strand sequence downstream of the terminator sequence and the DNA sequence that anneals to the promoter sequence, and the promoter sequence Using a reverse primer consisting of the antisense strand sequence in the 3 'end region, PCR is performed using the promoter sequence as a template to produce a linear double-stranded DNA consisting of a sequence downstream from the terminator sequence and a sequence comprising the promoter sequence in sequence. To do. Separately, a linear double-stranded DNA having the full length of the terminator sequence is prepared by PCR or the like. Next, a linear double-stranded DNA comprising a sequence downstream of the terminator sequence obtained above and a sequence comprising a promoter sequence and a linear double-stranded DNA having the full length of the terminator sequence are used as templates, and 5 of the terminator sequence is obtained. A sequence comprising a terminator sequence and a promoter sequence in sequence by performing PCR using a forward primer consisting of a sense strand sequence of a 'terminal region sequence and a reverse primer consisting of an antisense strand sequence of the 3' end region of the promoter sequence. A linear double-stranded DNA containing can also be prepared. Thereafter, the RNA expression DNA sequence is ligated by a conventional method upstream of the terminator sequence in the prepared linear double-stranded DNA or downstream of the promoter sequence in the prepared linear double-stranded DNA. Linear double-stranded DNA can be produced.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いると、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチド等のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグペプチド、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグ等のタグペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモータ活性を増強するエンハンサー配列等をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流又は下流に簡易に付与することが可能となる。 When the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention is used, the Golgi apparatus translocation signal peptide, cell membrane translocation signal peptide, mitochondrial translocation signal peptide, nuclear translocation signal peptide, synaptic translocation signal peptide, nucleolus translocation signal peptide, nucleus DNA sequence encoding signal peptide such as membrane translocation signal peptide, peroxisome translocation signal peptide, FLAG tag peptide, HA tag peptide, MYC tag peptide, GFP tag peptide, MBP tag peptide, GST tag peptide, HIS tag peptide, SNAP tag, DNA sequences encoding tag peptides such as ACP tags, CLIP tags, TAP tags, V5 tags, enhancer sequences that enhance promoter activity, etc. are easily added upstream or downstream of the DNA sequence for RNA expression. Theft is possible.
例えば、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１をテンプレートとして、ターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーと、付与するシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列のアンチセンス鎖配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列とを順次備えたリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１の下流（３’末端側）にシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を付与することや、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２をテンプレートとして、付与するシグナルペプチド、タグペプチド等をコードするＤＮＡ配列のセンス鎖配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列にアニールする配列とを順次備えたフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２の上流（５’末端側）にシグナルペプチドやタグペプチド等をコードするＤＮＡ配列を付与することが可能となる。 For example, using the double-stranded DNA 1 for RNA expression as a template, a forward primer consisting of a sense strand sequence in the 5 ′ end region of the terminator sequence, and an antisense strand of a DNA sequence encoding a signal peptide or tag peptide to be added By simply performing PCR using a reverse primer having a sequence and an antisense strand sequence in the 3 ′ end region of the RNA expression DNA sequence, the downstream (3 ′ end side) of the RNA expression linear double stranded DNA 1 ) With a DNA sequence encoding a signal peptide, a tag peptide, etc., or a sense strand sequence of a DNA sequence encoding a signal peptide, a tag peptide, etc. to be applied using the linear double-stranded DNA 2 for RNA expression as a template Forward with a sequence that anneals to the DNA sequence for RNA expression Just by performing PCR using a primer and a reverse primer consisting of the antisense strand sequence of the 3 ′ end region of the promoter sequence, a signal peptide or the like can be detected upstream (5 ′ end side) of the linear double-stranded DNA 2 for RNA expression in this case. It becomes possible to give a DNA sequence encoding a tag peptide or the like.
さらに、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いると、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に置換、付加、欠損等の変異を簡易に導入することが可能となる。例えば、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１をテンプレートとして、ターミネータ配列の５’末端領域のセンス鎖配列からなるフォワードプライマーと、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を有する配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ１のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入することができ、また、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２をテンプレートとして、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の５’末端領域のセンス鎖配列に変異を有する配列からなるフォワードプライマーと、プロモータ配列の３’末端領域のアンチセンス鎖配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、本件ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ２のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に変異を導入することができる。 Furthermore, when the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention is used, mutations such as substitution, addition and deletion can be easily introduced into the RNA expression DNA sequence. For example, using the linear double-stranded DNA 1 for RNA expression as a template, a forward primer consisting of a sense strand sequence in the 5 ′ end region of the terminator sequence and an antisense strand sequence in the 3 ′ end region of the DNA sequence for RNA expression Mutation can be introduced into the RNA expression DNA sequence of the present RNA expression linear double-stranded DNA 1 simply by performing PCR using a reverse primer consisting of a sequence having RNA. Using the double-stranded DNA 2 as a template, a forward primer composed of a sequence having a mutation in the sense strand sequence of the 5 ′ end region of the RNA expression DNA sequence and a reverse primer composed of the antisense strand sequence of the 3 ′ end region of the promoter sequence For RNA expression of the linear double-stranded DNA 2 for RNA expression in this case simply by performing PCR Mutations can be introduced into NA sequence.
本発明のフォワードプライマーは人工的に化学合成したり、かかるフォワードプライマーのＤＮＡ配列をテンプレートにＰＣＲ法にて増幅したり、遺伝子工学的手法にて、かかるフォワードプライマーのＤＮＡ配列を組み込んだプラスミドを大腸菌等を用いて増幅し、制限酵素等を用いて切り出すこと等によって作製することができる。 The forward primer of the present invention is artificially chemically synthesized, amplified by the PCR method using the DNA sequence of the forward primer as a template, or a plasmid in which the DNA sequence of the forward primer is incorporated by genetic engineering techniques. And the like, and cut out using a restriction enzyme or the like.
本発明のフォワードプライマーにおける、ターミネータ配列のセンス鎖配列の長さとしては、好ましくは３０〜２５０塩基、より好ましくは４０〜２００塩基、さらに好ましくは６０〜１２０塩基を挙げることができる。 The length of the sense strand sequence of the terminator sequence in the forward primer of the present invention is preferably 30 to 250 bases, more preferably 40 to 200 bases, still more preferably 60 to 120 bases.
本発明のフォワードプライマーは、ＰＣＲ反応を阻害しない限りは、標識分子配列、タグペプチド、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでもよく、また、同位体等で標識や修飾を受けたＤＮＡ分子であってもよい。かかる標識分子としては、蛍光色素、化学物質等を挙げることができ、タグペプチドとしてはＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグ等を挙げることができ、シグナルペプチドとしては、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチドを挙げることができる。 The forward primer of the present invention may contain a DNA sequence encoding a labeled molecule sequence, a tag peptide, or a signal peptide as long as it does not inhibit the PCR reaction, and is a DNA molecule that has been labeled or modified with an isotope or the like. May be. Examples of such labeled molecules include fluorescent dyes, chemical substances, etc., and tag peptides include FLAG tag peptide, HA tag peptide, MYC tag peptide, GFP tag peptide, MBP tag peptide, GST tag peptide, HIS tag, SNAP Tag, ACP tag, CLIP tag, TAP tag, V5 tag, etc., and signal peptides include Golgi apparatus signal peptide, cell membrane signal peptide, mitochondrial signal peptide, nuclear signal signal peptide, synaptic signal signal peptide Nucleoli translocation signal peptide, nuclear translocation signal peptide, and peroxisome translocation signal peptide.
本発明のフォワードプライマーにおけるプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列の長さとしては、好ましくは５塩基〜５０塩基、より好ましくは１０塩基〜３０塩基、特に好ましくは１５塩基〜２５塩基を挙げることができ、プロモータとして機能しうる配列の５’末端領域のセンス鎖配列を含有していればよく、必ずしもプロモータ配列の５’末端の塩基を含む必要はない。 The length of the DNA sequence annealed to the promoter sequence in the forward primer of the present invention is preferably 5 bases to 50 bases, more preferably 10 bases to 30 bases, particularly preferably 15 bases to 25 bases, It suffices to contain a sense strand sequence in the 5 ′ end region of a sequence that can function as a promoter, and it is not always necessary to include a base at the 5 ′ end of the promoter sequence.
