JP6258523B2 - Ｉｇｆ−１ｒ抗体−薬物複合体および癌の処置のためのその使用 - Google Patents

Ｉｇｆ−１ｒ抗体−薬物複合体および癌の処置のためのその使用 Download PDF

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Description

本発明は、ＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体−薬物複合体に関する。１つの態様から、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体を含んでなる抗体−薬物複合体に関し、前記抗体は、ドラスタチン１０の誘導体およびアウリスタチンから選択される少なくとも１種類の薬物とコンジュゲートされている。本発明はまた、癌の処置のための処置方法および前記抗体−薬物複合体の使用も含んでなる。
ＩＧＦ−ＩＲ（または時にはＩＧＦ１ＲもしくはＩＧＦ−ＩＲ）と呼ばれるインスリン様成長因子Ｉ受容体は、チロシンキナーゼ活性を有し、インスリン受容体ＩＲと７０％の相同性を有する受容体である。ＩＧＦ−ＩＲは、分子量が約３５０，０００の糖タンパク質である。これは、ヘテロ四量体の受容体であり、その半分はそれぞれジスルフィド架橋によって連結しており、細胞外α−サブユニットおよび膜貫通β−サブユニットからなる。ＩＧＦ−ＩＲは、極めて高い親和性（Ｋｄ＃１ｎＭ）でＩＧＦ１およびＩＧＦ２と結合するが、同様にインスリンとも１００分の１〜１０００分の１の親和性で結合し得る。逆に、ＩＧＦは１００分の１の親和性でしかインスリン受容体と結合しないが、ＩＲは極めて高い親和性でインスリンと結合する。α−サブユニット上に存在するシステインに富む領域とβ−サブユニットのＣ末端部分にそれぞれ相同性の低い区域があるが、ＩＧＦ−ＩＲのチロシンキナーゼドメインとＩＲのチロシンキナーゼドメインとは極めて高い配列相同性を有している。α−サブユニットに見られる配列の差異はリガンドの結合区域に存在するため、それはＩＧＦとインスリンのそれぞれに対するＩＧＦ−ＩＲとＩＲの相対的親和性の基となっている。β−サブユニットのＣ末端部分における差異は、２つの受容体のシグナル伝達経路における相違をもたらし、ＩＧＦ−ＩＲは細胞***促進特性、分化作用および抗アポトーシス作用を媒介し、一方、ＩＲの活性化は主として代謝経路のレベルでの作用に関与する。
細胞質チロシンキナーゼタンパク質は、リガンドが受容体の細胞外ドメインに結合することによって活性化される。キナーゼの活性化は、次に、ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２、ＳｈｃおよびＧｒｂ１０を含む種々の細胞内基質の刺激に関与する。ＩＧＦ−ＩＲの２つの主要な基質はＩＲＳおよびＳｈｃであり、これらは下流で多くのエフェクターの活性化によって、ＩＧＦのこの受容体への結合に関連した成長および分化作用の大部分を媒介する。従って、基質の利用度がＩＧＦ−ＩＲの活性化に関連した最終的な生物学的作用を決定し得る。ＩＲＳ−１が優勢である場合には、細胞は増殖し形質転換する傾向にある。Ｓｈｃが優勢である場合には、細胞は分化する傾向にある。アポトーシスに対する保護作用に主として関与する経路は、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）経路であると思われる。
発癌におけるＩＧＦ系の役割は、ここ１０年で集中的な研究の対象となってきている。この関心は、ＩＧＦ−ＩＲが、その細胞***促進性および抗アポトーシス性に加えて、形質転換された表現型の確立と維持に必要であると思われるという事実の発見に従ったものである。実際に、ＩＧＦ−ＩＲの過剰発現または構成的活性化が、多様な細胞において、ウシ胎仔血清を含まない培地で補助に依存することなく細胞を成長させ、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成させるということが十分に確認されている。成長因子の多数の受容体を含む、過剰発現した遺伝子の多様な産物が細胞を形質転換し得ることから、このこと自体は固有の特性ではない。しかしながら、ＩＧＦ−ＩＲが形質転換において果たす主要な役割を明らかに立証した重要な発見は、ＩＧＦ−ＩＲをコードする遺伝子が不活性化されたＩＧＲ−ＩＲ−細胞が、ウシパピローマウイルスのＥ５タンパク質などの、通常は細胞を形質転換することができる様々な物質、ＥＧＦＲまたはＰＤＧＦＲの過剰発現、ＳＶ４０のＴ抗原、活性化したｒａｓ、又はこれら最後の２つの因子の組合せなどによる形質転換に全く不応であるということを立証している。
ＩＧＦ−ＩＲは、多様な腫瘍および腫瘍株において発現し、ＩＧＦは、ＩＧＦ−ＩＲへの結合を介して腫瘍成長を増幅する。ＩＧＦ−ＩＲの発癌における役割を支持するその他の論拠は、受容体に対するマウスモノクローナル抗体を用いた、またはＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブを用いた研究から得られる。実際には、ＩＧＦ−ＩＲに対するマウスモノクローナル抗体は、多くの細胞株の培養増殖およびｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の成長を阻害する。同様に、ＩＧＦ−ＩＲのドミナントネガティブが腫瘍増殖を阻害することができるということが示されている。
多くのプロジェクトが、癌の処置のための裸のＩＧＦ−１Ｒ抗体の開発に着手している。しかしながら、現時点でこれらのプロジェクトに成功したものは無く、上市している抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は無い。
さらに、これらの抗体にＫＲＡＳ突然変異患者を治療できたものは無かったのでＥＧＦＲとＩＧＦ−１Ｒの両方を標的とするために抗ＥＧＦＲ抗体と組み合わせた抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体に関する一連の臨床試験は成功を見ていない。
結果として、ＩＧＦ−１Ｒは今や主要な標的とは見なされず、潜在的治療抗体の研究では、ＩＧＦ−１Ｒはもはや特に注目されるものとは考えられていない。
しかしながらやはり、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を作製するための努力は、裸の抗体、すなわち、それらの固有の特性により有用な抗体に焦点が当てられたことにも留意しなければならない。この意味で、ＩＧＦ−１Ｒは、ＩＧＦ−１Ｒは血管を含む正常な細胞によっても広く発現される標的として記載されているので、抗体−薬物複合体（「ＡＤＣ」と呼称）などのＡＤＣの作出には好適とは言えない標的と考えられる。この意味で、より最近のＩＧＦ−１Ｒ抗体、すなわち、ＡＶＥ１６４２は、薬物の腕を持たない裸の抗体として開発されていることに着目できる。それは現在開発中の他のＩＧＦ−１Ｒ抗体と、また、臨床試験で成功しなかった総てのものと同じである。
この文脈で、本発明は、癌、より詳しくは、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置のためのＡＤＣまたは複合体およびその使用に関する。
ＡＤＣは、抗体の結合特異性と例えば細胞傷害性薬剤などの薬物の効力を組み合わせたものである。モノクローナル抗体の開発、より有効な薬物の使用およびこれらの成分と共有結合する化学リンカーの設計に関連する技術が、近年、急速に進んできた。
ＡＤＣの使用は、複合体を形成してない薬物として投与された際に、正常な細胞に許容されないレベルの毒性をもたらし得る薬物の局所送達を可能とする。
言い換えれば、それにより最小の毒性で最大の有効性が求められる。ＡＤＣを設計および精密化するための努力は、抗体の選択性ならびに薬物の作用機序、薬物の架橋、薬物／抗体比（負荷量またはＤＡＲ）、および薬物放出特性に焦点が当てられてきた。薬物部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、プロテアソーム、リボソーム機能の障害、タンパク質合成および／またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってそれらの細胞傷害性および細胞増殖抑制作用を付与し得る。いくつかの細胞傷害性薬物は、大きな抗体とコンジュゲートされると不活性または低活性となる傾向がある。
各抗体は個別に特性決定されなければならず、適当なリンカーが設計されなければならず、また、腫瘍細胞へ送達された際にその効力を保持する好適な細胞傷害性薬剤が同定されなければならない。癌標的上の抗原の濃度および正常組織がその標的抗原を発現するかどうかを考慮しなければならない。他の考慮すべき点としては、標的と結合した際にＡＤＣ全体が内部移行されるかどうか；正常組織暴露の可能性ならびに／または処置される癌のタイプおよびステージを考慮する場合に細胞増殖抑制薬剤または細胞傷害性薬剤が好ましいかどうか；ならびに抗体と薬物弾頭を接続するリンカーが切断可能な結合か切断不能な結合かが含まれる。さらに、抗体と薬物成分のコンジュゲーション比は、抗体の結合活性および／または薬物の効力を損なわず、かつ、ＡＤＣの物理化学的特性を変化させて凝集またはその化合物の以降の開発工程に関して有害な特性を生じることのない十分なものでなければならない。
ＡＤＣは複雑な生体分子であり、有効なＡＤＣを開発する挑戦には大きな問題が残っている。
本発明はこの問題に取り組もうとするものであり、下式（Ｉ）：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ （Ｉ）
のＡＤＣまたはその薬学上許容可能な塩に関し、
式中、
Ａｂは、ｉ）配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；およびｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｄは、下式（ＩＩ）：
（式中、
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリルであり；
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
Ｒ９は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
ｍは、１〜８の間に含まれる整数であり；
波線は、Ｌとの結合点を示し；かつ
ｎは、１〜１２である）
の薬物成分である。
本発明の１つの実施形態は、Ａｂが
ａ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｄ）配列番号８、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択されるＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、Ａｂが
ａ）配列番号１３の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１４の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号１５の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｄ）配列番号１６の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号１７の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択されるＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、Ａｂが
ａ）配列番号１８の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１９の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号２０の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｄ）配列番号２１の配列の軽鎖可変ドメインとの配列番号８、２および３の配列３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号２２の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択されるＡＤＣに関する。
１つの実施形態では、本発明は、Ａｂが
ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０；
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体
から選択されるＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、Ａｂがヒト化抗体であるＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、Ａｂが
ａ）それぞれ配列番号７、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号４６）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８）に由来するＦＲ４とを有する重鎖と、
ｂ）それぞれ配列番号９、５および１１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号４７）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号４９）に由来するＦＲ４とを有する軽鎖
を含んでなる抗体から選択されるＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態では、Ａｂは、
ａ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメインまたは配列番号３３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列と、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号３４の配列の重鎖可変ドメインまたは配列番号３４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列と、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
本発明の１つの実施形態では、Ａｂは、
ａ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメインまたは配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列と、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号３６の配列の重鎖可変ドメインまたは配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列と、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
本発明の１つの実施形態では、Ａｂは、
ａ）配列番号３７の配列または配列番号３７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３９の配列または配列番号３９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号３８の配列または配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号４０の配列または配列番号４０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体
から選択される。
本発明の１つの実施形態では、Ａｂは、
ａ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号５７および６０から選択される配列または配列番号５７もしくは６０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号５７もしくは６０から選択される配列または配列番号５７もしくは６０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される。
本発明の１つの実施形態では、Ａｂは、
ａ）配列番号５８、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９および８１から選択される配列または配列番号５８、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９もしくは８１と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖；ならびに
ｂ）配列番号５９および６１から選択される配列または配列番号５９もしくは６１と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖
から選択される。
本発明の１つの実施形態では、Ｌが下式（ＩＩＩ）：
のリンカーであり、
式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニルであり；
Ｗは、アミノ酸単位であり；ｗは、０〜５の間に含まれる整数であり；
Ｙは、ＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは
であり；ｙは、０または１であり；
アスタリスクは、Ｄとの結合点を示し；かつ
波線は、Ａｂとの結合点を示す、ＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、Ｌ２が下式：
のものであり、式中、
アスタリスクは、（Ｗ）ｗとの結合点を示し；かつ
波線は、式：
のマレイミド部分の窒素原子との結合点を示す、ＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態では、ｗ＝０、またはｗ＝２であれば、（Ｗ）ｗは、
から選択され、
式中、
アスタリスクは、（Ｙ）ｙとの結合点を示し；かつ
波線は、Ｌ２との結合点を示す。
本発明の１つの実施形態は、Ｌが
から選択され、
アスタリスクはＤとの結合点を示し、かつ、波線はＡｂとの結合点を示すＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、（Ｌ−Ｄ）が
から選択され、式中、波線はＡｂとの結合点を示すＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、
から選択される式を有するＡＤＣおよびその薬学上許容可能な塩に関し、ここで、Ａｂは、
ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０；
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；および
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体
からなる群において選択される。
本発明の１つの実施形態は、ｎが２であるＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、ｎが４であるＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、薬剤として使用するためのＡＤＣに関する。
本発明の１つの実施形態は、上記のようなＡＤＣを含んでなる組成物に関する。
本発明の１つの実施形態は、薬学上許容可能なビヒクルをさらに含んでなる組成物に関する。
本発明の１つの実施形態は、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌、またはＩＧＦ−１Ｒ関連癌の処置において使用するための組成物に関する。
ＩＧＦ−１Ｒ発現癌またはＩＧＦ−１Ｒ関連癌は、それらの表面でＩＧＦ−１Ｒの全部または一部を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含む。
本発明の１つの実施形態は、前記ＩＧＦ−１Ｒ発現癌が、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、中皮腫、口腔扁平上皮癌および任意の薬剤耐性癌から選択される癌である組成物に関する。
本発明の１つの実施形態は、必要とする対象におけるＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置のための方法であって、前記対象に有効量の本発明による少なくとも１種類の抗体−薬物複合体または組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
本発明の１つの実施形態は、少なくともｉ）上記のような抗体−薬物複合体および／または組成物と、ｉｉ）前記抗体−薬物複合体および／または組成物が配分されているシリンジまたはバイアルまたはアンプルとを含んでなるキットに関する。
発明の具体的説明
Ｉ−抗体（Ａｂ）
用語「抗体」、「抗体（複数）」、「ａｂ」、「Ａｂ」、「ＭＡｂ」または「免疫グロブリン」は、最も広義で互換的に使用され、それらが所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、単離された、操作された、または組換え型の抗体（例えば、全長または完全モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびまたその抗体フラグメントが含まれる。
１つの実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体は組換え抗体からなる。用語「組換え抗体」は、生細胞内での組換えＤＮＡの発現から生じる抗体を意味する。本発明のＡＤＣの組換え抗体は、生物学的有機体では見られないＤＮＡ配列を作り出す、当業者に周知の遺伝子組換えの実験法を使用することにより得られる。
別の実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体は、化学的に合成された抗体からなる。
より詳しくは、このような分子は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含んでなる糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本発明ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域とを含んでなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本発明ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域とを含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本発明によるＡＤＣの抗体の「抗原結合フラグメント」または「ＩＧＦ−ＩＲ結合フラグメント」とは、抗体の標的（一般には抗原とも呼ばれる）と結合する能力を保持するいずれのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も示すものとする。
１つの実施形態では、このような「抗原結合フラグメント」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディ、またはポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化フラグメント）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコール）などのポリ（アルキレン）グリコールの添加などの化学修飾により、または本発明による抗体の特徴的ＣＤＲのうち少なくとも１つを有する前記フラグメントをリポソーム内に組み込むことによりその半減期が延長されている任意のフラグメントからなる群において選択される。好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列から構成されるか、または含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、および標的に対して十分な、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するのに十分なものである。より好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖の３つのＣＤＲ ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と可変軽鎖の３つのＣＤＲ ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から少なくとも構成されるか、または含んでなる。
「結合」または「結合する」などとは、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で比較的安定な、抗原との複合体を形成することが意図される。特異的結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍの平衡解離定数を特徴とし得る。２分子が結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、および放射性標識アッセイなどが挙げられる。疑念を避けるため、それは前記抗体が別の抗原と、低レベルで結合または干渉できないことを意味するものではない。しかしながら、１つの実施形態として、前記抗体は前記抗原のみと結合する。
本明細書において使用する場合、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」という表現は、「抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体」と同様に解釈されるべきであり、ＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体を意味する。
本出願の１つの実施形態では、抗体のエピトープは、優先的にはヒトＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメイン（ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤとも呼ばれる）に位置する。
特定の実施形態では、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、１０×１０−１０〜１×１０−１０の間、より優先的には８×１０−１０〜２×１０−１０の間に含まれるＥＣ５０でＩＧＦ−１Ｒと結合し得る。
用語５０％有効濃度（ＥＣ５０）は、ベースラインと明示されたある暴露時間後の最大値の半分の応答を誘導する薬物、抗体または毒物の濃度に相当する。それは薬物の効力の尺度として慣用されている。従って、漸増用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が見られる化合物の濃度を表す。素量的用量反応曲線のＥＣ５０は、明示された暴露期間の後に集団の５０％が応答を示す化合物の濃度を表す。濃度尺度は一般に、比較的小さな濃度変化で急激に増加するシグモイド曲線を描く。これはベストフィットラインの導出により数学的に決定できる。
好ましい実施形態として、本発明で決定されたＥＣ５０は、ヒト腫瘍細胞上に露出しているＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤに結合する抗体の効力を特徴付ける。ＥＣ５０パラメーターは、ＦＡＣＳ分析を用いて決定される。ＥＣ５０パラメーターは、ヒト腫瘍細胞上で発現されるヒトＩＧＦ−１Ｒ上で最大結合の５０％が得られる抗体濃度を表す。各ＥＣ５０値は、４パラメーター回帰曲線フィッティングプログラム（Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量反応曲線の中点として計算された。このパラメーターは生理学的／病理学的状態を代表するように選択された。
用語「エピトープ」は、抗体により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的または機能的として定義され得る。機能的エピトープは一般に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまたコンフォメーション的でもあり得、すなわち、非直鎖アミノ酸から構成される。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子群である決定基を含み得、特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴、および／または特定の変化特徴を有し得る。
ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関する競合は、限定されるものではないが、放射能、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなどの当業者に公知のいずれの方法または技術によっても決定可能である。「ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関して競合する」とは、少なくとも２０％、優先的には少なくとも５０％、より優先的には少なくとも７０％の競合を意味する。
同じエピトープへの結合の決定は、限定されるものではないが、放射能、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなどの当業者に公知のいずれの方法または技術によっても決定可能である。「ＩＧＦ−１Ｒの同じエピトープに結合する」とは、少なくとも２０％、優先的には少なくとも５０％、より優先的には少なくとも７０％に競合を意味する。
上述のように、一般的知識に反して、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ結合後に高い内部移行能を示す特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体に着目する。本明細書で使用される場合、「内部移行される」または「内部移行された」抗体（これらの２つの表現は同様である）は、哺乳動物細胞上のＩＧＦ−１Ｒに結合した際に細胞により取り込まれる（それが入ることを意味する）ものである。このような抗体はＡＤＣの一部として着目され、従って、それは連結された細胞傷害剤を標的癌細胞にアドレスする、または向ける。ひと度、内部移行されると、細胞傷害剤は癌細胞死を誘導する。
驚くべきことに、本発明による抗体は総てＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ２に関しては同じ配列を示し、他の３つのＣＤＲは異なる。この所見は、抗体の結合特異性に関して、ＣＤＲ−Ｈ３が最も重要であり、エピトープの認識に最も関連があると記載されている一般的知識の一部であるので、一貫性があると思われる。
ＡＤＣ療法で成功するための重要な鍵は、標的抗原の特異性と抗原−抗体複合体の癌細胞への内部移行であると思われる。明らかに内部移行しない抗原は内部移行する抗原よりも細胞傷害性薬剤送達効果が低い。内部移行プロセスは抗原によって異なり、抗体により影響を受け得る複数のパラメーターに依存する。
ＡＤＣでは、細胞傷害剤が細胞傷害活性を付与し、使用する抗体が癌細胞に対する特異性、ならびに細胞傷害剤を適正にアドレスするよう細胞内に入れるためのベクターを担う。従って、ＡＤＣを改善するために、抗体は標的癌細胞への高い内部移行能を示し得る。抗体により媒介される内部移行の効率は、標的とされるエピトープによって有意に異なる。強力な内部移行性ＩＧＦ−１Ｒ抗体の選択には、ＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションだけではなく、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞への内部移行後を研究する様々な実験データが必要である。
１つの実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体の内部移行は、免疫蛍光もしくはＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）（本出願の下記に例示される通り）または内部移行機構に特異的な当業者に知られている任意の方法もしくはプロセスによって評価することができる。好ましい実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、ＩＧＦ−１Ｒとの結合後に少なくとも３０％、優先的には５０％およびより優先的には８０％の内部移行を誘導し得る。
複合体ＩＧＦ−１Ｒ／抗体は、前記ＩＧＦ−１ＲのＥＣＤへの抗体の結合の後に内部移行され、細胞表面のＩＧＦ−１Ｒ量の減少が誘導される。この減少は、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫蛍光などの当業者に公知のいずれかの方法によって定量することができる。
１つの実施形態では、このように内部移行を反映するこの減少は、好ましくはＦＡＣＳにより測定可能され、４℃で測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）と抗体との４時間のインキュベーション後に３７℃で測定されたＭＦＩの間の差またはΔとして表すことができる。
非限定例として、このΔは、ｉ）本明細書に記載の抗体との４時間のインキュベーション後の乳癌細胞ＭＣＦ７と、ｉｉ）Ａｌｅｘａ４８８で標識された二次抗体を用い、非処理細胞および抗体で処理した細胞で得られたＭＦＩに基づいて決定される。このパラメーターは、下式：Δ（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）で算出される通りに定義される。
ＭＦＩは細胞表面で発現されるＩＧＦ−１Ｒに比例するので、このＭＦＩ間の差異は、ＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションを反映する。
有利な態様において、本抗体は、ＭＣＦ−７上でΔ（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）を惹起する少なくとも２８０、好ましくは少なくとも４００の抗体からなる。
より詳細には、上述のΔは下記の過程に従って測定することができ、それは例示的な非限定例と見なされるべきである：
ａ）対象とする腫瘍細胞を低温（４℃）または温かい（３７℃）完全培養培地中、本発明の抗体で処理し、インキュベートすること；
ｂ）工程ａ）の処理細胞および並行して非処理細胞を二次抗体で処理すること；
ｃ）本発明の抗体と結合し得る二次標的抗体で処理した細胞および非処理の細胞のＭＦＩを測定すること（表面に存在するＩＧＦ−１Ｒの量を代表する）；および
ｄ）Δを非処理細胞で得られたＭＦＩから処理細胞で得られたＭＦＩの減算として計算すること。
このΔＭＦＩから、内部移行パーセンテージ：
１００×（ＭＦＩ ４℃−ＭＦＩ３７℃）／ＭＦＩ ４℃
を求めることができる。
本発明によるＡＤＣの抗体は、好ましくは、ＭＣＦ７上に５０％〜９９％、７０％〜９０％、優先的には７５％〜８７％の間で含まれる内部移行パーセンテージで存在する。
本明細書に記載の抗体の特定の利点は、それらの内部移行速度に依存する。
ＡＤＣの場合、使用する抗体は急速な、好ましくは、抗体の投与から２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、いっそうより好ましくは６時間以内の内部移行速度を示すことが望ましいことが一般に知られている。
本発明では、細胞表面結合抗体減少または細胞表面抗体減衰とも呼ばれる内部移行率は、ｔ１／２（半減期）として表され、ΔＭＦＩの５０％の低下を得るために必要な時間に相当する（この態様は、下記の例に関して明確に理解される）。
特定の利点は、本発明のＡＤＣの抗体は、５〜２５分の間、優先的には１０〜２０分の間に含まれるｔ１／２を有する。
本発明の特定の実施形態は、抗体Ａｂが配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３を有する３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなるＡＤＣに関する。
本発明の特定の実施形態は、抗体Ａｂが配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなるＡＤＣに関する。
ＡＤＣの実施形態は、配列番号１、２および３の配列、または配列番号１、２もしくは３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列とを含んでなるまたはからなる３つの重鎖ＣＤＲ；ならびに配列番号４、５および６の配列、または配列番号４、５もしくは６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列を含んでなるまたはからなる３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体を含んでなる。
別の実施形態では、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲ；ならびに配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなる。
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体であれ、鎖型であれ、または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されている[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は、常に同じ位置を持ち、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準的な画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準的な画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで仕切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒｓ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼ばれる２Ｄグラフ、およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造において使用される。
本明細書に相反する記載がなければ、相補性決定領域またはＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。
ＣＤＲもやはりＫａｂａｔナンバリングシステム(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991,および後続版)に従って定義することができる。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。本明細書では、用語ＣＤＲ（単数または複数）は、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の親和性を担うアミノ酸残基の大多数を含むこれらの領域の１以上もしくはさらには全体を示すために使用される。本出願の通読を簡単にするために、ＫａｂａｔによるＣＤＲは定義しない。しかしながら、ＩＭＧＴによるＣＤＲの定義を用いてＫａｂａｔによるＣＤＲを定義することは当業者には自明であろう。
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２配列間の「同一性」または「同一性パーセンテージ」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異はそれらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって慣例的に行われ、前記比較はセグメントにより、または「アラインメントウインドウ」を使用することによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ Ｐによる）の手段によって行うことができる。
同一性パーセンテージは、２配列間、好ましくは２つの全配列の間でアミノ酸ヌクレオチドまたは残基が同一である位置の数を決定し、その同一の位置の数をアラインメントウインドウ内の位置の総数で割り、その商に１００を掛けて２配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２に関して；選択されるマトリックスは、このプログラムによって提案される例えば「ＢＬＯＳＵＭ ６２」マトリックスである）とともに使用でき、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムによって直接計算される。
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、参照配列、特定の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含有するものが含まれる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」は、構造アミノ酸の１つに関しておそらく置換されるが、対応する抗体の、また、以下に定義される具体例の、生物活性を変更しないいずれのアミノ酸も示すものとする。
等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成される可能性のある種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果かのいずれかに基づいて決定され得る。
限定されない例として、下表１は、対応する改変抗体の生物活性に有意な改変をもたらさずに行えると思われる潜在的置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も当然可能である。
本発明の特定の態様は、ＡＤＣの抗体がインスリン受容体（ＩＲ）に結合しないというものである。この態様は、本明細書に記載の抗体はＩＲ、すなわち、インスリン代謝に悪影響を持たないので注目される。
別の実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体のさらに別の有利な態様は、ヒトＩＧＦ−１Ｒにだけでなく、サルＩＧＦ−１Ｒにも、より詳しくはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒにも結合できるということである。この態様もまた、それが臨床試験に要される毒性評価を助けるので注目される。
さらに別の実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体は、モノクローナル抗体からなる。
用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」は、本明細書で使用される場合、実質的に均質の抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、その集団の個々の抗体は、わずかな量で見られ得る潜在的な自然突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられている。このようなモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の単一のクローンまたはハイブリドーマにより生産され得る。モノクローナル抗体はまた、組換え型であってもよく、すなわち、タンパク質工学または化学合成によっても生産され得る。モノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。加えて、一般に種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対するものである。
モノクローナル抗体は、本明細書において、以降に記載されるようなマウス、キメラおよびヒト化抗体を含む。
抗体は好ましくは、微生物培養物の仏国コレクション（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、２５ Ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、７５７２４ Ｐａｒｉｓ Ｃｅｄｅｘ １５、フランス）に提出されたマウス起源のハイブリドーマに由来し、前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ ２／Ｏ−Ａｇ １４細胞株の細胞の融合βにより得られたものである。
１つの実施形態では、本発明のＡＤＣのＩＧＦ−１Ｒ抗体はマウス抗体からなり、従って、ｍ［抗体の名称］と呼ばれる。
１つの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体はキメラ抗体からなり、従って、ｃ［抗体の名称］と呼ばれる。
