JP6273382B2 - スタチン系薬物用のキラル中間体の製造方法 - Google Patents
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Description
1)クロロ酢酸とベンジルアルコールを出発原料として、エーテル化反応によってベンジルオキシ酢酸を生成するステップと、
2)ベンジルオキシ酢酸とモルホリンを縮合反応させて2−ベンジルオキシモルホリノアセトアミドを生成するステップと、
3)2−ベンジルオキシモルホリノアセトアミドと式(5)に示されるアセトアセテートを置換反応させて式(6)に示されるジオン中間体を生成するステップと、
4)式(6)に示されるジオン中間体を不斉還元反応させて式(7)に示されるキラルジオール中間体を生成するステップと、
5)式(7)に示されるキラルジオール中間体と2,2−ジメトキシプロパンを反応させて式(8)に示される(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを生成するステップと、
6)式(8)に示される(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを脱ベンジル化して式(9)に示される(4R−cis)−6−ヒドロキシメチル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを得るステップと、
7)式(9)に示される(4R−cis)−6−ヒドロキシメチル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを酸化反応させて式(I)に示されるキラル中間体を得るステップとを備える。
好ましくは、Rはtert−ブチル基、tert−アミル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を示す。)
a)配列番号1ないし配列番号6で表される配列、
b)a)に示される配列と少なくとも70%の同一性を有し且つ改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、又は
c)a)の配列において1又は複数のアミノ酸残基が欠失、付加及び/又は置換されて得られるものあって、改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、
から選ばれる一種を含むジケトレダクターゼ突然変異体であり、
b)に示される配列は配列番号7に示される配列ではない。
1)クロロ酢酸1とベンジルアルコール2を出発原料として、エーテル化反応によってベンジルオキシ酢酸3を生成するステップと、
2)ベンジルオキシ酢酸3とモルホリンを縮合反応させて2−ベンジルオキシモルホリノアセトアミド4を生成するステップと、
3)2−ベンジルオキシモルホリノアセトアミド4と式(5)に示されるアセトアセテートを置換反応させて式(6)に示されるジオン中間体を生成するステップと、
4)式(6)に示されるジオン中間体を不斉還元反応させて式(7)に示されるキラルジオール中間体を生成するステップと、
5)式(7)に示されるキラルジオール中間体と2,2−ジメトキシプロパンを反応させて式(8)に示される(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを生成するステップと、
6)式(8)に示される(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを脱ベンジル化して式(9)に示される(4R−cis)−6−ヒドロキシメチル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを得るステップと、
7)式(9)に示される(4R−cis)−6−ヒドロキシメチル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを酸化反応させて式(I)に示されるキラル中間体を得るステップと、を備える。
a)配列番号1ないし配列番号6で表される配列、
b)a)に示される配列と少なくとも70%の同一性を有し且つ改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、又は
c)a)の配列において1又は複数のアミノ酸残基が欠失、付加及び/又は置換されて得られるものであって、改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、
から選ばれる一種を含むジケトレダクターゼ突然変異体であり、
b)に示される配列は配列番号7に示される配列ではない。
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG、
(2)配列番号2に示されるアミノ酸配列であって、突然変異部位がI94V+F231Wである。
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG、