本発明のフォワードプライマーは、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた配列を含む線状二本鎖ＤＮＡを作製するためのキットとして提供することもでき、かかるキットには本発明のフォワードプライマーの他、バッファー、ｄＮＴＰｓ、コントロールテンプレート、説明書等を含んでもよい。 The forward primer of the present invention can also be provided as a kit for producing a linear double-stranded DNA comprising a sequence comprising a terminator sequence and a promoter sequence in order. , Buffers, dNTPs, control templates, instructions and the like.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内にそのまま導入することでＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡが発現する形質転換細胞を製造することができる。本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入する方法としては、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を挙げることができ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等の市販のトランスフェクション試薬ならびに当技術分野で広く用いられている手法を用いることができる。 By introducing the RNA expression linear double-stranded DNA of the present invention into a cell as it is, a transformed cell in which RNA corresponding to the RNA expression DNA sequence is expressed can be produced. Examples of the method for introducing the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention into a cell include a liposome method, a lipofection method, a microinjection method, a DEAE dextran method, a calcium phosphate method, and an electroporation method. Lipofectin Reagent (registered trademark), Lipofectamine (registered trademark), Lipofectamine (registered trademark) 2000 Reagent (manufactured by Invitrogen), SuperFect (registered trademark) Transfection Reagent (manufactured by Qiagen), FuGENE (registered trademark) HD Transgent Diagnostic, Inc.), FuGENE (registered trademark) 6 Transfection Reagent Diagnostics Co.) can be used a technique widely used in commercial transfection reagents and the art of such.
本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡが発現する形質転換細胞を製造する場合において、本発明のＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを導入する細胞としては、哺乳動物細、植物細胞、昆虫細胞、酵母等を挙げることができ、好ましくは哺乳動物細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ由来の細胞を挙げることができ、特に好ましくはヒト、マウス由来の細胞を好適に挙げることができる。 When the linear double-stranded DNA for RNA expression of the present invention is introduced into a cell to produce a transformed cell that expresses RNA corresponding to the DNA sequence for RNA expression, the two linear RNA strands for RNA expression of the present invention are used. Examples of the cells into which the strand DNA is introduced include mammalian cells, plant cells, insect cells, yeast, etc., preferably mammalian cells, more preferably humans, monkeys, mice, rats, hamsters. And cells derived from rabbits, goats, sheep, horses, pigs, and dogs, with human and mouse cells being particularly preferred.
本発明においてＲＮＡ発現を行う細胞株としては、好ましくはＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ヒト骨肉腫細胞（ＨＯＳ細胞）、培養ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１細胞）、ヒト白血球Ｔ細胞（ｊｕｒｋａｔ細胞）、ヒト乳癌培養樹立細胞（ＭＣＦ−７細胞）、ヒト肝臓ガン由来細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、ヒト結腸癌由来細胞（ＣａＣＯ−２細胞）、ヒト骨芽細胞（ＳａＯＳ細胞）、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２細胞）、サル腎由来細胞（ＣＶ−１細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ−１細胞）、マウス由来線維芽細胞（Ｌ９２９細胞）、マウス奇形腫細胞（Ｆ９細胞）、マウス骨芽様細胞（ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞）、ラット副腎髄質褐色腫（ＰＣ−１２細胞）、ラット骨芽細胞様細胞（ＲＯＳ１７／２．８細胞）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１細胞）等を挙げることができ、より好ましくはＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を挙げることができ、株化Ｂリンパ芽球（ＥＢ３細胞）等の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、組織から採取した初代培養細胞等でもよい。 In the present invention, cell lines that perform RNA expression are preferably HEK293 cells, HeLa cells, COS-7 cells, NIH-3T3 cells, human osteosarcoma cells (HOS cells), cultured human osteoblasts (SaM-1 cells). , Human leukocyte T cells (jurkat cells), human breast cancer established cells (MCF-7 cells), human liver cancer-derived cells (HepG2 cells), human colon cancer-derived cells (CaCO-2 cells), human osteoblasts (SaOS) Cells), human chronic myeloid leukemia cells (K562 cells), monkey kidney-derived cells (CV-1 cells), African green monkey kidney cells (COS-1 cells), mouse-derived fibroblasts (L929 cells), mouse teratoma cells (F9 cells), mouse osteoblast-like cells (MC-3T3-E1 cells), rat adrenal medulla melanoma (PC-12 cells), rat osteoblast-like Cells (ROS17 / 2.8 cells), Chinese hamster ovary-derived cells (CHO-K1 cells), hamster kidney cells (BHK-21 cells) and the like, more preferably HEK293 cells, HeLa cells, COS-7. Cells, NIH-3T3 cells, embryonic stem cells (ES cells) such as established B lymphoblasts (EB3 cells), primary cultured cells collected from tissues, and the like.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（１）］
（実施例：β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号６(ｐＥＧＦＰ−６００)に示されるフォワードプライマーと配列番号７（ｐＥＧＦＰ＋７２０ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｉ−１を作製した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のマップを図１に示す。
[Linear double-stranded DNA for RNA expression (1) comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and a DNA sequence for RNA expression in sequence]
(Example: Production of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising β-globin terminator sequence, CMV promoter sequence, and gene sequence encoding GFP protein in sequence)
Using pEGFP-C1 (manufactured by Clontech) as a template and a forward primer represented by SEQ ID NO: 6 (pEGFP-600) and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 7 (pEGFP + 720c), a CMV promoter sequence and EGFP protein are encoded. Linear double-stranded DNA No. 1 i-1 was produced. A map of pEGFP-C1 is shown in FIG.
次に、ｐＴＲＩＥＸ−３ Ｈｙｇｒｏ β−ｇａｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をテンプレートとして、配列番号８（ｈＧｌｕｃＣ（２８）−ＧｌｏｂｉｎｐＡ＋２１）に示されるフォワードプライマーと配列番号９（ｐＥＧＦＰ−５７３ｃ−βＧｌｏｂｉｎｐＡ＋５００ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列（配列番号１）の塩基番号２１番目〜５００番目の配列を備えた線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｉ−２を作製した。 Next, using pTRIEX-3 Hygro β-gal (manufactured by Novagen) as a template, the reverse primer represented by SEQ ID NO: 8 (hGlucC (28) -GlobinpA + 21) and SEQ ID NO: 9 (pEGFP-573c-βGlobinpA + 500c) Using a primer, a linear double-stranded DNA No. 1 having a base number 21-500th sequence of a β-globin terminator sequence (SEQ ID NO: 1) was used. i-2 was produced.
ＰＣＲ反応は、ＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレート５０ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて，９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。 The PCR reaction was performed according to the recommended protocol using GXL polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). The final concentrations of each template were 50 pg / μl, forward primer 0.3 μM, reverse primer 0.3 μM, and 98 ° C. 10 seconds, 60 ° C. 15 seconds using an iccycler thermal cycler (manufactured by BIO-RAD). A cycle of 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times.
さらに前記作製した２種類の線状二本鎖ＤＮＡであるＮｏ．ｉ−１及びＮｏ．ｉ−２をテンプレートとして、配列番号８に示されるフォワードプライマーと配列番号７に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｉ−３を作製した。ＰＣＲ反応は、前記と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。 Furthermore, the two types of linear double-stranded DNAs prepared as described above are No. i-1 and no. Using i-2 as a template, a forward primer shown in SEQ ID NO: 8 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 7, a β-globin terminator sequence, a CMV promoter sequence, and a gene sequence encoding an EGFP protein in this order Provided linear double-stranded DNA for RNA expression No. i-3 was produced. In the PCR reaction, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 3 minutes was performed 30 times with the same reaction solution composition as described above.
（比較例：ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号７に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｉ−１を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも前記と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。
(Comparative example: Production of linear double-stranded DNA sequentially comprising CMV promoter sequence and gene sequence encoding EGFP protein)
Using pEGFP-C1 (manufactured by Clontech) as a template, a forward primer shown in SEQ ID NO: 6 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 7 were used to sequentially provide a CMV promoter sequence and a gene sequence encoding EGFP protein. Linear double-stranded DNA i-1 was produced. In the PCR reaction, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times with the same reaction solution composition as described above.
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、前記作製した、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｉ−３、及び、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｉ−１それぞれ１００ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。
(Introduction to cells)
HEK293 cells were seeded on a 96-well plate at 2000 cells / well and cultured for 18 hours, and the β-globin terminator sequence, CMV promoter sequence, and gene sequence encoding EGFP protein were sequentially prepared. Linear double-stranded DNA for RNA expression A linear double-stranded DNA No. 1 comprising an i-3 and CMV promoter sequence and a gene sequence encoding an EGFP protein in sequence. 100 ng of each i-1 was introduced into each cell using a FuGENE (registered trademark) HD Transfection Reagent kit (Roche Diagnostics) and observed with a fluorescence microscope 48 hours later. The results are shown in FIG.