１つの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体はヒト化抗体からなり、従って、ｈｚ［抗体の名称］と呼ばれる。
疑念を避けるため、以下の明細書において、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」および「［抗体の名称］という表現は同等であり、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体または前記「［抗体の名称］」のマウス型、キメラ型およびヒト化型を含む（相反する記載がない限り）。必要であれば、接頭辞ｍ−（マウス）、ｃ−（キメラ）またはｈｚ−（ヒト化）が使用される。
より明確にするために、下表２に好ましい抗体に関してＩＭＧＴに従って定義されるＣＤＲ配列を示す。
上記のような６つのＣＤＲのいずれの組合せも本発明の一部と見なされるべきであることは当業者には自明であろう。
この表２から見て取ることができるように、本明細書に記載の抗体は総て、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ２に関して同じ配列を有し、この特性は上記のように特に注目される。
特定の態様は、抗体がマウス抗体であり、前記抗体はまたマウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とするＡＤＣに関する。
別の特定の態様は、抗体がキメラ（ｃ）抗体であり、前記抗体はまたマウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とするＡＤＣに関する。
キメラ抗体は、所与の種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を前記の所与の種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含有するものである。
キメラ抗体は、組換え遺伝子の技術を使用することにより製造され得る。例えば、キメラ抗体は、プロモーターおよび非ヒト、特にマウスのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列および異種、好ましくは、ヒトの抗体定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることにより製造することができる。１つのこのような組換え遺伝子によりコードされている本発明によるＡＤＣのキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性はマウスＤＮＡに由来する可変領域により決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。
限定されるものではないが、好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号１３の配列または配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１４の配列または配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号１５の配列または配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｄ）配列番号１６の配列または配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号１７の配列または配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
「配列番号１３〜１７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号１、２および３の３つの重鎖ＣＤＲを示し、加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号１、２および３）外の配列番号１３〜１７の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
限定されるものではないが、別の好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号１８の配列または配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１９の配列または配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号２０の配列または配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
ｄ）配列番号２１の配列または配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号２２の配列または配列番号２２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
「配列番号１８〜２２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号４、５および６の３つの軽鎖ＣＤＲを示す、および加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号４、５および６）外の配列番号１８〜２２の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列をそれぞれ表すものとする。
本発明の実施形態は、Ａｂが、
ａ）配列番号１３の配列または配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１８の配列または配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体；
ｂ）配列番号１４の配列または配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１９の配列または配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体；
ｃ）配列番号１５の配列または配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号２０の配列または配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体；
ｄ）配列番号１６の配列または配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号２１の配列または配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号１７の配列または配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号２２の配列または配列番号２２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される抗体であるＡＤＣに関する。
本明細書に記載のキメラ抗体はまた定常ドメインによっても特徴付けることができ、より詳しくは、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの前記キメラ抗体が選択または設計され得る。より好ましくは、本発明に関して、前記キメラ抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
本発明の実施形態は、Ａｂが、形式ＩｇＧ１において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるキメラ抗体であるＡＤＣに関する。より好ましくは、前記キメラ抗体は、配列番号４３の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
本発明の実施形態は、Ａｂが、形式ＩｇＧ４において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるキメラ抗体であるＡＤＣに関する。より好ましくは、前記キメラ抗体は、配列番号４４の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
限定されるものではないが、別の好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号２３の配列または配列番号２３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号２８の配列または配列番号２８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｂ）配列番号２４の配列または配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号２９の配列または配列番号２９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｃ）配列番号２５の配列または配列番号２５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３０の配列または配列番号３０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｄ）配列番号２６の配列または配列番号２６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３１の配列または配列番号３１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；ならびに
ｅ）配列番号２７の配列または配列番号２７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３２の配列または配列番号３２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体
から選択される。
より明確にするために、下表３に好ましいキメラ抗体に関してそれぞれＶＨおよびＶＬの配列を示す。
本発明のさらに別の特定の態様は、「Ａｂ」が、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれλまたはκ領域およびγ−１、γ−２またはγ−４領域であることを特徴とするヒト化抗体である、ＡＤＣに関する。
「ヒト化抗体」は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、抗体分子の他の部分は１つの（またはいくつかの）ヒト抗体に由来する抗体を意味する。加えて、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）の一部を、結合親和性を保持するように改変することができる。
ヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ ｖｉｖｏにおける予防的および／または治療的処置を含む方法におけるそれらの使用に好ましい。ＰＤＬにより特許ＥＰ０４５１２１６、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９３９１２７、ＥＰ０５６６６４７またはＵＳ５，５３０，１０１、ＵＳ６，１８０，３７０、ＵＳ５，５８５，０８９およびＵＳ５，６９３，７６１に記載されている例えば、「ＣＤＲグラフト」技術などの他のヒト化技術もまた当業者に公知である。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も引用することができる。
本発明の特定の実施形態として、以下の実施例においてより詳しく解説されるように、本明細書ではｈｚ２０８Ｆ２からなる抗体が記載される。このようなヒト化は、本発明の他の抗体部分にも当てはまり得る。
好ましい実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、
ｉ）それぞれ配列番号７、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と、
ｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号４６）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、
ｉｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８）に由来するＦＲ４
を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。
好ましい実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、
ｉ）それぞれ配列番号９、５および１１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と、
ｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号４７）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、
ｉｉｉ）ヒト生殖細胞系ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号４９）に由来するＦＲ４
を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなる。
限定されるものではないが、本発明の好ましい実施形態では、抗体は、
ａ）それぞれ配列番号７、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号４６）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８）に由来するＦＲ４とを有する重鎖と、
ｂ）それぞれ配列番号９、５および１１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と、ヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号４７）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖細胞系ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号４９）に由来するＦＲ４とを有する軽鎖
を含んでなる。
１つの実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなる。前記ヒト化抗体は、以下、ｈｚ２０８Ｆ２（「変異体１」または「Ｖａｒ．１」）と呼ぶ。
別の実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなり、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２および９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる。
「復帰突然変異（back-mutation or back mutation)」という表現は、生殖細胞系中に存在するヒト残基の突然変異またはマウス配列に元々存在する対応する残基による置換を意味する。
別の実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなり、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２および９５から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の復帰突然変異を含んでなる。
より明確にするために、下表４に好ましい復帰突然変異を示す。
１つの実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７および８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる。
１つの実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７または８７から選択される２、３、４、５、６、７または８の復帰突然変異を含んでなる。
別の実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ここで前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２および９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる；と、
ｂ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ここで前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７および８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる
とを含んでなる。
より明確にするために、下表５に好ましい復帰突然変異を示す。
このような実施形態では、本発明によるＡＤＣの抗体は、上述の復帰突然変異の総てを含んでなり、配列番号３４の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３６の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなる抗体に相当する。前記ヒト化抗体を以下、ｈｚ２０８Ｆ２（「変異体３」または「Ｖａｒ．３」）と呼ぶ。
別の実施形態では、変異体１〜変異体３の間を含むヒト化型もまた本発明により包含される。言い換えれば、本発明による抗体は、配列番号４１の「コンセンサス」配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号４２の「コンセンサス」配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなる抗体に相当する。前記ヒト化抗体を以下、ｈｚ２０８Ｆ２（「変異体２」または「Ｖａｒ．２」）と呼ぶ。
限定されるものではないが、好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号３３の配列または配列番号３３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号３４の配列または配列番号３４と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
「配列番号３３または３４と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号１、２および３の３つの重鎖ＣＤＲを示し、加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号１、２および３）外の配列番号３３または３４の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
本明細書の関連段落に任意の配列によりまたは特定の配列と少なくとも８０％を示す配列により示されていなければ、前記配列は参照配列と少なくとも８０％および好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すと理解されるべきである。これらの配列がＣＤＲ配列を含むかどうかは、これらの配列が参照配列ＣＤＲと同様に少なくともこれらのＣＤＲにおいて、これらのＣＤＲに相当する配列の外に位置する残りの配列に関して算出されなければならない全長配列と８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すことを表すものとする。
限定されるものではないが、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、
ａ）配列番号３５の配列または配列番号３５と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号３６の配列または配列番号３６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
「配列番号３５または３６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号４、５および６の３つの軽鎖ＣＤＲを示し、加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号４、５および６）外の全長配列番号３５の配列または３６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
本明細書に記載のヒト化抗体はまた定常ドメインによっても特徴付けることができ、より詳しくは、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの前記ヒト化抗体が選択または設計され得る。より好ましくは、本発明に関して、前記ヒト化抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
本発明の実施形態は、「Ａｂ」が、形式ＩｇＧ１において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるヒト化抗体であるＡＤＣに関する。より好ましくは、前記ヒト化抗体は、配列番号４３の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
本発明の実施形態は、「Ａｂ」が、形式ＩｇＧ４において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるヒト化抗体であるＡＤＣに関する。より好ましくは、前記ヒト化抗体は、配列番号４４の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
本発明のさらに別の実施形態は、「Ａｂ」が、
ａ）配列番号３７の配列または配列番号３７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３９の配列または配列番号３９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号３８の配列または配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号４０の配列または配列番号４０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体
から選択される抗体であるＡＤＣに関する。
より明確にするために、下表６ａにヒト化抗体ｈｚ２０８Ｆ２の変異体１（Ｖａｒ．１）および変異体３（Ｖａｒ．３）に関するＶＨおよびＶＬの配列の非限定例を示す。それはまた、変異体２（Ｖａｒ．２）のコンセンサス配列も含んでなる。
限定されるものではないが、別の好ましい実施形態では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号５７もしくは６０から選択される配列または配列番号５７もしくまたは６０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤとを含んでなる抗体；ならびに
ｃ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号５７もしくは６０から選択される配列または配列番号５７もしくは６０と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される。
本発明のさらに別の実施形態は、「Ａｂ」抗体が
ａ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０の配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５７の配列または配列番号５７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる抗体；ならびに
ｂ）配列番号５６、６４、６８および７８の配列または配列番号５６、６４、６８もしくは７８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６０の配列または配列番号６０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる抗体
から選択されるＡＤＣに関する。
本発明のさらに別の実施形態は、Ａｂが
ａ）配列番号５８の配列または配列番号５８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｂ）配列番号５８の配列または配列番号５８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６１の配列または配列番号６１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｃ）配列番号６３の配列または配列番号６３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｄ）配列番号６５の配列または配列番号６５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｅ）配列番号６５の配列または配列番号６５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６１の配列または配列番号６１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｆ）配列番号６７の配列または配列番号６７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｇ）配列番号６９の配列または配列番号６９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｈ）配列番号６９の配列または配列番号６９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６１の配列または配列番号６１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｉ）配列番号７１の配列または配列番号７１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｊ）配列番号７３の配列または配列番号７３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｋ）配列番号７５の配列または配列番号７５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｌ）配列番号７７の配列または配列番号７７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｍ）配列番号７９の配列または配列番号７９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；
ｎ）配列番号７９の配列または配列番号７９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号６１の配列または配列番号６１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体；ならびに
ｏ）配列番号８１の配列または配列番号８１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号５９の配列または配列番号５９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体
から選択される抗体であるＡＤＣに関する。
言い換えれば、本発明は、Ａｂが
ａ）配列番号５８、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９および８１から選択される配列または配列番号５８、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９および８１と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖と、
ｂ）配列番号５９および６１から選択される配列または配列番号５９および６１と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖
とを含んでなる抗体ＡＤＣに関する。
より明確にするために、下表６ｂにヒト化抗体ｈｚ２０８Ｆ２の種々の変異体に関するＶＨおよびＶＬ（可変ドメインおよび全長）の配列の非限定例を示す。
本発明の別の態様は、Ａｂが、ｉ）それぞれ２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６もしくはＩ−４７７４により産生された抗体、またはｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体；またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープと結合する抗体から選択される抗体であるＡＤＣである。
実際に、それぞれ２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６およびＩ−４７７４から選択されるマウスハイブリドーマが本明細書に記載される。
また、本発明による、抗体をコードする単離された核酸、またはその抗原結合フラグメントも記載される。
本明細書において互換的に使用される用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有しない核酸のフラグメントまたは領域を定義し、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドの厳密な配列を意味する。
これらの配列は単離および／または精製されており、すなわち、それらは例えば複製により直接的または間接的にサンプリングされたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。組換え遺伝学により、例えば宿主細胞の手段により得られた、または化学合成により得られた単離された核酸もまた本明細書に記載されるべきである。
また、本発明によるＡＤＣの抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含んでなるベクター、特に、このようなヌクレオチド配列を得るクローニングおよび／または発現ベクターも記載される。
ベクターは好ましくは、所与の宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含む。従って、ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含み得る。ベクターは宿主細胞内で安定に維持可能でなければならず、場合により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特異的シグナルを有してよい。これらの種々のエレメントは使用する宿主細胞に応じて当業者により選択および最適化される。この目的で、ヌクレオチド配列は、選択された宿主内でまたは自己複製するベクターに挿入できるか、または選択された宿主の組み込みベクターであり得る。
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。ベクターは本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現するように、宿主細胞を形質転換させるために使用される。
このようなベクターは当業者により一般に使用される方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、熱ショックまたは化学法などの標準的方法により好適な宿主に導入することができる。
これらの単離された宿主細胞は、上記のベクターにより形質転換されるか、または上記のベクターを含んでなる。
宿主細胞は、細菌細胞などの原核生物系または真核生物系、例えば、また、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳動物細胞（ヒトを除く）などの中から選択され得る。昆虫または植物細胞も使用可能である。
また、本発明によるＡＤＣの抗体またはその抗原結合フラグメントの製造のための方法も開示され、前記方法は、以下の工程：
ａ）培地中、上記に開示されるような宿主細胞に好適な培養条件での培養；および
ｂ）このようにして産生された抗体の、培養培地からまたは前記培養細胞からの回収
を含んでなる。
形質転換細胞は、本発明によるＡＤＣの組換え抗体の生産方法で使用される。上記に開示されるようなベクターおよび／またはベクターにより形質転換された細胞を用いて組換え型の抗体を生産するための方法もまた本明細書に含まれる。好ましくは、上記のようなベクターにより形質転換された細胞は、前記抗体の発現および前記抗体の回収を可能とする条件下で培養される。
既述のように、宿主細胞は、原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系において分泌を促進するヌクレオチド配列を特定することができる。よって、このような配列を有する上記に開示されるベクターは、分泌される組換えタンパク質の製造に遊離に使用できる。実際に、対象とするこれらの組換えタンパク質の精製は、それらのタンパク質が宿主細胞内部ではなく細胞培養の上清中に存在するという事実により容易となる。
本発明のＡＤＣの抗体はまた、化学合成によって作製することもできる。このような１つの作製方法もまた、本発明の目的である。当業者は、固相技術または部分的固相技術、フラグメントの縮合による、または溶液中での従来合成によるなどの化学合成のための方法を知っている。化学合成により得られた、また対応する非天然アミノ酸を含有し得るポリペプチドも引用することができる。
上記の方法により得られる可能性のある抗体もまた、本発明に含まれる。
特定の態様によれば、本発明は、ＡＢが宿主標的部位に細胞傷害性薬剤を送達するためのアドレッシングビヒクルとして使用するための上記の抗体またはその抗原結合フラグメントである、ＡＤＣに関し、前記宿主標的部位は、ＩＧＦ−１Ｒ、好ましくは、ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン、より好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（配列番号５０）、いっそうより好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（配列番号５１）に、いっそうより好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインのＮ末端（配列番号５２）、またはその任意の天然変異体配列に局在するエピトープからなる。
好ましい実施形態では、前記宿主標的部位は、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、より好ましくは、天然にまたは遺伝子組換えの方法によりＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の標的部位である。
さらなる実施形態において、前記宿主標的部位は、癌、好ましくは、ＩＧＦ−１Ｒ発現癌、またはＩＧＦ−１Ｒ関連癌を有する患者、好ましくは、ヒトの細胞の標的部位である。
ＩＧＦ−１Ｒ発現癌またはＩＧＦ−１Ｒ関連癌としては、特に、腫瘍細胞がそれらの表面でＩＧＦ−１Ｒの全部または一部を発現または過剰発現する癌である。
ＩＩ−薬物（Ｄ）
本発明による薬物成分は下式（ＩＩ）
を有し、式中、
Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリル（例えば、チアゾール−２−イル）であり、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（例えば、メチル）、特に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり、
Ｒ９は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（例えば、メチル）であり、
ｍは、１〜８の間に含まれる整数であり、かつ
波線は、Ｌとの結合点を示す。
「アルキル」とは、本発明において、直鎖または分岐型の飽和炭化水素鎖を意味する。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはヘキシル基が挙げられる。
「（Ｃｘ−Ｃｙ）アルキル」とは、本発明において、ｘ〜ｙ個の炭素原子を含んでなる上記で定義されるものなどのアルキル鎖を意味する。従って、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル鎖である。
（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは有利には（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、好ましくは、（Ｃ１−Ｃ２）アルキルである。
本発明の化合物の中で、薬物部分の特に有価な１つのクラスは、Ｒ２がＣＯＯＨ基を表す式（ＩＩ）の薬物部分に相当する。
薬物部分の別の特に有価なクラスは、Ｒ２がチアゾール（特に、チアゾール−２−イル基）である式（ＩＩ）の部分に相当する。
特に有価な部分の別のクラスは、Ｒ２がＣＯＯＭｅである式（ＩＩ）の部分に相当する。
本発明の１つの特定の実施形態によれば、Ｒ２はより詳しくはＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅまたはチアゾール−２−イル基である。
第１の好ましい実施形態によれば、Ｒ２はＣＯＯＨである。
第２の好ましい実施形態によれば、Ｒ２はＣＯＯＭｅである。
Ｒ３は、特に（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、有利にはメチル基を表す。
ｍは、１〜８の間、特に１〜６の間、有利には１〜４の間に含まれる整数であり、好ましくは、１または２である。
好ましい実施形態では、Ｒ２はＣＯＯＨであり、Ｒ３はメチル基であり、かつ、ｍは１または２である。
本発明の薬物部分の中で、薬物部分の特に有価な１つのクラスは、Ｒ９がメチル基または水素である式（ＩＩ）の薬物部分に相当する。
好ましい実施形態では、
Ｒ２はＣＯＯＨであり、Ｒ３はメチル基であり、Ｒ９はメチル基であり、かつ、ｍは１または２であるか、または
Ｒ２はＣＯＯＨであり、Ｒ３はメチル基であり、Ｒ９は水素であり、かつ、ｍは１または２である。
好ましい実施形態によれば、ＮＲ９基は、フェニル環上で（ＣＨ２）ｍ基に対してパラ位に位置する。
有利には、薬物成分は下記の部分の中から選択される：
（式ＤＨの）薬物の製造：
薬物は、必要であれば、場合により、文献に記載のまたは当業者に周知の、または本明細書の実験の部の例に記載される任意の標準的操作を補って、下記の合成スキームに記載の一般法を用いて製造することができる。
スキーム１は、薬物を製造するために使用可能な第１の一般法を示す。上記一般式において、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２およびＲ３は従前に式ＩＩに関して定義されたものなどであり、Ｒ４は
を表し、Ｒ４ａは、場合により保護型の、従前に定義されたようなＲ４基を表し、かつ、Ｇは保護基である。
第１の工程は、そのアミン官能基上で保護基Ｇにより保護された化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）の縮合からなる。Ｘは、塩素などの脱離基を表し得る。この場合、この第１の工程は、酸塩化物とアミンの間の反応からなる。この反応は、当業者に周知の方法および技術を用いて行うことができる。１つの特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、ＴＨＦ、ジクロロメタン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの溶媒中、有機または無機塩基、例えば、Ｅｔ３Ｎ、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ピリジン、ＮａＨ、Ｃｓ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３の存在下で反応させる。Ｘはまたヒドロキシル（ＯＨ）であってもよい。この場合、第１の工程は、カルボン酸（ＩＩ）とアミン（ＩＩＩ）の間の縮合反応である。この反応は、当業者に周知の方法および技術に従って行うことができる。１つの特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンなどのカップリング剤、ジイソプロピルエチルアミンなどの第３級アミンの存在下で反応させる。別の特に有価な方法では、これら２つの実体を−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、ジエチルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、トリエチルアミンなどの第３級アミンの存在下で反応させる。別の特に有価な方法は、−１５℃〜１００℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、第３級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンの存在下でこれら２つの実体を反応させることからなる。
当業者に周知の技術(<< Protective Groups in Organic Synthesis >>, T.W. Greene, John Wiley & Sons, 2006 and << Protecting Groups >>, P.J. Kocienski, Thieme Verlag, 1994)を用いた中間体の脱保護後に、化合物（ＩＶ）を上記の方法および技術に従って化合物（Ｖ）と縮合させると、脱保護工程後に化合物（ＶＩ）が得られる。この化合物を次に、中間体（ＶＩＩ）と縮合させ、任意選択の脱保護の後に薬物の形成に至り得る。化合物（ＶＩ）はまた、Ｒ’３がＲ３の前駆体、特に、保護基により保護されたＲ３基である化合物（ＶＩＩ’）とカップリングさせることもできる。カップリングおよびその後のＲ３を得るための基Ｒ’３の脱保護は従前に記載されたものと同じ手順に従って行うことができる。
スキーム２は、薬物を製造するために使用可能な第２の一般法を示す。上記一般式において、Ｇは保護基であり、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４ａは従前に定義されたようなものであり、かつ、Ｒ４ｂは
を表す。
第１の工程において、そのアミン官能基上で保護基Ｇにより保護された化合物（ＩＸ）を化合物（ＶＩ）と縮合させる。Ｘは、脱離基、例えば、塩素を表し得る。この場合、第１の工程は、酸塩化物とアミンの間の反応からなる。この反応は、当業者に周知の方法および技術を用いて行うことができる。１つの特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、ＴＨＦ、ジクロロメタン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの溶媒中、Ｅｔ３Ｎ、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ピリジン、ＮａＨ、Ｃｓ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３などの有機または無機塩基の存在下で反応させる。Ｘはまたヒドロキシルを表してもよい。この場合、第１の工程は、カルボン酸（ＩＸ）とアミン（ＶＩ）の間の縮合反応である。この反応は当業者に周知の方法および技術に従って行うことができる。１つの特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン、第３級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンの存在下で反応させる。別の特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、ジエチルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、第３級アミン、例えばトリエチルアミンの存在下で反応させる。