(3)配列番号3に示されるアミノ酸配列であって、突然変異部位がI94V+V151Q+F231Wである。
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG、
(4)配列番号4に示されるアミノ酸配列であって、突然変異部位がV239I+R257Kである。
5MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDIVGLTTVYNISSQGGEKQKEFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG、
(5)配列番号5に示されるアミノ酸配列であって突然変異部位がV151Q+R257Kである。
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQKEFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG、又は
(6)配列番号6に示されるアミノ酸配列であって、突然変異部位がI94V+V151Qである。
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG。
(2)配列番号10:配列番号8に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において691−693bp番目のTTCがTGGに突然変異し、且つ280−282bp番目のATTがGTT、GTC、GTA又はGTGに突然変異してなるもの、
(3)配列番号11:配列番号8に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において691−693bp番目のTTCがTGGに突然変異し、280−282bp番目のATTがGTT、GTC、GTA又はGTGに突然変異し、且つ451−453bp番目のGTCがCAA又はCAGに突然変異してなるもの、
(4)配列番号12:配列番号8に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において715−717bp番目のGTCがATT、ATC又はATAに突然変異し、且つ769−771bp番目のCGCがAAA又はAAGに突然変異してなるもの、
(5)配列番号13:配列番号8に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において451−453bp番目のGTCがCAA又はCAGに突然変異し、且つ769−771bp番目のCGCがAAA又はAAGに突然変異してなるもの、又は
(6)配列番号14:配列番号8に示されるジケトレダクターゼ遺伝子配列において451−453bp番目のGTCがCAA又はCAGに突然変異し、且つ280−282bp番目のATTがGTT、GTC、GTA又はGTGに突然変異してなるもの。
1、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)SK121菌株由来のジケトレダクターゼ(DKR)(配列番号7)の部位特異的飽和突然変異誘発
ステップ1の前記内容に基づき、上記培養皿上の単一コロニーを取って96ディープウェルプレートに接種し、各ウェルに予め50μm/mlのアンピシリンを含有するLB液体培地を0.5ml添加して、37℃で振とう培養を3h行った後、IPTGを最終濃度が0.2mMになるまで添加し、18℃で16h誘導発現させ、6000gで10min遠心分離して菌体を収集し、菌体に対して超音波細胞破砕器(JY92−2D、寧波新芝生物科技股イ分有限公司製)により細胞を破砕し、4℃、10000gで20min遠心分離して上澄液を得て、マイクロプレートリーダーで初期の活性スクリーニングを行った。96ウェルプレートに30μLのDMSO、主原料として1.5μLの6−ベンジルオキシ−3,5−ジオキソ−tert−ブチルカプロエート(30mg/mL、DMSOに溶解したもの)、2.5μLのNADH(20mg/mL)、216μLのリン酸塩緩衝液(100mM、pH=6.0)を添加して、340nmでバックグラウンド検出を行い、次に各ウェルにそれぞれ調製済みの突然変異体酵素液50μLを添加し、添加直後に30℃で340nmの吸光度の変化を測定した。
ただし、△Aは反応過程中の吸光度の変化を示し、
V1は反応系の全体積を示し、
6.22は消光係数であり、
tは△Aの検出時間を示し、
V1は添加される酵素液の体積を示す。
ステップ2において酵素活性が親より高い突然変異体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB液体培地500mlに接種し、37℃で振とう培養をOD600=0.6になるまで行い、最終濃度が0.2mMになるまでIPTGを添加して、18℃で誘導発現させた。16h誘導発現させた後、6000gで10min遠心分離して菌体を収集した。菌体に対して超音波細胞破砕器(JY92−2D、寧波新芝生物科技股イ分有限公司製)により細胞を破砕し、4℃、10000gで20min遠心分離して上澄液を得て、活性の検出に用いた。10mlの反応フラスコに、主原料として