（結果）
β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを導入した細胞では緑蛍光が観察されたが（図２（ａ）右写真）、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを導入した細胞では緑蛍光が観察されなかった（図２（ｂ）右写真）。前記結果より、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することで、細胞内でＲＮＡが発現することが明らかとなった。
(result)
Although green fluorescence was observed in cells into which a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a β-globin terminator sequence, a CMV promoter sequence, and a gene sequence encoding an EGFP protein were sequentially introduced (FIG. 2 (a ) Right photo), green fluorescence was not observed in cells into which a linear double-stranded DNA having a CMV promoter sequence and a gene sequence encoding an EGFP protein were sequentially introduced (FIG. 2 (b) right photo). From the above results, it is clear that RNA is expressed in cells by directly introducing RNA expression linear double stranded DNA comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and an RNA expression DNA sequence into the cell as it is. It became.
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、β−グロビンターミネータ配列のセンス鎖配列と、ＣＭＶプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えた配列番号１０（βＧｌｏｐＡ（１２１−１９０）−ｅＣＭＶ−６００）に示されるフォワードプライマーと、配列番号１１（９Ｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋６８７ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ）を作製した。
[Linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, a DNA sequence for RNA expression, and a DNA sequence encoding a tag peptide in sequence]
(Production of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a β-globin terminator sequence, a CMV promoter sequence, and a gene sequence encoding mCherry protein)
pmCherry-C1 (manufactured by Clontech) as a template, SEQ ID NO: 10 (βGlopA (121-190) -eCMV-600 comprising a sense strand sequence of β-globin terminator sequence and a DNA sequence that anneals to the CMV promoter sequence in sequence ) And the reverse primer represented by SEQ ID NO: 11 (9C-mCherry + 687c), the sequence of base numbers 121 to 190 of the β-globin terminator sequence, the CMV promoter sequence, and the mCherry protein A linear double-stranded DNA for RNA expression (β-gloter-CMVp-mCherry), which was sequentially provided with a coding gene sequence, was prepared.
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１をテンプレートとして、配列番号１０に示されるフォワードプライマーと配列番号１２（９Ｃ−ＤＹＫＤＤＤＤＫｃ−ｍＣｈｅｒｒｙ＋６８７ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ）を作製した。
(Production of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a β-globin terminator sequence, a CMV promoter sequence, a gene sequence encoding mCherry protein, and a DNA sequence encoding FLAG peptide)
Using pmCherry-C1 as a template, using the forward primer shown in SEQ ID NO: 10 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 12 (9C-DYKDDDDKc-mCherry + 687c), the sequence of base numbers 121 to 190 of the β-globin terminator sequence A linear double-stranded DNA for RNA expression (β-gloter-CMVp-mCherry-FLAG) comprising a CMV promoter sequence, a gene sequence encoding an mCherry protein, and a DNA sequence encoding a FLAG peptide in sequence did.
ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図３（１）、（２）に示す。 In the PCR reaction, the same reaction solution composition as described in Example 1 was used, and a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times. The results of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA are shown in FIGS. 3 (1) and 3 (2).
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、作製したβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙそれぞれ１００ｎｇを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入した。β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧの配置図を図４（ａ）に示す。
(Introduction to cells)
After seeding HEK293 cells in a 96-well plate at 2000 cells / well and culturing for 18 hours, 100 ng of each of the prepared β-gloter-CMVp-mCherry-FLAG and β-gloter-CMVp-mCherry was added to FuGENE (registered). Trademark: HD Transfection Reagent kit (Roche Diagnostics) was introduced into each cell. FIG. 4A shows a layout diagram of β-gloter-CMVp-mCherry-FLAG.
（ウェスタンブロッティングによるｍＣｈｅｒｒｙ及びＦＬＡＧ発現の確認）
β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙをそれぞれ導入したＨＥＫ２９３細胞から常法にしたがってトータルタンパク質を抽出した。得られたトータルタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した後、分離したタンパク質をメンブレンにトランスファーした。このメンブレンをブロッキングバッファーにてブロッキングした後、洗浄バッファーにて洗浄を行なった。洗浄したメンブレンに、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体である１Ｅ６（和光純薬工業社製）、Ｍ２（シグマアルドリッチ社製）、ＦＬＡ−１（ＭＢＬ社製）、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体であるＲＦＰポリクローナル抗体（ＭＢＬ社製）を添加してインキュベートした後に洗浄した。洗浄したメンブレンに、２次抗体ＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）又は、ＨＲＰ−抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を添加した。メンブレン上の発色の様子を観察した結果を図４（ｂ）に示す。
(Confirmation of mCherry and FLAG expression by Western blotting)
Total protein was extracted from HEK293 cells into which β-gloter-CMVp-mCherry-FLAG and β-gloter-CMVp-mCherry were introduced according to a conventional method. The obtained total protein was separated by SDS-PAGE, and then the separated protein was transferred to a membrane. The membrane was blocked with a blocking buffer and then washed with a washing buffer. On the washed membrane, anti-FLAG monoclonal antibody 1E6 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), M2 (manufactured by Sigma Aldrich), FLA-1 (manufactured by MBL), RFP polyclonal antibody (anti-mCherry antibody) (manufactured by MBL) ) Was added and incubated, and then washed. Secondary antibody HRP-anti-mouse IgG antibody (Jackson Immunoresearch) or HRP-anti-rabbit IgG antibody (Jackson Immunoresearch) was added to the washed membrane. The result of observing the state of color development on the membrane is shown in FIG.
（結果）
図４（ｂ）において、右レーン（ＦＬＡＧ）がβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧを導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したタンパク質、左レーン（−）がβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙを導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したタンパク質のウェスタンブロッティングによる解析結果である。右レーンでは抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体（ａｎｔｉ−ＲＦＰ）のいずれを用いてもバンドが検出され、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧを導入したＨＥＫ２９３細胞においてＦＬＡＧペプチドを融合したｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が存在していることが明らかとなった。
(result)
In FIG. 4 (b), the right lane (FLAG) is a protein extracted from HEK293 cells introduced with β-gloter-CMVp-mCherry-FLAG, and the left lane (−) is HEK293 cells introduced with β-gloter-CMVp-mCherry. It is the analysis result by the western blotting of the protein extracted from. In the right lane, a band was detected using either anti-FLAG antibody (anti-FLAG) or anti-mCherry antibody (anti-RFP), and FLAG peptide was fused in HEK293 cells into which β-gloter-CMVp-mCherry-FLAG was introduced. It was revealed that the mCherry protein was present.
一方、左レーンでは抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体を用いた場合のみにバンドが検出され、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙを導入したＨＥＫ２９３細胞においてはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が存在していることが明らかとなった。さらに、ＨＥＫ２９３細胞にβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧを導入し、４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した結果、赤色蛍光が観察され（図４（ｃ））、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子が細胞内で発現していることが確認された。 On the other hand, in the left lane, a band was detected only when the anti-mCherry antibody was used, and it was revealed that mCherry protein was present in HEK293 cells into which β-gloter-CMVp-mCherry was introduced. Furthermore, β-gloter-CMVp-mCherry-FLAG was introduced into HEK293 cells, and as a result of observation with a fluorescence microscope 48 hours later, red fluorescence was observed (FIG. 4 (c)), and the mCherry gene was expressed in the cells. It was confirmed that
前記結果より、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現すること、及び、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いると、ＲＮＡ発現用ＤＮＡの下流にタグペプチドをコードするＤＮＡ配列を簡易に付与することが可能であることが明らかとなった。さらに、本発明のフォワードプライマーを用いることで、簡便かつ迅速にターミネータ配列の下流にプロモータ配列を順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを作製することができることが明らかとなった。 Based on the above results, by introducing a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, a DNA sequence for RNA expression, and a DNA sequence encoding a tag peptide in sequence into the cell as it is, RNA expression and linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and a DNA sequence for RNA expression in sequence, a tag peptide is placed downstream of the RNA expression DNA. It became clear that the DNA sequence to be encoded can be easily added. Furthermore, it has been clarified that by using the forward primer of the present invention, a linear double-stranded DNA for RNA expression having a promoter sequence sequentially downstream of a terminator sequence can be prepared easily and rapidly.