当業者に周知の技術を用いた中間体の脱保護の後、得られた化合物（ＶＩＩＩ）はＲ４Ｙとの反応の後に薬物となり得る。この場合、Ｙは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＳＯ２ＣＨ３、ＯＳＯ２ＣＦ３またはＯ−トシルなどの脱離基である。この反応は、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、ジクロロメタン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの極性無水溶媒中、Ｅｔ３Ｎ、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ＮａＨ、Ｃｓ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３などの有機または無機塩基の存在下で行われる。別の特に有価な方法では、化合物（ＶＩＩＩ）を、Ｒ４ｂがＲ４の前駆体に相当する式Ｒ４ｂ−ＣＨＯのアルデヒドと反応させる。この場合、この反応は、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、酢酸などの酸の添加により制御可能なｐＨにて、任意選択のチタンイソプロポキシド（ＩＶ）の存在下、１，２−ジクロロエタン、ジクロロメタン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨなどの極性溶媒中、ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３などの還元剤の存在下での還元的アミノ化である。
以上の合成スキームでは、薬物は、例えば、当業者に周知の方法を用いた鹸化などの付加的反応工程後に別の薬物となり得、それにより、エステル（ＣＯＯＭｅ）を表すＲ２基がカルボン酸（ＣＯＯＨ）を表すＲ２基に変化する。
少なくとも１つの塩基官能基を含有する薬物を酸付加塩の状態で単離することが望まれる場合には、これは薬物の遊離塩基（少なくとも１つの塩基官能基を含有する）を好ましくは等量の好適な酸で処理することにより可能となる。好適な酸は特にトリフルオロ酢酸であり得る。
ＩＩＩ−リンカー（Ｌ）
「リンカー」、「リンカー単位」、「Ｌ」または「連結」は、本発明において、共有結合を含んでなる化学部分または抗体を少なくとも１つの薬物に共有結合させる原子の鎖を意味する。
リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、２，６−ジイソシアン酸トルエン）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製され得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、細胞傷害性薬剤とアドレス指定系のコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。他の架橋試薬は、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびに（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、ロックフォード、Ｉｌｌ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）であり得る。
リンカーは、「切断不能」であってもまたは「切断可能」であってもよい。
好ましい実施形態では、リンカーは、細胞内での薬物の放出を助ける「切断なリンカー」からなる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーが使用可能である。リンカーは、好ましい実施形態では、リンカーの切断が細胞内環境において抗体から薬物を放出するように、細胞内条件下で切断可能である。
例えば、いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断因子により切断可能である。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素（限定されるものではないが、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む）により切断されるペプチジルリンカーであり得る。一般に、ペプチジルリンカーは、少なくとも２つの連続するアミノ酸もしくは少なくとも３つの連続するアミノ酸を含んでなるか、または少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断因子はカテプシンＢおよびＤおよびプラスミンを含むことができ、これらは総て、ジペプチド薬誘導体を加水分解して標的細胞内で活性薬物の放出をもたらすことが知られている。例えば、癌組織で発現の高いチオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂにより切断可能なペプチジルリンカーが使用可能である（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含んでなる、またはそのものであるリンカー）。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔまたはＰｈｅ−Ｌｙｓを含んでなる、またはそのものである。薬物の細胞内タンパク質分解性放出を使用することの１つの利点は、薬物がコンジュゲートされた場合には一般に減弱され、かつ、その複合体の血清安定性が一般に高いことである。
他の実施形態では、切断可能なリンカーはｐＨ感受性、すなわち、特定のｐＨ値での加水分解に対して感受性である。一般に、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、またはケタールなど）が使用できる。このようなリンカーは、血中などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０以下では不安定である。特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して薬物と結合されているチオエーテル）である。
さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を用いて形成可能なものが含まれる。
特定の好ましい実施形態では、リンカー単位は、下記一般式：
−（Ｔ）ａ−（Ｗ）ｗ−（Ｙ）ｙ−
を有してよく、式中、
Ｔは、延伸単位であり；
ａは、０または１であり；
Ｗは、アミノ酸単位であり；
ｗは、０〜１２の範囲の整数であり；
Ｙは、スペーサー単位であり；
ｙは、０、１または２である。
延伸単位（Ｔ）は、存在する場合、抗体を、存在する場合にアミノ酸単位（Ｗ）と、または存在する場合にスペーサー単位と、または直接的に薬物と連結する。天然にまたは化学的操作を介して抗体上に存在し得る有用な官能基としては、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、炭水化物のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシルが含まれる。好適な官能基はスルフヒドリルおよびアミノである。スルフヒドリル基は、存在する場合、抗体の分子内ジスルフィド結合の還元により作製することができる。あるいは、スルフヒドリル基は、抗体のリシン部分のアミノ基と２−イミノチオランまたは他のスルフヒドリル生成試薬との反応により生成することもできる。特定の実施形態では、抗体は、１以上のリシンを有するように操作される。より好ましくは、抗体は、１以上のシステインを有するように操作することができる（ＴｈｉｏＭａｂｓ参照）。
ある特定の実施形態では、延伸単位は、抗体の硫黄原子と結合を形成する。硫黄原子は、還元型の抗体のスルフヒドリル（−ＳＨ）基に由来し得る。
他のある特定の実施形態では、延伸単位は、抗体の硫黄原子と延伸単位の硫黄原子の間のジスルフィド結合を介して抗体に連結される。
他の特定の実施形態では、延伸部の反応性基は、抗体のアミノ基に反応し得る反応性部位を含む。このアミノ基は、アルギニンまたはリシンのものであり得る。好適なアミン反応性部位としては、限定されるものではないが、活性化エステル（例えば、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル）、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。
さらに別の態様では、延伸部の反応性官能基は、抗体上に存在し得る修飾炭水化物基に反応性のある反応性部位を含む。特定の実施形態では、抗体は、炭水化物部分を提供するように酵素的にグリコシル化されているか、または天然にグリコシル化されている。炭水化物は過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬で穏やかに酸化されてもよく、結果として得られる酸化炭水化物のカルボニル単位は、ヒドラジド、オキシム、反応性アミン、ヒドラジン、チオセミカルバジド、カルボン酸ヒドラジン、またはアリールヒドラジドなどの官能基を含む延伸部と縮合させることができる。
特定の実施形態によれば、延伸単位は下式：
を有し、式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル（前記シクロアルキルまたはアルキル部分は、マレイミド部分の窒素原子に結合される）であり、
アスタリスクは、存在する場合にアミノ酸単位との、存在する場合にスペーサー単位との、または薬物Ｄとの結合点を示し、かつ
波線は、抗体Ａｂとの結合点を示す。
「（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル」は、本発明において、４〜１０個の炭素原子を有する炭化水素環を意味し、限定されるものではないが、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなどが含まれる。
Ｌ２は、有利には（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル、例えば、下式：
のペンチル−カルボニルであり得、式中、
アスタリスクは、存在する場合にアミノ酸単位、存在する場合にスペーサー単位、または薬物Ｄとの結合点を示し；かつ
波線は、マレイミド部分の窒素原子との結合点を示す。
アミノ酸単位（Ｗ）は、存在する場合、存在する場合に延伸単位（Ｔ）を連結し、またはそうでなければ、抗体を、スペーサー単位が存在する場合にスペーサー単位（Ｙ）に、もしくはスペーサー単位が存在しない場合には薬物に連結する。
上述のように、（Ｗ）ｗは存在しないか（ｗ＝０）、またはジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドもしくはドデカペプチド単位であり得、ここで、ペプチドを形成するアミノ酸は互いに異なり得る。
よって、（Ｗ）ｗは、下式：（Ｗ１）ｗ１（Ｗ２）ｗ２（Ｗ３）ｗ３（Ｗ４）ｗ４（Ｗ５）ｗ５により表すことができ、式中、各Ｗ１〜Ｗ５は互いに独立にアミノ酸単位を表し、各ｗ１〜ｗ５は、０または１である。
いくつかの実施形態では、アミノ酸単位（Ｗ）ｗは、天然に存在するものなどのアミノ酸残基、ならびにシトルリンなどの希少アミノ酸および非天然アミノ酸類似体を含んでなり得る。
アミノ酸単位（Ｗ）ｗのアミノ酸残基としては、限定されるものではないが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、アセチルまたはホルミルで保護されたまたは保護されていないリシン、アルギニン、トシルまたはニトロ基で保護されたまたは保護されていないアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルまたはホルミルで保護されたオルニチン、およびシトルリンが挙げられる。例示的アミノ酸リンカー成分としては、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチド、特に、ジペプチドまたはトリペプチドが挙げられる。
例示的ジペプチドとしては、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇが挙げられる。
例示的トリペプチドとしては、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓが挙げられる。
例示的テトラペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号５３）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号５４）が挙げられる。
例示的ペンタペプチドとしては、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号５５）が挙げられる。
特定の実施形態によれば、（Ｗ）ｗは、Ｖａｌ−Ｃｉｔなどのジペプチド（すなわち、ｗ＝２）であり得、またはリンカーはアミノ酸単位を欠いている（ｗ＝０）。リンカーがアミノ酸単位を欠く場合、好ましくは、それはスペーサー単位も欠く。
好ましい実施形態によれば、ｗ＝０（すなわち、（Ｗ）ｗは一重結合である）またはｗ＝２（すなわち、（Ｗ）ｗはジペプチドである）および従って、（Ｗ）ｗは
から選択することができ、特に、Ｖａｌ−Ｃｉｔであり、式中、
アスタリスクは、存在する場合にスペーサー単位との、または薬物Ｄとの結合点を示し；かつ
波線は、Ｌ２との結合点を示す。
アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性において設計および最適化することができる。
リンカーのアミノ酸単位は、限定されるものではないが、腫瘍関連プロテアーゼを含む酵素により酵素的に切断されて薬物を遊離し得る。
アミノ酸単位は、特定の腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性において設計および最適化することができる。好適な単位は、その切断がプロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、ならびにプラスミンにより触媒されるものである。
スペーサー単位（Ｙ）は、存在する場合、存在する場合にアミノ酸単位を、または存在する場合に延伸単位を、またはそうでなければ、抗体を薬物に連結する。スペーサー単位は、自壊的および非自壊的の２つの一般的タイプのものである。非自壊的スペーサー単位は、抗体−薬物複合体からのアミノ酸単位の酵素的切断後にそのスペーサー単位の一部または全部が薬物に結合して残るものである。非自壊的スペーサー単位の例としては、限定されるものではないが、（グリシン−グリシン）スペーサー単位およびグリシンスペーサー単位が挙げられる。薬物を遊離させるためには、非依存的加水分解反応がグリシン−薬物単位の結合を切断するように標的細胞内で起こるべきである。
特定の実施形態では、非自壊的スペーサー単位（Ｙ）はＧｌｙである。
あるいは、自壊的スペーサー単位を含有する抗体−薬物複合体は、独立した加水分解工程の必要なく薬物を放出することができる。これらの実施形態では、（Ｙ）は、ＰＡＢ基の窒素原子を介して（Ｗ）ｗに連結され、かつ、エステル基、炭酸基、カルバミン酸基またはエーテル基を介して薬物に直接接続されたｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）単位の残基である。
自壊的スペーサーの他の例としては、限定されるものではないが、ＰＡＢ基と電気的に等価な芳香族化合物、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールの残基が挙げられる。スペーサーは、アミド結合の加水分解時に容易に環化を受けるもの、例えば、置換および非置換４−アミノ酪酸アミド、適宜置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミドが使用可能である。
別の実施形態では、スペーサー単位は、分岐型のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位であり、これは付加的薬物を組み込むために使用可能である。
特定の実施形態では、スペーサー単位（Ｙ）はＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは
（ＰＡＢ単位の酸素は、カルボニルに連結されている）であり、かつ、ｙ＝１またはリンカーはスペーサー単位を欠いている（ｙ＝０）。
特定の実施形態では、リンカーは下式（ＩＩＩ）：
を有し、式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル（これらの部分のカルボニルは、存在する場合、（Ｗ）ｗに連結されている）であり、
Ｗは、アミノ酸単位を表し、ここで、ｗは、０〜５の間に含まれる整数を表し、
Ｙは、ＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは、
（ＰＡＢ単位の酸素は、カルボニルに連結されている）であり、かつ、ｙは０または１であり（好ましくは、ｗが０である場合、ｙは０であり、ｗが１〜５の間に含まれる場合、ｙは０または１である）、
アスタリスクは、薬物Ｄとの結合点を示し、かつ
波線は、抗体Ａｂとの結合点を示す。
有利には、Ｌ２は、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル、例えば、下式：
のペンチル−カルボニルであり、式中、
アスタリスクは、（Ｗ）ｗとの結合点を示し；かつ
波線は、マレイミド部分の窒素原子との結合点を示す。
好ましい実施形態によれば、リンカーＬは、
から選択され、式中、
アスタリスクは、薬物Ｄとの結合点を示し、かつ、波線は、抗体Ａｂとの結合点を示す。
ＩＶ−抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）
好ましい実施形態では、本発明の抗体−薬物複合体は、例えば、限定されるものではないが、ｉ）抗体の求核基と二価リンカー試薬との反応およびその後の薬物の求核基との反応、またはｉｉ）薬物の求核基と二価リンカー試薬との反応およびその後の抗体の求核基との反応など、当業者に公知のいずれの方法によって作製されてもよい。
抗体上の求核基としては、限定されるものではないが、Ｎ末端アミン基、側鎖アミン基（例えば、リシン）、側鎖チオール基、および抗体がグリコシル化されている場合には糖のヒドロキシル基またはアミノ基が挙げられる。
薬物上の求核基としては、限定されるものではないが、アミン、チオール、およびヒドロキシル基、好ましくは、アミン基が挙げられる。
アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができ、限定されるものではないが、活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハリド；アルキルおよびベンジルハリド、例えば、ハロアセトアミド；アルデヒド；ケトン；カルボキシル；およびマレイミド基が挙げられる。抗体は、還元可能な鎖内ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有してもよい。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤での処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性とすることができる。従って、各システイン架橋は理論上２つの反応性チオール求核部分を形成する。当業者に公知の任意の反応を介して抗体に付加的求核基を導入することができる。非限定例として、反応性チオール基は、１以上のシステイン残基を導入することにより抗体に導入され得る。
抗体−薬物複合体はまた、リンカー試薬上の求核置換基と反応し得る求電子部分を導入するための抗体の修飾によっても作製され得る。グリコシル化抗体の糖を酸化してアルデヒドまたはケトン基を形成させてもよく、これはリンカー試薬または薬物のアミン基と反応し得る。生じたイミンシッフ塩基群は安定な結合を形成し得るか、または還元して安定なアミン結合を形成させてもよい。一実施形態では、グリコシル化抗体の炭水化物部分とガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応はタンパク質中に、薬物上の適当な基と反応し得るカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を生じ得る。別の実施形態では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有するタンパク質はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、その結果、最初のアミノ酸に代わってアルデヒドの生成をもたらし得る。
好ましい実施形態では、本発明の抗体−薬物複合体は、薬物−リンカー部分の形成とその後の抗体の求核基（例えば、システイン部分のＳＨ基）と薬物−リンカー部分の求電子基（例えば、マレイミド）との間のカップリングにより作製される。
１．薬物−リンカー
薬物−リンカー部分は、
リンカーと薬物、
リンカーの合成が完了する前のリンカーの一部と薬物、
薬物の合成が完了する前のリンカーと薬物の一部または前駆体、または
リンカーおよび薬物の合成が完了する前のリンカーの一部と薬物の一部または前駆体
をカップリングすることにより作製され得る。
カップリング反応は、求核基と求電子基の間の当業者に周知の反応である。
求核基は特に、アミン、チオールまたはヒドロキシル基であり得る。好ましい実施形態では、求核基は第１級または第２級アミン基である。
求電子基は、場合により活性化形態のカルボン酸基（ＣＯＯＨ）、または活性化された炭酸エステル部分であり得る。
カルボン酸の「活性化形態」とは、ＣＯＯＨ官能基のＯＨ部分が、アミド結合を形成して化合物ＬＧ−Ｈを放出するために活性化カルボン酸基とアミノ基のカップリングを可能とする活性化脱離基（ＬＧ）で置換されている、カルボン酸を意味する。活性化形態は、活性化エステル、活性化アミド、無水物またはアシルハリド、例えば、塩化アシルであり得る。活性化エステルとしては、カルボン酸基とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドの反応により形成される誘導体が含まれる。
「活性化炭酸エステル」は、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ部分を含んでなる炭酸エステルを意味し、ここで、ＯＲは、カルバミン酸部分を形成して化合物ＲＯＨを放出するために活性化炭酸エステルとアミノ基のカップリングを可能とする良好な脱離基を表す。活性化炭酸エステルのＲ基としては、限定されるものではないが、ｐ−ニトロ−フェニル、ペンタフルオロフェニル、２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イルおよびベンジル基、好ましくはｐ−ニトロ−フェニルおよびペンタフルオロフェニル基が挙げられる。
リンカーが下式（ＩＩＩ）：
を有する場合、薬物−リンカー部分は下式（ＩＶ）：
を有し、薬物−リンカー部分の合成の最終工程は一般に、下式（Ｖ）：
（式中、Ｌ２は従前に定義された通りであり、ＬＧは、脱離基、特に、ハリド、例えば、クロリドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドに由来する基を表す）
の化合物と下式（ＶＩ）：
Ｈ−（Ｗ）ｗ−（Ｙ）ｙ−Ｄ （ＶＩ）
（式中、ｙ＝１およびＹ＝ＰＡＢ−カルボニル）
の化合物の間のカップリングであり、式（ＶＩ）の化合物は、薬物（ＤＨ）と下式（ＶＩＩ）の化合物、好ましくは、その保護形態：
Ｇ−（Ｗ）ｗ−ＰＡＢ−ＣＯ−ＯＲ （ＶＩＩ）
（式中、Ｗおよびｗは従前に定義された通りであり、Ｒは、「活性化炭酸エステル」の定義に定義された通りであり、ＧはＨまたは保護基である）
の間のカップリングにより作製され得る。
式（ＶＩＩ）の化合物が保護形態である場合、脱保護の最終工程が必要である。
ｙ＝０である場合、化合物（ＶＩ）は式Ｈ−（Ｗ）ｗ−Ｄを有し、式中、（Ｗ）ｗおよび好ましくは、Ｄはアミノ酸単位から構成される。結果として、化合物（ＶＩ）はこの場合、当業者に周知の従来のペプチド合成方法により作製され得る。
２．Ａｂ−リンカー−薬物
本発明による好ましい実施形態は、抗体上に存在するシステインと薬物−リンカー部分の求電子基、好ましくは、薬物−リンカー部分上に存在するマレイミド部分との間のカップリングからなる。
マレイミド−システインのカップリングは、当業者に周知の方法により行うことができる。
一般に、抗体は、たとえあるとしても、薬物成分に連結可能な多くの遊離の反応性システインチオール基を含まない。抗体中のほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在し、部分的または完全な還元条件下でジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰなどの還元剤を用いて還元しなければならない。ＡＤＣの負荷量（薬物／抗体比）は、薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）または抗体に対するリンカー試薬のモル過剰率の制限、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間または温度の制限、および（ｉｉｉ）システインチオール修飾に対する部分的還元条件または還元条件の制限を含む、いくつかの異なる方法で制御可能である。
ヒトＩｇＧのジスルフィド結合構造は、今日、よく確立されている（Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23に総説）。実際に、４つのヒトＩｇＧサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のジスルフィド結合構造に関して、多くの類似性といつくかの相違がある。総てのＩｇＧサブクラスが常に１２の鎖内ジスルフィド架橋と、重鎖と軽鎖の間で形成されるそれらの鎖内ジスルフィド結合内に存在する相違を含む。各鎖内ジスルフィド結合は、個々のＩｇＧドメイン、すなわち、可変（ＶＬおよびＶＨ）および定常（ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）ドメインに関連する。２本の重鎖はそれらのヒンジ領域で様々な数：ＩｇＧ１およびＩｇＧ４では２つ、ＩｇＧ２では４つ、ＩｇＧ３では１１のジスルフィド架橋により連結されている。ＩｇＧ１の重鎖と軽鎖は軽鎖の最後のシステイン残基と重鎖の５番目の残基の間のジスルフィド結合により接続されているが、他のサブクラスＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４では、軽鎖は、軽鎖の最後のシステイン残基とＶＨドメインとＣＨ１ドメインの境界に存在する、重鎖の３番目のシステイン残基の間のジスルフィド結合により重鎖に連結されている。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では、これらの古典的構造以外のジスルフィド結合構造が記載されている（Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23に総説）。鎖内ジスルフィド結合は溶媒露出性が高く、結果として、各ドメイン内で逆平行β−シート構造に埋もれて溶媒に曝されていない鎖内ジスルフィド結合よりもはるかに反応性が高い。これらの理由で、抗体のアイソタイプによらず、カップリングは、軽い還元の後に露出した鎖内システイン残基で起こる。従って、各鎖内ジスルフィド架橋は、理論上、２つのコンジュゲーション部位を形成し得る。
付加的な求核基は、リシンと２−イミノチオラン（トロート試薬）との反応によるアミンのチオールへの変換を介して抗体に導入することができる。反応性チオール基はまた、１、２、３、４、またはそれを越えるシステイン残基を操作すること（例えば、１以上の非天然システインアミノ酸残基を含んでなる変異型抗体を作製すること）によって抗体（またはそのフラグメント）に導入してもよい。米国特許第７５２１５４１号は、反応性システインアミノ酸の導入による抗体の操作を教示している。
システインアミノ酸は、抗体中の、鎖内または分子間ジスルフィド結合を形成しない反応性部位で操作し得る（Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729;米国特許第７５２１５４１号；米国特許第７７２３４８５号；ＷＯ２００９／０５２２４９)。操作されたシステインチオールは、マレイミドまたはα−ハロアミドなどのチオール反応性求電子基を有する本発明のリンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応させて、システイン操作抗体と薬物部分を有するＡＤＣを形成することができる。従って、薬物成分の位置は設計、制御可能であり、既知である。操作されたシステインチオール基は一般に高収率でチオール反応性リンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応するので、薬物負荷量は制御可能である。重鎖または軽鎖上の単一部位における置換によるシステインアミノ酸の導入のためのＩｇＧ抗体の操作から、対称抗体上に２つの新たなシステインが得られる。ほぼ均質なコンジュゲーション産物ＡＤＣで、２に近い薬物負荷量が達成できる。
抗体の２以上の求核基または求電子基が薬物−リンカー中間体、またはリンカー試薬次いで薬物成分試薬と反応する場合、得られる産物は、抗体と結合した一定の分布、例えば、１、２、３などの薬物部分を持ったＡＤＣ化合物の混合物である。ポリマー逆相（ＰＬＲＰ）および疎水性相互作用（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法で、混合物中の化合物を薬物負荷値によって分離することができる。単一薬物負荷値（ｐ）を有するＡＤＣの調製物は単離可能であるが、薬物部分はリンカーを介して抗体の異なる部位に結合されている可能性があるので、これらの単一薬物負荷値のＡＤＣはなお異質な混合物であり得る。
一部の抗体−薬物複合体では、薬物比は抗体上の結合部位の数によって制限を受け得る。高い薬物負荷、例えば、薬物比＞５は、特定の抗体−薬物複合体の凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の低下を招く場合がある。一般には、コンジュゲーション反応では、理論的最大値より少ない薬物部分が抗体にコンジュゲートされる。
薬物負荷量はまた薬物−抗体比（ＤＡＲ）とも呼ばれ、細胞結合剤当たりの薬物の平均数である。
抗体ＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプの場合、部分的抗体還元の後に薬物がシステインに結合される場合、薬物負荷量は抗体当たり１〜８薬物（Ｄ）の範囲であり得、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、および８つの薬物部分が抗体と共有結合される。
抗体ＩｇＧ２アイソタイプの場合、部分的抗体還元の後に薬物がシステインに結合される場合、薬物負荷量は抗体当たり１〜１２薬物（Ｄ）の範囲であり得、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２の薬物部分が抗体と共有結合される。
ＡＤＣの組成物は、一定範囲の、１〜８または１〜１２の薬物とコンジュゲートされた細胞結合剤、例えば抗体の集合体を含む。
コンジュゲーション反応からのＡＤＣの調製における抗体当たりの薬物の平均数は、ＵＶ、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および電気泳動などの従来の手段によって特徴付けることができる。
非限定実施形態として、本明細書では、抗体ｃ２０８Ｆ２とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号２８の配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列番号２３の配列の重鎖では２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される少なくとも１つのシステインとカップリングされる。
非限定実施形態として、本明細書では、抗体ｃ２０８Ｆ２とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号２８の配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列番号２３の配列の重鎖では、２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される２、３または４つのシステインとカップリングされる。
非限定実施形態として、本明細書では、抗体ｈｚ２０８Ｆ２（ａｒ．１）とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号３９の配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列番号３７の配列の重鎖では２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される少なくとも１つのシステインとカップリングされる。
非限定実施形態として、本明細書では、抗体ｈｚ２０８Ｆ２（ｖａｒ．３）とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号４０の配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列番号３８の配列の重鎖では２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される２、３または４つのシステインとカップリングされる。
別の例はリシンカップリングからなる。抗体は、薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）またはリンカー試薬と反応しない、例えば、多数のリシン残基を含み得る。最も反応性の高いリシン基だけがアミン反応性リンカー試薬と反応し得る。また、最も反応性の高いシステインチオール基だけがチオール反応性リンカー試薬と反応し得る。
本発明の化合物がリシンと結合される場合、薬物負荷量は細胞抗体当たり１〜８０薬物（Ｄ）の範囲であり得るが、上限は４０、２０、１０または８が好ましいものであり得る。ＡＤＣの組成物は、一定範囲の、１〜８０、１〜４０、１〜２０、１〜１０または１〜の薬物とコンジュゲートされた細胞結合剤、例えば抗体の集合体を含む。
本発明による式（Ｉ）のＡＤＣは、薬学上許容可能な塩の形態であり得る。
本発明において、「薬学上許容可能な」とは、一般に、安全、無毒で、生物学的もその他の点でも望ましくないものではなく、かつ、獣医学的使用ならびにヒト医薬的使用に許容可能な医薬組成物の作製に使用できるものを意味する。
化合物の「薬学上許容可能な塩」とは、本明細書で定義されるように薬学上許容可能であり、かつ、親化合物の所望の薬理活性を有する塩を意味する。
薬学上許容可能な塩は特に、
（１）塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および類似の酸などの薬学上許容可能な無機酸を伴って形成される、または酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ステアリン酸、乳酸および類似の酸などの薬学上許容可能な有機酸を伴って形成される、薬学上許容可能な酸の付加塩；ならびに
（２）親化合物中に存在する酸プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンまたはアルミニウムイオンのいずれかにより置換されている；またはリシン、アルギニンおよび類似のものなどの薬学上許容可能な有機塩基；もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムおよび類似のものなどの薬学上許容可能な無機塩基とともに配位している場合に形成される薬学上許容可能な塩基の付加塩
を含んでなる。
これらの塩は、塩基または酸官能基を含有する本発明の化合物および対応する酸または塩基から、従来の化学法を用いて作製することができる。
Ｖ−処置
最後に、本発明は、特に、癌の処置における薬物として使用するための上記のＡＤＣに関する。
本発明のさらなる主題は、特に、癌の処置のために医薬品として使用するための、上記で定義されるものなどの式（Ｉ）の化合物である。
本発明はまた、特に癌の処置のために意図される医薬品を製造するための、上記で定義されるものなどの式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
本発明はまた、癌を処置するための方法であって、それを必要とする人に有効量の上記で定義されるものなどの式（Ｉ）の化合物を投与することを含んでなる方法に関する。
癌は好ましくは、それらの表面でタンパク質ＩＧＦ−１Ｒの全部または一部を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含むＩＧＦ−１Ｒ関連癌から選択することができる。
より詳しくは、前記癌は、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、神経鞘腫、神経芽腫、口腔扁平上皮癌、中皮腫、平滑筋肉腫および任意の薬物耐性現象または癌である。
疑念を避けるため、薬物耐性ＩＧＦ−１Ｒ発現癌とは、元々ＩＧＦ−１Ｒを発現する耐性癌だけなく、元々はＩＧＦ−１Ｒを発現または過剰発現しないが、それらがひと度従前の処置に対して耐性となった場合にＩＧＦ−１Ｒを発現する癌もそうであると理解されるべきである。
本発明のもう１つの目的は、本明細書に記載のようなＡＤＣを含んでなる医薬組成物である。
より詳しくは、本発明は、本発明のＡＤＣを少なくとも賦形剤および／または薬学上許容可能なビヒクルを含んでなる医薬組成物に関する。
本明細書において、「薬学上許容可能なビヒクル」または「賦形剤」は、二次反応を誘発せずに医薬組成物中に入り、かつ、１または複数の有効化合物の投与の助長、内体でのその寿命および／またはその有効性の増強、溶液中でのその溶解度の増大またはその保存の改善を可能とする化合物または化合物の組合せを表すものとする。これらの薬学上許容可能なビヒクルおよび賦形剤は周知であり、選択された１または複数の化合物の性質および投与様式の関数として当業者により適合される。
有効成分は、従来の医薬担体との混合物として単位投与形で動物またはヒトに投与することができる。好適な単位投与形は、経口経路を介する形態および非経口経路（皮下、皮内の、筋肉内または静脈内）を介する投与形態を含んでなる。
経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸剤、散剤（ゼラチン硬または軟カプセル）または顆粒の使用が可能である。これらの組成物では、本発明の有効成分は、アルゴン流中でデンプン、セルロース、スクロース、ラクトースまたはシリカなどの１以上の不活性希釈剤と混合する。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの１以上の滑沢剤、着色剤、コーティング剤（コーティング錠）またはワニスも含んでなり得る。
非経口投与用の無菌組成物は、好ましくは、水性または非水性溶液、懸濁液またはエマルションであり得る。溶媒またはビヒクルとして、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、特に、オリーブ油、注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルまたは他の好適な有機溶媒の使用が可能である。これらの組成物は、アジュバント、特に、湿潤剤、等張剤、乳化剤、分散剤および安定剤も含有してよい。滅菌は、例えば、除菌濾過、組成物への滅菌剤の配合、照射または加熱によるなどのいくつかの方法で行うことができる。それらはまた、使用時に無菌水または他の任意の注射用無菌媒体に溶かすことができる固体無菌組成物の形態で調製することもできる。
好ましくは、これらのＡＤＣは、全身経路により、特に、静脈内経路により、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下経路により、または経口経路により投与される。より好ましい様式では、本発明によるＡＤＣを含んでなる組成物は、連続的に数回投与される。
本発明は、従って、また、少なくともｉ）本発明による抗体−薬物複合体、および／または本発明による医薬組成物と、ｉｉ）前記抗体−薬物複合体および／または医薬組成物が配分されているシリンジまたはバイアルまたはアンプルとを含んでなるキットにも関する。
それらの投与様式、用量および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、処置に対する忍容性および示される二次的影響など、患者に適合された処置の確立において一般に考慮される基準に従って決定することができる。
本発明の他の特徴および利点は、実施例および判例が以下に表される図面とともに本明細書の続きで明らかとなる。
