JP6262877B2 - 環状dnaの増幅方法 - Google Patents
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Description
(1)環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
(2)岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;および
(3)2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む反応液と混合して生成した反応混合物を等温で反応させることにより、「複製の開始(DNA2重鎖開裂)・伸長(複製フォーク進行)・複製された姉妹DNAの分離(Decatenation)」のサイクルが繰り返し、指数的に環状DNAを増幅することができることを見出した。
[1]
以下の工程を含む環状DNAの増幅方法:
(1)環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;および
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む反応液と、鋳型となる環状DNAとの反応混合物を形成する工程、ここで環状DNAがDnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列(origin of chromosome(oriC))を含む;および
(2)工程(1)において形成した反応混合物を等温条件下で保温する工程。
[2]
[1]に記載の方法であって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、1種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質(single-strand binding protein(SSB))、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群の組み合わせであり、
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群が、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせであり、
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群が、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素の組み合わせである、方法。
[3]
DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列が、大腸菌の複製開始配列である、[2]に記載の方法。
[4]
環状DNAのサイズが50kb以上である、[2]または[3]のいずれかに記載の方法。
[5]
1種以上の核様体タンパク質がIhfAおよびIhfBの組み合わせである、[2]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群が、GyrAおよびGyrBの組み合わせである、[2]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]
DNAヘリカーゼ活性を有する酵素がDnaBヘリカーゼである、[2]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]
DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素がDnaCヘリカーゼローダーである、[2]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]
DNAプライマーゼ活性を有する酵素がDnaGプライマーゼである、[2]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]
DNAクランプ活性を有する酵素がDnaNクランプである、[2]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]
DNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群が、DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ、およびHolEの組み合わせである、[2]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12]
DnaA活性を有する酵素、1種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質(single-strand binding protein(SSB))、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、DNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、DNAリガーゼ活性を有する酵素、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素が大腸菌由来である、[2]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13]
工程(1)における反応液が、副次的産物の生成を抑制する成分をさらに含む、[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]
工程(2)における等温条件が、25℃〜50℃の範囲に含まれる一定の温度である、[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;および
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む、環状DNAの増幅用組成物。
[16]
[15]に記載の組成物であって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、1種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質(single-strand binding protein(SSB))、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群の組み合わせであり、
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群が、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせであり、
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群が、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素の組み合わせである、組成物。
[17]
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;および
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む、環状DNAの増幅用キット。
[18]
[17]に記載のキットであって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、1種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質(single-strand binding protein(SSB))、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群の組み合わせであり、
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群が、RNaseH活性を有する酵素、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素、およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせであり、
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群が、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素の組み合わせである、キット。
鋳型として用いる環状DNAは、2重鎖であることが好ましい。鋳型として用いる環状DNAは、DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列(origin of chromosome(oriC))を含むものであれば、特に制限はされず、微生物の環状染色体等の天然の環状DNA、天然の環状DNAを酵素処理等によって切断したもの等に別のDNA断片を連結し、それを環状化した環状DNA、すべて人工的に合成した環状DNA等を例示することができる。DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列(origin of chromosome(oriC))(以下、単に「複製開始配列」ということがある)としては、たとえば大腸菌、枯草菌等の細菌に存在する公知の複製開始配列を、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等の公的なデータベースから入手することができる。また、DnaA活性を有する酵素と結合可能なDNA断片をクローニングし、その塩基配列を解析することによって、複製開始配列を得ることもできる。
本発明は、複製開始配列(origin of chromosome(oriC))を有する環状DNAを以下の酵素群:
(1)環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
(2)岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;および