ジケトレダクターゼ突然変異体の発現及び同定を簡便に実施するために、遺伝子の5’末端と3’末端の何れにも対応する制限酵素切断部位が設計されている。Nde I及びXho Iを使用してそれぞれ目的遺伝子とpET−22b(+)(腸菌においてタンパク質を発現可能なその他の発現プラスミドも使用可能)を独立して同時に切断し、切断された目的遺伝子とプラスミドの大きな断片とをT4 DNAリガーゼで連結反応させて、その産物を大腸菌DH5a菌株のコンピテント細胞に形質転換し、次に形質転換されたコンピテント細胞を50μg/mlのアンピシリンを含むLB培養板に塗布して、37℃で培養して一晩放置した。
(1)ベンジルオキシ酢酸(化合物3)の合成
反応フラスコにテトラヒドロフラン960gとトルエン41gを添加し、系の温度を10〜20℃に制御し、534.0gの水酸化カリウムを四回で加え、水酸化カリウムの添加が終了した後、1371.1gのベンジルアルコールを三回で加えた。300.1gのクロロ酢酸を480.5gのテトラヒドロフランに溶解させた後、滴下温度を70−80℃に制御し、クロロ酢酸のテトラヒドロフラン溶液を前述系に滴下して、クロロ酢酸が完全に消費されるまで反応させた。系冷却後、3.12Kgの精製水を添加してテトラヒドロフランを減圧除去し、水相をトルエンで四回抽出して、10〜20℃で塩酸を使用して水相のpHを3に調整し、水相をメチルtert−ブチルエーテルで二回抽出した後、濃縮させて収率88.3%にてGC純度≧99.2%のベンジルオキシ酢酸(化合物3) 421.3gを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 12.28 (br, 1H), 7.34−7.30 (m, 5H), 4.59 (s, 2H), 4.12 (s, 2H)。
反応フラスコに700.5gのジクロロメタンと110.1gの化合物3を添加して、系の温度を10〜20℃に制御しながら575.3gの塩化オキサリルを滴下し、塩化オキサリルの添加が終了した後、lh撹拌し、次に低沸点物質を濃縮除去して、使用に備えた。48.0gのモルホリン、75.5gのトリエチルアミン及び480.1gのトルエンを反応フラスコに添加し、温度を10℃程度に制御して、上記濃縮液を反応フラスコの系に滴下した。滴下終了後、lh撹拌し、次に希塩酸を添加して反応をクエンチさせて分液し、有機相を順に水、飽和炭酸水素ナトリウム、水でそれぞれ一回洗浄し、濃縮させて収率90.3%にてHPLC純度≧97.5%の2−ベンジルオキシ−モルホリノアセトアミド(化合物4) 116.0gを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.33−7.28 (m, 5H),4.56 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 3.63−3.57 (m, 6H), 3.45−3.44 (br, 2H)。
500gのtert−アミルアルコールと34.6gの4−ジメチルアミノピリジンを2.5Lの無水テトラヒドロフランに溶解させ、5℃程度に降温し、次に蒸留したばかりのジケテン524.3gをゆっくり滴下した。滴下終了後、20℃程度に昇温して反応させ、TLCでモニターしながら完全に反応させた。溶剤と過剰なジケテンを蒸留除去し、次に減圧蒸留(5〜8mmHg、80−90℃)によって精製して、収率75.2%にて、GC純度≧98.5%のtert−アミルアセトアセテート(化合物5a) 732.5gを得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ : 6.11 (s, 2H), 3.39(s, 2H), 2.28 (s, 3H), 1.81 (q, J=7.4 Hz, 2H), 1.47 (s, 6H), 0.92 (t, J= 7.5 Hz, 3H)。
72.3gの水素化ナトリウムを1600.1gのテトラヒドロフランに懸濁させ、温度を10℃程度に制御しながら387.3gのtert−アミルアセトアセテートを滴下し、温度を−20℃程度に低下させて、次に722.5mLのn−ブチルリチウムをゆっくり滴下し、滴下終了後、300.3gの化合物4をさらに滴下し、TLCでモニターしながら完全に反応させた。希塩酸を系に添加して反応をクエンチさせ、分液後、水相をメチルtert−ブチルエーテルで抽出し、有機相を併合して濃縮させて収率70.0%にてHPLC純度≧98.2%の6−(ベンジルオキシ)−3,5−ジオキソシクロペンチルカプロエート(化合物6a) 200.8gを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.32−7.23 (m, 5H),6.08 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 3.24 (s, 2H), 3.09 (s, 2H), 1.14−1.02 (m, 8H), 0.88 (t, J= 7.6 Hz, 3H)。