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＣＡＡＸペプチドをコードするＤＮＡ配列を順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号１０に示されるフォワードプライマーと配列番号１３（３ＣＧＣ９−ＣＣＴＩＣｃ−ｐＥＧＦＰ＋７１７ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＣＡＡＸペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−ＣＡＡＸ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図５（２）に示す。
[Linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, a DNA sequence for RNA expression, and a DNA sequence encoding a signal peptide in sequence]
(Production of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a β-globin terminator sequence, a CMV promoter sequence, a gene sequence encoding EGFP protein, and a DNA sequence encoding CAAX peptide)
Using pEGFP-C1 (manufactured by Clontech) as a template, using the forward primer shown in SEQ ID NO: 10 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 13 (3CGC9-CCTICc-pEGFP + 717c), the base number 121 of the β-globin terminator sequence A linear double-stranded DNA for RNA expression (pEGFP-CAAX) was prepared, which was sequentially provided with a ~ 190th sequence, a CMV promoter sequence, a gene sequence encoding an EGFP protein, and a DNA sequence encoding a CAAX peptide. . In the PCR reaction, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 3 minutes was performed 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1. FIG. 5 (2) shows the result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA.
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号１０に示されるフォワードプライマーと配列番号１４（ＥＧＦＰ＋７１７ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図５（１）に示す。
(Preparation of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a β-globin terminator sequence, a CMV promoter sequence, and a gene sequence encoding EGFP protein in sequence)
Using pEGFP-C1 (manufactured by Clontech) as a template and using the forward primer shown in SEQ ID NO: 10 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 14 (EGFP + 717c), the base numbers 121 to 190 of the β-globin terminator sequence A linear double-stranded DNA for RNA expression (pEGFP) comprising a sequence, a CMV promoter sequence, and a gene sequence encoding an EGFP protein in sequence was prepared. In the PCR reaction, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 3 minutes was performed 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1. The result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA is shown in FIG.
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、作製したｐＥＧＦＰ−ＣＡＡＸ、及びｐＥＧＦＰそれぞれ１００ｎｇを、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により細胞に導入し、４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した。ｐＥＧＦＰ−ＣＡＡＸを細胞に導入して観察した結果を図６（ａ）、ｐＥＧＦＰを細胞に導入して観察した結果を図６（ｂ）に示す。
(Introduction to cells)
HEK293 cells were seeded on a 96-well plate at 2000 cells / well and cultured for 18 hours. Then, 100 ng of each of the prepared pEGFP-CAAX and pEGFP was added to the FuGENE (registered trademark) HD Transfection Reagent kit (Roche Diagnostics). The product was introduced into the cells according to the company) and observed with a fluorescence microscope 48 hours later. FIG. 6 (a) shows the results observed when pEGFP-CAAX was introduced into the cells, and FIG. 6 (b) shows the results observed when pEGFP was introduced into the cells.
（結果）
ｐＥＧＦＰ−ＣＡＡＸを導入した細胞においては、ゴルジ・細胞膜が存在する場所に緑蛍光が観察され、ＥＧＦＰタンパク質がゴルジ・細胞膜が存在する場所に局在して発現していることが確認された。一方、ｐＥＧＦＰを導入した細胞においては、細胞全体に緑蛍光が観察された。
(result)
In the cells into which pEGFP-CAAX was introduced, green fluorescence was observed where the Golgi / cell membrane was present, and it was confirmed that the EGFP protein was localized and expressed where the Golgi / cell membrane was present. On the other hand, in the cells into which pEGFP was introduced, green fluorescence was observed throughout the cells.
前記結果より、ターミネータ配列とプロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現すること、及び、シグナルペプチドが有効に機能していることが明らかとなった。 From the above results, RNA was introduced into the cell as it was by introducing linear double-stranded DNA for RNA expression, which was sequentially provided with a terminator sequence, a promoter sequence, a DNA sequence for RNA expression, and a DNA sequence encoding a signal peptide into the cell. It was revealed that it was expressed and that the signal peptide was functioning effectively.
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（２）］
（プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと、配列番号１５（Ｇｌｕｃ＋５５８ｔｔａＣ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（１）に示す。
[Linear double-stranded DNA for RNA expression (2) comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and a DNA sequence for RNA expression in sequence]
(Production of linear double-stranded DNA sequentially comprising a promoter sequence and a gene sequence encoding luciferase protein)
Using pCMV-Gluc (manufactured by New England Biolabs) as a template, a CMV promoter sequence and a luciferase protein are encoded using a forward primer represented by SEQ ID NO: 6 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 15 (Gluc + 558ttaC). A linear double-stranded DNA (CMVp-gluc) having a sequence of the gene sequence to be prepared was prepared. The PCR reaction was performed in the same reaction solution composition as described in Example 1, with 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes. FIG. 7 (1) shows the result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA.
（ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、ＳＶ４０ターミネータ配列のセンス鎖配列とＣＭＶプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えた配列番号１６（ＳＶ４０ｐＡ（１３０−２０８）−ｅＣＭＶ−６００）に示されるフォワードプライマーと配列番号１５に示されるリバースプライマーを用いて、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１３０番目〜２０８番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（３）に示す。
(Production of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising SV40 terminator sequence, CMV promoter sequence, and gene sequence encoding luciferase protein)
pCMV-Gluc (manufactured by New England Biolabs) as a template, SEQ ID NO: 16 (SV40pA (130-208) -eCMV-) comprising a sense strand sequence of the SV40 terminator sequence and a DNA sequence that anneals to the CMV promoter sequence 600) and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 15 are used to sequentially sequence the nucleotide numbers 130 to 208 in the SV40 terminator sequence, the CMV promoter sequence, and the gene sequence encoding the luciferase protein. A linear double-stranded DNA for RNA expression (Svter-CMVp-gluc) was prepared. In the PCR reaction, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1. FIG. 7 (3) shows the result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA.
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、β−グロビンターミネータ配列のセンス鎖配列とＣＭＶプロモータ配列にアニールするＤＮＡ配列とを順次備えた配列番号１７（βＧｌｏｐＡ（１２１−１９０）−ｅＣＭＶ−６００）に示されるフォワードプライマーと配列番号１５に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（βｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（５）に示す。
(Preparation of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising β-globin terminator sequence, CMV promoter sequence, and gene sequence encoding luciferase protein in sequence)
Using pCMV-Gluc (manufactured by New England Biolabs) as a template, SEQ ID NO: 17 (βGlopA (121-190) −) comprising a sense strand sequence of β-globin terminator sequence and a DNA sequence that anneals to the CMV promoter sequence in sequence eCMV-600) using the forward primer shown in SEQ ID NO: 15 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 15, the sequence of nucleotide numbers 121 to 190 in the β-globin terminator sequence, the CMV promoter sequence, and the gene encoding the luciferase protein A linear double-stranded DNA for RNA expression (βglotter-CMVp-gluc) having a sequence was prepared. In the PCR reaction, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1. FIG. 7 (5) shows the result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA.
（ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
まず、ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号１８（ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ＋１４０ｃ−Ｇｌｕｃ＋５５８ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１４０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−ＳＶ４０ １２１−１４０）を作製した。次に、作製したＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−ＳＶ４０ １２１−１４０をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号１９（ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ（１２１−２２０）ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜２２０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）を作製した。ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（２）に示す。
(Production of a linear double-stranded DNA comprising a CMV promoter sequence, a gene sequence encoding a luciferase protein, and an SV40 terminator sequence in sequence)
First, using pCMV-Gluc (manufactured by New England Biolabs) as a template, using a forward primer represented by SEQ ID NO: 6 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 18 (SV40polyA + 140c-Gluc + 558c), a promoter sequence and luciferase protein A linear double-stranded DNA (CMVp-gluc-SV40 121-140) was prepared, which was sequentially provided with a gene sequence coding for and a sequence of nucleotide numbers 121 to 140 of the SV40 terminator sequence. Next, using the prepared CMVp-gluc-SV40 121-140 as a template, using the forward primer shown in SEQ ID NO: 6 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 19 (SV40polyA (121-220) c), Then, a linear double-stranded DNA (CMVp-gluc-Svter) comprising a gene sequence encoding a luciferase protein and a sequence of nucleotide numbers 121 to 220 of the SV40 terminator sequence was prepared. In the PCR reaction, the same reaction solution composition as described in Example 1 was used, and a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times. FIG. 7 (2) shows the result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA.
（ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
まず、ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号２０（βＧｌｏｂｉｎｐＡ（１２１−１４０）ｃ−ｈＧｌｕｃ＋５５８ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１４０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ１２１−１４０）を作製した。次に、作製したＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ１２１−１４０をテンプレートとして、配列番号６に示されるフォワードプライマーと配列番号２１（βＧｌｏｐＡ（１２１−１９０）ｃＷＴ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ）を作製した。ＰＣＲ反応は、それぞれ実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図７（４）に示す。
(Production of a linear double-stranded DNA sequentially comprising a CMV promoter sequence, a gene sequence encoding a luciferase protein, and a β-globin terminator sequence)
First, using pCMV-Gluc (manufactured by New England Biolabs) as a template, using a forward primer represented by SEQ ID NO: 6 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 20 (βGlobinpA (121-140) c-hGluc + 558c), A linear double-stranded DNA (CMVp-gluc-βgluter121-140) comprising a CMV promoter sequence, a gene sequence encoding a luciferase protein, and a sequence of base numbers 121 to 140 of the β-globin terminator sequence in sequence. Produced. Next, using the prepared CMVp-gluc-βgloter 121-140 as a template, using the forward primer shown in SEQ ID NO: 6 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 21 (βGlopA (121-190) cWT), the CMV promoter sequence Then, a linear double-stranded DNA (CMVp-gluc-βgloter) having a gene sequence encoding a luciferase protein and a sequence of base numbers 121 to 190 of the β-globin terminator sequence in sequence was prepared. In the PCR reaction, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1, respectively. FIG. 7 (4) shows the result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA.
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をそれぞれ２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、前記で得られた、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、βｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒそれぞれ４０ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをＢｉｏＬｕｘ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）とＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（ベルトールド社製）を用いて測定した。ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた場合におけるルシフェラーゼの測定をそれぞれ図８〜１１に示す。
(Introduction to cells)
HEK293 cells, HeLa cells, COS-7 cells, and NIH3T3 cells were seeded in 96-well plates at 2000 cells / well and cultured for 18 hours, and CMVp-gluc, Svter-CMVp-gluc, obtained above, 40 ng each of βgloter-CMVp-gluc, CMVp-gluc-Svter, and CMVp-gluc-βglotter were introduced into each cell using FuGENE (registered trademark) HD Transfection Reagent kit (Roche Diagnostics) and collected 24 hours later. The secreted luciferase contained in the obtained culture supernatant is BioLux Gaussia Luciferase assay kit (manufactured by New England Biolabs) and Centro LB960. It was measured using (Berthold). The measurement of luciferase when HEK293 cells, HeLa cells, COS-7 cells, and NIH3T3 cells are used is shown in FIGS.
（結果）
Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ及びβｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃを導入することにより、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のすべてにおいてルシフェラーゼ活性が測定され、それぞれの細胞内でルシフェラーゼ遺伝子が発現していることが明らかとなった。特にβｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃにおいては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞を用いた場合には、従来の二本鎖ＤＮＡで用いられている配列の順である、ＣＭＶプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−グロビンターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ｇｌｕｃ−βｇｌｏｔｅｒ）よりもルシフェラーゼ量が高い値であった。
(result)
By introducing Svter-CMVp-gluc and βgloter-CMVp-gluc, luciferase activity was measured in all of HEK293 cells, HeLa cells, COS-7 cells, and NIH3T3 cells, and the luciferase gene was expressed in each cell. It became clear that In particular, in β-gloter-CMVp-gluc, when HEK293 cells, HeLa cells, and COS-7 cells are used, the CMV promoter sequence and luciferase protein, which are in the order of the sequences used in conventional double-stranded DNA, The amount of luciferase was higher than that of linear double-stranded DNA (CMVp-gluc-βgloter), which was sequentially provided with a gene sequence encoding γ and a β-globin terminator sequence.
前記結果より、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現することが明らかとなり、特に、ターミネータ配列としてβ−グロビンターミネータ配列、プロモータ配列としてＣＭＶプロモータ配列を用い、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、又はＣＯＳ−７細胞に導入することで、細胞内においてＲＮＡを高発現させることが可能であることが明らかとなった。 From the above results, it is clear that RNA is expressed in cells by introducing RNA expression linear double-stranded DNA comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and an RNA expression DNA sequence sequentially into the cell. In particular, by using β-globin terminator sequence as a terminator sequence and CMV promoter sequence as a promoter sequence and introducing it into HEK293 cells, HeLa cells, or COS-7 cells, RNA can be highly expressed in the cells. It became clear that there was.
［ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号２２（６ＡＣ−ｐＥＧＦＰ−６００）に示されるフォワードプライマーと配列番号２３（ＣＭＶｐＣ）に示されるリバースプライマーを用いて、６ＡＣ（ａｃａｃａｃａｃａｃａｃ）−ＣＭＶプロモータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−１）を作製した。次に、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号２４（ｐＥＧＦＰ＋１）に示されるフォワードプライマーと配列番号２５（ｅＣＭＶ−５７１６００ｃ−ｐＥＧＦＰ＋１０１８ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列上流側３０塩基とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−４）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。さらに前記作製した２種類の線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｊ−１及びＮｏ．ｊ−４をテンプレートとして、配列番号２４に示されるフォワードプライマーと配列番号２３に示されるリバースプライマーを用いて、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−１４：ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）を作製した。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。作製したそれぞれの線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｊ−１、ｊ−４、ｊ−１４のアガロース電気泳動の結果をそれぞれ図１２（ａ）、図１２（ｂ）に示す。
[RNA expression linear double-stranded DNA sequentially comprising a DNA sequence, a terminator sequence, and a promoter sequence]
(Preparation of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a gene sequence encoding EGFP protein, an SV40 terminator sequence, and a CMV promoter sequence in sequence)
Using pEGFP-C1 (Clontech) as a template, a forward primer represented by SEQ ID NO: 22 (6AC-pEGFP-600) and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 23 (CMVpC), 6AC (acacacacacac) -CMV promoter A linear double-stranded DNA (No. j-1) having a sequence was prepared. Next, using pEGFP-C1 (manufactured by Clontech) as a template, a forward primer represented by SEQ ID NO: 24 (pEGFP + 1) and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 25 (eCMV-571600c-pEGFP + 1018c) are used to code an EGFP protein. A linear double-stranded DNA (No. j-4) was prepared, which was sequentially provided with a gene sequence, SV40 terminator sequence, and 30 bases upstream of the CMV promoter sequence. In the PCR reaction, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1. Furthermore, the two types of linear double-stranded DNA No. j-1 and no. Using j-4 as a template, a forward primer shown in SEQ ID NO: 24 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 23 were used, and a gene sequence encoding an EGFP protein, an SV40 terminator sequence, and a CMV promoter sequence were sequentially provided. A linear double-stranded DNA for RNA expression (No. j-14: EGFP-Svter-CMVp) was prepared. The PCR reaction was performed using GXL polymerase (Takara Bio) according to the recommended protocol. The final concentration of each template was adjusted to 0.5 pg / μl, forward primer 0.3 μM and reverse primer 0.3 μM, respectively, and 98 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. using an iccycler thermal cycler (manufactured by BIO-RAD). A cycle of 15 seconds at 68 ° C. for 3 minutes was performed 30 times. Each of the prepared linear double-stranded DNAs No. The results of agarose electrophoresis for j-1, j-4, and j-14 are shown in FIGS. 12 (a) and 12 (b), respectively.
［シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号２２に示されるフォワードプライマーと配列番号２３に示されるリバースプライマーを用いて、６ＡＣ−ＣＭＶプロモータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−１）を作製した。次に、図１３に示すＫｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＫＭ４２６をテンプレートとして、配列番号２６（ｅＣＭＶ−３０−ＮｃＳｕ９＋１）に示されるフォワードプライマーと配列番号２５に示されるリバースプライマーを用いて、ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列の上流側３０塩基とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ−２１）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分秒のサイクルを３０回行った。
[Linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a DNA sequence encoding a signal peptide, a DNA sequence for RNA expression, a terminator sequence, and a promoter sequence]
(Preparation of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a DNA sequence encoding a mitochondrial translocation signal peptide, a gene sequence encoding an EGFP protein, an SV40 terminator sequence, and a CMV promoter sequence)
Using pEGFP-C1 (manufactured by Clontech) as a template and a forward primer represented by SEQ ID NO: 22 and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 23, a linear double-stranded DNA (No. .J-1). Next, DNA encoding a mitochondrial translocation signal peptide using the forward primer shown in SEQ ID NO: 26 (eCMV-30-NcSu9 + 1) and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 25 using Km plasmid pKM426 shown in FIG. 13 as a template. A linear double-stranded DNA (No. j-21) comprising a sequence, a gene sequence encoding an EGFP protein, an SV40 terminator sequence, and 30 bases upstream of the CMV promoter sequence was prepared. In the PCR reaction, a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1.