図１Ａ〜１Ｃ：ＦＡＣＳ分析によるヒト天然ＩＧＦ−１Ｒへの抗体結合。図１Ａは、ＭＣＦ−７細胞株での力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図１Ｂは、ＭＣＦ−７細胞株でのマウスおよびキメラ両方の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。図１Ｃは、ＭＣＦ−７細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＢｍａｘを表す。 図２Ａ〜２Ｂ：トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞を用いたｈＩＧＦ−１Ｒ認識の評価。図２Ａ）は、ＩＧＦ−１Ｒ＋細胞株での１つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂの力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図２Ｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ−細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂの結合を表す。 図３Ａ〜３Ｂ：トランスフェクト細胞を用いたＩＧＦ−１ＲとｈＩＲのＡｂの特異性の評価。図３Ａは、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞株でのマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂの結合を表す。図３Ｂは、ＩＲ＋細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂの結合を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。ＧＲＯ５抗ｈＩＲ Ｍａｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は陽性対照として導入された。 図４：ＩＭ−９細胞株でのマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂの結合。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。ＧＲＯ５抗ｈＩＲ Ｍａｂは陽性対照として導入された。 図５Ａ〜５Ｃ：サルＩＧＦ−１Ｒの認識の評価。図５Ａは、ＣＯＳ−７細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂの力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図５Ｂは、ＣＯＳ−７細胞株でのマウスおよびキメラ両抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。図５Ｃは、ＮＩＨ ３Ｔ３トランスフェクト細胞ｈＩＧＦ−１Ｒ＋およびＣＯＳ−７の両細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。 図６：カルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトされたマウス抗Ｔａｇ Ｈｉｓ抗体１１０００ＲＵ超で活性化したＣＭ５センサーチップを用いたＳＰＲ技術に基づくＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００で得られたセンサーグラム。実験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、２５℃にて３０μｌ／分の流速で行った。図は、分析の最初の注入の開始時にｘ軸上に、また、この最初の注入直前に定義されたベースラインによりｙ軸上に並べた４つの独立したセンサーグラムの重畳を示した。組換え可溶性ＩＧＦ１Ｒのヒトに基づく配列のキャプチャーで得られたセンサーグラムを菱形で示す。組換え可溶性ＩＧＦ−１Ｒのカニクイザルに基づく配列のキャプチャーで得られたセンサーグラムを三角で示す。白い記号はブランクサイクル（ランニングバッファーの５回の注入）に相当し、黒い記号は漸増濃度範囲のｃ２０８Ｆ２（５、１０、２０、４０および８０ｎＭ）の注入に相当する。 図７：ＩＧＦ１と比較した場合の受容体リン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の固有の効果の評価。 図８：マウス抗ｈＩＧＦ−１ＲによるＩＧＦ−１に応答したＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害。 図９：抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞表面シグナル強度は、３７℃での細胞インキュベーション後にダウンレギュレートされる。ＭＣＦ−７細胞を４℃または３７℃で４時間、１０μｇ／ｍｌのＡｂとともにインキュベートした。図は、ΔＭＦＩを表す。 図１０Ａ〜１０Ｂ：抗体表面減衰。細胞表面結合抗体を３７℃で１０、２０、３０、６０および１２０分後に評価した。図１０Ａは、４℃で測定したシグナル強度と比較した残留ＩＧＦ−１Ｒ％を表す。図１０Ｂは、Ｐｒｉｍｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用い、指数減衰フィッティングを用いた半減期計算を表す。 図１１：抗ｈＩＧＦ−１Ｒ Ａｂは内部移行される。細胞を１０μｇ／ｍｌのマウスＡｂとともに３７℃で０、３０または６０分間インキュベートした。細胞に透過処理を施し、または施さず、二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８とともにインキュベートした。膜は、シグナル強度ｗ／ｏ透過処理に相当する。全体は、細胞透過処理後のシグナル強度に相当し、細胞質は、内部移行したＡｂに相当する。各評価抗体の名称を各グラフの上に示す。 図１２Ａ〜１２Ｂ：Ａｂ内部移行の画像。図１２Ａ：ｍ２０８Ｆ２とともに４℃で２０分間インキュベートし、インキュベーション前（Ｗ）、３７℃で１５分（Ｘ）、３０分（Ｙ）および６０分（Ｚ）洗浄したＭＣＦ−７細胞。細胞を固定し透過処理を施した。ｍ２０８Ｆ２ Ａｂは抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８を用いて、Ｌａｍｐ−１はウサギ抗Ｌａｍｐ−１抗体を二次抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ ５５５とともに用いて可視化した。図１２Ｂ：ＭＣＦ−７細胞を３７℃で３０分間抗ｈＩＧＦ−１Ｒマウス抗体とともにインキュベートし、上記のように染色した。共局在はＩｍａｇｅＪソフトウエアの共局在ハイライター(highliter)プラグインを用いて確認した。 図１３：抗体分解におけるリソソーム経路の関与。 図１４：酸性ｐＨは５種類のマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合能を低下させる。 図１５Ａ〜１５Ｄ：ｃ２０８Ｆ２ Ｍａｂの第１のヒト化型の結合特徴。ｈｚ２０８Ｆ２ ＶＨ３／ＶＬ３ ｍＡｂの結合特性をヒト細胞株ＭＣＦ−７（Ａ）、サル細胞株ＣＯＳ−７（Ｂ）およびヒトインスリン受容体を発現するトランスフェクトマウス細胞株（Ｃ）で評価した。マウスおよびキメラの両２０８Ｆ２ ｍＡｂの結合を並行して評価した。トランスフェクト(transefected)細胞株（Ｄ）でのｈＩＲの発現を確認するために抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を用いた。 図１６：ｈｚ２０８Ｆ２ ＶＨ３／ＶＬ３抗体表面減衰。 図１７：両フローセルにて、流速３０μｌ／分でランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、カルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトした１２．０００ＲＵ前後のマウス抗ＴａｇＨｉｓモノクローナル抗体で活性化したＣＭ５センサーチップを用い、２５℃の温度でＳＰＲに基づくＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００装置で得られたセンサーグラムの重畳。各センサーグラム（第１のものを三角で示し、第２のものを菱形で示す）は全サイクルに相当する。 １−第２のフローセルでの組換えｈ−ＩＧＦ−１Ｒ（１０μｇ／ｍｌ）の溶液の１分間の注入 ２−第１のセンサーグラムでは：各９０秒で５回のランニングバッファーの注入。 第２のセンサーグラムでは：各９０秒で漸増濃度範囲での抗ＩＧＦ−１Ｒ ｃ２０８Ｆ２抗体溶液の５回の注入 ３−解離動態速度の決定のための３００秒の減衰 ４−１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ ｐＨ１．５バッファーの４５秒の注入による表面の再生 図１８：漸増濃度範囲の抗ＩＧＦ−１Ｒ ｃ２０８Ｆ２溶液で得られたセンサーグラムに対するブランクセンサーグラム（ＨＢＳ−ＥＰ＋の５回の注入）の減算に相当するセンサーグラムを灰色で示す。下記パラメーター：ｋｏｎ＝（１．２０６±０．０３６）×１０６Ｍ−１．ｓ−１、ｋｏｆｆ＝（７．８１±０．１８）×１０−５ｓ−１、Ｒｍａｘ＝３０７．６±０．３ＲＵを用いた１：１モデルに相当する理論的センサーグラムを細い黒線で示す。ｃ２０８Ｆ２の算出濃度をグラフに示す：最高濃度（２４ｎＭ）のみを定数と見なす）。 図１９：解離定数は各抗体に関して行った４回の実験の平均に相当し、ｐＭ単位で表される比：ｋｏｆｆ／ｋｏｎ×１０１２に相当する。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）に相当する。 図２０：半減期は、各抗体に関して行った４回の実験の平均に相当し、時間の単位で表される比：Ｌｎ（２）／ｋｏｆｆ／３６００に相当する。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）に相当する。 図２１：３つの異なる化合物とカップリングされた抗ＩＧＦ−１Ｒの細胞傷害性。５種類のキメラ抗体、抗ＩＧＦ−１ＲをＥ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３のいずれかとカップリングさせた。無関連抗体ｃ９Ｇ４もまた同じ化合物とカップリングさせた。 図２２Ａ〜２２Ｃ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３（図２２Ａ）、ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（図２２Ｂ）およびｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３（図２２Ｃ）のｉｎ ｖｉｖｏ評価。 図２３Ａ〜２３Ｂ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＡＤＣ対照（ｃ９Ｇ４−Ｅ１３およびｃ９Ｇ４−Ｇ−１３）と比較したｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３（図２３Ａ）およびｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（図２３Ｂ）の両方のｉｎ ｖｉｖｏ評価。 図２４Ａおよび２４Ｂ：酸性ｐＨはヒト化ＩＧＦ−１Ｒ抗体ｈｚ２０８Ｆ２ Ｈ０７６／Ｌ０２４（Ａ）およびｈｚ２０８Ｆ２（Ｈ０７７／Ｌ０１８（Ｂ）の結合能を低下させる。 図２５：正常細胞でのｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３の細胞傷害性の評価。 図２６：Ｇ−１３とカップリグされたｈｚ２０８Ｆ２のヒト化変異体の細胞傷害性。無関連抗体ｃ９Ｇ４もまた同じ化合物とカップリングさせた。 図２７：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける２０８Ｆ２−Ｇ−１３とｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３のヒト化型のｉｎ ｖｉｖｏ評価。 図２８Ａおよび２８Ｂ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおける１回の注入と比較した４回の注入のｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（２８Ａ）またはｈｚ２０８Ｆ２−４−Ｇ−１３（２８Ｂ）のいずれかのｉｎ ｖｉｖｏ評価。 図２９Ａおよび２９Ｂ：ＣａＯＶ−３異種移植モデルにおけるｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３（２９Ａ）およびｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（２９Ｂ）のｉｎ ｖｉｖｏ評価。
実施例１：ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤに対するマウス抗体の作製
ヒトＩＧＦ−１受容体（ｈＩＧＦ−１Ｒ）のヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対して生成したマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを１０μｇのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９１−ＧＲ）で３回皮下免疫した。別途、一部の動物で、１０μｇのＩＧＦ−１Ｒマウス細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６６３０−ＧＲ／Ｆｃ）での３回の付加的免疫誘導も行った。初回の免疫誘導はフロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。以降の免疫誘導にはフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。融合３日前に、免疫マウスに１０μｇのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質で追加免疫を行った。次に、脾細胞およびリンパ球をそれぞれ脾臓の灌流および近位リンパ節の細断により調製し、５個体の免疫マウスのうち１個体（総てのマウスの血清力価測定の後に選択）から採取し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）と融合させた。融合プロトコールはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)に記載されている。融合細胞に対してＨＡＴ選択を行う。一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製には、特にマニュアル“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術を参照することができる。融合のおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングとして、ハイブリドーマの上清を、ヒト***ＭＣＦ７腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）および／または細胞表面にサルＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＯＳ７細胞（アフリカミドリザル腎臓ＳＶ４０形質転換）を用いたＦＡＣＳ分析によって、ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤタンパク質に対して生成したＭａｂの分泌に関して評価した。より厳密には、フローサイトメトリーによる選択のために、１０５細胞（ＭＣＦ７またはＣＯＳ７のいずれか）を９６ウェルプレートの各ウェルの１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後に、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｒｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｓ Ｉｎｃ．、ユージーン、ＵＳＡ）で１／５００希釈したＡｌｅｘａ ４８８コンジュゲートヤギ抗マウス抗体を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄後、各試験管に終濃度４０μｇ／ｍｌでヨウ化プロピジウムを加えた後に、ＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により細胞を分析した。細胞単独およびＡｌｅｘａ ４８８コンジュゲート二次抗体ともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。アイソタイプ対照を各実験で使用した（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ Ｍ９０３５１ＭＧ）。蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を算出するために少なくとも５０００細胞を評価した。
加えて、内部移行する抗体のみを選択するために内部移行アッセイを行った。このアッセイでは、ＭＣＦ７腫瘍細胞株を試験前にフェノールレッド不含の、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％のＦＡＣＳを含むＲＭＰＩ １６４０中で３日間培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を解離させ、１００μｌの細胞懸濁液を４．１０５細胞／ｍｌで、９６マルチウェルプレートのフェノールレッド不含の、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後に、細胞を５０μｌのハイブリドーマ上清または対照抗体溶液（１μｇ／ｍｌの陽性対照およびアイソタイプ対照）のいずれかに再懸濁させた。４℃で２０分のインキュベーション時間の後、細胞を２０００ｒｐｍで２分遠心分離し、冷（４℃）または温（３７℃）いずれかの完全培養培地に再懸濁させた。次に、細胞を３７℃または４℃のいずれかで２時間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を２０分間インキュベートし、細胞を３回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム陰性細胞集団でのＦＡＣＳ分析を行った。
ＦＡＣＳ分析の後、（ｉ）ハイブリドーマ上清とともに、４℃でインキュベートした細胞の表面上で検出された蛍光シグナルと、３７℃でインキュベートした細胞で得られたものとの差異、および（ｉｉ）細胞表面上に残留するＩＧＦ−１Ｒのパーセンテージの、２つのパラメーターを決定した。
残留ｈＩＧＦ １Ｒのパーセンテージは、下記のように算出される：
％残留ＩＧＦ−１Ｒ＝（ＭＦＩＡｂ ３７℃／ＭＦＩＡｂ ４℃）×１００。
加えて、組換えヒト（ｈＩＧＦ−１Ｒ）およびマウス（ｍＩＧＦ−１Ｒ）タンパク質、ならびに組換えヒトインスリン受容体（ｈＩＲ）タンパク質への抗体結合を検討するために、３種類のＥＬＩＳＡを行った（クローニング前または後のいずれか）。ｒｈ−ＩＧＦ−１Ｒおよび／またはｒｍ−ＩＧＦ−１Ｒへの結合を示し、ｒｈＩＲには結合しない抗体を分泌するハイブリドーマを保持した。簡単に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を４℃にて一晩、ＰＢＳ中０．６μｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９１−ＧＲ）または１μｇ／ｍｌのｒｍＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６６３０−ＧＲ／Ｆｃ）または１μｇ／ｍｌのｒｈＩＲタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４４−ＩＲ／ＣＦ）１００μｌ／ウェルでコーティングした。次に、これらのプレートを３７℃にて２時間、０．５％ゼラチンを含有するＰＢＳ（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）でブロッキングした。プレートを軽く打ち付けることで飽和バッファーを排出したところで、各ウェルに１００μｌの各上清希釈液（無希釈ハイブリドーマ上清も上清連続希釈液も）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、１００μｌセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中１／５０００希釈で３７℃にて１時間加えた。次に、ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加える。室温で１０分のインキュベーション時間後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍでの光学密度を測定する。
対象とする抗体を分泌するハイブリドーマを拡大培養し、限界希釈によりクローニングした。アイソタイプ分類を行ったところで、各コードの１クローンを拡大培養し、凍結させた。さらなる特性決定のため、対象とする各抗体をＣｅｌｌＬｉｎｅ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と呼ばれるｉｎ ｖｉｔｒｏ生産系で生産した。
結合特異性ＦＡＣＳ分析に取り組むためのさらなるアッセイを、ＩＭ９細胞（ヒトＩＲ発現Ｂリンパ芽球）ならびにｈＩＧＦ−１Ｒトランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞に対して行った。
選択された抗体に対応するデータを総て表７にまとめ、５つの選択抗体がＭＣＦ−７乳癌細胞またはトランスフェクト細胞のいずれかで発現された天然ヒトＩＧＦ−１Ｒを強く認識することを示した。それらの抗体はまたＣＯＳ−７細胞でサルＩＧＦ−１Ｒも認識する。これらの抗体は、ＩＭ９細胞で発現の高いヒトインスリン受容体とは交差反応しない。これらの抗体はＥＬＩＳＡプレートに直接コーティングされた場合のｒｈＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤタンパク質をあまり認識しないことを述べておかなければならない。
実施例２：ＦＡＣＳ分析によるヒト天然ＩＧＦ−１Ｒへの抗体結合
５つのマウスＩＧＦ−１Ｒ抗体をキメラ化した。マウスおよびキメラ両方のＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合特性をヒトＭＣＦ−７乳腺癌細胞株（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）にて漸増抗体濃度を用い、ＦＡＣＳ分析により評価した。この目的で、細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を４℃にてＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともに２０分間インキュベートした。次に、それらの細胞を３回洗浄し、暗所、４℃にてさらに２０分間、Ａｌｅｘａ ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。各抗体で得られたシグナル強度の最大値をＢｍａｘと呼び、蛍光強度の平均（ＭＦＩ）で表した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓ ４．０）を用いて算出した。
各マウスまたはキメラＡｂの力価測定曲線は、生成した総ての抗体が典型的な飽和特性で天然ＩＧＦ−１Ｒ型を認識できることを示した（図１Ａ）。抗体のランク付けを行い、マウスおよびキメラの両Ａｂの結合特性を比較するために、各化合物の結合ＥＣ５０を、非直線回帰分析を用いて決定した。各マウスＡｂとその対応するキメラ型のＥＣ５０の比較は、これら２つの形態が同じ結合特性を示し、Ａｂのキメラ化がＩＧＦ−１Ｒ認識に影響を及ぼさなかったことを示した（図１Ｂ−Ｃ）。キメラ抗体のＥＣ５０値およびＢｍａｘ値を表８にまとめた。
実施例３：有意なレベルのＩＲを発現するＩＧＦ−１ＲまたはＩＲトランスフェクト細胞またはＩＭ９細胞のいずれかを使用することによる抗体特異性の確認
生成された抗体のＩＧＦ−１ＲとＩＲに対する特異性を確認するために、ｈＩＧＦ−１ＲまたはｈＩＲのいずれかを発現する安定なトランスフェクト体を、ＦＡＣＳ分析により評価した。簡単に述べれば、漸増濃度のキメラｍＡｂをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃で２０分間、細胞とともにインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓ ４．０）を用いて算出した。
ｈＩＧＦ−１Ｒトランスフェクト細胞株（図２Ａ）と非トランスフェクト細胞で得られた力価測定曲線（図２Ｂ）から、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対するキメラＡｂの結合特異性が確認された。ＥＣ５０値およびＢｍａｘ値を表９にまとめた。
ｈＩＲへのマウスおよびキメラの両抗体の結合の不在を確認するために、ヒトＩＲ（ｈＩＲ）を発現する安定な細胞株を用いた。マウスおよびキメラの両Ａｂによるヒト細胞表面ｈＩＲの認識は、ＦＡＣＳ分析により行った。漸増濃度のマウスまたはキメラいずれのｍＡｂをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃にて２０分間、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞株上でインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓ ４．０）を用いて算出した。抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を陽性対照として用いた。マウスおよびキメラ９Ｇ４抗体を無関連抗体として導入した。
トランスフェクト細胞の細胞表面での高レベルのｈＩＲ発現は、市販の抗ｈＩＲ抗体ＧＲＯ５を用いて確認した（図３Ａおよび３Ｂ）。高濃度のマウス（図３Ａ）またはキメラ（図３Ｂ）いずれかのｈＩＧＦ−１Ｒ Ａｂを用いても、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞の細胞表面での結合は見られなかった。これらの結果は、マウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ Ａｂもキメラ抗ｈＩＧＦ−１Ｒ ＡｂもｈＩＲを認識しなかったことを示した。
ｈＩＧＦ−１ＲとＩＲの認識のこの特異性はまた、ｈＩＲを発現するＢリンパ腫細胞株であるＩＭ９細胞を用いたＦＡＣＳ分析によっても示された（図４）。このＦＡＣＳ分析では、プロトコールは上記のものと同じであり、抗ヒト二次Ａｂの交差反応性を避けるためにマウス抗体を用いた（ＩＭ９細胞はそれらの細胞表面にヒトＩｇを発現する）。図４に示す結果は、ここでも、ＧＲＯ５抗ｈＩＲ抗体を用いた場合にも予想されたシグナルが見られたが、評価したマウス抗体にこの細胞株上で有意な結合シグナルを示したものはなかったことを示した。
実施例４：ＦＡＣＳ分析およびＢｉａｃｏｒｅ分析によるサル天然ＩＧＦ−１Ｒへの抗体結合
規制毒性試験の第１の前提条件の１つは、選択された化合物を評価するために適切な動物種を見つけることである。本明細書に記載の抗体系列はマウスＩＧＦ−１Ｒを認識できないので、毒性評価に最も可能性のある種は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）である。
サルＩＧＦ−１Ｒに対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合を評価するために、マウスおよびキメラの両抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合をまず、漸増抗体濃度を用い、ＣＯＳ−７細胞株でＦＡＣＳ分析により評価した。細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％、ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃で２０分間、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、最後にＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認される生細胞に対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合をすぐに評価した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓ ４．０）を用いて算出した。
ＣＯＳ−７サル細胞株で得られた力価測定曲線は、総ての抗ｈＩＧＦ−１Ｒ Ａｂがサル細胞株の表面で発現されたＩＧＦ−１Ｒを特異的に認識したことを示した（図５Ａ）。マウスおよびキメラの各Ａｂに関するＥＣ５０の決定は、これらの２形態はサルＩＧＦ−１Ｒに対するそれらの結合特性に関して十分匹敵したことを示した（図５Ｂ）。これらの結果は、生成された総ての抗ｈＩＧＦ−１ＲがサルＩＧＦ−１Ｒを認識したことを示した。
ヒトとサルのＩＧＦ−１Ｒに対するキメラ抗体認識の大きさを確認するために、ＣＯＳ−７細胞とトランスフェクトＩＧＦ−１Ｒ細胞での結合ＥＣ５０の比較を行った。図５Ｃに示される結果は、総ての抗体によるヒトおよびサルＩＧＦ−１Ｒの同等の認識を示した。
別の種類のサルにおける認識を確認するために、細胞をＩＧＦ−１Ｒ型カニクイザルでトランスフェクトして可溶性サルＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤを作製し、ｈＩＧＦ−１ＲまたはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒのいずれかに対するその結合特性を比較するためにキメラ抗体の１つ（ｃ２０８Ｆ２）を用いてＢｉａｃｏｒｅ試験を行った。
認識試験は、Ｘ１００装置にて、抗Ｔａｇ Ｈｉｓ抗体（ＨｉｓキャプチャーキットＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ カタログ番号２８−９９５０−５６）により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて行った。アミンキット化学を用い、１１０００ＲＵを越える抗体をカルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトした。これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。マカク属ＩＧＦ−１Ｒと比較してｈＩＧＦ−１Ｒに対する２０８Ｆ２抗体のキメラ型（ｃ２０８Ｆ２）の結合の速度パラメーターを定義するためにシングルサイクル動態スキームを用いた。
ヒト（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３０５−ＧＲ−５０）またはカニクイザル（自家作製）のうち１つのいずれかの配列に基づく、２本のα鎖と、付加的なＣ末端１０Ｈｉｓタグとともに発現される２本のβ鎖の細胞外ドメインから構成されるＩＧＦ−１Ｒヘテロ四量体の可溶性組換え型の溶液を、１６０ＲＵ前後の抗原を捕捉するために定義された希釈で第２のフローセルに１分注入した。捕捉相の後、両フローセルにランニングバッファーを５回注入するか（各９０秒注入）、または漸増する５種類の濃度範囲のｃ２０８Ｆ２を注入した（各９０秒注入）。５回目の注入の終了時に、解離速度を定義するためにランニングバッファーを通した。
次に、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ ｐＨ１．５バッファーを３０秒間注入して表面を再生した。
コンピューターで計算されたシグナルは、フローセル２（捕捉されたＩＧＦ−１Ｒを含む）の応答とフローセル１（ＩＧＦ−１Ｒ分子を含まない）の応答の間の差異に相当する（図６）。
各ＩＧＦ−１Ｒ分子（ヒトまたはカニクイザル）に関して、漸増濃度範囲のｃ２０８Ｆ２の注入によるシグナルを、５回のバッファー注入で得られたシグナル（二重参照）の減算により補正した。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアを１：１モデルとともに用いて分析した。動態速度は独立に（各ＩＧＦ−１Ｒに対するｃ２０８Ｆ２の結合の２つの動態速度）または一般に（ヒトおよびカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに対するｃ２０８Ｆ２の結合の同じ動態速度）評価する。フィッティングの質は、０．０５ＲＵ未満のＣｈｉ２／Ｒｍａｘ比により評価した。
各ＩＧＦ−１Ｒに関して個別に定義された結合の動態速度（表１０参照）は近く、同じ動態速度を有する両センサーグラムのフィッティングは良好な質である。
ｃ２０８Ｆ２抗体は、組換えヒトＩＧＦ−１ＲとカニクイザルＩＧＦ−１Ｒを約０．２ｎＭの解離定数（ＫＤ）で同様に認識する。この研究で定義された親和性は、１６０ＲＵ前後の捕捉ヒトおよびカニクイザルＩＧＦ−１Ｒレベルに関しての抗体の機能的親和性（アビディティー）に相当する。
実施例５：ＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対する生成抗体の固有の効果
抗体チロシンキナーゼ受容体と結合した際に促進作用を誘導し得ることはよく知られている。本発明者らはこのようなアゴニスト抗体を選択したくはなかったので、キメラ抗体を用いてｈＩＧＦ−１Ｒリン酸化の評価を検討した。
この目的で、ＭＣＦ−７細胞を無血清培地で一晩インキュベートした。次に、ＩＧＦ−１（１００ｎＭ）または供試Ａｂのいずれかを３７℃で１０分間加えた（１０μｇ／ｍｌ）。培地を排出し、細胞を４℃にて９０分間、ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５％ＮａＣｌ（１Ｍ）、１０％洗剤混合物（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％Ｉｇｅｐａｌ溶解バッファー）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、１個のプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ錠（Ｒｏｃｈｅ）、１％ホスファターゼ阻害剤カクテルＳｅｔ ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する溶解バッファー（ｐＨ７．５）中で崩壊させた。これらの溶解液を４℃での遠心分離により明澄化し、１００℃で５分間加熱し、−２０℃で維持するか、またはそのまま４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った後、ＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行った。メンブランをＴＢＳＴ中で洗浄した後、タンパク質をＥＣＬで可視化した。ブロットを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウエアを用いて定量した。ＧＡＰＤＨを用いてホスホタンパク質値を正規化した。ＩＧＦ−１に応答したｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を１００％の刺激と見なした。ｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ Ａｂの効果を、ＩＧＦ−１により誘導されたリン酸化の％として求めた。
図７に記載される結果は、ＩＧＦ−１と比較した場合の３回の独立した実験のキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂに応答したｐＩＧＦ−１Ｒの％の平均＋／−Ｓ．Ｄ．を表す。示されたように、ＭＣＦ−７細胞が１０μｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ Ａｂとともにインキュベートされた場合に、ｈＩＧＦ−１Ｒの有意なリン酸化は検出されなかったか、または低い（＜１０％）しか検出されなかった。
実施例６：マウスＩＧＦ−１Ｒ抗体による、ＩＧＦ−１に応答したＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害
選択された抗体の特性決定を行うために、ＩＧＦ１により誘導されたリン酸化を阻害するそれらの能力を検討した。この目的で、ＭＣＦ−７細胞を無血清培地で一晩インキュベートした。次に、細胞をマウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ Ａｂとともに５分間インキュベートした後、３７℃で２分間ＩＧＦ−１を添加した。培地を排出し、細胞を４℃で９０分間、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５％ＮａＣｌ（１Ｍ）、１０％洗剤混合物（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％Ｉｇｅｐａｌ溶解バッファー）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、１個のプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ錠（Ｒｏｃｈｅ）、１％ホスファターゼ阻害剤カクテルＳｅｔ ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する溶解バッファー（ｐＨ７．５）中でかき集めさせた。これらの溶解液を４℃での遠心分離により明澄化し、１００℃で５分間加熱し、−２０℃で維持するか、またはそのまま４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った後、ＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行った。メンブランをＴＢＳＴ中で洗浄した後、タンパク質をＥＣＬで可視化した。ブロットを、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウエアを用いて定量した。ＧＡＰＤＨを用いてホスホタンパク質値を正規化した。ＩＧＦ−１に応答したｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を１００％の刺激と見なした。ｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ Ａｂの効果を、ＩＧＦ−１により誘導されたリン酸化の％として求めた。
総ての抗ＩＧＦ−１Ｒ ＡｂがＩＧＦ−１に応答してｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を強く阻害した（８０％を越える低下）（図８）。ＩＧＦ１により誘導されたｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の最良の阻害剤は、ｍ２０８Ｆ２、ｍ２１２Ａ１１およびｍ２１４Ｆ８ Ｍａｂである。
実施例７：ＦＡＣＳ分析による生成ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合後のＩＧＦ−１Ｒ内部移行の研究
ＭＣＦ−７細胞を４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのキメラ抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩとの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを図９および表１１に示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂの内部移行パーセンテージは、次：１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩのように算出され、、表１１に示された。
サルＩＧＦ−１Ｒも認識した抗体がこの受容体を内部移行することができたかどうかを決定するために、同じ内部移行試験を行った。表１２にまとめた結果は、総ての供試抗体がサルＩＧＦ−１Ｒ内部移行を媒介できたことを示した。
細胞表面結合抗体減少の動態をさらに評価した。この目的で、ＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートに播種し、４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのマウスとともにインキュベートした。次に、３７℃にて１０、２０、３０、６０または１２０分間、培地中で細胞を洗浄して結合してない抗体を除去した。各時点で、細胞を遠心分離した後、氷上にて二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８で表面標識して、細胞表面に残留する抗体の量を決定した。各マウスＡｂおよび各時点の蛍光強度を４℃でのシグナル（残留ＩＧＦ−１Ｒ％）により正規化し、指数減衰に当てはめて半減期（ｔ１／２）を求めた。ｔ１／２は、シグナルの５０％の低下を得るために必要な時間と考えた。図１０に示されるように、総てのマウスＡｂの表面レベルは最初の３０分で急速に低下し、低下は６０分のインキュベーション後にほぼ最大となった（図１０Ａ）。算出された半減期はマウスＡｂに応じて１０〜１８分の間を含んだ（図１０Ｂ）。
細胞表面シグナルの低下がＡｂの内部移行によるものであって、受容体の脱落によるものではなかったことを確認するために、細胞を３７℃で０、３０および６０分間、マウスＡｂとともにインキュベートした（図１１）。次に、細胞結合抗体（ｗ／ｏ透過処理）および細胞表面結合＋内部移行Ａｂ（透過処理有り）に相当する全抗体シグナルを決定するために、細胞を固定し、透過処理を施すか、または施さなかった。内部移行Ａｂ（細胞質）の量は次のように決定した：透過処理後のＭＦＩ−ＭＦＩ ｗ／ｏ透過処理。この試験は、細胞表面結合Ａｂの減少は細胞質Ａｂの増加によるものであり、Ａｂが内部移行したことを示すということを示した（図１１）。加えて、透過処理後のシグナル（全体）の低下により示されるように、Ａｂの分解は１時間のインキュベーション後に始まった。
実施例８：共焦点分析による生成ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合後のＩＧＦ−１Ｒ内部移行の研究
抗体の内部移行をさらに確認するため、細胞輸送後の抗体の細胞下分布を評価するために共焦点顕微鏡観察を行った。細胞を抗ｈＩＧＦ−１Ｒ Ａｂ ３７℃とともにインキュベートし、固定し、透過処理を施した。従って、細胞を、二次抗体Ａｌｅｘａ−４８８をウサギ抗Ｌａｍｐ−１抗体（二次抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ ５５５を用いて可視化した）を用いて染色した。３７℃でのインキュベーション前に、マウス２０８Ｆ２ ＡｂはＭＣＦ−７細胞の膜上に局在した（図１２Ａ）。ＩｍａｇｅＪソフトウエアの共局在ハイライタープラグインを用いてリソソームマーカーｌａｍｐ−１との共局在は見られなかった。細胞表面結合抗体は、３７℃で１５分のインキュベーション後に劇的に減少した。細胞表面結合抗体の減少と同時に、細胞内抗体が小胞に検出された。ｌａｍｐ−１との共局在はまれにしか見られなかった。３０分のインキュベーション後に、細胞表面結合抗体はほとんど検出されなかった。しかしながら、リソソームでのＡｂの共局在は増加した。１時間のインキュベーション後には、細胞内Ａｂ染色ならびにｌａｍｐ−１との共局在数は低下した。細胞表面結合抗体のこの動態およびその細胞内蓄積は、ＦＡＣＳによる抗体表面減衰尺度の動態と相関していた。加えて、ＦＡＣＳ試験ですでに記載したように、マウスＡｂの分解は、共焦点顕微鏡によれば、１時間のインキュベーション後に始まった。
他の総てのｈＩＧＦ−１Ｒマウス抗体の内部移行およびそれらのＬａｍｐ−１との共局在もまた評価した（図１２Ｂ）。３７℃で３０分のインキュベーション後に、細胞内抗体が検出され、ｌａｍｐ−１との共局在が見られ、このことは選択された総ての抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体がリソソームに効果的に内部移行されたことを示す。
実施例９：リソソーム阻害剤バフィロマイシンＡ１を用いたＡｂ分解の阻害
抗体がリソソームに到達してそこで分解されることを確認するために、細胞をリソソーム機能の強力な阻害剤であるバフィロマイシンＡ１で処理したか、または非処理とした。次に、細胞を４℃で１０μｇ／ｍｌの供試Ａｂとともにインキュベートし、洗浄し、３７℃で２時間インキュベートした。内部移行したＡｂは細胞透過処理後に二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８ Ａｂを用いて検出された。バフィロマイシンＡ１の添加は細胞内Ａｂの分解を防ぎ（図１３）、このことはＡｂが効果的に内部移行され、リソソームで分解されたことを示す。
実施例１０：抗体−ＩＧＦ−１Ｒ結合に対するｐＨの影響
抗体はそれらの内部移行能に基づいて選択され、リソソームコンパートメントに入る前に初期エンドソームと共局在することが上記で示されたので、対象とするアプローチは、Ａｂ／ｈＩＧＦ−１Ｒ結合の安定性がｐＨ環境によって調節された抗体、優先的には、ｐＨ環境が酸性となった場合にＩＧＦ−１Ｒから優先的に解離される抗体を選択することからなった。実際に、初期エンドソームとリソソームの間の主要な違いはそれらの管腔ｐＨであり、エンドソームコンパートメントではｐＨはおよそ６であり、リソソームコンパートメントではｐＨは約４．５である。
リガンド結合（ＩＧＦ１）後にひと度、内部移行されると、ｈＩＧＦ−１Ｒは再循環経路を介して細胞表面に戻ることがよく知られている。
特定の理論に関連付けるものではないが、本明細書の仮説は、酸性ｐＨで早期にそれらの標的からより放出されやすい抗体はおそらく膜への標的再循環に有利であり、結果として、ＡＤＣアプローチのより良い候補と考えられるはずであるというものである。
本発明者らの抗体にこのような特性を示すものがあるか、また、この特性が細胞傷害活性と相関するかどうかを検討するために、ＭＣＦ−７細胞株でのマウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ Ｍａｂの結合を、種々のｐＨのバッファー中で行った。漸増濃度のマウスｍＡｂをＭＣＦ−７細胞株上で４℃にて２０分間、５〜８の範囲の種々のｐＨでインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中で、Ａｌｅｘａ ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした。細胞を暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓ ４．０）を用いて算出した。図１４に示されるように、選択された総てのマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が酸性ｐＨでより低い結合能を示した。
ＭＣＦ−７細胞株でのヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒ Ｍａｂの結合は種々のｐＨで行った。漸増濃度のヒト化ｍＡｂをＭＣＦ−７細胞株上で４℃にて２０分間、５〜８の範囲の種々のｐＨでインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中で、Ａｌｅｘａ ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした。細胞を暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒヒト化抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓ ４．０）を用いて算出した。図２４に示されるように、ヒト化抗ＩＧＦＲ抗体は酸性ｐＨでより低い結合能を示した。
実施例１２：２０８Ｆ２ Ｍａｂのヒト化型の評価
１２．１ 第１のヒト化型ｈｚ２０８Ｆ２ ＶＨ３／ＶＬ３（ｈｚ２０８Ｆ２ Ｈ０２６／Ｌ０２４とも呼称）の結合および内部移行の評価
ｃ２０８Ｆ２ ｍＡｂの第１のヒト化型の結合をＭＣＦ−７、ＣＯＳ−７およびＮＩＨ ３Ｔ３ ＩＲ＋細胞株で評価した。漸増濃度のｍ２０８Ｆ２、ｃ２０８Ｆ２またはｈｚ２０８Ｆ２ ＶＨ３ＶＬ３を各細胞株に４℃で２０分間加えた。次に、細胞を洗浄し、供試ｍＡｂの結合を、対応する二次抗体を用いて可視化した。トランスフェクト細胞株上でのヒトＩＲの発現を確認するために、市販の抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を用い、その認識特性を例示した（図１５Ｄ）。
ＭＣＦ−７細胞（図１５Ａ）またはサルＣＯＳ−７（図１５Ｂ）細胞でヒト化型とマウス型またはキメラ型のいずれかと比較したところ、供試したこれら３つの型に近似した特性が示された。ヒト化のプロセスは、ヒトインスリン受容体に対する交差反応性に関してマウス型およびキメラ型に完全に匹敵する抗体の認識特異性を改変しなかった（図１５Ｃ）。
ヒト細胞株ＭＣＦ−７およびサル細胞株ＣＯＳ−７に対する２０８Ｆ２の第１のヒト化型の算出ＥＣ５０は、ｍＡｂ ２０８Ｆ２のマウス型またはキメラ型のいずれで決定されたものとも同等であった。