反応フラスコに精製水(4.0 mL/gの化合物6a)と6−(ベンジルオキシ)−3,5−ジオキソtert−アミルカプロエート(化合物6a、1.0mol)を加え、均一に撹拌した後、化合物6aの質量に対して約0.1mg/gのジケトレダクターゼ突然変異体I94V+F231W粗酵素液、ギ酸アンモニウム(2.0mol)、NAD+(0.03mol)を添加し、pH=6.2〜6.4に調整した後、系を30℃程度に昇温して、約20h保温した。反応終了後、系を65〜70℃に昇温して酵素タンパク質を破壊し、酢酸エチルを添加してシリカゲルパッドを通過させ、分液して、水相を酢酸エチルで逆抽出し、有機相を併合して濃縮させ、生成物として純度が95%、収率が73.1%、ee値が99.3%超え、de値が93.5%である、(3R,5S)−6−(ベンジルオキシ)−3,5−ジヒドロキシtert−アミルカプロエート(化合物7a)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.37−7.30 (m, 5H), 6.12 (s, 2H), 4.59 (d, J= 7.2Hz, 30 2H), 4.31 (br, 1H), 4.14 (br, 1H), 3.09 (s, 2H), 1.14−1.02 (m, 8H), 0.88 (t, J= 7.6 Hz,3H)。
反応フラスコにアセトン(10.0mL/gの化合物7a)、(3R,5S)−6−ベンジルオキシ−3,5−ジヒドロキシtert−アミルカプロエート(化合物7a、1.0mol)、2,2−ジメトキシプロパン(2.0mol)及び触媒量のp−トルエンスルホン酸ピリジニウム塩(0.02mol)を添加して撹拌し、20℃程度で原料(化合物7a)がほぼなくなるまで反応させ、3質量%の希塩酸(0.05mol)を加えて洗浄し、更に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加して系を中和し、低沸点物質を減圧除去した後、水を添加して分液し、水相を酢酸エチルで2回抽出し、有機相を併合して飽和食塩水で一回洗浄し、有機相をシリカゲルパッドに通過させた後、濃縮させて、生成物として、純度93.5%、収率90.3%の(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−tert−アミルカプロエート(化合物8a)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.35−7.28 (m, 5H), 6.13 (s, 2H), 4.80 (d, J= 7.5 Hz, 2H), 4.33−4.28 (m, 1H), 4.12−4.07 (m, 1H), 2.87−2.64 (m, 2H), 1.83−1.79 (m, 2H), 1.37− 1.29 (m, 14H), 0.88 (t, J= 7.5 Hz, 3H)。
反応フラスコに酢酸エチル(10.0mL/gの化合物8a)、(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−tert−アミルカプロエート(化合物8a、1.0mol)及び金属触媒としての水酸化パラジウム(5%)を添加して撹拌し、系を密閉した後、窒素ガスで五回置換し、次に水素ガスで三回置換し、系を20℃程度で原料(化合物8a)がほぼなくなるまで反応させた。窒素ガスで三回置換して放圧した後、系を吸引濾過して、濾過ケーキを酢酸エチルで二回洗浄し、濾液とリンス液を混合して乾固するまで濃縮させ、製品として純度96.7%、収率93.9%の(4R−cis)−6−ヒドロキシメチル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−tert−アミルカプロエート(化合物9a)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) 5: 4.33−4.26 (m, 1H), 4.01−3.98 (m, 1H), 3.81−3.48 (m, 2H), 2.46−2.30 (m, 2H), 1.79−1.76 (m, 2H), 1.42−1.33 (m, 14H), 0.88 (t, J= 7.6 Hz, 3H)。
反応フラスコにジクロロメタン(10.0mL/gの化合物9a)と2−((4R,6S)−6−メトキシ−2,2−ジメチル−[1,3]ジエポキシ−4−イル)−アセテート(化合物9a、1.0mol)を添加して撹拌し、系の温度を−10〜0℃に低下させ、ジメチルスルホキシド(10.0mol)とN,N−ジイソプロピルエチルアミン(3.5mol)を添加し、次に三酸化硫ピリジン(3.25mol)を分割して添加し、添加終了後、保温して化合物9aがほぼなくなるまで反応させた。次に、系に精製水を添加して反応をクエンチさせ、分液して水相をジクロロメタンで一回逆抽出し、有機相を併合して精製水で洗浄し、乾固するまで濃縮させ、目的側鎖生成物として純度93.2%、収率82.5%の(4R−Cis)−6−ホルミル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−tert−アミルカプロエート(式Ia)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 9.58 (s, 1H), 4.34−4.30 (m, 2H), 2.43−2.37 (m, 2H), 2.46−2.30 (m, 2H), 1.57−1.43 (m, 2H), 1.43−1.36 (m, 12H), 0.89 (t, J= 7.8 Hz, 3H)。