さらに、前記作製した２種類の線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｊ−１及びｊ−２１をテンプレートとして、配列番号２７（ＮｃＳｕ９＋１）に示されるフォワードプライマーと配列番号２３に示されるリバースプライマーを用いて、ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（Ｎｏ．ｊ２−１：ＮｃＳｕ９（９９）−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）を作製した。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートとして Ｎｏ．ｊ−1及びＮｏ．ｊ−２１それぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６５℃１５秒、６８℃３分のサイクルを３０回行った。 Furthermore, the two types of linear double-stranded DNA No. Using j-1 and j-21 as templates, a forward primer shown in SEQ ID NO: 27 (NcSu9 + 1) and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 23, and a DNA sequence encoding a mitochondrial translocation signal peptide and an EGFP protein A linear double-stranded DNA for RNA expression (No. j2-1: NcSu9 (99) -EGFP-Svter-CMVp), which was sequentially provided with a gene sequence to be processed, an SV40 terminator sequence, and a CMV promoter sequence, was prepared. The PCR reaction was performed using GXL polymerase (Takara Bio) according to the recommended protocol. The final concentration of each is No. as a template. j-1 and no. Each of j-21 was prepared at 0.5 pg / μl, forward primer 0.3 μM, reverse primer 0.3 μM, and 98 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 15 seconds, 68 using an iccycler thermal cycler (BIO-RAD). A cycle of 3 minutes at 30 ° C. was performed 30 times.
作製したそれぞれの線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｊ−２１、ｊ２−１のアガロース電気泳動の結果をそれぞれ図１２（ｂ）、図１２（ｃ）に示す。 Each of the prepared linear double-stranded DNAs No. The results of agarose electrophoresis of j-21 and j2-1 are shown in FIG. 12 (b) and FIG. 12 (c), respectively.
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞をそれぞれ２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｊ２−１及びｊ−１４それぞれ１００ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、２４時間後に蛍光顕微鏡で観察した。観察結果を図１４に示す。
(Introduction to cells)
HEK293 cells and HeLa cells were seeded on a 96-well plate at 2000 cells / well and cultured for 18 hours. 100 ng of each of j2-1 and j-14 was introduced into each cell using a FuGENE (registered trademark) HD Transfection Reagent kit (Roche Diagnostics), and observed with a fluorescence microscope 24 hours later. The observation results are shown in FIG.
（結果）
図１４（ａ）は、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｊ−１４（ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）をＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞にそれぞれ導入した場合、図１４（ｂ）は、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｊ２−１（ＮｃＳｕ９（９９）−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐ）をＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞にそれぞれ導入した場合の蛍光観察結果を示す。ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐを導入した細胞においては、細胞内全体に緑蛍光が観察され（図１４（ａ））、ＮｃＳｕ９（９９）−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ−ＣＭＶｐを導入した細胞においては、細胞内のミトコンドリアが存在する所に緑蛍光が観察された（図１４（ｂ））。
(result)
FIG. 14 (a) shows RNA expression linear double-stranded DNA No. When j-14 (EGFP-Svter-CMVp) was introduced into HEK293 and HeLa cells, respectively, FIG. The fluorescence observation result at the time of introduce | transducing j2-1 (NcSu9 (99) -EGFP-Svter-CMVp) into HEK293 and HeLa cell, respectively is shown. In cells into which EGFP-Svter-CMVp has been introduced, green fluorescence is observed throughout the cell (FIG. 14 (a)), and in cells into which NcSu9 (99) -EGFP-Svter-CMVp has been introduced, intracellular mitochondria are observed. Green fluorescence was observed in the presence of (Fig. 14 (b)).
前記結果より、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ、及び、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現すること及びシグナルペプチドが有効に機能していることが明らかとなった。 From the above results, the RNA expression linear double-stranded DNA comprising a DNA sequence for RNA expression, a terminator sequence, and a promoter sequence, a DNA sequence encoding a signal peptide, and a DNA sequence for RNA expression, It is clear that RNA is expressed in the cell and that the signal peptide functions effectively by introducing linear double-stranded DNA for RNA expression, which is sequentially provided with a terminator sequence and a promoter sequence, into the cell. became.
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（３）］
（参考例６−１：ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
図１５に示すｐＫＭ５９３をテンプレートとして、配列番号２８(ＥＦｌαｐ−１１００)に示されるフォワードプライマーと配列番号２９（ｈＣＬｕｃ＋１６６２ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃６分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図１６（２）に示す。
[Linear double-stranded DNA for RNA expression (3) comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and a DNA sequence for RNA expression in sequence]
(Reference Example 6-1: Production of linear double-stranded DNA sequentially comprising EF1α promoter sequence and gene sequence encoding luciferase protein)
Using pKM593 shown in FIG. 15 as a template, a forward primer represented by SEQ ID NO: 28 (EFlαp-1100) and a reverse primer represented by SEQ ID NO: 29 (hCLuc + 1662c), and a gene sequence encoding EF1α promoter sequence and luciferase protein A linear double-stranded DNA (EF1αp-hCluc) was prepared. The PCR reaction was carried out 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1 at 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 6 minutes. FIG. 16 (2) shows the result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA.
（参考例６−２：ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータとを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＫＭ５９３をテンプレートとして、配列番号２８に示されるフォワードプライマーと配列番号３０（βｇｌｏｂｉｎｐＡ１２１−２２０ｃ）に示されるリバースプライマーを用いて、ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列と、β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜２２０番目の配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ−β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−２２０））を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃６分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図１６（３）に示す。
(Reference Example 6-2: Production of linear double-stranded DNA sequentially comprising EF1α promoter sequence, gene sequence encoding luciferase protein, and β-Globin terminator)
Using pKM593 as a template, a forward primer shown in SEQ ID NO: 28 and a reverse primer shown in SEQ ID NO: 30 (βglobinpA121-220c), an EF1α promoter sequence, a gene sequence encoding a luciferase protein, and a β-Globin terminator sequence A linear double-stranded DNA (EF1αp-hCluc-β-Globin (121-220)) having the base numbers 121 to 220 in sequence was prepared. The PCR reaction was carried out 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1 at 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 6 minutes. FIG. 16 (3) shows the result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA.
（実施例：β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータ配列と、ＥＦ１αプロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＫＭ５９３をテンプレートとして、β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータ配列のセンス鎖配列とＥＦ１αプロモータ配列にアニールする配列とを順次備えた配列番号３１（βＧｌｏｐＡ（１２１−１９０）−ＥＦｌａｐ−１１００）に示されるフォワードプライマーと、配列番号２９に示されるリバースプライマーを用いて、β−Ｇｌｏｂｉｎターミネータ配列の塩基番号１２１番目〜１９０番目の配列と、プロモータ配列と、ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ（β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−１９０）−ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ）を作製した。ＰＣＲ反応は、実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃６分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図１６（１）に示す。
(Example: Production of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising β-Globin terminator sequence, EF1α promoter sequence, and gene sequence encoding luciferase protein)
Using pKM593 as a template, a forward primer represented by SEQ ID NO: 31 (βGlopA (121-190) -EFlap-1100) comprising a sense strand sequence of β-Globin terminator sequence and a sequence that anneals to the EF1α promoter sequence, and a sequence Using the reverse primer represented by No. 29, a linear two RNA expression sequence comprising a sequence of base numbers 121 to 190 of the β-Globin terminator sequence, a promoter sequence, and a gene sequence encoding a luciferase protein in sequence. A double-stranded DNA (β-Globin (121-190) -EF1αp-hCluc) was prepared. The PCR reaction was carried out 30 times with the same reaction solution composition as described in Example 1 at 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 6 minutes. FIG. 16 (1) shows the result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA.
（細胞への導入）
ＨＥＫ２９３細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、前記で得られた、ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ、ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ−βＧｌｏｂｉｎ（１２１−２２０）、β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−１９０）−ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃそれぞれ２７ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によりＨＥＫ２９３細胞に導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをＣＬ-Ｓ１０００ Ｃｌｕｃ発光基質１０００（ＡＴＴＯ社製）とＧＬＯＭＡＸ２０／２０ ＬＵＭＩＮＯＭＥＴＥＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。ルシフェラーゼの測定を図１７に示す。
(Introduction to cells)
HEK293 cells were seeded on a 96-well plate at 2000 cells / well and cultured for 18 hours, and EF1αp-hCluc, EF1αp-hCluc-βGlobin (121-220) and β-Globin (121-190) obtained above. ) -EF1αp-hCluc was introduced into HEK293 cells by FuGENE (registered trademark) HD Transfection Reagent kit (manufactured by Roche Diagnostics), and secreted luciferase contained in the culture supernatant collected 24 hours later was CL. -S1000 Measured using a Luc luminescent substrate 1000 (manufactured by ATTO) and GLOMAX 20/20 LUMINOMETER (manufactured by Promega). The measurement of luciferase is shown in FIG.