(3)2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群
を含む反応液と混合して生成した反応混合物を等温で反応させることに関する。
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群としては、たとえばKaguni JM & Kornberg A. Cell. 1984, 38:183-90に記載された酵素群を用いることができる。具体的には、第一の酵素群として、以下:DnaA活性を有する酵素、1種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質(single-strand binding protein(SSB))、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII活性を有する酵素または酵素群、からなる群より選択される酵素または酵素群の1つ、または当該酵素または酵素群の組合せ、を例示することができる。
本発明において、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAとは、DNA複製反応によって合成された2つの環状DNAがつながった状態にあるものをいう。
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群としては、たとえばPeng & Marians 1993 PNASに記載された酵素群を用いることができる。具体的には、第三の酵素群として、以下:トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素、から成る群より選択される1つの酵素または当該酵素の組み合わせを例示することができる。
本発明の方法は、上記第一から第三の酵素群を含む反応液と、鋳型となる環状DNAとの反応混合物を形成する工程を含む。
本発明は、環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;および2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群を含む、環状DNAの増幅用組成物にも関する。本発明の組成物は、本発明の効果を妨げない限り、安定剤、還元剤、反応バッファー等の追加の成分を含んでいてよい。
<材料と方法>
表2に示す組成の反応液に鋳型DNAを添加して氷上で混合した後、30℃のインキュベータで1時間、2時間、または3時間保温した。1反応あたりの総容量は10マイクロリットルとなるようにした。30℃における反応後、反応産物をアガロースゲル電気泳動(0.5% 1×TAE、150V、100分間、14℃)したのち、SyberGreen(タカラバイオ株式会社)を用いてDNAを検出した。
SyberGreenによる増幅産物の検出結果を図3に示す。
SyberGreenによる増幅産物の検出結果を図4に示す。
SyberGreenによる増幅産物の検出結果を図5に示す。
実施例1に記載の9.6 kbの環状DNAを用い、実施例1と同様に増幅反応を行った。
増幅反応液(実施例1、表2)10μlに、9.6 kbの環状DNAを環状分子として1〜1000分子含まれるように加え、30℃で3時間保温することにより増幅反応を行った。反応物について、0.5%アガロースゲル電気泳動を行い、SybrGreen(タカラバイオ株式会社)で染色し、増幅DNAを検出した(図6a)。また、増副産物の総DNA量を、PicoGreen検出キット(ThermoFisher社)により定量した(図6b:PicoGreen法)。環状DNA分子としての増幅量を、増幅産物を直接、大腸菌に形質転換し、カナマイシン耐性コロニー数を求めることにより定量した(図6b:形質転換法)。定量結果から、初期DNA量に対する増幅度合いを求め(増幅)、グラフに示した。
上記の結果より、鋳型DNAとして1分子の環状DNAを、わずか3時間の等温反応で約1011分子にまで、増幅可能であることが明らかとなった(約1,000億倍の増幅)。
増幅反応液(実施例1、表2)80μlに、上記の環状DNAを加え、30℃で保温することにより増幅反応を行った。環状DNAは反応液1μlあたり105分子となるよう加えた。経時的にサンプリングし、サンプルを直接、大腸菌に形質転換し、カナマイシン耐性コロニー数を求めることにより増幅された環状DNA分子数を定量した(図7)。
上記の結果より、9.6 kbの環状DNA分子の倍加時間は約5分であることが確認された。
実施例1に記載の9.6 kbの環状DNA及び12.0 kbの環状DNA(複製開始配列oriCを持つ環状DNA、カナマイシン耐性(Km))の混合物から単一な環状DNAクローンの増幅を行った。
lacZ環状DNAを用いて、環状DNAの継代増幅について試験した。
実施例4における鋳型の環状DNAにはlacZ遺伝子が含まれているため、この環状遺伝子で形質転換した大腸菌をX-galプレート上で培養すると、lacZ遺伝子が正常に発現したコロニー(lacZ+)はX-galを分解できるため青色を呈し、複製エラーによる変異導入でlacZ遺伝子が正常に機能しなくなったコロニー(lacZ−)はX-galを分解できないため白色を呈する。すなわち、この環状遺伝子で形質転換した大腸菌がX-galプレート上で呈する色によって、増幅した環状DNAにおける複製エラーを判定できる。
Claims (14)
- (a)環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
(b)岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;および
(c)2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群;
を含む反応液と、鋳型となる環状DNAとの反応混合物を形成する工程を含み、ここで環状DNAがDnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列(origin of chromosome(oriC))を含む、複製サイクルを繰り返し、指数的に環状DNAを増幅する方法。 - 前記第三の酵素群が、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素、からなる群より選択される少なくとも2つの酵素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、1種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質(single-strand binding protein(SSB))、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII*活性を有する酵素または酵素群、の組み合わせを含み、
前記第二の酵素群が、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせを含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記環状DNAのサイズが8kb以上である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記反応液が、さらにtRNAを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記反応液が、さらにグルタミン酸カリウムを含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記反応混合物を等温条件下で保温する工程を含む、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記保温する工程を1.5時間以上行う、請求項7に記載の方法。
- 前記反応混合物を形成する工程において、鋳型となる環状DNAが1分子〜15pMの範囲で存在する、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 環状DNAの増幅用キットであって、以下:
(a)環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
(b)岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;および
(c)2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群であって、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素、トポイソメラーゼIV活性を有する酵素、およびRecQ活性を有する酵素からなる群より選択される少なくとも2つの酵素を含む酵素群;
を含む、前記キット。 - 前記第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、1種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質(single-strand binding protein(SSB))、DNAヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII*活性を有する酵素または酵素群、の組み合わせを含み、
前記第二の酵素群が、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせを含む、
請求項10に記載のキット。 - さらにtRNAを含む、請求項10または11に記載のキット。
- さらにグルタミン酸カリウムを含む、請求項10〜12のいずれかに記載のキット。
- 複製サイクルを繰り返し、指数的に環状DNAを増幅するためのキットであって、以下:
(a)環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
(b)岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;および
(c)2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群;
を含む、前記キット。
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