(1)ベンジルオキシ酢酸(化合物3)の合成
反応フラスコに720.3gのテトラヒドロフランと41.1gのトルエンを添加し、系の温度を10−20℃に制御して、382.1gの水酸化ナトリウムを分割して添加し、水酸化ナトリウムの添加が終了した後、系に1371.1gのベンジルアルコールを三回添加した。300.2gのクロロ酢酸を720.5gのテトラヒドロフランに溶解した後、滴下温度を70−80℃に制御して、クロロ酢酸のテトラヒドロフラン溶液を前述系に滴下し、系をクロロ酢酸が使用済みになるまで反応させた。系冷却後、3.1Kgの精製水を添加し、次にテトラヒドロフランを減圧除去して、水相をトルエンで四回抽出し、10−20℃で塩酸を使用して水相のpHを3.2に調整し、水相をメチルtert−ブチルエーテルで二回抽出した後、濃縮させて収率86.2%にてGC純度≧99.1%のベンジルオキシ酢酸(化合物3) 410.5gを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 12.28 (br, 1H), 7.34−7.30 (m, 5H), 4.59 (s, 2H), 4.1215 (s, 2H)。
反応フラスコに700.0gのトルエンと110.1gの化合物3を添加し、系の温度を10−20℃に制御して557.3gの塩化チオニルを滴下し、塩化チオニルの添加が終了した後、系をlh撹拌し、濃縮させて低沸点物質を除去し、使用に備えた。48.0gのモルホリン、75.1gのトリエチルアミン及び480.0gのトルエンを反応フラスコに加え、温度を15℃程度に制御して、上記濃縮液を反応フラスコの系に滴下した。滴下終了後、lh撹拌して希塩酸を添加して反応をクエンチさせ、分液して有機相を順に水、飽和炭酸水素ナトリウム、水でそれぞれ一回洗浄し、濃縮させて、収率90.2%にてHPLC純度≧97.5%の2−ベンジルオキシ−モルホリノアセトアミド(化合物4) 116.3gを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.33−7.28 (m, 5H), 4.56 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 3.63−3.57 (m, 6H), 3.45−3.44 (br, 2H)。
500.0gのtert−アミルアルコールと34.6gの4−ジメチルアミノピリジンを2.5Lの無水テトラヒドロフランに溶解して、5℃程度に降温し、次に、蒸留した直後のジケテン524.2gをゆっくり滴下した。滴下終了後、15℃程度に降温して反応させ、TLCでモニターしながら完全に反応させた。溶剤と過剰なジケテンを蒸留除去し、次に減圧蒸留(5〜8ミリメートルの水銀柱、80〜90℃)により精製して収率75.3%にてGC純度≧98.5%のtert−アミルアセトアセテート(化合物5a) 732.2gを得た。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ : 6.11 (s, 2H), 3.39 (s, 2H), 2.28 (s, 3H), 1.81 (q, J=7.4 Hz, 2H), 1.47 (s, 6H), 0.92 (t, J= 7.5 Hz, 3H)。
144.6gの水酸化ナトリウムを1600.2gのテトラヒドロフランに懸濁させ、温度を10℃程度に制御しながら387.5gのtert−アミルアセトアセテートを滴下し、温度を約−20℃に低下させて、次に、722mLのジプロピルエチルリチウムをゆっくり滴下して、滴下終了後、300.2gの化合物4を添加し、TLCでモニターしながら完全に反応させた。希塩酸を系に添加して反応をクエンチさせ、分液後、水相をメチルtert−ブチルエーテルで抽出して、有機相を併合して濃縮させて、収率68.2%にてHPLC純度≧98.3%の6−(ベンジルオキシ)−3,5−ジオキソシクロペンチルカプロエート(化合物6a) 194.8gを得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.32−7.23 (m, 5H), 6.08 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 3.24 (s, 2H), 3.09 (s, 2H), 1.14−1.02 (m, 8H), 0.88 (t, J= 7.6Hz, 3H)。