（結果）
ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃ−β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−２２０）、及び、β−Ｇｌｏｂｉｎ（１２１−１９０）−ＥＦ１αｐ−ｈＣｌｕｃのいずれも、ＨＥＫ２９３細胞においてルシフェラーゼ活性が測定され、それぞれの細胞内でルシフェラーゼ遺伝子が発現していることが明らかになった。
(result)
Both EF1αp-hCluc-β-Globin (121-220) and β-Globin (121-190) -EF1αp-hCluc were measured for luciferase activity in HEK293 cells, and the luciferase gene was expressed in each cell. It became clear that.
前記結果より、プロモータの種類を問わずに、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入することにより細胞内でＲＮＡが発現することが明らかとなった。 From the above results, regardless of the type of promoter, a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and a DNA sequence for RNA expression in that order is directly introduced into the cell. It was revealed that RNA was expressed.
［ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さの違いによる発現量の影響］
（ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、表１に記載の配列番号６、３２、３３、３４、３５、３６、３７に示されるフォワードプライマーと配列番号２３に示されるリバースプライマーを用いて、ＣＭＶプロモータ配列を含む線状二本鎖ＤＮＡであるＮｏ．ｏ−１１、Ｎｏ．ｏ−１３〜Ｎｏ．ｏ−１８を作製した。次に、Ｋｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＫＭ４２６をテンプレートとして、表２に記載の配列番号２６に示されるフォワードプライマーと配列番号２５、３８、３９に示されるリバースプライマーを用いて、ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡであるＮｏ．ｏ−１９〜Ｎｏ．ｏ−２１を作製した。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｏ−１１、Ｎｏ．ｏ−１３〜Ｎｏ．ｏ−１６のアガロース電気泳動の結果を図１８（ａ）Ｎｏ．ｏ−１７〜Ｎｏ．ｏ−２１のアガロース電気泳動の結果を図１８（ｂ）に示す。
[Effect of expression level due to differences in length of linear double-stranded DNA for RNA expression]
(Preparation of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a DNA sequence encoding a mitochondrial translocation signal peptide, a gene sequence encoding an EGFP protein, an SV40 terminator sequence, and a CMV promoter sequence)
Using pEGFP-C1 (manufactured by Clontech) as a template, using the forward primer shown in SEQ ID NO: 6, 32, 33, 34, 35, 36, 37 shown in Table 1 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 23, A linear double-stranded DNA containing a CMV promoter sequence, No. o-11, no. o-13-No. o-18 was produced. Next, using Km plasmid pKM426 as a template, a forward primer shown in SEQ ID NO: 26 described in Table 2 and a reverse primer shown in SEQ ID NOs: 25, 38, 39, and a DNA sequence encoding a mitochondrial translocation signal peptide No. 1 is a linear double-stranded DNA sequentially comprising a gene sequence encoding EGFP protein and an SV40 terminator sequence. o-19-No. o-21 was produced. The PCR reaction was performed using GXL polymerase (Takara Bio) according to the recommended protocol. The final concentration of each template was adjusted to 0.5 pg / μl, forward primer 0.3 μM, reverse primer 0.3 μM, and 98 ° C. for 10 seconds and 60 ° C. using an iccycler thermal cycler (manufactured by BIO-RAD). A cycle of 15 seconds at 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times. The prepared linear double-stranded DNA No. o-11, no. o-13-No. The results of agarose electrophoresis of o-16 are shown in FIG. o-17-No. The result of agarose electrophoresis of o-21 is shown in FIG.
さらに、表３中のテンプレート欄に記載した２種類の線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｏ−１１及びＮｏ．ｏ−１９、Ｎｏ．ｏ−１３及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１４及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１５及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１６及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１７及びＮｏ．ｏ−２０、Ｎｏ．ｏ−１８及びＮｏ．ｏ−２１それぞれ５ｐｇずつをテンプレートとして、表３の配列番号２７に示すフォワードプライマーと配列番号２３に示すリバースプライマーを用いて、ミトコンドリア移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列と、ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＳＶ４０ターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡであるＮｏ．ｏ−４１〜Ｎｏ．ｏ−４７を作製した。それぞれのＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ０．５ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃１５秒、７４℃５分のサイクルを４０回行った。作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｏ−４１〜Ｎｏ．ｏ−４７のアガロース電気泳動の結果を図１９に、作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｏ−４１〜Ｎｏ．ｏ−４７の配置図を図２０に順番に示す。 Furthermore, two types of linear double-stranded DNA No. 2 described in the template column in Table 3 are used. o-11 and no. o-19, no. o-13 and no. o-20, no. o-14 and no. o-20, no. o-15 and no. o-20, no. o-16 and no. o-20, no. o-17 and no. o-20, no. o-18 and no. DNA sequence encoding mitochondrial translocation signal peptide and gene sequence encoding EGFP protein using 5 pg each of o-21 as a template and using the forward primer shown in SEQ ID NO: 27 and the reverse primer shown in SEQ ID NO: 23 of Table 3. No. 2 which is a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising an SV40 terminator sequence and a CMV promoter sequence in sequence. o-41-No. o-47 was produced. Each PCR reaction was performed according to the recommended protocol using GXL polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.). The final concentration of each template was adjusted to 0.5 pg / μl, forward primer 0.3 μM and reverse primer 0.3 μM, respectively, using an iccycler thermal cycler (manufactured by BIO-RAD), 98 ° C. for 15 seconds, 74 A cycle of 5 minutes at 40 ° C. was performed 40 times. The produced linear double-stranded DNA for RNA expression No. o-41-No. The results of agarose electrophoresis of o-47 are shown in FIG. o-41-No. The layout of o-47 is shown in order in FIG.
なお、図２０における数字は、図１に示すように、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を１とした場合のｐＥＧＦＰ−Ｃ１上の塩基の位置を示し、例えば１０１８はｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を１とした場合の３’末端側の１０１８番目の塩基を示し、−６００はｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を１とした場合の５’末端側の６００番目の塩基を示す。 The numbers in FIG. 20 indicate the positions of bases on pEGFP-C1 when the adenine position of the start codon of the gene encoding the EGFP protein of pEGFP-C1 is 1, as shown in FIG. 1018 represents the 1018th base at the 3 ′ end when the adenine position of the start codon of the gene encoding the EGFP protein of pEGFP-C1 is 1, and −600 is a gene encoding the EGFP protein of pEGFP-C1 The 600th base on the 5 ′ end side when the adenine position of the start codon is 1 is shown.
（細胞への導入）
ＨｅＬａ細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートに播種して１８時間培養後、前記で得られたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．ｏ−４１〜ｏ−４７それぞれ１００ｎｇをＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、２４時間後に蛍光顕微鏡で観察した。観察結果を図２１に示す。
(Introduction to cells)
HeLa cells were seeded on a 96-well plate at 2000 cells / well and cultured for 18 hours, and then the linear double-stranded DNA for RNA expression obtained above was used. 100 ng each of o-41 to o-47 was introduced into each cell by FuGENE (registered trademark) HD Transfection Reagent kit (Roche Diagnostics), and observed with a fluorescence microscope 24 hours later. The observation results are shown in FIG.
Ｎｏ．ｏ−４１、４７、４２，４３を導入した細胞では１６０ｍｓの露光時間で緑蛍光が観察されたが、Ｎｏ．ｏ−４４、４５、４６を導入した細胞では１ｓの露光時間で緑蛍光が少し観察された。前記結果より、ＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの長さが短いほどＲＮＡ発現量が多く、また、ｏ−４１でも緑蛍光が観察されたことから、ターミネータとプロモータがリンカー配列を介さずに直接連結していてもよいことが明らかとなった。 No. In the cells into which o-41, 47, 42, and 43 were introduced, green fluorescence was observed with an exposure time of 160 ms. In the cells into which o-44, 45, and 46 were introduced, green fluorescence was slightly observed with an exposure time of 1 s. From the above results, as the length of the linear double-stranded DNA for RNA expression is shorter, the amount of RNA expression is larger, and green fluorescence was also observed with o-41. Therefore, the terminator and the promoter were not mediated by the linker sequence. It became clear that they could be directly connected.
［ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異を有する配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ］
（β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異を有する配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、表４の配列番号１０に示されるフォワードプライマーと、配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７に示されるリバースプライマーを用いて、β−グロビンターミネータ配列と、ＣＭＶプロモータ配列と、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする遺伝子配列と、ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異を有する配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａをそれぞれ作製した。なお、Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａは、それぞれＦＬＡＧのペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫにおける１アミノ酸がアラニン（Ａ）に変異したペプチドであるＡＹＫＤＤＤＤＫ、ＤＡＫＤＤＤＤＫ、ＤＹＡＤＤＤＤＫ、ＤＹＫＡＤＤＤＫ、ＤＹＫＤＡＤＤＫ、ＤＹＫＤＤＡＤＫ、ＤＹＫＤＤＤＡＫ、ＤＹＫＤＤＤＤＡをコードするように変異を有するＤＮＡ配列を備えている。
[Linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, a DNA sequence for RNA expression, and a sequence having a mutation in the DNA sequence encoding the tag peptide]
(Preparation of linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a β-globin terminator sequence, a CMV promoter sequence, a gene sequence encoding mCherry protein, and a sequence having a mutation in the DNA sequence encoding FLAG peptide) )
Using pmCherry-C1 (manufactured by Clontech) as a template, a forward primer represented by SEQ ID NO: 10 in Table 4 and a reverse primer represented by SEQ ID NOs: 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 , Β-globin terminator sequence, CMV promoter sequence, gene sequence encoding mCherry protein, and linear double-stranded DNA for RNA expression No. 1 comprising a sequence having a mutation in the DNA sequence encoding FLAG peptide. D1A, Y2A, K3A, D4A, D5A, D6A, D7A, and K8A were produced. In addition, No. D1A, Y2A, K3A, D4A, D5A, D6A, D7A, K8A are peptides DYKDDDDK, DAKDDDK, DYKADDDK, DDK, DYKDDK, DYKDDK, DYKDDK, DK, DK A DNA sequence having a mutation is provided so as to encode DYKDDDDA.
ＰＣＲ反応は、いずれも実施例１記載と同様の反応溶液組成にて、９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。作製した線状二本鎖ＤＮＡのアガロース電気泳動の結果を図２２に示す。 In the PCR reaction, the same reaction solution composition as described in Example 1 was used, and a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, and 68 ° C. for 2 minutes was performed 30 times. The result of agarose electrophoresis of the prepared linear double-stranded DNA is shown in FIG.
（細胞への導入）
実施例２に記載の方法と同様に、作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａ、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙをＨＥＫ２９３細胞にそれぞれ導入した。
(Introduction to cells)
In the same manner as in the method described in Example 2, the prepared linear double-stranded DNA for RNA expression No. D1A, Y2A, K3A, D4A, D5A, D6A, D7A, K8A, β-gloter-CMVp-mCherry-FLAG, and β-gloter-CMVp-mCherry were introduced into HEK293 cells, respectively.
（ウェスタンブロッティングによるｍＣｈｅｒｒｙ及びＦＬＡＧ発現の確認）
実施例２に記載の方法と同様に、作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａ、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、及び、β−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙをＨＥＫ２９３細胞にそれぞれ導入したＨＥＫ２９３細胞からトータルタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図２３に示す。図２３において、１Ｄａ、２Ｙａ、３Ｋａ、４Ｄａ、５Ｄａ、６Ｄａ、７Ｄａ、８Ｋａレーンが、それぞれ作製したＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ Ｎｏ．Ｄ１Ａ、Ｙ２Ａ、Ｋ３Ａ、Ｄ４Ａ、Ｄ５Ａ、Ｄ６Ａ、Ｄ７Ａ、Ｋ８Ａを導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したタンパク質のウェスタンブロッティングによる解析結果、左から２番目のレーン（ＦＬＡＧ）がβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＦＬＡＧ、一番左レーン（−）がβ−ｇｌｏｔｅｒ−ＣＭＶｐ−ｍＣｈｅｒｒｙを導入したＨＥＫ２９３細胞から抽出したタンパク質のウェスタンブロッティングによる解析結果である。
(Confirmation of mCherry and FLAG expression by Western blotting)
In the same manner as in the method described in Example 2, the prepared linear double-stranded DNA for RNA expression No. Total protein was extracted from HEK293 cells into which D1A, Y2A, K3A, D4A, D5A, D6A, D7A, K8A, β-gloter-CMVp-mCherry-FLAG, and β-gloter-CMVp-mCherry were introduced into HEK293 cells, respectively. Western blotting was performed. The results are shown in FIG. In FIG. 23, 1 Da, 2Ya, 3Ka, 4Da, 5Da, 6Da, 7Da, and 8Ka lanes represent the RNA expression linear double-stranded DNA No. Analysis results by Western blotting of proteins extracted from HEK293 cells into which D1A, Y2A, K3A, D4A, D5A, D6A, D7A, and K8A were introduced. The leftmost lane (−) is the analysis result by Western blotting of the protein extracted from HEK293 cells into which β-gloter-CMVp-mCherry was introduced.
（結果）
図２３において、１Ｄａ、２Ｙａ、３Ｋａ、４Ｄａ、５Ｄａ、６Ｄａ、７Ｄａ、８Ｋａレーンそれぞれにおいて抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体（ａｎｔｉ−ＲＦＰ）のいずれを用いてもバンドが検出されたが、バンドのパターンがＦＬＡＧレーンと異なっていた。上記結果から、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを用いると、変異を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うだけでタグペプチドをコードするＤＮＡ配列に簡易に変異を導入することが可能であること、及び、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列と、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列に変異を有する配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡを細胞にそのまま導入すると、細胞内に変異を有するＦＬＡＧペプチドが存在していることが明らかとなった。したがって、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡも同様に、変異を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うだけで、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流に簡易に変異を導入することが可能となる。
(result)
In FIG. 23, bands were detected using either anti-FLAG antibody (anti-FLAG) or anti-mCherry antibody (anti-RFP) in each of the 1Da, 2Ya, 3Ka, 4Da, 5Da, 6Da, 7Da, and 8Ka lanes. However, the band pattern was different from the FLAG lane. From the above results, when using linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, a DNA sequence for RNA expression, and a DNA sequence encoding a tag peptide, a primer having a mutation is used. It is possible to introduce a mutation into a DNA sequence encoding a tag peptide simply by performing PCR, and a terminator sequence, a promoter sequence, a DNA sequence for RNA expression, and a DNA encoding the tag peptide. When linear double-stranded DNA for RNA expression, which was sequentially provided with a sequence having a mutation in the sequence, was directly introduced into a cell, it was revealed that a FLAG peptide having a mutation was present in the cell. Therefore, RNA expression linear double-stranded DNA comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and an RNA expression DNA sequence in the same manner can be similarly obtained by performing PCR using primers having mutations. Mutations can be easily introduced downstream of the sequence.
本発明によると、ＲＮＡ発現用ＤＮＡの上流又は下流にシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、タグペプチドをコードするＤＮＡ配列等を付与することや、ＲＮＡ発現用ＤＮＡに変異を導入することが簡易となることから、細胞内におけるタンパク質の機能解析や、細胞を用いた有用タンパク質の生産等の分野において有用である。 According to the present invention, it is easy to add a DNA sequence encoding a signal peptide, a DNA sequence encoding a tag peptide, or the like upstream or downstream of an RNA expression DNA, or to introduce a mutation into an RNA expression DNA. Therefore, it is useful in fields such as functional analysis of proteins in cells and production of useful proteins using cells.
Claims (4)
（ａ）ターミネータ配列と、プロモータ配列と、タンパク質をコードする遺伝子配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ；
（ｂ）タンパク質をコードする遺伝子配列と、ターミネータ配列と、プロモータ配列とを順次備えたＲＮＡ発現用線状二本鎖ＤＮＡ； A linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence and a promoter sequence shown in (a) or (b) below , wherein the terminator sequence is (A / T / G), (A / T / G), T, A, A, A, (A / T / G / C), (A / T / G / C), (A / G / C) The linear double-stranded DNA for RNA expression, wherein the promoter sequence is a human cytomegalovirus (CMV) promoter sequence or a human elongation factor 1α (EF1α) promoter sequence .
(A) a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a terminator sequence, a promoter sequence, and a gene sequence encoding a protein in sequence;
(B) a linear double-stranded DNA for RNA expression comprising a gene sequence encoding a protein , a terminator sequence, and a promoter sequence in sequence;
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