ｍＡｂ ｈｚ２０８Ｆ２ ＶＨ３／ＶＬ３の内部移行能をフローサイトメトリーにより評価した。ＭＣＦ−７細胞を４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌの抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを図１６および表１３に示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂにおける内部移行のパーセンテージは、次１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩのように算出され、表１３に示す。よって、ヒト化ｈｚ２０８Ｆ２ ＶＨ３／ＶＬ３は、対応するマウスおよびキメラ２０８Ｆ２抗体で測定されたものと同等の結合および内部移行特性を有していた。
１２．２ 後続ｈｚ２０８Ｆ２ヒト化型の結合の評価
ｍＡｂ ２０８Ｆ２をヒト化し、１６のヒト化変異体（１２．１に記載の第１の型と含む）の結合特性を評価した。ヒト化変異体の結合特性は、ＦＡＣＳ分析により、ヒトＭＣＦ−７乳腺癌細胞株およびサル細胞株Ｃｏｓ−７にて、漸増抗体濃度を用いて評価した。この目的で、細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を４℃で２０分間、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中で、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともにインキュベートした。次に、これらの細胞を３回洗浄し、暗所、４℃にてさらに２０分間、Ａｌｅｘａ ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓ ４．０）を用いて算出した。
ヒト化変異体のＥＣ５０は、総てのヒト化変異体がヒトおよびサルの両細胞株で同等の結合特性を示したことを示した。
ヒト化抗体のＥＣ５０を表１３ｂにまとめた。
１２．３ 別のｈｚ２０８Ｆ２ヒト化型の内部移行の評価
ＭＣＦ−７細胞を、４℃にて２０分間、１０μｇ／ｍｌのヒト化抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを表１３ｃに示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂにおける内部移行のパーセンテージは、次のように算出された：１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩ。ヒト化抗体ｈｚ２０８Ｆ２ Ｈ０７７／Ｌ０１８は、ＩＧＦ−１Ｒの有意な内部移行を誘導することができる。
実施例１３：可溶性組換えヒトＩＧＦ−１Ｒに対する２０８Ｆ２抗体の５つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ｃ２０８Ｆ２、ｃ２１３Ｂ１０、ｃ２１２Ａ１１、ｃ２１４Ｆ８およびｃ２１９Ｄ６）およびヒト化型（ＶＨ３／ＶＬ３）の結合の解離定数（Ｋ Ｄ ）の定義
組換え可溶性ヒト−ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体の結合の解離定数（ＫＤ）は、解離速度（ｋｏｆｆ）と会合速度（ｋｏｎ）の間の比により定義した。動態試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００装置にて、マウス抗Ｔａｇ Ｈｉｓモノクローナル抗体により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて行った。１２０００ＲＵ前後の抗体を、アミンキット化学を用いてカルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトする。
これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。
その２つのＣ末端１０ヒスチジンタグにより捕捉された可溶性組換えヒトＩＧＦ−１Ｒへの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合の動態パラメーターを定義するためにシングルサイクル動態スキームを用いた。
１− ２本のα鎖と付加的Ｃ末端１０−Ｈｉｓタグとともに発現される２本β鎖の細胞外ドメインのヒトＩＧＦ−１Ｒヘテロ四量体の可溶性組換え型（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３０５−ＧＲ−５０）の溶液を第２のフローセルに１０μｇ／ｍｌの濃度で１分間注入した。本試験で実現した２４サイクルのそれぞれにおいて平均５８７ＲＵ（標準偏差２４ＲＵ）の可溶性受容体が捕捉された。
２− この捕捉相の後、両フローセルにランニングバッファーを５回注入するか（各９０秒注入）、または漸増する５種類の濃度範囲の、６種類の抗体のうちの１つを注入した（各９０秒注入）。５回目の注入の終了時に、解離速度を定義するためにランニングバッファーを５分間通した。
３− 次に、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ ｐＨ１．５のバッファーを４５秒間注入して表面を再生した。
コンピューターで計算されたシグナルは、フローセル２（捕捉されたＩＧＦ−１Ｒを含む）の応答とフローセル１（ＩＧＦ−１Ｒ分子を含まない）の応答の間の差異に相当する。
各ＩＧＦ−１Ｒ分子に関して、漸増濃度範囲の１つの抗体の注入によるシグナルを、５回のバッファー注入で得られたシグナル（二重参照）の減算により補正した（図１７参照）。
得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアを１：１モデルとともに用いて分析した。
各抗体について、２つの異なる濃度範囲、すなわち、各抗体について実施した最初の２回の試験では４０、２０、１０、５および２．５ｎＭおよびあとの２回の試験では２４、１２、６、３および１．５ｎＭを用いて４回の試験を行った。
本試験で供試した６つの抗体について、試験データは、より高い濃度が定数と定義された場合に有意なｋｏｆｆ値を有する１：１モデルによく適合し、他の４つの濃度が計算される（図１８参照）。
比：ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される解離定数（ＫＤ）および比：Ｌｎ（２）／ｋｏｆｆとして算出されるそれらの複合体の半減期を図１９および２０に示す。これらは各抗体について行った４回の独立した試験の平均に相当する。エラーバーは値の標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
解離定数は１０〜１００ｐＭの範囲である。ｃ２０８Ｆ２抗体は、ｈ−ＩＧＦ−１Ｒに対してより弱い親和性（より高い解離定数値）を示し（ＫＤ ７５ｐＭ前後）、そのヒト化型は少なくともキメラ型と同等に良好である（ＫＤ ６０ｐＭ前後）。他の４つの抗ＩＧＦ−１Ｒキメラ抗体は、ｈＩＧＦ１−Ｒに対して全く同等の親和性を示す（ＫＤ ３０ｐＭ前後）。この親和性の違いは主として解離速度または結果としての複合体の半減期に関連している。２０８Ｆ２では、キメラ型およびヒト化型（ＶＨ３／ＶＬ３）の場合、複合体の半減期は２〜３時間の間である。他の４つのキメラ抗体では、平均半減期は７．０〜９．４時間の間である。
これらの極めて緩慢な解離速度は、それらの両Ｆａｂアームにより２つの隣接するｈ−ＩＧＦ−１Ｒ分子に同時に結合できる抗体の二価構造に明らかに関連している。この場合、捕捉されたＩＧＦ−１Ｒ分子のレベルは解離速度に影響を持ち得る。本試験で定義された親和性は、捕捉された６００ＲＵ前後のｈ−ＩＧＦ−１Ｒのレベルに対する抗体の機能的親和性（アビディティー）に相当する。上記に示されるデータ（表１０）と実施例１３に示される値の間に見られるＫＤの３倍の違いは、ｈＩＧＦ−１Ｒの捕捉レベルの違い（実施例４では６００ＲＵと１６０ＲＵ）に関連している。
実施例１４：本発明の薬物の合成
以下の実施例では下記の略号を使用する。
ａｑ． 水性
ｅｅ 鏡像体過剰率
ｅｑｕｉｖ 当量
ＥＳＩ エレクトロスプレーイオン化
ＬＣ／ＭＳ 液体クロマトグラフィーと質量分析の組み合わせ
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ｓａｔ． 飽和
ＵＶ 紫外線
参照化合物１
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，ビストリフルオロ酢酸
化合物１Ａ：（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−５−フェニル−３−プロパノイル−１，３−オキサゾリジン−２−オン
（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−２−オン（５．８ｇ、３２．７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１２０ｍＬ）に溶かした。この混合物を−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（１４．４ｍＬ）を滴下した。−７８℃で３０分間振盪した後、塩化プロパノイル（５．７ｍＬ）を加えた。−７８℃で３０分間、次いで、周囲温度で一晩振盪を続けた。この反応混合物を濃縮した後、２００ｍＬの水に再溶解させた。溶液のｐＨを重炭酸ナトリウム飽和水溶液で７に調整した。この水相を１００ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、６．８ｇ（８９％）の化合物１Ａを黄色油状物の形態で得た。
化合物１Ｂ：（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−３−［（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−イル］−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１Ａ（１７．６ｇ、７５．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２８６ｍＬ）に溶かした。この溶液を氷浴で冷却した。トリエチルアミン（ＴＥＡ、１２．１ｍＬ、１．１５当量）およびＢｕ２ＢＯＴｆ（７８．３ｍＬ、１．０４当量）を、反応混合物の温度を２℃より低く保持しながら滴下した。０℃で４５分分間振盪を続け、その後、この反応物を−７８℃に冷却した。ＤＣＭ（４２ｍＬ）中、（２Ｓ）−２−ホルミルピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８．５ｇ、４２．６６ｍｍｏｌ、０．５７当量）の溶液を滴下した。−７８℃で２時間、次いで０℃で１時間、最後に周囲温度で１時間振盪を続けた。この反応物を７２ｍＬのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．２〜７．４）および２１４ｍＬのメタノールで中和し、０℃に冷却した。メタノール中３０％過酸化水素の溶液（２５７ｍＬ）を、温度を１０℃より低く維持しながら滴下した。０℃で１時間振盪を続けた。この反応物を１４２ｍＬの水で中和した後、減圧下で濃縮した。得られた水溶液を２００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を、シリカカラムにてＥｔＯＡｃおよび石油エーテルの混合物（ＥｔＯＡｃ：ＰＥ＝１：８）を用いて精製し、１３．１６ｇ（４０％）の化合物１Ｂを無色の油状物の形態で得た。
化合物１Ｃ：（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（２Ｓ）−１−［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］ピロリジン−２−イル］−３−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸
化合物１Ｂ（１３．１６ｇ、３０．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を過酸化水素（水中３０％、１５．７ｍＬ）の存在下でＴＨＦ（４６０ｍＬ）に溶かした後、氷浴で冷却した。水酸化リチウム水溶液（０．４ｍｏｌ／Ｌ、１５２．１ｍＬ）を、反応温度を４℃より低く保持しながら滴下した。この反応混合物を０℃で２．５時間振盪した。Ｎａ２ＳＯ３水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ、１６７．３ｍＬ）を、温度を０℃に保持しながら滴下した。この反応混合物を周囲温度で１４時間振盪した後、１５０ｍＬの冷重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和し、５０ｍＬのＤＣＭで３回洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｍ ＫＨＳＯ４水溶液で２〜３に調整した。この水溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、飽和ＮａＣｌ溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、７．３１ｇ（８８％）の化合物１Ｃを無色の油状物の形態で得た。
化合物１Ｄ：（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（２Ｓ）−１−［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］ピロリジン−２−イル］−３−メトキシ−２−メチルプロパン酸
化合物１Ｃ（７．３１ｇ、２６．７４ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ヨードメタン（２５．３ｍＬ）の存在下でＴＨＦ（１３５ｍＬ）に溶かした。この反応媒体を氷浴で冷却し、その後、ＮａＨ（油中６０％、４．２８ｇ）を少量ずつ加えた。この反応物を０℃で３日、振盪下で放置した後、１００ｍＬの重炭酸ナトリウム飽和水溶液で中和し、５０ｍＬのエーテルで３回洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｍ ＫＨＳＯ４水溶液で３に調整した。この水溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、１００ｍＬのＮａ２Ｓ２Ｏ３（水中５％）で１回、ＮａＣｌ飽和溶液で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、５．５ｇ（７２％）の化合物１Ｄを無色の油状物の形態で得た。
化合物１Ｅ：Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−２−フェニルアセトアミド
２−フェニル酢酸（１６．２ｇ、１１８．９９ｍｍｏｌ、１．００当量）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１３０ｍＬ）に溶かした後、−１０℃に冷却した。ジエチルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ、１９．２ｍＬ）、メトキシ（メチル）アミン塩酸塩（１２．９２ｇ、１３３．２０ｍｍｏｌ、１．１２当量）およびトリエチルアミン（３３．６ｍＬ）を加えた。この反応混合物を−１０℃で３０分、次いで、周囲温度で２．５時間振盪した。次に、これを１リットルのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、５００ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で２回、４００ｍＬの水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：３）を用いて精製し、２０．２ｇ（９５％）の化合物１Ｅを黄色油状物の形態で得た。
化合物１Ｆ：２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−オン
テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ、２７．２ｍＬ）を不活性雰囲気中、ＴＨＦ ３００ｍＬに溶かした後、−７８℃に冷却し、その後、ｎ−ＢｕＬｉ（６７．６ｍＬ、２．５Ｍ）を滴下した。２−ブロモ−１，３−チアゾール（１５．２ｍＬ）を滴下し、−７８℃で３０分振盪を続けた。ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かした化合物１Ｅ（２５ｇ、１３９．５０ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下した。−７８℃で３０分間、次いで、−１０℃で２時間振盪を続けた。この反応物を５００ｍＬのＫＨＳＯ４（飽和）で中和した後、１リットルのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、４００ｍＬの水で２回および７００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：１０）を用いて精製し、２５ｇ（８８％）の化合物１Ｆを黄色油状物の形態で得た。
化合物１Ｇ：（１Ｒ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−オール
不活性雰囲気中、（＋）−Ｂ−クロロジイソピノカンフェイルボラン（（＋）−Ｉｐｃ２ＢＣｌ、１１０．８ｍＬ）に、エーテル（３００ｍＬ）中、化合物１Ｆ（１５ｇ、７３．８ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を滴下した。この反応混合物を０℃で２４時間振盪した後、ＮａＯＨ（水中１０％）とＨ２Ｏ２（水中３０％）の（１：１）混合物３００ｍＬで中和し、最後に５００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、３００ｍＬのＫ２ＣＯ３（飽和）で２回および５００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：２０から１：２）を用いて精製し、６．３ｇ（４２％）の化合物１Ｇを白色固体の形態で得た。
化合物１Ｈ：２−［（１Ｓ）−１−アジド−２−フェニルエチル］−１，３−チアゾール
化合物１Ｇ（６ｇ、２９．２３ｍｍｏｌ、１．００当量）を、不活性雰囲気中、トリフェニルホスフィン（１３ｇ、４９．５６ｍｍｏｌ、１．７０当量）の存在下でＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ、７．６ｍＬ）、次いで、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ、１１ｍＬ）を滴下した後、冷却浴を外し、溶液を振盪下、周囲温度で４８時間放置した。この媒体を減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：３０）を用いて精製し、８ｇの部分的に精製された化合物１Ｈを黄色油状物の形態で得た。化合物１Ｈはそのまま次の工程で使用した。
化合物１Ｉ：Ｎ−［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１Ｈ（６．５ｇ、２８．２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、トリフェニルホスフィン（６．５ｇ、３３．９ｍｍｏｌ、１．２０当量）の存在下でＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かし、２時間５０℃に加熱した。次に、アンモニア（７０ｍＬ）を加え、３時間加熱を続けた。この反応物を冷却し、５００ｍＬの水で中和した後、５００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、５００ｍＬの１Ｎ ＨＣｌで２回抽出した、水相を合わせ、水酸化ナトリウム溶液（水中１０％）を加えることによりｐＨ８〜９とした後、５００ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、４．８ｇ（８３％）の（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−アミンを黄色油状物の形態で得た。次に、この化合物を、それが精製可能となるように、Ｂｏｃ基（（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル）で保護した。これを不活性雰囲気中、１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。２０ｍＬの１，４−ジオキサンに希釈した（Ｂｏｃ）２Ｏ（１０．２６ｇ、４７．０１ｍｍｏｌ、２．００当量）を滴下した。冷却浴を外し、溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、３００ｍＬの水で中和し、５００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：２０、ｅｅ＝９３％）を用いて精製した。次に、これをヘキサン／アセトン混合物（約５〜１０／１、１ｇ／１０ｍＬ）中で再結晶させ、６ｇ（８４％）の化合物１Ｉを白色固体の形態で得た（ｅｅ＞９９％）．
化合物１Ｊ：（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１Ｉ（３ｇ、９．８６ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、１０ｍＬのＤＣＭに溶かした。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１０ｍＬ）を加え、溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮し、２．０ｇ（６４％）の（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−アミン；トリフルオロ酢酸を黄色油状物の形態で得た。この中間体を２０ｍＬのＤＣＭに再溶解させ、その後、化合物１Ｄ（１．８ｇ、６．２６ｍｍｏｌ、１．０５当量）、ＤＥＰＣ（１．１ｇ、６．７５ｍｍｏｌ、１．１３当量）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１．６４ｇ、１２．７１ｍｍｏｌ、２．１３当量）を加えた。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：３）を用いて精製し、２．３ｇ（８１％）の化合物１Ｊを淡黄色固体の形態で得た。
化合物１Ｋ：（２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］−３−［（２Ｓ）−ピロリジン−２−イル］プロパンアミド；トリフルオロ酢酸
化合物１Ｊ（２．２５ｇ、４．７５ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、１０ｍＬのＤＣＭに溶かした。ＴＦＡ（１０ｍＬ）を加え、溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮し、２．１８ｇ（９４％）の化合物１Ｋを黄色油状物の形態で得た。
化合物１Ｌ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−（ベンジルアミノ）−３−メチルペンタン酸
２Ｎ水酸化ナトリウム溶液（３７５ｍＬ）に、（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸（９８．４ｇ、７５０ｍｍｏｌ、１．００当量）を周囲温度で少量ずつ加えた。ベンズアルデヒド（７９．７ｇ、７５１．０２ｍｍｏｌ、１．００当量）を手早く加え、得られた溶液を３０分振盪した。水素化ホウ素ナトリウム（１０．９ｇ、２８８．１７ｍｍｏｌ、０．３８当量）を、温度を５〜１５℃の間に保持しながら少量ずつ加えた。周囲温度で４時間振盪を続けた。この反応混合物を２００ｍＬの水で希釈した後、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回洗浄した。水溶液のｐＨを２Ｎ塩酸溶液で７に調整した。生じた沈澱を濾取し、１４９．２ｇ（９０％）の化合物１Ｌを白色固体の形態で得た。
化合物１Ｍ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メチルペンタン酸
化合物１Ｌ（２５ｇ、１１２．９７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ホルムアルデヒド（水中３６．５％、２２．３ｇ）の存在下でギ酸（３１．２ｇ）に溶かした。溶液を９０℃で３時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を２５０ｍＬのアセトン中で摩砕した後、濃縮した。この摩砕／蒸発操作を、５００ｍＬのアセトンを用いて２回繰り返し、２１．６ｇ（８１％）の化合物１Ｍを白色固体の形態で得た。
化合物１Ｎ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メチルペンタン−１−オール
ＬｉＡｌＨ４（０．３６ｇ）を不活性雰囲気中、０℃で１０ｍＬのＴＨＦに懸濁させた。化合物１Ｍ（１．５ｇ、６．３７ｍｍｏｌ、１．００当量）を、温度を０〜１０℃の間に保持しながら少量ずつ加えた。この反応混合物を６５℃で２時間振盪した後、再び０℃に冷却し、その後、３６０μｌの水、１ｍＬの１５％水酸化ナトリウムおよび３６０μｌの水を順次加えて中和した。沈澱したアルミニウム塩を濾去した。濾液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：５０）を用いて精製し、８２０ｍｇ（５８％）の化合物１Ｎを淡黄色油状物の形態で得た。
化合物１Ｏ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メチルペンタナール
塩化オキサリル（０．４ｍＬ）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶かした。溶液を−７０℃に冷却し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）の溶液を１５分間滴下した。この反応混合物を３０分振盪し、その後、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、化合物１Ｎ（８２０ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を１５分間滴下した。この反応混合物をさらに３０分、低温で振盪した後、トリエチルアミン（２．５ｍＬ）をゆっくり加えた。この反応混合物を−５０℃で１時間振盪した後、冷却浴を外し、温度を常温に戻しながら、反応物を２５ｍＬの水で中和した。この溶液を３０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：２００）を用いて精製し、０．４２ｇ（５２％）の化合物１Ｏを黄色油状物の形態で得た。
化合物１Ｐ：（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ベンジル−１，１−ジメトキシ−Ｎ，３−ジメチルペンタン−２−アミン
化合物１Ｏ（４．７ｇ、２１．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を０℃で２０ｍＬのメタノールに溶かした。濃硫酸（４．３ｍＬ）を滴下し、０℃で３０分間振盪を続けた。オルトギ酸トリメチル（２１．４ｍＬ）を加え、冷却浴を外し、反応媒体を周囲温度で３時間、振盪下で放置した。この反応媒体を２００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、１００ｍＬの１０％Ｎａ２ＣＯ３および２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで順次洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、３．４ｇ（６０％）の化合物１Ｐを淡黄色油状物の形態で得た。
化合物１Ｑ：［［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）エテニル］オキシ］（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラン
ジイソプロピルアミン（２０ｇ、１８６．７１ｍｍｏｌ、１．０８当量）を不活性雰囲気中、１７０ｍＬのＴＨＦに溶かし、−７８℃に冷却した。ｎＢｕＬｉ（２．４Ｍ、７８．８ｍＬ）を滴下し、溶液を低温で３０分振盪し（ＬＤＡ−リチウムジイソプロピルアミドを得るため）、その後、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（２０ｇ、１７２．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。この反応混合物を−７８℃で２０分振盪した後、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ、２５．８ｍＬ）および３５ｍＬのＴＨＦ中、ｔｅｒｔブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＤＭＳＣｌ、２８ｇ、１８５．８０ｍｍｏｌ、１．０８当量）の溶液を加えた。低温でさらに２０分間振盪を続けた後、冷却浴を外した。この溶液を減圧下で濃縮した。残渣を１００ｍＬの水に再溶解させ、１００ｍＬのＰＥで３回抽出した。有機相を合わせ、５００ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を蒸留により精製し、１６．６ｇ（８３％）の化合物１Ｑを無色の油状物の形態で得た。
化合物１Ｒ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１Ｐ（２．０ｇ、７．５４ｍｍｏｌ、１．００当量）および化合物１Ｑ（２．６ｇ、１１．２８ｍｍｏｌ、１．５０当量）を不活性雰囲気中、３３ｍＬのＤＣＭに溶かした。この溶液を０℃に冷却した。ＤＭＦ（１．２ｇ）を７．５ｍＬのＤＣＭ中、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（２．１ｇ）の溶液とともに滴下した。０℃で２４時間振盪を続けた。この反応媒体を３０ｍＬの炭酸ナトリウム（１０％）で１回および５０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００）を用いて精製し、１．８２ｇ（９１％）の化合物１Ｒを黄色油状物の形態で得た。
化合物１Ｓ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−５−メチル−４−（メチルアミノ）ヘプタン酸塩酸塩
化合物１Ｒ（２．４ｇ、６．８７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、Ｐｄ／Ｃ（０．１２ｇ）および濃塩酸（０．６３ｍＬ）の存在下で３５ｍＬのエタノールに溶かした。窒素雰囲気を水素雰囲気に置き換え、反応媒体を周囲温度で１８時間、振盪下で放置した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を５０ｍＬのヘキサン中で摩砕し、上清を取り出し、減圧下で乾燥させた後、１．６６ｇ（８２％）の化合物１Ｓを白色固体の形態で得た。
化合物１Ｔ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ(mthoxy)−５−メチルヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
（２Ｓ）−２−［［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ］−３−メチルブタン酸（１５ｇ、０．４０ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＩＥＡ（３８．３ｍＬ）およびブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ、３２．３ｇ）の存在下で３００ｍＬのＤＣＭに溶かした。この溶液を周囲温度で３０分振盪した後、化合物１Ｓ（１５．９９ｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．０７当量）を加えた。この反応媒体を２時間振盪した後、濃縮した。残渣をアセトニトリル（ＡＣＮ）と水の混合物（４０分で３０：７０から１００：０）を用いて逆相（Ｃ１８）で精製し、１７ｇ（５８％）の化合物１Ｔを無色の油状物の形態で得た。
化合物１Ｕ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１Ｔ（７６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、Ｐｄ／Ｃ（０．０５ｇ）の存在下で１０ｍＬのエタノールに溶かした。窒素雰囲気を水素雰囲気に置き換え、この反応物を周囲温度で２時間振盪した。反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、６４ｍｇの化合物１Ｕを無色の油状物の形態で得た。
化合物１Ｖ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタノエート
化合物１Ｕ（１８．１９ｇ、５０．７４ｍｍｏｌ、１．００当量）を重炭酸ナトリウム（１２．７８ｇ、１５２ｍｍｏｌ、３．００当量）およびクロロギ酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ、１９．６９ｇ、７６ｍｍｏｌ、１．５０当量）の存在下で４００ｍＬの１，４−ジオキサン／水混合物（１：１）に溶かした後、周囲温度で２時間振盪した。次に、この反応媒体を５００ｍＬの水で希釈し、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、２００ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、４０ｇの部分的に精製された化合物１Ｖを淡黄色油状物の形態で得た。
化合物１Ｗ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸
化合物１Ｖ（４０ｇ、６８．８８ｍｍｏｌ、１．００当量）を中性雰囲気中、６００ｍＬのＤＣＭに溶かした。ＴＦＡ（３００ｍＬ）を加えた。この溶液を周囲温度で２時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてメタノールとＤＣＭの混合物（１：１０）を用いて精製し、２３．６ｇ（６５％）の化合物１Ｗを無色の油状物の形態で得た。
化合物１Ｘ：Ｎ−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］（メチル）カルバモイル］−２−メチルプロピル］カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル
化合物１Ｗ（２．５３ｇ、４．８２ｍｍｏｌ、１．０８当量）を化合物１Ｋ（２．１８ｇ、４．４７ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＥＰＣ（８７５ｍｇ、５．３７ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびＤＩＥＡ（１．２５ｇ、９．６７ｍｍｏｌ、２．１６当量）の存在下で２０ｍＬのＤＣＭに溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、５０ｍＬの飽和ＫＨＳＯ４および１００ｍＬの水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてメタノールとＤＣＭの混合物（１：２００から１：４０）を用いて精製し、２．８ｇ（７１％）の化合物１Ｘを淡黄色固体の形態で得た。
化合物１Ｙ：（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−［（３Ｒ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド
化合物１Ｘ（２．８ｇ、３．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）をピペリジン（３ｍＬ）の存在下でアセトニトリル（ＡＣＮ、１２ｍＬ）に溶かし、周囲温度で１８時間、振盪シアで放置した。この反応物を５０ｍＬの水で中和した後、１００ｍＬのＤＣＭで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてメタノールとＤＣＭの混合物（１：１００から１：４０）を用いて精製し、１．２ｇ（５７％）の化合物１Ｙを黄色固体の形態で得た。
化合物１ＺＡ：（２Ｓ）−２−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
（２Ｓ）−２−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］−３−メチルブタン酸（６３ｇ、２８９．９７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ヨードメタン（１８１ｍＬ）の存在下でＴＨＦ（１０００ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、水素化ナトリウム（１１６ｇ、４．８３ｍｏｌ、１６．６７当量）を少量ずつ加えた。この反応混合物を０℃で１．５時間振盪した後、冷却浴を外し、１８時間振盪を続けた。この反応物を２００ｍＬの水で中和した後、減圧下で濃縮した。残った水相を４リットルの水で希釈し、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで１回洗浄し、そのｐＨを１Ｎ塩酸溶液で３〜４の間に調整した。得られた混合物を１．２ＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、６０ｇ（８９％）の化合物１ＺＡを黄色油状物の形態で得た。
化合物１ＺＢ：（２Ｓ）−２−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸ベンジル
化合物１ＺＡ（４７ｇ、２０３．２１ｍｍｏｌ、１．００当量）をＬｉ２ＣＯ３（１５．８ｇ、２１３．８３ｍｍｏｌ、１．０５当量）の存在下でＤＭＦ（６００ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、臭化ベンジル（ＢｎＢｒ ５７．９ｇ、３３８．５３ｍｍｏｌ、１．６７当量）を滴下した。この反応混合物を一晩振盪下で放置した後、４００ｍＬの水で中和し、濾過した。得られた溶液を５００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：２０）を用いて精製し、２２．５ｇ（３４％）の化合物１ＺＢを黄色油状物の形態で得た。
化合物１ＺＣ：（２Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタン酸ベンジル塩酸塩
化合物１ＺＢ（２２．５ｇ、７０．００ｍｍｏｌ、１．００当量）を１５０ｍＬのＤＣＭに溶かした。気体塩酸をバブリングさせた。この反応物を周囲温度で１時間振盪した後、減圧下で濃縮し、１７ｇ（９４％）の化合物１ＺＣを黄色固体の形態で得た。
化合物１ＺＤ：Ｎ−（３，３−ジエトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
３，３−ジエトキシプロパン−１−アミン（６ｇ、４０．７６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＴＥＡ（４．４５ｇ、４３．９８ｍｍｏｌ、１．０８当量）の存在下で１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。２０ｍＬの１，４−ジオキサンに希釈した（Ｂｏｃ）２Ｏ（９．６ｇ、４３．９９ｍｍｏｌ、１．０８当量）を滴下した。この溶液を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した後、１０ｍＬの水で中和した。ｐＨをＨＣｌ（１％）で５に調整した。この溶液を５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、８．２１ｇ（８１％）の化合物１ＺＤ淡黄色油状物の形態で得た。
化合物１ＺＥ：Ｎ−（３−オキソプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１ＺＤ（８．２０ｇ、３３．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）を１８．７５ｍＬの酢酸に溶かし、周囲温度で一晩、振盪下で放置した。次に、この反応媒体を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、３０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で３回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、５ｇ（８７％）の化合物１ＺＥを暗赤色油状物の形態で得た。
化合物１ＺＦ：（２Ｓ）−２−［（３−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］プロピル）（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
化合物１ＺＥ（２．４ｇ、１３．８６ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（３．５６ｇ、１３．８１ｍｍｏｌ、１．００当量）およびＤＩＥＡ（９．１６ｍＬ、４．００当量）の存在下で５０ｍＬのＴＨＦに溶かした。この反応混合物を周囲温度で３０分振盪した後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５．８７ｇ、２７．７０ｍｍｏｌ、２．００当量）を加えた。一晩振盪を続けた後、反応物を１００ｍＬの水で中和し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：４）を用いて部分的に精製した。得られた粗生成物をＰｄ／Ｃ（１．２ｇ）の存在下で２０ｍＬのメタノールに再溶解させ、常温および常圧で２０分間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、２００ｍｇ（５％）の化合物１ＺＦを白色固体の形態で得た。
化合物１ＺＧ：Ｎ−（３−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］チル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４イル］（メチル） カルバモイル］−２−メチルプロピル］カルバモイル］−２−メチルプロピル］（メチル）アミノ］プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１Ｙ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＦ（２６．２ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．２０当量）、ＤＩＥＡ（３７．７ｍＬ）およびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、４３．３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．５０当量）の存在下で２ｍＬのＤＭＦに溶かした。この反応物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、１０ｍＬの水で希釈し、５ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、１００ｍｇの化合物１ＺＧを部分的に精製された無色の油状物の形態で得た。
化合物１ＺＧ（９０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）を中性雰囲気中、２ｍＬのＤＣＭに溶かし、この溶液を氷浴で冷却した。ＴＦＡ（１ｍＬ）を加え、この反応物を周囲温度で２時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％のＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；７分で１８％から３１％ＡＣＮへ、次いで、２分で３１％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１を２５％（２３ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３カラム、３μｍ、４．６×１００ｍｍ；３５℃； １ｍＬ／分、水中３０％から６０％ＡＣＮへ（６分で２０ｍＭ酢酸アンモニウム）；ＥＳＩ（Ｃ４４Ｈ７３Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８２７．５３）ｍ／ｚ：８２９（ＭＨ＋）、５．８４分（９３．７％、２５４ｎｍ）。