反応フラスコに精製水(4.0mL/gの化合物6a)と6−(ベンジルオキシ)−3,5−ジオキソtert−アミルカプロエート(化合物6a、1.0mol)を添加して、均一に撹拌した後、化合物6aの質量に対して約0.1mg/gのジケトレダクターゼ突然変異体I94V+V151Q+F231W粗酵素液、ギ酸アンモニウム(2.0mol)、NAD+(0.03mol)を添加し、pH=6.2〜6.4に調整した後、系を30℃程度に昇温して、20h保温した。反応終了後、系を65〜70℃に昇温して酵素タンパク質を破壊し、酢酸エチルを加えて、シリカゲルパッドに通過させ、分液して、水相を酢酸エチルで逆抽出し、有機相を併合して濃縮させ、製品として純度が93.1%、収率が73.2%、ee値が99.3%超え、de値が92.8%の(3R,5S)−6−(ベンジルオキシ)−3,5−ジヒドロキシtert−アミルカプロエート(化合物7a)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 7.37−7.30 (m, 5H), 6.12 (s, 2H), 4.59 (d, J= 7.2Hz, 2H), 4.31 (br, 1H), 4.14 (br, 1H), 3.09 (s, 2H), 1.14−1.02 (m, 8H), 0.88 (t, J= 7.6 Hz, 20 3H)。
反応フラスコにアセトン(10.0mL/gの化合物7a)、(3R,58)−6−ベンジルオキシ−3,5−ジヒドロキシtert−アミルカプロエート(化合物7a、1.0mol)、2,2−ジメトキシプロパン(2.0mol)及び触媒量の塩酸(0.02mol)を添加して撹拌し、系を約25℃で原料化合物7aがほぼなくなるまで反応させ、3質量%の希塩酸(0.05mol)を添加して洗浄し、更に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加して系を中和し、低沸点物質を減圧除去した後、水を添加して分液し、水相を酢酸エチルで2回抽出し、有機相を併合して飽和食塩水で一回洗浄し、有機相をシリカゲルパッドに通過させた後、濃縮させて、製品として純度94.0%、収率90.2%の(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−tert−アミルカプロエート(化合物8a)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ : 7.35−7.28 (m, 5H), 6.13 (s, 2H), 4.80 (d, J= 7.5 Hz, 2H), 4.33−4.28 (m, 1H), 4.12−4.07 (m, 1H), 2.87−2.64 (m, 2H), 1.83−1.79 (m, 2H),1.37−1.29 (m, 14H), 0.88 (t, J= 7.5 Hz, 3H)。
反応フラスコに酢酸エチル(10.0mL/gの化合物8a)、(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−tert−アミルカプロエート(化合物8a、1.0mol)及び金属触媒としての水酸化パラジウム(5%)を添加して撹拌し、系を密閉させた後、窒素ガスで五回置換して、水素ガスで三回置換し、系を約25℃で化合物8aがほぼなくなるまで反応させた。窒素ガスで三回置換し、放圧後、系を吸引濾過して、濾過ケーキを酢酸エチルで二回洗浄し、濾液とリンス液を混合して、乾固するまで濃縮させ、製品として純度96.3%、収率92.6%の(4R−Cis)−6−ヒドロキシメチル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−tert−アミルカプロエート(化合物9a)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 4.33−4.26 (m, 1H), 4.01−3.98 (m, 1H), 3.81−3.48 (m, 2H), 2.46−2.30 (m, 2H), 1.79−1.76 (m, 2H), 1.42−1.33 (m, 14H), 0.88 (t, J= 7.6 Hz, 3H)。
反応フラスコにジクロロメタン(10.0mL/gの化合物9a)と2−((4R,6S)−6−メトキシ−2,2−ジメチル−[1,3]ジエポキシ−4−イル)−アセテート(化合物9a、1.0mol)を添加して撹拌し、系の温度を−10〜0℃に低下させてジメチルスルホキシド(10mol)とトリエチルアミン(3.5mol)を添加し、次に、三酸化硫黄ピリジン(3.25mol)を三回で加え、添加終了後、保温しながら化合物9aがほぼ消えるまで反応させた。次に、系に精製水を加えて反応をクエンチさせ、分液して水相をジクロロメタンで一回逆抽出し、有機相を併合して、精製水で洗浄し、乾固するまで濃縮させて、目的側鎖生成物として純度95.1%、収率82.7%の(4R−cis)−6−ホルミル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−tert−アミルカプロエート(式Ia)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ : 9.58 (s, 1H), 4.34−4.30 (m, 2H), 2.43−2.37 (m, 2H), 2.46−2.30 (m, 2H), 1.57−1.43 (m, 2H), 1.43−1.36 (m, 12H), 0.89 (t, J= 7.8 Hz, 3H)。