1H NMR(300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.85 - 7.80 (m, 1H); 7.69 - 7.66 (m, 1H), 7.40 - 7.10 (m, 5H), 5.80 - 5.63 (m, 1H), 4.80 - 4.65 (m, 2H), 4.22 -4.00 (m, 1H), 3.89 - 0.74 (m, 58H)。
参照化合物２
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（２−アミノピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，トリフルオロ酢酸
化合物２Ａ：（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１Ｄ（２．５ｇ、８．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）および（１Ｓ，２Ｒ）−２−アミノ−１−フェニルプロパン−１−オール（１．３１５ｇ、８．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＭＦ（３５ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（１．３９ｍＬ）およびＴＥＡ（１．８２ｍＬ）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で４時間振盪した。この反応混合物を２００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、３．６ｇ（９８％）の化合物２Ａを黄色固体の形態で得た。
化合物２Ｂ：（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチル−３−（（Ｓ）−ピロリジン−２−イル）プロパンアミド２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物２Ａ（２．７ｇ、６．４２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。ＴＦＡ（２５ｍＬ）を加え、この溶液を０℃で２時間振盪した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、４．４ｇの化合物２Ｂを黄色油状物の形態で得た。
化合物２Ｃ：（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル
化合物２Ｂ（４．４ｇ、１０．１３ｍｍｏｌ、１．００当量）および１Ｗ（５．３１ｇ、１０．１２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４５ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（１．６２ｍＬ）およびＤＩＥＡ（８．４ｍＬ）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応混合物を１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、圧力下で濃縮し、３．３ｇ（３９％）の化合物２Ｃを黄色固体の形態で得た。
化合物２Ｄ：（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド
化合物２Ｃ（３００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＡＣＮ（２ｍＬ）およびピペリジン（０．５ｍＬ）に溶かした。この溶液を周囲温度一晩、振盪下で放置した後、減圧下で蒸発乾固した。残渣をシリカカラムにてＤＣＭとＭｅＯＨの混合物（１：１００）を用いて精製し、１５０ｍｇ（６８％）の化合物２Ｄを白色固体の形態で得た。
化合物２Ｅ：２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）イソニコチン酸メチル
２−アミノピリジン−４−カルボン酸メチル（２ｇ、１３．１４ｍｍｏｌ、１．００当量）をｔｅｒｔ−ブタノール（２０ｍＬ）に溶かし、その後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４．０２ｇ、１８．４２ｍｍｏｌ、１．４０当量）を加えた。この反応混合物を６０℃で一晩振盪した後、この反応を１Ｍ ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）の添加により停止させた。固体を濾別し、５０ｍＬのＥｔＯＨで洗浄した後、真空乾燥させ、２．５ｇ（７５％）の化合物２Ｅを白色固体の形態で得た。
化合物２Ｆ：（４−（ヒドロキシメチル）ピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物２Ｅ（２．５ｇ、９．９１ｍｍｏｌ、１．００当量）およびＣａＣｌ２（１．６５ｇ）をＥｔＯＨ（３０ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＮａＢＨ４（１．１３ｇ、２９．８７ｍｍｏｌ、３．０１当量）を徐々に加えた。この溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、この反応を水（５０ｍＬ）の添加により停止させた。この混合物を２０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、２０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、２．０ｇ（９０％）の化合物２Ｆを無色の固体の形態で得た。
化合物２Ｇ：（４−ホルミルピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物２Ｆ（２．５ｇ、１１．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＣＥ（２５ｍＬ）に溶かした後、１９．４ｇ（２２３．１４ｍｍｏｌ、２０．０２当量）のＭｎＯ２を加えた。この混合物を７０℃で一晩、振盪下で放置した後、固体を濾去した。濾液を蒸発乾固させ、１．４ｇ（５７％）の化合物２Ｇを白色固体の形態で得た。
化合物２Ｈ：（Ｓ）−２−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
化合物２Ｇ（２．３ｇ、１０．３５ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（２．９３ｇ、１１．３７ｍｍｏｌ、１．１０当量）、ＤＩＥＡ（５．３９ｇ、４１．７１ｍｍｏｌ、４．０３当量）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（４．３９ｇ、２０．７１ｍｍｏｌ、２．００当量）の存在下で２５ｍＬのＴＨＦに溶かした。この反応混合物を周囲温度で６時間振盪した後、６０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で中和し、２０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、２０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１５）を用いて精製し、２．７ｇ（６１％）の化合物２Ｈを白色固体の形態で得た。
化合物２Ｉ：（Ｓ）−２−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
化合物２Ｈ（５００ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（２５０ｍｇ）の存在下でに１０ｍＬのＡｃＯＥｔおよび２ｍＬのメタノール溶かし、周囲温度および大気圧で３時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、２５４ｍｇ（６４％）の化合物２Ｉを無色の固体の形態で得た。
化合物２Ｊ：（４−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ）−９−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−１０−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−３，６−ジイソプロピル−２，８−ジメチル−４，７−ジオキソ−１１−オキサ−２，５，８−トリアザドデシル）ピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物２Ｊは、ＤＭＦ（３ｍＬ）中、アミン２Ｄ（８５．２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．５０当量）、酸２Ｉ（３１．７ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＨＡＴＵ（４２．９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびＤＩＥＡ（３６．７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、３．０２当量）から、化合物１ＺＧと同様にして製造された。蒸発乾固の後、１００ｍｇの粗生成物を白色固体の形態で得た。
化合物２Ｊ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）を２ｍＬのＤＣＭおよび１ｍＬのＴＦＡに溶かした。この反応物を周囲温度で１時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣（８０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物２を６％（６．３ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；４０℃；１．８ｍＬ／分、６分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＡＣＮへ）；ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７３Ｎ７Ｏ７、正確な質量８２３．５６）ｍ／ｚ：８２４．５（ＭＨ＋）および４１２．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、３．２１分（９９．２％、２１０ｎｍ）
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.81 - 7.79 (m, 1H); 7.39 - 7.29 (m, 5H); 6.61 - 6.59 (m, 2H); 4.84 - 4.52 (m, 1H); 4.32 - 4.02 (m, 1H); 3.90 - 2.98 (m, 10H); 2.90 - 2.78 (m, 1H); 2.55 - 0.81 (m, 39H)。
参照化合物３
（（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタンｏｙｌ）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，トリフルオロ酢酸
化合物３Ａ：（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−（（（Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１Ｄ（３ｇ、１０．４４ｍｍｏｌ、１．００当量）および（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロパン酸メチル（２．２５ｇ、１２．５５ｍｍｏｌ、１．２０当量）を不活性雰囲気中、ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（１．６７ｍＬ、１．０５当量）およびＴＥＡ（３．６４ｍＬ、２．５０当量）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応混合物を１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、１００ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、１００ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、１００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、圧力下で(under pressure)濃縮し、４ｇ（８５％）の化合物３Ａを無色の油状物の形態で得た。
化合物３Ｂ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−３−（（Ｓ）−ピロリジン−２−イル）プロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチルの２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物３Ａ（５ｇ、１１．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）は、不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶かした。ＴＦＡ（２５ｍＬ）を加え、溶液を２時間振盪した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、８ｇの化合物３Ｂを黄色油状物の形態で得た。
化合物３Ｃ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
化合物３Ｂ（８．０３ｇ、１７．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）および１Ｗ（９．１ｇ、１７．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（２．８ｍＬ）およびＤＩＥＡ（１２ｍＬ）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。反応混合物を２００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、５ｇ（３４％）の化合物３Ｃを黄色固体の形態で得た。
化合物３Ｄ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
化合物３Ｃ（５．５ｇ、６．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ、２．６１ｇ、９．９８ｍｍｏｌ、１．５５当量）の溶液に溶かした。この溶液を周囲温度で２時間振盪した後、１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせた後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、３．３ｇ（８１％）の化合物３Ｄを黄色固体の形態で得た。
化合物３Ｅ：（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタン酸ベンジル
ピリジン−４−カルバルデヒド（１ｇ、９．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（２．９ｇ、１１．２５ｍｍｏｌ、１．２１当量）およびチタンイソプロポキシド（ＩＶ）（４．１９ｍＬ、１．４０当量）の存在下で１０ｍＬの１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）に溶かした。この混合物を周囲温度で３０分間振盪した後、２．７７ｇのＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１３．０７ｍｍｏｌ、１．４０当量）を加えた。この反応媒体を振盪下で一晩放置した後、１００ｍＬの水で中和し、この混合物を５０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、蒸発乾固させた。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：２０）を用いて精製し、１．３ｇ（４５％）の化合物３Ｅを無色の油状物の形態で得た。
化合物３Ｆ：（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタン酸
化合物３Ｅ（８００ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（３００ｍｇ）の存在下で３０ｍＬのＡｃＯＥｔに溶かし、周囲温度および大気圧下で３時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてＤＣＭとＭｅＯＨの混合物（１００：１から５：１）を用いて精製し、１００ｍｇ（１８％）の化合物３Ｆを白色固体の形態で得た。
化合物３Ｄ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）および３Ｆ（２６．３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．５０当量）を３ｍＬのＤＣＭに溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、０．０１８ｍＬのＤＥＰＣおよび０．０３９２ｍＬのＤＩＥＡを加えた。この反応物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応媒体を減圧下で濃縮し、残基（７０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％のＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２５４５ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物３を２７％（２０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；４０℃；１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＡＣＮ）；ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量８３６．５）ｍ／ｚ：８３７．５（ＭＨ＋）および４１９．４（Ｍ．２Ｈ＋／２（１００％））、７．０４分（９０．０％、２１０ｎｍ）
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.76 - 8.74 (m, 2H); 8.53 - 8.48 (m, 0.4H, NHCO不完全交換); 8.29 - 8.15 (m, 0.8H, NHCO不完全交換); 8.01 (s, 2H), 7.31 - 7.22 (m, 5H), 4.88 - 4.68 (m, 3H); 4.31 - 4.07 (m, 2H); 3.94 - 2.90 (m, 18H); 2.55 - 0.86 (m, 38H)。
参照化合物４
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸、トリフルオロ酢酸
化合物３（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（５ｍＬ）およびピペリジン（２．５ｍＬ）の混合物に溶かした。この反応混合物を振盪下で一晩放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２５４５ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、２０ｍｇ（２０％）の化合物４を白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；４０℃；１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＡＣＮへ）；ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７０Ｎ６Ｏ８、正確な質量８２２．５）ｍ／ｚ：８２３．５（ＭＨ＋）および４１２．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．８４分（８９．１％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.79 - 8.78 (m, 2H); 8.09 (m, 2H); 7.30 - 7.21 (m, 5H); 4.80 - 4.80 (m, 1H), 4.36 - 0.87 (m, 58H)。
参照化合物６
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，ビストリフルオロ酢酸
化合物６Ａ：（２Ｓ）−２−［（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−［（２Ｓ）−１−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−［（３−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］プロピル）（メチル）アミノ］−３−メチルブタンアミド］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル］ピロリジン−２−イル］（メトキシ）メチル］プロパンアミド］−３−フェニルプロパン酸メチル
化合物３Ｄ（１５７．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１．００当量）を０℃で不活性雰囲気中、カルボン酸１ＺＦ（７８．７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．１０当量）、ＤＥＰＣ（４６μｌ）およびＤＩＥＡ（１２４μｌ）の存在下で３ｍＬのＤＣＭに溶かした。この反応混合物を低温で２時間振盪した後、冷却浴を外し、４時間振盪を続けた。次に、これを減圧下で濃縮し、２００ｍｇの化合物６Ａを粗黄色油状物の形態で得た。これはそのまま次の工程で使用した。
化合物６Ａ（２００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、０℃で、２ｍＬのＤＣＭに溶かした。ＴＦＡ（１ｍＬ）を滴下し、冷却浴を外した。この反応混合物を周囲温度で１時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、６０ｍｇ（２工程の収率２６％）の化合物６を白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．１％Ｈ３ＰＯ４）中３０から８０％メタノール）；ＥＳＩ（Ｃ４３Ｈ７４Ｎ６Ｏ８、正確な質量８０２．５６）ｍ／ｚ：８０４（ＭＨ＋）；１１．５０分（９１．５％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.52 (d, 0.3H, NHCO不完全交換); 8.25 (d, 0.5H, NHCO不完全交換); 7.30-7.22 (m, 5H); 4.9-4.6 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 4.0-0.86 (m, 61H)。
参照化合物７
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，ビストリフルオロ酢酸
化合物６（７０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（２．５ｍＬ）とピペリジン（５ｍＬ）の混合物に溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；ＵＶ Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、１４．６ｍｇ（２１％）の化合物７を白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；１．５ｍＬ／分、４０℃、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中０から８０％メタノール；ＥＳＩ（Ｃ４２Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量７８８．５４）ｍ／ｚ：７９０（ＭＨ＋）、５．７１分（９６．８３％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.42 (d, 0.3H, NHCO不完全交換); 8.15 (d, 0.2H, NHCO不完全交換); 7.31-7.21 (m, 5H); 4.9-4.6 (m, 3H); 4.25-4.0 (m, 1H); 4.0-0.86 (m, 59H)。
化合物１１
（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）フェネチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド，トリフルオロ酢酸
化合物１１Ａ：Ｎ−［４−（２−ヒドロキシエチル）フェニル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＨＦ（２００ｍＬ）中、２−（４−アミノフェニル）エタノール（１０ｇ、７２．９ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１６．７ｇ、７７ｍｍｏｌ、１．０５当量）を加え、この反応物を周囲温度で一晩撹拌した。この混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、水（２００ｍＬ）、次いで、ＨＣｌ １Ｍ（１００ｍＬ）、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、次いで、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、減圧下で蒸発乾固させた。粗生成物をヘプタン（１５０ｍＬ）で２回摩砕し、真空下で乾燥させ、化合物１１Ａを白色固体として得た（１４．７ｇ、８４％）。
化合物１１Ｂ：Ｎ−［４−（２−オキソエチル）フェニル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１１Ａ（２．５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ、１．００当量）を２５ｍＬのＤＣＭに溶かした後、−７８℃に冷却した。ＤＣＭ（１０ｍＬ）中デス・マーチン・ペルヨージナン溶液（ＤＭＰ、６．７１ｇ、１５．８ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下した。冷却浴を外し、周囲温度で１時間振盪を続けた。この反応物を重炭酸ナトリウム飽和水溶液とＮａ２Ｓ２Ｏ３飽和水溶液の５０／５０混合物６０ｍＬで中和した。得られた溶液を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、ＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ １／１５）で精製し、１．０ｇ（４０％）の化合物１１Ｂを淡黄色固体の形態で得た。
化合物１１Ｃ：（２Ｓ）−２−［［２−（４−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］フェニル）エチル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸ベンジル
化合物１ＺＣ（３．５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＩＥＡ（６．４ｇ、４９．７ｍｍｏｌ、４．０当量）、アルデヒド１１Ｂ（２．９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５．２３ｇ、４９．７ｍｍｏｌ、２．０当量）の存在下でＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、６０ｍＬの重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和した。得られた溶液を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、ＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ １：２０）で精製し、３．７ｇ（６８％）の化合物１１Ｃを黄色油状物の形態で得た。
化合物１１Ｄ：（２Ｓ）−２−［［２−（４−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］フェニル）エチル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
化合物１１Ｃ（２ｇ、４．５ｍｍｏｌ、１当量）をＰｄ／Ｃ（２ｇ）の存在下で１０ｍＬのメタノールに溶かし、常温および常圧で２時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、１．２ｇ（７５％）の化合物１１Ｄを黄色油状物の形態で得た。
化合物１１Ｅ：（２Ｓ）−２−［［２−（４−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］フェニル）エチル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
化合物１１Ｄ（１．２ｇ、３．４ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶かした。反応媒体を氷浴で冷却し、その後、ＮａＨ（油中６０％、５４９ｍｇ、１３．７ｍｍｏｌ、４．０当量）を少量ずつ加えた後、ヨードメタン（４．９ｇ、３４ｍｍｏｌ、１０当量）を加えた。この反応物を周囲温度で(at ambient temperature)一晩、振盪下で放置した後、水で中和し、１００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｎ ＨＣｌで６〜７に調整した。この水溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、８００ｍｇ（６４％）の化合物１１Ｅを黄色固体の形態で得た。
化合物１１Ｆ：Ｎ−［４−（２−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４イル］（メチル）カルバモイル］−２−メチルプロピル］カルバモイル］−２−メチルプロピル］（メチル）アミノ］エチル）フェニル］−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１１Ｆは、アミン１Ｙ（１５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．２当量）および酸１１Ｅ（７０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１．０当量）から、化合物６Ａと同様にして製造された。シリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ １：１）での精製後、１００ｍｇ（５２％）の目的生成物を淡黄色固体の形態で得た。
化合物１１は、中間体１１Ｆ（１００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）から、化合物１と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１１を３９％（３９．７ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中５０から９５％メタノール）；ＥＳＩ（Ｃ５０Ｈ７７Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量９０３．５７）ｍ／ｚ：９０４．５（ＭＨ＋）、７．５３分（９３．６８％、２５４ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.84 (d, 0.5H, NHCO不完全交換); 8.7-8.5 (m, 0.9H, NHCO不完全交換); 7.76-7.73 (m, 1H); 7.55 - 7.4 (m, 1H); 7.28-7.22 (m, 7H); 7.08-7.05 (m, 2H); 5.51-5.72 (m, 1H); 4.9-4.80 (m, 2H); 4.3-0.7 (m, 60H)。
化合物１２
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）フェネチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，トリフルオロ酢酸
化合物１の合成の最終段階と同様にして、化合物１２をアミン３Ｄ（１１８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および酸１１Ｅ（８２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）から２段階で製造した。最終残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１２を７％（１３．７ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中４０から９５％メタノール）；ＥＳＩ（Ｃ４９Ｈ７８Ｎ６Ｏ８、正確な質量８７８．５９）ｍ／ｚ：８７９．７（ＭＨ＋）、１０．０７分（９０．６％、２５４ｎｍ）。
1H:NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.40 (se, 2H); 7.38-7.22 (m, 7H); 4.95-4.7 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.86 (m, 62H)。
化合物１３
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）フェネチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，トリフルオロ酢酸
化合物１３は、化合物１２（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）から、化合物７と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１３を２０％（２０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；１．５ｍＬ／分、４０℃、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０から９５％メタノール）；ＥＳＩ（Ｃ４８Ｈ７６Ｎ６Ｏ８、正確な質量８６４．５７）ｍ／ｚ：８６５．６（ＭＨ＋）、６．０５分（９０．９％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.32-7.19 (m, 9H); 4.9-4.65 (m, 3H); 4.2-4.0 (m, 1H); 3.9-0.86 (m, 59H)。
化合物１４
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，トリフルオロ酢酸
化合物１４Ａ：（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
（３−アミノフェニル）メタノール（３ｇ、２４．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＴＨＦ（６０ｍＬ）に溶かし、その後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（６．３８ｇ、２９．２３ｍｍｏｌ、１．２０当量）を加えた。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、この反応物を２００ｍＬの水を加えて希釈した。生成物を１００ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した後、有機相を再び合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、粗生成物（１３．８５ｇの化合物１４Ａ）を黄色油状物の形態で得た。
化合物１４Ｂ：（３−ホルミルフェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１４Ａ（１３．８ｇ、６１．８１ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＣＥ（４００ｍＬ）に溶かした後、ＭｎＯ２（５４ｇ、６２１．１４ｍｍｏｌ、１０．０５当量）を加えた。この混合物を周囲温度で３日間、振盪下で放置し、その後、これらの固体を濾去した。濾液を蒸発乾固させ、残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：３０）を用いて精製し、３ｇ（２２％）の化合物１４Ｂを白色固体の形態で得た。
化合物１４Ｃ：（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
化合物１４Ｂ（１ｇ、４．５２ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（１．１６ｇ、４．５０ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＩＥＡ（３ｍＬ）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１．９２ｇ、９．０６ｍｍｏｌ、２．０１当量）の存在下で２０ｍＬのＴＨＦに溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、１００ｍＬの水で中和し、５０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：５０）を用いて精製し、１．９ｇ（９９％）の化合物１４Ｃを白色固体の形態で得た。
化合物１４Ｄ：（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
化合物１４Ｃ（１ｇ、２．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（４００ｍｇ）の存在下で３０ｍＬのＡｃＯＥｔおよび４ｍＬのメタノールに溶かし、周囲温度および大気圧で１時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、６８０ｍｇ（８６％）の化合物１４Ｄを白色固体の形態で得た。
化合物１４Ｅ：（３−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ）−９−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−３，６−ジイソプロピル−１０−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−２，８−ジメチル−４，７−ジオキソ−１１−オキサ−２，５，８−トリアザドデシル）フェニル） カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物１４Ｅは、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン１Ｙ（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸１４Ｄ（１０２．２７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０５３ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０４６ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（８０ｍｇ）をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１）を用いて精製し、１００ｍｇ（６７％）の化合物１４Ｅを淡黄色固体の形態で得た。
化合物１４は、中間体１４Ｅ（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物（８０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２５４５ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１４を１０％（１０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ ｐｌｕｓ Ｃ８カラム、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；４０℃；１．０ｍＬ／分、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中４０％から９５％ＭｅＯＨ）；ＥＳＩ（Ｃ４８Ｈ７３Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８７５．５）ｍ／ｚ：８７６．５（ＭＨ＋）および４３８．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１１．３５分（９５．６％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.92 - 8.86 (m, 0.4H, NH不完全交換); 8.70 - 8.54 (m, 0.6H, NH不完全交換); 7.88 - 7.78 (m, 1H); 7.60 - 7.50 (m, 1H); 7.45 - 6.97 (m, 9H); 5.80 - 5.65 (m, 1H); 4.85 - 4.70 (m, 1H); 4.40 - 0.80 (m, 56H)。
化合物１５
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，トリフルオロ酢酸
化合物１５Ａ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
化合物１５Ａは、ＤＣＭ（５ｍＬ）中、アミン３Ｄ（２００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸１４Ｄ（２１２．６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．１１０３ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．１５７ｍＬ、３．００当量）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１）を用いて精製し、２００ｍｇ（６７％）の化合物１５Ａを黄色固体の形態で得た。
化合物１５：化合物１５は、中間体１５Ａ（２００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ＵＶ検出器 ２５４５ ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１５を１９％（３８．６ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ；４０℃；１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨ）；ＥＳＩ（Ｃ４７Ｈ７４Ｎ６Ｏ８、正確な質量８５０．５）ｍ／ｚ：８５１．５（ＭＨ＋）および４２６．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．６１分（９１．１％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.53 - 7.42 (m, 1H); 7.35 - 7.18 (m, 8H); 4.88 - 4.79 (m, 2H); 4.42 - 4.00 (m, 3H); 3.93 - 2.71 (m, 22H); 2.61 - 0.81 (m, 33H)。
化合物２０
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル(phnyl)−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，トリフルオロ酢酸
化合物２０は、アミン１ＺＣおよび対応するアルデヒドから、化合物１と同様にして製造された。
化合物２０の製造に関与する４−ニトロベンズアルデヒドは市販品であった。
化合物２０の合成はニトロ基を還元することにより完了した。これは次のように行った：（２Ｓ）−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−［［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］カルバモイル］−１−メトキシ−２−メチルエチル］ピロリジン−１−イル］−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ，３−ジメチル−２−［（２Ｓ）−３−メチル−２−［メチル［（４−ニトロフェニル）メチル］アミノ］ブタンアミド］ブタンアミド（４０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１．０当量）を１５ｍＬのエタノールに溶かした。二水和塩化スズ（ＩＩ）（３１７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、３０当量）を加え、この溶液を周囲温度で３日間、振盪下で放置した。この反応物を５０ｍＬの水で中和した後、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、化合物２０を粗状態で得た（純度：９３．２％；量：２１．６ｍｇ）。
化合物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、対応するＴＦＡ塩を白色固体の形態で得た。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.85-7.80 (m, 1H); 7.6-7.5 (m, 1H); 7.4-7.15 (m, 5H); 7.1-7.05 (m, 2H); 6.73-6.70 (m, 2H); 5.8-5.55 (m, 1H); 5.0-4.7 (m, 2H); 4.25-4.05 (m, 1H); 4.0-0.8 (m, 54H)。LC/MS/UV ESI:(C48H73N7O7S, 正確な質量875.53) m/z 876 (MH+), 439 [75 %, (M.2H+)/2]; UV: RT＝4.83分 (96.8 %, 254 nm)。1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.85-7.80 (m, 1H); 7.6-7.5 (m, 1H); 7.4-7.1 (m, 7H); 6.76-6.72 (m, 2H); 5.8-5.55 (m, 1H); 4.9-4.65 (m, 2H); 4.25-4.05 (m, 1H); 4.0-0.8 (m, 54H)。
化合物２９
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，トリフルオロ酢酸
化合物１５（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（５ｍＬ）とピペリジンの混合物（２．５ｍＬ）に溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１ ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ；１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２５４５ ＵＶ検出器 ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、２０ｍｇ（２０％）の化合物２９を白色固体の形態で得た。
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ８カラム、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ；４０℃；１．０ｍＬ／分、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中４０％から９５％ＭｅＯＨ）；ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量８３６．５４）ｍ／ｚ：８３７．５（ＭＨ＋）および４１９．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１０．６１分（９２．５％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.38 - 7.15 (m, 6H); 7.00 - 6.99 (m, 3H); 4.85 - 4.68 (m, 2H); 4.37 - 3.38 (m, 11H); 3.31 - 2.70 (m, 8H); 2.60 - 0.82 (m, 35H)。
化合物６１
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド
化合物６１Ａ：Ｎ−（４−アミノフェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン二塩酸塩
化合物１１Ｄ（９６２ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をプロパン−２−オール中ＨＣｌの市販溶液（５〜６Ｍ）１０ｍｌに溶かし、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、出発材料の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた黄色固体をＥｔ２Ｏ（２×１０ｍｌ）で摩砕した。生成物を真空下で乾燥させ、化合物６１Ａを黄色固体として得た（３２２ｍｇ、４７％）。
化合物６１：カルボン酸６１Ａ（７３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびアミン１Ｙ（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かした。ＤＩＥＡ（１５８μｌ、０．９０ｍｍｏｌ、４当量）およびＤＥＣＰ（ＤＥＰＣとも呼ばれる）（５１μｌ、０．３４ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、この反応物を室温で４時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳによる分析は、出発材料の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製し、化合物６１を淡黄色固体として得た（８３ｍｇ、４０％）。
1H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ(回転異性体の存在), 8.86 (d, 0.5H, NHCO); 8.65 (d, 0.5H, NHCO), 8.11-8.05 (m, 1H, NHCO), 7.80 (d, 0.5H, チアゾール), 7.78 (d, 0.5H, チアゾール), 7.65 (d, 0.5H, チアゾール), 7.63 (d, 0.5H, チアゾール), 7.32 - 7.12 (m, 5H), 6.83 (d, J=8.3 Hz, 2H), 6.45 (d, J=8.3 Hz, 2H), 5.56 - 5.49 (m, 0.5 H), 5.42 - 5.35 (m, 0.5H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.46 (m, 2H), 4.01 - 0.66 (m, 57H)。
ＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×５０ｍｍ；３．５ｍｌ／分、４０℃、２．２５分で水（０．１％ＴＦＡ）中０から９５％ＭｅＣＮ、次いで、０．５分間９５％ＭｅＣＮ、Ｔｒ＝１．３１分（９６．５％、２２０ｎｍ）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＥＳＩ＋）８９０．５５５８（２％、ＭＨ＋、Ｃ４９Ｈ７６Ｎ７Ｏ６Ｓ理論値８９０．５５７２）、４４５．７８３４（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ４９Ｈ７７Ｎ７Ｏ６Ｓ理論値４４５．７８２３）。
化合物６２
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル
化合物６２は、カルボン酸６１Ａ（６９ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１当量）、アミン３Ｄ（１３５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＩＥＡ（７５μｌ、０．４３ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＥＣＰ（４９μｌ、０．３２ｍｍｏｌ、１．５当量）を用い、化合物６１と同様にして製造された。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製し、化合物６２を帯黄色固体として得た（８２ｍｇ、４５％）。
1H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ(回転異性体の存在), 8.50 (d, J=8.3, 0.5H, NHCO); 8.27 (d, J=8.0, 0.5H, NHCO), 8.15-8.04 (m, 1H, NHCO), 7.27 - 7.13 (m, 5H), 6.86 - 6.79 (m, 2H), 6.48 - 6.42 (m, 2H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.44 (m, 3H), 4.01 - 3.72 (m, 1.5H), 3.66 (s, 1.5H, CO2Me), 3.63 (s, 1.5H, CO2Me), 3.57 - 0.65 (m, 55.5H)。
ＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×５０ｍｍ；３．５ｍｌ／分、４０℃、２．２５分で水（０．１％ＴＦＡ）中０から９５％ＭｅＣＮ、次いで、０．５分間９５％ＭｅＣＮ、Ｔｒ＝１．２９分（９５．３％、２２０ｎｍ）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＥＳＩ＋）８６５．５８００（２％、ＭＨ＋、Ｃ４８Ｈ７７Ｎ６Ｏ８理論値８６５．５７９７）、４３３．２９３７（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ４８Ｈ７８Ｎ６Ｏ８理論値４３３．２９３５）。
化合物６３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物６２（２３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を水（１ｍｌ）とアセトニトリル（１ｍｌ）の混合物に溶かした。ピペリジン（０．７５ｍｌ）を加え、この混合物を室温で５時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、出発材料の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐカラム Ｃ１８ ＯＢＤ、５μｍ、１９×１５０ｍｍ；移動相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１０分で２０％から４０％ＭｅＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；検出器 ＵＶ Ｗａｔｅｒｓ ２５４５ ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物６３を白色固体として得た（１４ｍｇ、６６％）。
1H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ(回転異性体の存在), 12.7 (s(br), 1H, CO2H), 9.58 (m(br), 1H); 9.04 - 8.89 (m, 1H), 8.41 (d, 0.6H, NHCO), 8.15 (d, 0.4H, NHCO), 7.27 - 7.13 (m, 5H), 7.13 - 6.99 (m(br), 2H), 6.90 - 6.64 (s(br), 2H), 4.77 - 3.40 (m, 10H), 3.34 - 2.75 (m, 20H), 2.34 - 1.94 (m, 4H), 1.90 - 0.7 (m, 25H)。
ＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ Ｃ１８， ３．５μｍ、４．６×５０ｍｍ；３．５ｍｌ／分、４０℃、２．２５分で水（０．１％ＴＦＡ）中０から９５％ＭｅＣＮへ、次いで、０．５分間９５％ＭｅＣＮ、Ｔｒ＝１．２４分（１００％、２２０ｎｍ）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＥＳＩ＋）８５１．５６４１（６％、ＭＨ＋、Ｃ４７Ｈ７５Ｎ６Ｏ８理論値８５１．５６４１）、４２６．２８５４（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ４７Ｈ７６Ｎ６Ｏ８理論値４２６．２８５７）。
実施例１５：薬物の抗増殖性の活性
方法：
細胞培養 Ａ５４９（非小細胞肺癌−ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳腺癌−ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２６）細胞をそれぞれ、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）および１０％ＦＣＳを含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＭＣＦ７（乳管癌−ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）細胞およびＳＮ−１２Ｃ（腎臓癌−ＡＴＣＣ）細胞は、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＣＦ７細胞の場合にはフェノールレッド不含）で維持した。総ての培地にファンギゾン（１．２５μｇ／ｍＬ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／１００μｇ／ｍＬ）を添加した。細胞を３７℃のインキュベーターにて、５％ＣＯ２および９５％大気湿度の標準条件下で培養した。
４つの腫瘍細胞株での抗増殖性活性 選択された薬物を、４細胞株の包括的パネルでＡＴＰｌｉｔｅ増殖アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｌｌｅｂｏｎ ｓｕｒ Ｙｖｅｔｔｅ、フランス）を用い、それらの抗増殖性の活性に関して調べた。０日目に、細胞を９６ウェルプレートに、細胞が７２時間の薬物処理期間に対数細胞増殖期に留まることを保証する濃度で播種した（Ａ５４９では１０３細胞／ウェル、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＮ１２Ｃでは２．１０３）。２４時間のインキュベーション期間の後、総ての細胞を供試化合物の希釈系で処理した（１％ＤＭＳＯ中１０倍溶液１１μＬ−６ウェル／条件）。チップ上への化合物の接着を避けるため、２つの連続する希釈の間でチップを交換した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。４日目に、細胞の生存率を、生細胞により放出されるＡＴＰを定量することにより評価した。生細胞の数を溶媒処理細胞の数と比較して分析した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，ＣＡ、ＵＳＡ）により提供されているアルゴリズムを用いて実行される曲線フィッティング分析（シグモイド用量反応、可変ヒル傾き係数を用いる非線形回帰モデル）で評価した。
結果：
種々の薬物：
上記の方法に従いＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株でのそれらの抗増殖活性を決定するために種々の薬物を試験した。測定された活性はＥＣ５０＜０．１μＭの値を示した。
上記で例示した薬物の中から選択された少数の下記の例は、それらの十分に顕著な抗増殖活性を示す：
実施例１２：ＥＣ５０＝５．８０×１０−１０Ｍ；実施例１３：ＥＣ５０＝７．９５×１０−８Ｍ；実施例１５：ＥＣ５０＝１．７０×１０−１０Ｍ；実施例２７：ＥＣ５０＝１．２０×１０−１０Ｍ。
種々の細胞株：
化合物１５を、上記の方法に従い種々の細胞株（Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＳＮ１２Ｃ）で試験した。測定された活性は、総ての供試細胞株でＥＣ５０＜０．１μＭの値を示した。
比較例：
以下の比較例でフェニル環上での置換（アミノ対カルボキシル）を検討したところ、アミノ置換基を含んでなる本発明による薬物の抗増殖活性の向上が示された。
実施例１６：薬物−リンカー部分の合成
化合物Ｅ−１１
（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）（メチル）カルバミン酸４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｅ−１１−１：（Ｓ）−２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸メチル塩酸塩
塩化アセチル（１０ｍＬ）を、０℃で撹拌しながらＭｅＯＨ（１２０ｍＬ）に滴下した。２０分後、Ｌ−シトルリン（１０ｇ、５７ｍｍｏｌ、１．００当量）を加え、この混合物を一晩還流下で加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させ、１５ｇ（１１６％）の化合物Ｅ−１１−１を白色固体として得た。この生成物をそれ以上乾燥させずに次の工程で使用した。
化合物Ｅ−１１−２：（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタン酸メチル
化合物Ｅ−１１−１（１３ｇ、５７．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を０℃で不活性雰囲気下、ＤＭＦ（１４０ｍＬ）に溶かした。ＤＩＥＡ（３０ｍＬ、１７３ｍｍｏｌ、３．０当量）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ−１０．５９ｇ、６９．１ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＢｏｃ−Ｌ−バリンヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ−１８．１ｇ、５７．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。この反応混合物を周囲温度で一晩振盪した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を水（１００ｍＬ）に溶かしＤＣＭ（１５０ｍＬ）で２回抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、１８．８ｇ（８４％）の化合物Ｅ−１１−２を白色固体として得た。
化合物Ｅ−１１−３：（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタン酸
化合物Ｅ−１１−２（１８．８ｇ、４８．４ｍｍｏｌ、１当量）を０℃でＭｅＯＨ（２００ｍＬ）に溶かした。ＮａＯＨ １Ｍ溶液（７２ｍＬ、７２ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、この混合物を室温で２時間撹拌した。ＭｅＯＨを減圧下で除去し、残った水溶液をＨＣｌ １Ｍで酸性化した。水相を蒸発乾固させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、１８ｇ（９９％）の化合物Ｅ−１１−３を白色固体として得た。
化合物Ｅ−１１−４：（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物Ｅ−１１−３（５ｇ、１３．４ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＣＭ（６５ｍｌ）と乾燥ＭｅＯＨ（３５ｍｌ）の混合物に溶かした。（４−アミノフェニル）メタノール（１．８１ｇ、１４．７ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ−６．６０ｇ、２６．７ｍｍｏｌ、２当量）を加え、この混合物を暗所で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、５．２ｇ（７３％）の化合物Ｅ−１１−４を灰白色固体として得た。
化合物Ｅ−１１−５：（（Ｓ）−３−メチル−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物Ｅ−１１−４（１．１ｇ、２．２９ｍｍｏｌ、１当量）を不活性雰囲気下、周囲温度で乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かした。炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（１．４０ｇ、４．５９ｍｍｏｌ、２当量）、次いで、ＤＩＥＡ（６００μｌ、３．４４ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、得られた黄色溶液を一晩撹拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、１．２７ｇ（８４％）の化合物Ｅ−１１−５を灰白色固体として得た。
化合物Ｅ−１１−６：（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）（メチル）カルバミン酸４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
カーボネートＥ−１１−５（１１４ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、１．２当量）およびアニリン１１Ｆ（１５０ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶かした。ＨＯＢｔ（３８ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＥＡ（５４μＬ、０．２９５ｍｍｏｌ、２当量）を加え、この混合物を週末にわたって室温で撹拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣を、ＤＣＭで溶出するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により再精製した。選択された画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１１−６を白色固体として得た（８９ｍｇ、３９％）。
化合物Ｅ−１１：
化合物Ｅ−１１−６（２１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＣＭ（０．２５ｍＬ）に溶かし、ＴＦＡ（４０μＬ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌し、その後、ＬＣ−ＭＳ分析は出発材料の完全な消費を示した。この混合物を軽く冷却（液体窒素浴）すると同時にＤＭＦ（０．５ｍＬ）、次いで、ＴＦＡを中和するためのＤＩＥＡ（１００μＬ）を加えた。その後、冷却浴を外し、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。この混合物を室温で４８時間撹拌し、生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１１を白色固体として得た（１１ｍｇ、５４％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１５２４．８２８２（２％、ＭＮａ＋、Ｃ７９Ｈ１１５Ｎ１３ＮａＯ１４Ｓ理論値１５２４．８２９９）、７５１．９２８３（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７９Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１４Ｓ理論値７５１．９２７６）。
化合物Ｅ−１２
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｅ−１２−１：（（Ｓ）−３−メチル−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（４−（（（（ペルフルオロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）ブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
化合物Ｅ−１１−４（６７０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で不活性雰囲気下、乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）に溶かした。炭酸ビス（ペルフルオロフェニル）（９９１ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ、２当量）、次いで、ＤＩＥＡ（３２９μｌ、１．８９ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、得られた無色の溶液を室温で３０分間撹拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、８３６ｍｇ（９６％）の化合物Ｅ−１２−１を灰白色固体として得た。
化合物Ｅ−１２−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
アニリン１２（１６５ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ、１．０当量）を０℃で不活性雰囲気下、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶かした。カーボネートＥ−１２−１（１９４ｍｇ、０．２８２ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＨＯＢｔ（５１ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＥＡ（６６μＬ、０．３７５ｍｍｏｌ、２当量）を加え、この混合物を室温で８時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ１２−７を白色固体として得た（２４７ｍｇ、７７％）。
化合物Ｅ−１２−３：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
化合物Ｅ−１２−２（５．６ｍｇ、４．０４μｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（１００μＬ）に溶かした。５分後、２ｍｌの水を加え、この混合物を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１２−３を灰白色固体として得た（５．６ｍｇ、９８％）。
化合物Ｅ−１２：
化合物Ｅ−１２−３（５．６ｍｇ、４μｍｏｌ、１．０当量）をアセトニトリル（０．５ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（５μＬ、７当量）、次いで、６−（２,５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２．５ｍｇ、８μｍｏｌ、２当量）を加えた。この混合物を室温で６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳにより反応を管理した後、２００μｌの水を加え、得られた溶液を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１２を白色固体として得た（４．６ｍｇ、７０％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）７３９．４３８９（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７８Ｈ１１８Ｎ１２Ｏ１６理論値７３９．４３８９）。
化合物Ｅ−１３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｅ−１３−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン
化合物Ｅ−１２−２（１８５ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ、１．０当量）を室温で水（５ｍＬ）とアセトニトリル（５ｍＬ）の混合物に溶かした。ピペリジン（３．６７ｍＬ、３００当量）を加え、この混合物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発乾固させ、残渣をＥｔ２Ｏ（６０ｍＬ）で摩砕した。この固体をＥｔ２Ｏ（２０ｍｌ）で２回すすぎ、真空下で乾燥させ、化合物Ｅ−１３−１を灰白色固体として得た（１７５ｍｇ、９５％）。
化合物Ｅ−１３−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
化合物Ｅ−１３−１（１７５ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。５分後、水（１ｍＬ）およびアセトニトリル（１ｍＬ）を加え、この溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１３−２を灰白色固体として得た（１８０ｍｇ、８７％）。
化合物Ｅ−１３：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｅ−１３−２（８０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ、１．０当量）をアセトニトリル（１．５ｍＬ）とＤＭＦ（０．４ｍＬ）の混合物に溶かした。ＤＩＥＡ（５０μＬ、０．２８９ｍｍｏｌ、５当量）、次いで、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（３６ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。この混合物を室温で３時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳにより反応を管理した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１３を白色固体として得た（３２ｍｇ、３５％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ−）１４６１．８３３６（１００％、（Ｍ−Ｈ）−、Ｃ７７Ｈ１１３Ｎ１２Ｏ１６理論値１４６１．８４０３）。ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１４６３．８５６５（２％、ＭＨ＋、Ｃ７７Ｈ１１５Ｎ１２Ｏ１６理論値１４６３．８５４９）、７３２．４３１７（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７７Ｈ１１６Ｎ１２Ｏ１６理論値７３２．４３１１）。
化合物Ｅ−１５
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｅ−１５−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｅ−１５−１は、ＤＭＦ（２ｍＬ）中、カーボネートＥ−１１−５（２８ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、１当量）、アニリン１５（４２ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、１当量）、ＨＯＢｔ（３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、０．５当量）、およびＤＩＥＡ（１５μＬ、０．０８７ｍｍｏｌ、２当量）を用い、化合物Ｅ−１１−６と同じ方法に従って製造された。化合物Ｅ−１５−１を白色固体として単離した（８．２ｍｇ、１３％）。
化合物Ｅ−１５−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
化合物Ｅ−１５−１（８．２ｍｇ、５．５８μｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かしたた。５分後、水（１ｍＬ）を加え、この溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１５−８を白色固体として得た（７．６ｍｇ、９９％）。
化合物Ｅ−１５：
化合物Ｅ−１５は、アセトニトリル（０．５ｍＬ）中、アミンＥ−１５−２（７．６ｍｇ、５．５５μｍｏｌ、１当量）、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、１．２当量）およびＤＩＥＡ（５μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ、５当量）を用い、化合物Ｅ−１２と同じ方法に従って製造された。化合物Ｅ−１５を白色固体として単離した（４．２ｍｇ、４８％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１４７１．８１６９（２％、ＭＮａ＋、Ｃ７６Ｈ１１２Ｎ１２ＮａＯ１６理論値１４７１．８２１１）、７２５．４２２３（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７６Ｈ１１４Ｎ１２Ｏ１６理論値７２５．４２３２）、４８３．９４８２（１０％、（ＭＨ３）３＋、Ｃ７６Ｈ１１５Ｎ１２Ｏ１６理論値４８３．９５１３）。
化合物Ｆ−１３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン ２，２，２−トリフルオロ酢酸酸
化合物Ｆ−１３−１：Ｎ−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル
化合物１１Ｃ（２５０ｍｇ、０．５６７ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶かした後、ＮａＨ（鉱油中６０％懸濁液、６８ｍｇ、１．７０２ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。この混合物を５分間撹拌した後、ヨードメタン（１０６μＬ、１．７０２ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。この反応物を室温で２時間撹拌した後、水で急冷し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）と水（５０ｍＬ）とで分離した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、化合物Ｆ−１３−１を黄色油状物として得（２５０ｍｇ、９７％）、これをそれ以上精製せずに用いた。
化合物Ｆ−１３−２：Ｎ−メチル−Ｎ−（４−（メチルアミノ）フェネチル）−Ｌ−バリン酸ベンジル
Ｂｏｃ保護アニリンＦ−１３−１（２５０ｍｇ、０．５５０ｍｍｏｌ、１当量）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶かした後、ｉＰｒＯＨ中ＨＣｌの市販溶液（５〜６Ｍ）１ｍＬを加えた。この溶液を室温で２時間撹拌した後、減圧下で蒸発乾固させた。得られた黄色油状物をＥｔ２Ｏで摩砕し、化合物Ｆ−１３−２を黄色固体として得た（２０２ｍｇ、９４％）。
化合物Ｆ−１３−３：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル
酸Ｅ−１１−３（１９０ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶かした後、ＤＩＥＡ（１１８μＬ、０．６７７ｍｍｏｌ、２当量）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ−２６４ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ、１．５当量）およびアニリンＦ−１３−２（１２０ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−１３−３を白色固体として得た（１４０ｍｇ、４５％）。
化合物Ｆ−１３−４：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン
化合物Ｆ−１３−３（１１６ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、１当量）をＰｄ／Ｃ１０％（３０ｍｇ）の存在下でＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶かし、周囲温度および大気圧下で２時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、１１０ｍｇ（９９％）の化合物Ｆ−１３−４をベージュの固体として得た。
化合物Ｆ−１３−５：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
アミン３Ｄ（８９ｍｇ、０．１４０ｍｍｏｌ、１当量）および酸Ｆ−１３−４（１４５ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶かし、ＰｙＢＯＰ（１０９ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＥＡ（７３μＬ、０．４２０ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。この混合物を室温で１時間撹拌し、溶媒を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃと水とで分離し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−１３−５を白色固体として得た（１４０ｍｇ、７３％）。
化合物Ｆ−１３−６：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｆ−１３−５（１４０ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ、１当量）を水（４ｍＬ）、アセトニトリル（４ｍＬ）およびピペリジン（２ｍＬ）の混合物に溶かし、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−１３−６を白色固体として得た（１１５ｍｇ、８３％）。
化合物Ｆ−１３：
化合物Ｆ−１３は、化合物Ｅ−１１と同じ方法に従い、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）およびＴＦＡ（１００μＬ、３０当量）中、Ｂｏｃ保護アミンＦ−１３−６（５５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、１．０当量）を用い、次いで、ＤＭＦ（１ｍＬ）で希釈し、ＤＩＥＡ（３２０μＬ、４５当量）で急冷した後、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１５ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、１．２当量）と反応させて製造された。分取ＨＰＬＣによる精製および凍結乾燥の後に、化合物Ｆ−１３を白色固体として得た（１４ｍｇ、２４％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１３１４．８０６７（２％、ＭＨ＋、Ｃ６９Ｈ１０８Ｎ１１Ｏ１４理論値１３１４．８０７２）、６５７．９０６７（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ６９Ｈ１０９Ｎ１１Ｏ１４理論値６５７．９０７２）。
化合物Ｆ−６１
Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｆ−６１−１：Ｎ−（４−アミノフェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル二塩酸塩
化合物１１Ｃ（１．０ｇ、２．２７ｍｍｏｌ、１当量）をｉＰｒＯＨ中ＨＣｌの市販溶液（５〜６Ｍ）８ｍＬに溶かした。この混合物を室温で２時間撹拌した後、減圧下で蒸発乾固させた。残渣をＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）で２回摩砕し、真空下で乾燥させ、化合物Ｆ−６１−１を白色固体として得た（９１６ｍｇ、９８％）。
化合物Ｆ−６１−２：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル
酸Ｅ−１１−３（７６９ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（２．５ｍｌ）に溶かした後、ＤＩＥＡ（９５７μＬ、５．４８ｍｍｏｌ、４当量）およびＰｙＢＯＰ（１．０７ｇ、２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。アニリンＦ−６１−１（５６６ｍｇ、１．３６９ｍｍｏｌ、１当量）を加え、この混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、９６９ｍｇ（１０２％）の化合物Ｆ−６１−２を白色固体として得た。
化合物Ｆ−６１−３：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン
化合物Ｆ−６１−２（９６９ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、１当量）をＰｄ／Ｃ１０％（２７０ｍｇ）の存在下でＭｅＯＨ（２０ｍｌ）に溶かし、周囲温度および大気圧下で３時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ）で精製し、５２０ｍｇ（６７％）の化合物Ｆ−６１−３を白色固体として得た。
化合物Ｆ−６１−４：（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
酸Ｆ−６１−３（６７．５ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）およびＤＥＣＰ（１７μＬ、０．１１１ｍｍｏｌ、１．５当量）に溶かし、ＤＩＥＡ（３９μＬ、０．２２３ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。室温で１５分間撹拌した後、アミン１Ｙ（５０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ、１当量）を加え、この溶液を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ６１−４を白色固体として得た（２８ｍｇ、２８％）。
化合物Ｆ−６１−５：（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミド ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
化合物Ｆ−６１−４（２８ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。５分後、水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え、溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６１−５を無色の油状物として得た（３８ｍｇ、１３４％）。
化合物Ｆ−６１：
化合物Ｆ−６１−５（２８．３ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（０．５ｍＬ）、次いで、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（９ｍｇ、０．０２９μｍｏｌ、１．４当量）およびＤＩＥＡ（２５μＬ、０．１４３ｍｍｏｌ、７当量）に溶かした。この混合物を４．５時間撹拌し、その後、ＨＰＬＣ分析は出発材料の存在、スクシンイミドの完全な消費を示した。従って、補助的に６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（３ｍｇ、０．０１μｍｏｌ、０．５当量）を加え、この反応物を１．５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は出発材料の完全な消費を示した。溶媒を蒸発させて乾固し、残渣をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２Ｏ（８０／２０）の混合物で２回摩砕し、化合物Ｆ−６１を灰白色固体として得た（１９．４ｍｇ、７０％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１３６１．７７２５（２％、ＭＮａ＋、Ｃ７０Ｈ１０６Ｎ１２ＮａＯ１２Ｓ理論値１３６１．７６６６）、６７０．３９６１（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７０Ｈ１０８Ｎ１２Ｏ１２Ｓ理論値６７０．３９６０）。