アセトアセテートをシクロアミルアセトアセテートに変更した以外、製造過程は実施例1と同様にした。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ : 5.22 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 3.40 (s, 2H), 2.25 (s, 3H), 1.91−1.79 (m, 2H), 1.78−1.66 (m, 5H), 1.65−1.53 (m, 2H)。
Claims (9)
- 式(I)に示されるスタチン系薬物用のキラル中間体の製造方法であって、
1)クロロ酢酸(1)とベンジルアルコール(2)を出発原料として、エーテル化反応によってベンジルオキシ酢酸(3)を生成するステップと、
2)ベンジルオキシ酢酸(3)とモルホリンとを縮合反応させて2−ベンジルオキシモルホリノアセトアミド(4)を生成するステップと、
3)2−ベンジルオキシモルホリノアセトアミド(4)と、式(5)に示されるアセトアセテートとを置換反応させて式(6)に示されるジオン中間体を生成するステップと、
4)式(6)に示されるジオン中間体を還元酵素により不斉還元反応させて式(7)に示されるキラルジオール中間体を生成するステップと、
5)式(7)に示されるキラルジオール中間体と2,2−ジメトキシプロパンとを反応させて式(8)に示される(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを生成するステップと、
6)式(8)に示される(4R−cis)−6−(ベンジルオキシ)−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを脱ベンジル化して、式(9)に示される(4R−cis)−6−ヒドロキシメチル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを得るステップと、
7)式(9)に示される(4R−cis)−6−ヒドロキシメチル−2,2−ジメチル−1,3−ジオキサン−4−カプロエートを酸化反応させて、式(I)に示されるキラル中間体を得るステップと、を備え、
反応式は
であり、
上記のステップ4)における還元酵素は、アミノ酸配列として、
a)配列番号1ないし配列番号6で表される配列、
b)a)に示される配列と少なくとも70%の同一性を有し、且つ改良したジケトレダ
クターゼ活性を持つ配列、又は
c)a)における配列において1又は複数のアミノ酸残基が欠陥、付加及び/又は置換されてなるものであって、改良したジケトレダクターゼ活性を持つ配列、
から選ばれる一種を含む、ジケトレダクターゼ突然変異体であり、
b)に示される配列は配列番号7に示される配列ではない、
ことを特徴とする製造方法。 - Rはtert−ブチル基、tert−アミル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基を示す、請求項1に記載の製造方法。
- 前記ステップ4)における不斉還元反応は、式(6)に示されるジオン中間体を均一に溶剤に分散させ、還元酵素、ギ酸又はギ酸塩、NAD+を添加して、pH値を6.2〜6.4に調整した後、系を27〜33℃に昇温して、17〜24h保温することによって行われる、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記還元酵素の使用量と前記式(6)に示されるジオン中間体の使用量との質量比が0.00005〜0.004:1である、請求項4に記載の製造方法。
- 前記ジケトレダクターゼ突然変異体は、配列番号1、2、3、4、5又は6に示されるアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の製造方法。
- 前記溶剤は、精製水、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、エタノール、n−ヘプタン、トルエン、アセトン、ジメチルホルムアミド、メタノールから選ばれる一種又は複数種である、請求項4に記載の製造方法。
- 前記ギ酸塩はギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム又はギ酸カリウムから選ばれるものであり、前記ギ酸又はギ酸塩の使用量と前記式(6)に示されるジオン中間体の使用量とのモル比は2〜10:1である、請求項4に記載の製造方法。
- 前記NAD+の使用量と前記式(6)に示されるジオン中間体の使用量との質量比は、0.001〜0.1:1である、請求項4に記載の製造方法。
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