化合物Ｆ−６２：
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｆ−６２−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｆ−６２−１は、ＤＭＦ（２ｍＬ） 中、アミン３Ｄ（１００ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ、０．９当量）、酸Ｆ−６１−３（１０８ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＥＣＰ（４１μＬ、０．２６７ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＥＡ（９３μＬ、０．５３４ｍｍｏｌ、３当量）から、化合物Ｆ−６１−４と同様にして製造された。分取ＨＰＬＣによる精製の後、化合物Ｆ−６２−１を白色固体として得た（９３ｍｇ、３９％）。
化合物Ｆ−６２−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
化合物Ｆ−６２−１（３５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。１０分後、水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え、溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６２−２を白色固体として得た（３４ｍｇ、１０５％）。
化合物Ｆ−６２：
アミンＦ−６２−２（３４ｍｇ、５．５５μｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（３ｍＬ）に溶かした。ＤＩＥＡ（５μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ、５当量）および６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、１．２当量）を加えた。ＨＰＬＣ 分析は出発材料の完全な消費を示した。溶媒を蒸発させて乾固し、残渣をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２Ｏ（８０／２０）の混合物で摩砕した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６２を白色固体として得た（５．５ｍｇ、１３％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１３３６．７８５９（２％、ＭＮａ＋、Ｃ６９Ｈ１０７Ｎ１１ＮａＯ１４理論値１３３６．７８９１）、６５７．９０７３（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ６９Ｈ１０９Ｎ１１Ｏ１４理論値６５７．９０７２）。
化合物Ｆ−６３：
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｆ−６３−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン
化合物Ｆ−６２−１（１５７ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ、１当量）を水（４．５ｍＬ）、アセトニトリル（４．５ｍＬ）およびピペリジン（３．５ｍＬ）の混合物に溶かし、室温で５時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をＥｔ２Ｏ（６０ｍＬ）で摩砕した。固体を濾取し、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で２回すすぎ、化合物Ｆ−６３−１を灰白色固体として得た（１５３ｍｇ、１００％）。
化合物Ｆ−６３−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン ビス２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｆ−６３−１（１５３ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。１０分後、水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え、この溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６３−２を白色固体として得た（３４ｍｇ、１０５％）。
化合物Ｆ−６３：
アミンＦ−６３−２（１００ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（２ｍＬ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合物に溶かし、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４５ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、１．８当量）およびＤＩＥＡ（７１μＬ、０．４０９ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。室温で４．５時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、その後、化合物Ｆ−６３を白色固体として得た（４２ｍｇ、３６％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１３００．７９０１（２％、ＭＨ＋、Ｃ６８Ｈ１０６Ｎ１１Ｏ１４理論値１３００．７９１５）、６５０．８９９０（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ６８Ｈ１０７Ｎ１１Ｏ１４理論値６５０．８９９４）。
化合物Ｇ−１２
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｇ−１２−１：Ｎ−（４−アミノフェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル二塩酸塩
塩化オキサリル（３ｍＬ）に６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（２００ｍｇ、０．９４７ｍｍｏｌ、１当量）を溶かした。この溶液を室温で５時間撹拌した後、減圧下で蒸発乾固させた。化合物Ｇ−１２−１をベージュの固体として得（２１７ｍｇ、１００％）、精製せずに次の工程で用いた。
化合物Ｇ−１２：
アニリン１２（４０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（８μＬ、０．０４５ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。３０分間撹拌した後、乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中、化合物Ｇ−１２−１（１０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を導入し、この反応物を０℃で１時間撹拌した。この混合物をＤＣＭ（２５ｍｌ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で２回、ブライン（１０ｍＬ）で１回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、粗生成物を淡褐色固体として得た（５４ｍｇ）。これをシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）、次いで、分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。単離された生成物を凍結乾燥させ、白色固体を得（２３ｍｇ）、これを分取ＨＰＬＣにより再精製し、選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｇ−１２を白色固体として得た（９ｍｇ、１６％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１０９４．６５４３（２０％、ＭＮａ＋、Ｃ５９Ｈ８９Ｎ７ＮａＯ１１理論値１０９４．６５１２）、１０７２．６７２２（１６％、ＭＨ＋、Ｃ５９Ｈ９０Ｎ７Ｏ１１理論値１０７２．６６９３）、５３６．８３５８（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ５９Ｈ９１Ｎ７Ｏ１１理論値５３６．８３８３）。
化合物Ｇ−１３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン ２，２，２−トリフルオロ酢酸酸
化合物Ｇ−１３：
アニリン１３（１５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で乾燥ＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（８μＬ、０．０４６ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。乾燥ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中、化合物Ｇ−１２−１（３．５ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を導入し、この反応物を０℃で１．５時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｇ−１３を白色固体として得た（１１．４ｍｇ、６２％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１０５８．６５１０（３０％、ＭＨ＋、Ｃ５８Ｈ８８Ｎ７Ｏ１１理論値１０５８．６５３６）、５２９．８２８５（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ５８Ｈ８９Ｎ７Ｏ１１理論値５２９．８３０５）。
化合物Ｇ−１５
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
化合物Ｇ−１５：
アニリン１５（４０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（１０μＬ、０．０５６ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中、化合物Ｇ−１２−１（１０８ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ、１０当量）の溶液を導入し、この反応物を０℃で１．５時間撹拌した。この混合物をＤＣＭ（１０ｍｌ）で希釈し、水（５ｍＬ）で２回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、粗生成物をベージュの固体として得た。これを分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ；溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ；１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配；Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ ＵＶ検出器 ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｇ１５を白色固体として得た（２７ｍｇ、５０％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ ＥＳＩ＋）１０６６．６５１７（２％、ＭＮａ＋、Ｃ５７Ｈ８５Ｎ７ＮａＯ１１理論値１０６６．６１９９）、５２２．８２２４（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ５７Ｈ８７Ｎ７Ｏ１１理論値５２２．８２２６）。
実施例１７：ＡＤＣの合成、精製および特性決定
下記の手順はキメラおよびヒト化ＩｇＧ１形態に当てはまる。ＩｇＧ２、ＩｇＧ４などの他の形態については、当業者ならば一般知識を用いてこの手順を適合させることができると理解されなければならない。
抗体（１〜５ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃にて２時間、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭホウ酸バッファー ｐＨ８．４中、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で部分的に還元した。一般に、それぞれ４前後の薬物−抗体比（ＤＡＲ）を目標とするために２．５〜３ｍｏｌ当量のＴＣＥＰを使用した。部分的抗体還元は、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。遊離した鎖内システイン残基へのリンカー−薬物のカップリングの前に、還元混合物を室温まで放冷した。次に、抗体濃度を１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭホウ酸バッファー ｐＨ８．４で１ｍｇ／ｍｌに調整し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１０ｍＭ溶液から、抗体に対して５モル過剰の薬物を加えた。カップリング中に水性媒体での薬物の溶解度を維持するために、最終ＤＭＳＯ濃度は１０％に調整した。反応は室温で１時間行った。薬物過剰分は、薬物１モル当たり１．５モルのＮ−アセチルシステインを加えて室温で１時間インキュベートすることによって急冷した。１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ Ｈｉｓバッファー ｐＨ６．５に対して４℃で一晩透析した後、抗体−薬物複合体を、市販のクロマトグラフィーカラムおよび限外濾過装置に基づく当業者に公知の方法を使用することにより精製した。まず、非結合薬物とＡＤＣ凝集物をＳ２００（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ）カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により除去した。次に、精製されたＡＤＣモノマーを３０または５０ｋＤａ ＭＷＣＯ濾過装置での限外濾過またはプロテインＡでのアフィニティークロマトグラフィーにより２〜３ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。精製されたＡＤＣを０．２μｍフィルターで濾過除菌した後に４℃で保存した。それらをさらに、薬物コンジュゲーションを確認するために還元条件および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、また、モノマーおよび凝集形態の含量を決定するために分析的Ｓ２００またはＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラムでのＳＥＣにより分析した。タンパク質濃度は、標品としてＩｇＧを用いたビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用することにより決定した。ＤＡＲは各精製ＡＤＣに関してＨＩＣおよびＬＣ−ＭＳにより評価した。一般に、凝集形態の含量は５％未満であり、ＤＡＲは３．５〜５の間を含んだ。
実施例１８：種々の薬物とカップリングされたＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞傷害性評価
１８．１ ＭＣＦ−７細胞でのキメラ抗体の評価
５つのＩＧＦ−１Ｒ抗体は急速にリソソームへ内部移行されること、および酸性環境になると低結合能を有することが示された。この点で、これらのＡｂはＡＤＣとして使用されるべき総ての特性を備えていた。従って、これら５つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を３つの異なる化合物（Ｇ−１３；Ｅ−１３およびＦ−６３）とカップリングさせた。これらのＡＤＣの薬物抗体比は約４であった。非特異的細胞傷害性を評価するために、無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４も同じＤＡＲでこれらの化合物とカップリングさせた。ＭＣＦ−７細胞を完全培養培地で、３７℃にて６日間、漸増濃度の各ＡＤＣとともにインキュベートした。細胞生存率は、発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。発光シグナルはＭｉｔｈｒａｓプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて読み取った。Ｅ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３のいずれかとカップリングさせた無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４は、ＭＣＦ−７細胞で細胞傷害活性を全く示さなかったかまたは低活性であった（図２１）。これに対して、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をＥ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３のいずれかとカップリングさせた後に得られた他の総てのＡＤＣを加えると、ＭＣＦ−７細胞の生存率は劇的に低下した。
１８．２ 正常細胞でのキメラ抗体の評価
ＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを、ｃ２０８Ｆ２ ｍＡｂを用いて初代正常細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ）で評価した。この目的で、細胞（０．５×１０６細胞／ｍｌ）をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃にて２０分間、１０μｇ／ｍｌのｃ２０８Ｆ２抗体とともにインキュベートした。次に、それらを３回洗浄し、暗所、４℃にてさらに２０分間、Ａｌｅｘａ ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。発現レベル（Ｂｍａｘ）は、ＭＣＦ−７細胞でのＩＧＦ−１Ｒ発現（実施例２、表８参照）に比べて正常細胞では低かった（表１４）。
ＡＤＣ ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３の細胞傷害性を正常細胞で評価した。これらの細胞を完全培養培地で３７℃にて６日間、漸増濃度のｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３とともにインキュベートした。細胞生存率は、発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。発光シグナルはＭｉｔｈｒａｓプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて読み取った。ＨＢＳＭＣ、ＨＰＭＥＣ、ＨＡｏＥＣおよびＨＲＥｐＣでは主要な細胞傷害性は見られなかった（図２５）。ＨＵＣでは高濃度のｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３のみで軽微な細胞傷害性が測定された。
１８．３ ｈｚ２０８Ｆ２のヒト化変異体の評価
２０８Ｆ２の１６のヒト化変異体を化合物Ｇ−１３とカップリングさせた。これらのＡＤＣの薬物抗体は約４であった。非特異的細胞傷害性を評価するために、無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４も同じＤＡＲでこれらの化合物とカップリングさせた。キメラ抗体ｃ２０８Ｆ２もＧ−１３とカップリングさせた。ＭＣＦ−７細胞を完全培養培地で、３７℃にて６日間、漸増濃度の各ＡＤＣとともにインキュベートした。細胞生存率は、発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。発光シグナルはＭｉｔｈｒａｓプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて読み取った。Ｇ−１３とカップリングさせた無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４は、ＭＣＦ−７細胞で細胞傷害活性を全く示さなかったかまたは低活性であった（図２６）。これに対して、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をＧ−１３とカップリングさせた後に得られた他の総てのＡＤＣを加えると、ＭＣＦ−７細胞の生存率は劇的に低下した。これら１６のヒト化変異体の細胞傷害性誘導能は、表１５に示され、また、図２６に１つのヒト化変異体で例示されるように、キメラ型ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３で測定されたものと少なくとも同等かさらに良好であった。
実施例１９：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＥ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３化合物のいずれかとコンジュゲートされたｃ２０８Ｆ２抗体のｉｎ ｖｉｖｏ活性
Ｇ−１３、Ｅ−１３またはＦ−６３化合物とカップリングされたｃ２０８Ｆ２のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性がｉｎ ｖｉｖｏで翻訳可能であったことを確認するために、それらがＭＣＦ−７異種移植モデルで試験された。
総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。５００万のＭＣＦ−７細胞を７週齢のスイス／ヌードマウスに皮下注射した。細胞注入前に、ＭＣＦ−７腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ成長に必要なエストロゲンを放出させるために、マウスの左側腹部にエストロゲンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。
ＭＣＦ−７細胞移植の２０日後、腫瘍が１２０〜１５０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、腫瘍のサイズと外観に従って動物を５個体ずつの群に分けた。種々の処置剤を腹腔内注射により接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は式：π／６×長さ×幅×高さで計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。総ての化合物を腹膜内に（ｉ．ｐ．）注射した。この実施例では、Ｅ−１３、Ｆ−１３またはＦ−６３のいずれかと約ＤＡＲ４でカップリングされたｃ２０８Ｆ２ ｍＡｂの抗腫瘍活性は、Ｄ２０およびＤ２７に７ｍｇ／ｋｇ用量の２回の注射の後に評価した（図２２Ａ、２２Ｂおよび２２Ｃ）。並行して、キャップされた薬物部分Ｅ−１３、Ｆ−１３およびＦ−６３を、７ｍｇ／ｋｇのｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３、ｃ２０８Ｆ２−Ｆ−１３およびｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３ ＤＡＲ 約４に相当するものと同等の用量で注射した。
ｃ２０８−Ｅ−１３（図２２Ａ）、ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（図２２Ｂ）またはｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３（図２２Ｃ）のいずれかの注射は、腫瘍成長を有意に阻害し、完全な腫瘍成長の退縮を誘導しさえした（対応するキャップ薬物に対してｐ＜０．０５）。ｃ２０８−Ｅ−１３、ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３およびｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３の間に統計的な活性の違いは認めることができなかった。キャップ薬物はＭＣＦ−７腫瘍の成長に影響を及ぼさなかった（対照群に対してｐ＞０．０５）。
従前に記載したＭＣＦ−７異種移植モデルにおいて、Ｅ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされたｃ２０８Ｆ２およびＥ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされた無関連抗体ｃ９Ｇ４を用いて第２の試験セットを実施した。Ｄ２０およびＤ２７に、マウスに７ｍｇ／ｋｇの各ＡＤＣをｉ．ｐ．注射した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。
ｃ９Ｇ４−Ｅ−１３とｃ９Ｇ４−Ｆ−１３の両方の注射は、ＭＣＦ−７異種移植腫瘍の成長にあまり大きくない一時的な影響を及ぼすだけであった。しかしながら、この第２の試験により、Ｄ４３にＡＤＣの高い抗腫瘍活性が示されたことから、ｃ２０８−Ｅ−１３またはｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３のいずれの注射も完全な腫瘍退縮を誘導したことが確認された。
実施例２０：３ ＋ ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＧ−１３化合物とコンジュゲートされたｈｚ２０８Ｆ２抗体のｉｎ ｖｉｖｏ活性
Ｇ−１３化合物とコンジュゲートされた２０８Ｆ２のヒト化型が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＭＣＦ−７異種移植モデルで評価された。
総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。５００万のＭＣＦ−７細胞を７週齢のスイス／ヌードマウスに皮下注射した。細胞注入前に、ＭＣＦ−７腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ成長に必要なエストロゲンを放出させるために、マウスの左側腹部にエストロゲンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。
ＭＣＦ−７細胞移植の２０日後、腫瘍が１２０〜１５０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、腫瘍のサイズと外観に従って動物を６個体ずつの群に分けた。種々の処置剤を腹腔内注射により、４日ごとに１回の注射の４回注射プロトコール（Ｑ４ｄ４）として接種した．動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は式：π／６×長さ×幅×高さで計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。総ての化合物を腹膜内に（ｉ．ｐ．）注射した。この実施例では、Ｇ−１３化合物とカップリングされたｃ２０８Ｆ２ ｍＡｂの抗腫瘍活性は、それもまたＧ−１３とカップリングされた種々のヒト化型に匹敵した（図２７）。供試したヒト化型を下表１６に記載する。
ｃ２０８−Ｇ−１３または２０８Ｆ２ヒト化型のいずれの注射も腫瘍成長を有意に阻害し、完全な腫瘍成長の退縮を誘導しさえした（対応する対照に対してｐ＜０．０５）。ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３および供試したヒト化型の間に統計的に有効な違いは見られなかった。
従前に記載したＭＣＦ−７異種移植モデルにおいて、Ｇ−１３とカップリングされたｃ２０８Ｆ２またはｈｚ２０８Ｆ２−４を用いて第２の試験セットを実施した（それぞれ図２８Ａおよび２８Ｂ）。マウスに３ｍｇ／ｋｇの各ＡＤＣを４日ごと４回の注射（Ｑ４ｄ４）でまたは１回のみｉ．ｐ．注射した。
ＭＣＦ異種移植モデルにおいてＤＣを４回または１回のみ注射した場合に同じ強い抗腫瘍活性が見られた。
実施例２１：２ ＋ ＣａＯＶ−３異種移植モデルにおけるＧ−１３またはＥ−１３化合物とコンジュゲートされた２０８Ｆ２抗体のｉｎ ｖｉｖｏ活性
抗腫瘍活性を卵巣癌細胞株であるＣａＯＶ−３異種移植モデルとしての２＋発現腫瘍でも試験した。この提示のため、Ｄ０においてマウスに７×１０６細胞を皮下注射した。腫瘍がおよそ１２０ｍｍ３に達した際（腫瘍細胞注射１９日後）に、動物を対応する腫瘍サイズで５個体ずつの５群に分け、Ｅ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされたｃ２０８Ｆ２およびＥ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされた無関連抗体ｃ９Ｇ４を用いて腹膜内処理した。マウスに３ｍｇ／ｋｇの各ＡＤＣを４日ごとに１回の注射の６回の注射サイクルでｉ．ｐ．注射した。異種移植成長速度の観察のためにマウスを追跡した。腫瘍体積はπ／６×長さ×幅×高さで計算した。
あまり大きくない一時的な成長の緩徐化を誘導したｔｃ９Ｇ４−Ｅ−１３に比べ、ｃ９Ｇ４−Ｇ−１３の注射はＣａＯＶ−３異種移植腫瘍の成長に影響を及ぼさなかった。一方で、ｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３またはｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３いずれかの注射は、５０日目にそれぞれ９５％および７７％の腫瘍成長阻害を誘導した（図２９Ａおよび２９Ｂ）。

Claims (24)

  1. 下式（Ｉ）の抗体−薬物複合体またはその薬学上許容可能な塩：
    Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ （Ｉ）
    ［式中、
    Ａｂは、配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントであり；
    Ｌは、リンカーであり；
    Ｄは、下式（ＩＩ）の薬物成分である：
    （式中、
    Ｒ２は、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３またはチアゾリルであり；
    Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
    Ｒ９は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり；
    ｍは、１〜８の間に含まれる整数であり；
    波線は、Ｌとの結合点を示し；かつ
    ｎは、１〜１２である）］。
  2. Ａｂが、
    ａ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
    ｂ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
    ｃ）配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
    ｄ）配列番号８、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
    から選択される、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
  3. Ａｂが、
    ａ）配列番号１３の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
    ｂ）配列番号１４の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
    ｃ）配列番号１５の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
    ｄ）配列番号１６の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
    ｅ）配列番号１７の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
    から選択される、請求項１または２の抗体−薬物複合体。
  4. Ａｂが、
    ａ）配列番号１８の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
    ｂ）配列番号１９の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
    ｃ）配列番号２０の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
    ｄ）配列番号２１の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
    ｅ）配列番号２２の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
    から選択される、請求項１または２に記載の抗体−薬物複合体。
  5. Ａｂが、抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０から選択される、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
  6. Ａｂが、
    ａ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２および９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる重鎖可変ドメイン；ならびに
    ｂ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）であって、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７または８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる軽鎖可変ドメイン
    を含んでなる、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
  7. Ａｂが、
    ａ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；
    ｂ）配列番号５７もしくは６０から選択される配列または配列番号５７もしくは６０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体；ならびに
    ｃ）配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８および８０から選択される配列または配列番号５６、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８もしくは８０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号５７もしくは６０から選択される配列または配列番号５７もしくは６０と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
    から選択される、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
  8. Ａｂが、
    ａ）配列番号５８、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９および８１から選択される配列または配列番号５８、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９もしくは８１と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の重鎖；ならびに
    ｂ）配列番号５９および６１から選択される配列または配列番号５９もしくは６１と少なくとも８０％の同一性を有する任意の配列の軽鎖
    を含んでなる、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
  9. Ｌが下式（ＩＩＩ）：
    のリンカーであり、式中、
    Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、または（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニルであり、Ｗは、アミノ酸単位であり；ｗは、０〜５の間に含まれる整数であり；
    Ｙは、ＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは、
    であり；ｙは、０または１であり；
    アスタリスクは、Ｄとの結合点を示し；かつ
    波線は、Ａｂとの結合点を示す、
    請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体。
  10. Ｌ２が下式：
    のものであり、式中、
    アスタリスクは、（Ｗ）ｗとの結合点を示し；かつ
    波線は、マレイミド部分の窒素原子との結合点を示す、
    請求項９に記載の抗体−薬物複合体。
  11. （Ｗ）ｗが、
    一重結合、
    から選択され、
    アスタリスクは（Ｙ）ｙとの結合点を示し；かつ
    波線はＬ２との結合点を示す、請求項９に記載の抗体−薬物複合体。
  12. ｗ＝０；またはｗ＝２であり、かつ、（Ｗ）ｗが、
    から選択され、
    アスタリスクは、（Ｙ）ｙとの結合点を示し；かつ
    波線は、Ｌ２との結合点を示す、請求項９に記載の抗体−薬物複合体。
  13. （Ｌ−Ｄ）が、
    から選択され、
    波線は、Ａｂとの結合点を示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体。
  14. から選択される式を有する、請求項１に記載の抗体−薬物複合体、およびその薬学上許容可能な塩であって、
    Ａｂが、抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０からなる群において選択される、抗体−薬物複合体、およびその薬学上許容可能な塩。
  15. Ａｂが、
    配列番号５６の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号５６の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６０の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号６２の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号６４の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号６４の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６０の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号６６の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号６８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号６８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６０の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号７０の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号７２の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号７４の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号７６の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号７８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；
    配列番号７８の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号６０の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体；並びに
    配列番号８０の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体からなる群から選択される、請求項１４に記載の抗体−薬物複合体。
  16. Ａｂが、
    配列番号５８の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号５８の配列の重鎖および配列番号６１の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号６３の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号６５の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号６５の配列の重鎖および配列番号６１の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号６７の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号６９の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号６９の配列の重鎖および配列番号６１の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号７１の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号７３の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号７５の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号７７の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号７９の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体；
    配列番号７９の配列の重鎖および配列番号６１の配列の軽鎖を有する抗体；並びに
    配列番号８１の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体からなる群から選択される、請求項１５に記載の抗体−薬物複合体。
  17. 以下の式：
    を有する、請求項１４に記載の抗体−薬物複合体、またはその薬学上許容可能な塩であって、
    Ａｂが、配列番号８０の配列の重鎖可変ドメインおよび配列番号５７の配列の軽鎖可変ドメインを有する抗体である、抗体−薬物複合体、またはその薬学上許容可能な塩。
  18. Ａｂが、配列番号８１の配列の重鎖および配列番号５９の配列の軽鎖を有する抗体である、請求項１７に記載の抗体−薬物複合体。
  19. ｎが２である、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
  20. ｎが４である、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
  21. 請求項１〜２０のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の抗体−薬物複合体を含んでなる組成物。
  22. 薬学上許容可能なビヒクルをさらに含んでなる、請求項２１に記載の組成物。
  23. ＩＧＦ−１Ｒ発現癌の処置に使用するための、請求項２１または２２に記載の組成物。
  24. ＩＧＦ−１Ｒ発現癌が、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、中皮腫、口腔扁平上皮癌および任意の薬剤耐性癌から選択される癌である、請求項２３に記載の組成物。
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